Summary
Bağışıklık yetkili sıçanların plevra boşluğuna II-45 mezotelyoma hücrelerin nakledilmesi ile plevra malign mezotelyoma ortotopik sıçan modelinin üretimi sunulmuştur. Bir akış sitometrik yöntemi de tanımlanan bir 25 ul kan örneğinden, bu hayvanlarda, yedi immün hücre alt analiz etmek.
Abstract
Bu tür aşıların ve bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri ve tedavi yanıt tümör mikro rolü artmış anlayış kanseri için bağışıklık bazlı tedavilerde ilgi muazzam kabarış, toplu klinik öncesi testler için immün yetkili ortotopik modellere ihtiyaç işaret Bu yeni tedavilerin. Bu yazıda plevral malign mezotelyoma ortotopik bağışıklık yetkili sıçan modeli kurmak için nasıl gösterir. Ortotopik modellerde İzleme hastalığın ilerlemesi tümörlerin iç konuma göre şaşırmış. Uzunlamasına hastalığın ilerlemesini bu ve diğer kanser fare modellerinde immün hücreleri, dolaşımdaki üzerindeki etkisini izlemek için, tek bir tüp sadece 25 ul tam kan açıklanan gerektiren tahlilinde akış sitometrisi. Toplam lenfositler, monositler ve nötrofiller, hem de T-hücre alt CD4 ve CD8, B-hücreleri ve doğal katil hücreler: bu, doğru yedi bağışıklık parametrelerinin ölçümü sağlar. Farklı subsBu parametrelerin ets mezotelyoma modelde hastalığın ilerlemesinin izlenmesi için en büyük yararı olan lenfosit oranı nötrofil ile farklı koşulları ve model yararlıdır. Ayrıca bağışıklık bazlı tedavilere yanıtın izlenmesinde ve tedavi başarı ya da başarısızlığa yol açan altta yatan mekanizmaların anlaşılmasında yardımcı olabilir bu tek tüp yöntemi kullanarak bağışıklık hücre düzeylerinin dolaşan Analiz.
Introduction
Malign mezotelyoma (MM) membran (mesothelium) dönüştürülmüş hücrelerden kaynaklanan saldırgan malignite olduğu satırları akciğer ve karın boşlukları, kalp ve iç üreme organları ve akciğer boşluğuna veya plevra 1,2 en sık görülen primer tümör . Asbest liflerine maruz kalma tüm MM% 80'ini ve asbest kullanımına ilişkin yasakları en batı ülkelerinde yıl önce tanıtıldı olurken, toplumdaki yaygın kullanımı ölümcül bir miras bırakmıştır. Dünya Sağlık Örgütü 107.000 kişi dünya çapında artmaya devam ölüm oranları ile, asbest ilgili hastalıklar her yıl ölmektedir tahmin ediyor. Yeni bir meslek dışı insidans dalgası da ortaya çıkmaktadır ve bu 3 zirve zaman ve hangi düzeyde küçük anlayış var.
Sistemik kemoterapi tek geçerli seçenek 4 birini temsil ettiğinde MM ile insanların büyük çoğunluğu geç teşhis edilir. En effectikemoterapi ve (cisplatin 5 ile birlikte pemetrexed) geçerli 'bakım standardını' ziyaretinde 10 yıl önce tespit edilmiştir. Bu tedavinin Ancak başarısızlık kaçınılmazdır ve sadece 12 ay 2 sert bir prognoz ve medyan sağkalım hastaları bırakarak kanıtlanmış ikinci satırı seçenekleri vardır. Bu nedenle, daha etkin tedavi için acil bir karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Klinik çalışmalarda yeni tedavilerin bir dizi incelemede karşın, hiçbiri uygulamada değişiklikler ile sonuçlanmıştır. Bu klinik 6-8 ayar genellikle ksenograft fare modellerinde gerçekleştirilen ön klinik sonuçlar, düşük (% 5) aktarım, kısmen bağlıdır. Bu tür modeller sadakatle sıklıkla bağışıklık sistemi 9 yokluğunda, fizyolojik olmayan yerlerde meydana gelen tümör mikro-ortamınm karmaşık yönleri özetlemek yoktur.
Singenik ortotopik modeller c göre belirgin daha gerçekçi tümör ortamı yaratmaktümörler bozulmamış bağışıklık sistemi 10,11 ile doğru fizyolojik konumda ortaya gibi ommonly derialtı ksenograft modelleri kullanılmaktadır. Sıçan büyük boyutta özellikle seri kan tedavi yanıtını ve toksisite 12 değerlendirmek için gerekli olan berabere ilaç çalışmalarında, bir kemirgen hastalık modeli olarak kullanımını geliştirir. Bundan başka, bir model olduğu hastalık ilerlemesini takip dolaşımda bulunan faktörler son derece çekici kullanılarak hastalığın ilerlemesini izlemek için yeteneği nedeniyle, (plevral boşluğuna gibi) tümörlerin konuma zordur. Bağışıklık yetkili fareler kullanılarak plevral mezotelyoma bir singenik ortotopik model üretimi tarif edilmektedir. Buna ek olarak, dolaşımdaki immün hücre ölçülerek plevral hastalığı ilerlemesinin izlenmesi için kolay ve göreceli olarak invazif olmayan bir yöntem de tarif edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları da içeren tüm prosedürler Bilimsel Amaçlarla Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Uygulama Avustralya Kanunu tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür. Bu çalışma için protokol Kraliyet North Shore Hastanesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından onaylandı. Kadın Fischer 344 fareleri (F344, 150-200 g), Kearns Tesisinde muhafaza edilmiştir, standart koşullar (12 saat ışık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya serbest erişim) altında Kolling Enstitüsü.
Not: Tüm deneysel işlemleri için bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de sunulmuştur.
İmplantasyon için Hücrelerin hazırlanması 1.
- (Aynı zamanda IL-45 olarak da bilinen krosidolit asbest periton sokulmasıyla elde edilen) Kültür sıçan mezotelyoma II-45 hücre hattı RPMI 1640 (RPMI) ortam (37 °,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş ve standart koşullarda büyümeye % 5 CO2) C nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı. Mainta75 cm 2 balonuna pasajlayarak ve iki alt kültürleme yaklaşık 01:50 Haftada tarafından.
- 37 ° C'de hücre kültürü ve sıcak alikotları için reaktifler hazırlayın. Gerekli reaktifler,% 10 FBS, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve% 0.5 tripsin-EDTA ile, serum içermeyen RPMI ortamı (SFM), RPMI bulunmaktadır.
- Yaklaşık 70-80% konfluansa implantasyon için kültür hücreleri. Bu da doğrusal büyüme aşamasında olmasını sağlar.
- Medya atarak steril PBS, 5 ml ile bir kez yıkanması ve daha sonra 3 ml% 0.5 tripsin EDTA ekleyerek Hasat hücreleri.
- Tüm hücreler, yapışmayan olana kadar yaklaşık 5 dakika boyunca inkübatör şişeler dönün.
- Hücreler yapışmayan olduğunda, tripsin inaktive% 10 FBS ile RPMI 3 ilave edin. Toplama ve santrifüj hücreleri 3 dakika boyunca 300 xg'de.
- 3 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar santrifüj SOY ve 10 ml hücre pelletini yıkayın.
- 10 SOY ml ve santrifüj yukarıdaki gibi tekrar yıkayın hücre topağı.
- SFM 10 ml hücrelerin tekrar ve bir hemasitometre ve benzeri cihazlar kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin.
- 100 ul implante edilecek hücrelerin miktarını ihtiva ettiği şekilde hücreleri ile seyreltilir.
Not: Tümör büyümesi 100 100 ul hücre fakat standart bir doz 100 ul 500,000 hücreleri gibi düşük bir dozda gösterilmiştir. - Sıçanların sayısı (yani, 100 ul / fare) implante edilebilir için ortam yeterli hücrelerini hazırlamak artı astarlama ve iğne ölü hacminden kayıplarını telafi etmek için, en az 0,5 ml ilave.
- Hazırlama (hücreler olmadan) yeterli SFM kontrol farelerinde (örneğin, 100 ul / fare) içine implant edilmek üzere, ayrıca, en az 0,5 ml ilave.
Hücreleri ve SFM artık implantasyon için hazırız: Not. Onlar 37 o C'de tutuldu ve canlılığını korumak için hasat 2 saat içinde implante edilmelidir.
Hücreler 2. in vivo İmplantasyon
- Indüksiyon odasına F344 sıçan (> yaşı 13 hafta) yerleştirin ve% 1,4 izofluran inhalasyonu (ya da tesiste kullanılan yöntem) ile uyutmak. Sıçan (akan% 1.4 izofluran ile) burun konisi için odadan uykuda hareket onu olduğu göründüğünde, (ventral görünüm) yukarı bakacak şekilde göğüs ile sırtında yerleştirin. Bu iç organları uzakta göğüs boşluğundan yerleşmek için izin verir. Sıçan sağlamak için kurumsal protokollere göre refleksleri kontrol tamamen uyuşturulduktan.
- Kürk çıkarmak için sağ regio costalis (göğüs) alan tıraş.
- % 80 v / v etanol ile traşlı alanı temizleyin.
- Enjeksiyon bölgesini belirleyin: Sağ tarafta, 2 bezi kranial başlayan bulabilirsiniz. Enjeksiyon sitesi göğüs kafesinin kuyruk ucundan 3. ve 4. kaburga arasında, bu 0.5 cm proksimalinde olduğunu. (Şekil 2A).
- Yavaşça tekrar süspansiyon II-45 hücreleri karıştırın. Yavaşça 1 ml hücre süspansiyonu (veya kontrol sıçanlar için SFM) çizmek ve# 160; ekli bir iğne olmadan şırınga. Bir iğne hücrelerin çizim up bağlıysa hücreler iğne, enjeksiyon hattı boyunca büyümek için potansiyeli vardır. Bir 23G x 1 ¼ iğne takın. Başbakan makaralı ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
- Şırınga ve iğne astarlanmış sonra, iğne mili üzerinde 20 mm uzunluğunda ve 5 mm çapında bir boşluk yerleştirin. Bu enjeksiyon sırasında plevra boşluğuna çok derin nüfuz iğne önlemek için kullanılır. Maruz kalan iğne Yaklaşık olarak 5 mm-12 mm bir organların zarar vermeden kaburga nüfuz için yeterlidir.
- Yavaşça, kaburgaların arasındaki iğneyi bir kan damarı (kan şırınga içinde görünmelidir) daha sonra 100 ul hücreleri veya SFM enjekte delinmiş olmamıştır sağlamak için şırınga geri çekin. (Şekil 2B).
- İğneyi çıkarın ve yavaşça göğüs boşluğunda hücreleri yaymak için yanlara doğru sıçan yuvarlayın.
- Bir kafese sıçan yerleştirin ve kurtarma için kontrol edin. The sıçan 1 dakika içinde uyanık ve hareket başlıyor olmalıdır.
- Yeni bir iğne kullanarak her sıçan için tekrarlayın. Aynı iğne tekrar kullanımı iğnenin enjeksiyon hattı boyunca hücre büyümesinin neden olur.
- Günlük hayvanların refahını izleyin.
- Kurumsal hayvan etik komitesi tarafından yönetilir olarak etik tanımlanan uç noktaları hayvanların Euthanize. Bu deneylerde sıçanlar için etik son nokta 10'dan daha fazla veya% da zor nefes alma ve ağırlık kaybı vardı.
3. Kuyruk Ven Kan Toplama
- Kan sonrası hücre implantasyonu hemen tahsil edilecek olursa, anestezi sıçan tutun. Başka bir zaman noktasında kan örnekleme ise,% 1.4 izofluran inhalasyonu ile sıçan uyutmak. Sıçan sağlamak için kurumsal protokollere göre refleksleri kontrol tamamen anestezi edilir.
- Onun yüzüne sıçan yerleştirin ve bir yanal kuyruk damarı bulun.
- % 80 etanol ile kuyruk sterilize ve 0.5 ml EDTA c etiketollection tüpü.
- Kan toplamak için, her zaman (boyunca yol yaklaşık üçte biri) kuyruk kaudal ucunda başlar. Bu ilk girişim başarısız olması halinde kuyruk kafa ucuna daha yakın girişimleri verir. Bu bir kan pıhtısı neden olabilir kaudal resample asla.
- Yanal ven bir 23G x 1 ¼ iğne paralel yerleştirin ve yaklaşık 10 mm (Şekil 3A) nüfuz böylece sığ bir açıyla damara doğru kaydırın.
- Not: Damar başarıyla delinirse olmuşsa, kan iğne (Şekil 3B) bağlanma sonunda görünür olacaktır.
- Bir damla kan iğne ponksiyon yerinde kuyruk oluşacaktır. Etiketli 0.5 ml (veya daha küçük) EDTA toplama tüpüne bir pipet ve transfer kullanarak bu kan toplayın. Immün hücre deneyi 25 ul için yeterlidir. Kanama durana kadar siteyi delinme basıncı ile gazlı bez uygulayın.
- Pr kan ve EDTA karıştırmak için kan tüpü FlickOlay pıhtılaşması. Kan toplama ve pıhtılaşmayı önlemek için mümkün olduğu kadar kısa EDTA ile karıştırılarak arasındaki süre devam edin.
- Analize kadar oda sıcaklığında rafa birden fareler mağaza EDTA kan örneklerinde kan toplarken. Koleksiyonun 2 saat içinde Süreç kan.
Boncuk merkezli Yöntemiyle Bağışıklık Hücre Profil Oluşturma 4. Numune Hazırlama
Not: Bu tek bir platform yöntemi, her numune için boncuk bilinen bir dizi var piyasada mevcut mutlak sayım tüpleri kullanılarak dayanır. Bu tüpler boncuk serbest numune hazırlama sırasında çözülür liyofilize pelet, içerirler. Boncuklar flüoresan olarak etiketlenir ve boncuk nüfus yolluk mutlak sayımlar hesaplanabilir.
- EDTA tam kan örneği birkaç dakika yavaş döner mikser üzerine yerleştirerek iyice karıştırılır olduğundan emin olun. Her numune için tek mutlak sayma tüp etiketleyin. Boncuklar içeren bir pelet t altında görünür olmalıdırtüpün dibinde o metal boncuk tutucu.
- Etiketli mutlak sayım tüpüne EDTA tam kan 25 ul aktarın. Boncuk pelet kanın ilave edilmesi üzerine eriyecektir.
- Her bir tüpe, anti-sıçan T / B / Doğal Katil (NK) hücre kokteyli 20 ul anti-sıçan CD8a PE 10 ul anti-fare CD4 (alan 1) FITC 10 ul ve anti-sıçan 10 ul CD45 PE / Cy7 (Şekil 4A). Flüoroforlar Tablo 1 'de tanımlandığı gibidir.
- Antikorlar ve hücreler, tüpün alt ve tüpün yanına yapışmış olmayan sağlamak için boru kısa bir süre (300 xg) santrifüjleyin. Girdap karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe.
- Kırmızı kan hücreleri 10 mM Tris, 400 ul lize etmek için, 0.15 M amonyum klorür tamponu (pH 7.5) ve vorteks karıştırın. Numune saydam ve bulanık değil (Şekil 4B ve C) göründüğünde lizis tamamlandı. Numune tamamen artmasına sebep olacağı parçalamak için başarısızlıkd arka plan ve flow sitometri ile analiz ederken yanlışlıkla sayıları yüksek.
Numunelerin 5. Akış Sitometrik İşleme
Not: akış sitometresi 4 renk gerçekleştirin.
- Şekil 5 de gösterildiği gibi, tedarik etme kipi ve 8 parsel ile yeni bir şablon yazılım açın.
- Tablo 1'de listelenen ve kapı R1 kurmak olanlara cihaz ayarlarını yapın (FITC [FL-1] APC [FL-4] karşı), Şekil 5ai) floresan boncuk saymak için. Diğer kapılar bu satın alma aşamasında önemli değildir ama analiz için gerekli olacaktır. Bu protokolde kullanılan mutlak sayım boncuk floresan boyalar içeren ve mavi kanalda zayıf olmasına rağmen herhangi bir kanalda tespit edilebilir.
- Hazırlanmış bir kontrol kan örneği, vorteks kullanarak ve sonra Sitometre üzerine yüklemek ve veri toplama kapıları ayarlanabilir, böylece kurulum modunda düşük hızda (12 ul / dak) çalışacak.
- Edinimi ayarlayınR1 boncuk kapısı 10.000 olayları toplamak.
- Veri kaydetmek ve satın alma menüsünden dosya numarasını ve etiket örnek dosya ayarlamak için bir klasör oluşturun.
- Numune sitometresinin üzerine analiz edilecek yerleştirin ve orta (35 ul / dk) akış hızını ayarlamak. Aynı akış hızında her bir örnek çalıştırın. Akış hızı (12 ul / dakika) düşük ya da (60 ul / dakika) yüksekten değiştirilebilir gerekebilir, ancak orta genellikle uygundur. Bu hızla her numune için 10,000 boncuk olayları elde etmek için yaklaşık 90 ila 120 saniye sürüyor.
- Numune emin olaylar R1 boncuk kapısında görünen emin olmak için dağılım araziler izlemek yüklendikten sonra. Başlangıçta saçılım araziler sürüklenme neden örnek baskısı bazı istikrarsızlık olabilir. Bu stabilize etmek için bekleyin.
- Stabilize sonra edinilen tıklayın ve örnek çalışmasına izin. Sitometresinin R1 10.000 boncuk olayları satın bittikten sonra sitometresinin elde durdurmak ve tüm verileri kaydetmek olacaktır.
- Numuneyi çıkarın ve tu akış atınolacak. Sitometresinin şimdi bir sonraki numune için hazırdır. Tüm örnekleri çalıştırın ve daha sonra analiz moduna geçin.
6. Bağışıklık Hücre Analizi
Not: yolluk stratejileri ve Boole cebri her hücre popülasyonu tanımlamak için kullanılır. Boole cebri, tek bir tanımı birden operasyonlar için izin veren bir mantık tabanlı analiz yöntemidir. (Örneğin, BD CELLQuest) Akış Sitometre analiz yazılımı Boole cebri kullanımı için izin verir. Denklemler daha özel olarak her bir hücre popülasyonu tespit hücre tanımlanmasında yardımcı önemli bir negatif reaktiflik için aktif hesap için kullanılır. 'Bölgeler' bir 'kapıyı' tanımlamak için kullanılır. (- Tablo 2 'de tanımlandığı +, *) kapıları cebirsel operatörler tarafından bağlanmış bir çok bölgesine oluşur, oysa bölgeler 2 boyutlu bir boşluk tanımlar.
- Analiz moduna yazılımı geçin. Bir analiz şablonu maç için oluşturulan edilmelidir
- Ayrı ayrı her bir dosyayı (örn, her numune) analiz edin. Tablo 2'de tarif edildiği gibi ayarlama kapıları R1 R9 üzerine ve sonra, (aynı zamanda, Şekil 5'de gösterildiği gibi), her hücre türü için algoritmaları ayarlayın.
- Kapıları ve algoritmalar (Tablo 2 ve Şekil 5) tarafından tanımlanan bireysel hücre popülasyonlarının hesaplamak için hücre istatistik sayacı kullanın. Algoritmalar hücre istatistik sayaç otomatik olarak hücre sayıları ayarlayacaktır.
- Aşağıdaki denklem kullanılarak hücre alt hesaplayın:
Not: sayılan hücre olayların sayısı (örneğin, CD4 T hücre olaylar) kan ul başına hücre sayısını vermek için yukarıdaki denklemi kullanılarak numaralandırılmış. Örnekleri, Şekil 5 de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
II-45 hücreleri kullanılarak plevral mezotelyoma ortotopik modeli üretimi için bu çalışmada kullanılan yöntem, hiçbir sıçan implantasyon yöntemi nedeniyle ölüyor ile, tekrarlanabilir ve hızlı bir süre içinde mezotelyoma yenik hayvanlarda sonuçlandı. Implante edilen hücre sayısı titrasyon 1 x 10 3 hücreleri, tam nüfuz modeli (100% melezleme) için gerekli olan en az sayıda olduğunu tespit ettik. Sıçanlarda implante hücrelerin farklı sayıda hastalığın şiddetini etkileyen görünmeden hastalığın süresi seyrini değiştirdi. X 10 3 1 alınan hayvanlar, günde 40, 30, sırasıyla günde 20 (Şekil 6) tarafından belirlenen son noktaları etik ulaştığı x 10 4, 1 ve 5 x 10 5 hücre.
Kan toplama ile ilgili görülmüştür bir sorun olmaksızın yaklaşık olarak iki haftada sıçanlar toplanmıştır. Bu, toplam kan hacminin bu en fazla 10% dikkat etmek önemlidir (ya dayaklaşık 2 mi) 2 haftalık bir süre içinde alınmalıdır. Yolluk stratejilerini birleştirildi ve Boole cebri lenfositler, monositler ve nötrofillerin ve lenfosit alt kümelerini T, CD4 T, CD8, B ve NK hücreleri tanımlamak için kurulmuş bir akış sitometri deneyi. Her hücre tipi için ortalama ve bir mesafe kontrol sıçanları (n = 5) ve son noktada II-45 implante edilmiş sıçanların ortalama ve aralığı ile karşılaştırılmıştır (Tablo 3) kullanılarak kurulmuştur. Endpoint değerleri, ilk farklılıklar sağlıklı ve hastalıklı hayvanlar arasında immün hücre sayılarında var olup olmadığını belirlemek için karşılaştırıldı. Lenfosit oranı (NLR) için monositler, nötrofiller ve nötrofil artış göstermiştir sağlıklı farelere kıyasla, toplam lenfositler, CD4 + T hücreleri, B lenfositler ve NK hücreleri son noktada II-45 implante edilmiş farelerde azalmıştır.
Ayrıca böylece hastalığın ilerlemesi ile değişti ve bu immün hücre parametreleri f taşıyıcı belirteç olarak kullanılabilir olup olmadığını belirlemek içinya da hastalığının izlenmesi uzunlamasına örnekleri de (Şekil 7) karşılaştırıldı. En bilgilendirici boyuna parametre etik uç noktalar (Şekil 7A) 7 gün öncesine kadar tespit edilen artışlar ile NLR oldu. Düşük doz hücreleri ile fareler için NLR gün 18 ve 22 toplam lenfosit sayıları ile artmaya başladı ise yüksek doz hücreleri ile sıçanlarda, yüksek NLR'ler, gün 7 ve gün 12 implantasyon sonrası arasında tespit edildi, bir ile sıçanlarda hastalığın ilerlemesi azalmaktadır uzun hastalık süresi ders modeli (düşük hücre dozu: 1 x10 4, Şekil 7B). Bu azalma hızlı bir zamanla ile sıçanlarda belirgin değildi (yüksek hücre doz: 5 x10 5). Fena halde arttı sayıları genellikle (Şekil 7C) gözlendi zaman monositler, terminal koleksiyon kadar normal seviyelerde kalmıştır. Diğer immün hücre sayımı (nötrofiller, NK, B hücre ve CD4 ve CD8 T hücreleri) daha değişken ve bu yüzden daha az bilgilendirici.
Şekil 1. Deneysel işlemin akış şeması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Konum ve implantasyon bir site. Sıçan ilk sırtında yerleştirilir ve sağ regio costalis (göğüs) alan kürk çıkarmak için traş, anestezi. Sağ tarafta, üstten 2. nipeli tanımlanır ve enjeksiyon yeri göğüs kafesi (A) 'nın tabanından 3 ve 4. kaburga arasına, bu 0,5 cm yakın yerleştirilir. Bir boşluk sonra plevra içine çok derin nüfuz iğne önlemek için hazırlanan iğne ve şırınga üzerine yerleştirilir kavite ve hücreleri veya SOY 100 ul (B) enjekte edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. kuyruk kan toplamak için Örnekleme tekniği. Yanal ven (A) bir 23G x 1 ¼ iğne paralel yerleştirin. Sığ bir açıyla yaklaşık 10 mm derinliğinde damar içine iğne kaydırın ve kan görünür (B) olana kadar iğneyi çıkarın, birkaç saniye orada tutun. Bir pipet (C) kullanarak kan toplayın. Gerekirse hafifçe inme kuyruk ven kan akmaya devam sağlamaktır. Eğer pıhtılaşmasını önlemek için gitmek gibi bir 0.5 ml EDTA toplama tüpüne (D) içine pipet kan, karıştırma. arge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. akış sitometrik analiz için mutlak bir sayıcı tüp kan numunesinin Etiketleme. Blood (25 uL) ve antikorların mutlak sayıcı tüp (A) ilave edilir. Tüp daha sonra vortekslendi ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. Amonyum klorür tampon ilavesi, kırmızı kan hücreleri lize etmek için önce, örnek bulanık veya opak (B) belirir. Lize sonra, numune saydam görünür ve analizi (C) flow sitometri için hazırdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
es / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
Şekil akış sitometri analizi 5. Ayırıcı stratejisi. Bir 6-boyutlu bir veri seti lenfositler, monositler ve nötrofillerin ve lenfosit alt kümeleri T CD4 T ve CD8 T, B ve NK hücreleri tespit edebilirsiniz. Tanımlanmış yolluk strateji ve algoritmalar belirli kimlik sağlayan her hücre tipini tanımlamak hem negatif ve pozitif reaktivite dahil. (Her bir tüp için kese üzerinde bulunan), her Mutlak sayım tüp içinde tanelerin sayısı, her bir örnek için tespit edilir ve gösterildiği üzere her alt-grup için kan ul başına hücre sayısını hesaplamak için gereklidir. Her hücre alt kümesi için tam yolluk algoritma analizi araziler sağında yer almaktadır. (Ai) Boncuk (R1) başlangıçta APC karşı FITC (FL-1) (FL-4) tarafından sayılır. Toplama yaklaşık 10.000 olaylar (Bu örnekte 9960) olarak ayarlanır. (Aii) Enkaz (R2) sonraki tüm g SSC karşı FSC tarafından belirlenen ve çıkarıldığındaating. (Bi) enkaz izlenerek çıkarılması SSC karşı (R2) FSC lenfositler (R3), monositler (R4) ve nötrofillerin (R5) içine beyaz kan hücre popülasyonunu ayırır. (BII) (Bi) tanımlanan hücre popülasyonları kullanılarak teyit edilmiştir SSC karşı PE / Cy7 (FL-3) ortak lökosit antijen CD45 yolluk. (BIII) lenfosit popülasyonu (R3) ayrıca SSC karşı APC (FL-4) üzerine CD3 yolluk kullanarak T hücrelerinin (R6) ayrışmıştır. ( (BIV) CD8 T hücreleri) (. B hücreleri Ci da CD8a (R9 ifade) ve SSC karşı PE (FL-2) üzerinde Geçitli T hücresi (R6) ayrışmıştır lenfositler (R3) ve NK hücreleri lenfositler olarak tanımlanır CD3 negatif R3). Bunlar CD45RA ifade ve FITC (FL-1). (Cn) CD4 T hücreleri lenfositleri (R3) gibi tanımlanmıştır karşı APC (FL-4) ile birlikte yan yana açık CD3 kapılı gibi B hücreleri (R7) NK hücreleri ayrılırlar (T hücreleri, R6) veCD4 (R8), fakat kullanılan diğer markörlerin bir ifade yoktur. Onlar PE karşı FITC (FL-1) (FL-2) yolluk kullanılarak ayrılır. NK hücreleri de CD161a. Ifade önceden tanımlanmış henüz kalan lenfosit olarak tanımlanan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
II-45 mezotelyoma hücrelerin farklı dozları ile implante sıçanlar için Şekil 6. hayatta kalma eğrisi. Sıçan grupları pleurally implante edildi, 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2), veya 1 x 10 2 (n = 4), II-45 mezotelyoma hücreler 100 uL hacim içinde ve daha sonra kurban edilmiştir etik uç kadar izlenir. Survival log-rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon yöntemi kullanılarak grafikle edildi. p>
Boyuna sağlıklı kontrol sıçanlar için ortalama ve dizi mezotelyoma akrabası olan sıçanların immün hücre sayımları, dolaşımdaki. Sağlıklı kontrol her hücre tipi için ortalama rakam 7. değeri sağ Y ekseni üzerinde gösterilir (yatay kesintisiz siyah bir çizgi olarak gösterilir Her grafik) ve aralık gri gölgeli alanda tarafından tasvir edilmiştir. Y ekseni Belirtilen hücre tipi veya NLR için değer kan ul başına sayıları gösterir. X ekseni gün 0 implantasyon günüdür hastalığın ilerlemesinin, zaman derstir. 5 x 10 5 hücre (C, D) 'da gösterilmiştir implante 1 x 10 4 hücreleri (A, B) ve 2 sıçan implante 2 sıçanlar için uzunlamasına sonuçlar (A). NLR, (B) toplam lenfosit sayımları, (C) monosit sayıları.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Detektör | Fluorofor | Detaylar | Gerilim | Kip |
| FSC | --- | --- | E00 | Doğrusal |
| SSC | --- | --- | 450 | Doğrusal |
| FL-1 | FITC | 533/30 nm | 670 | Giriş |
| FL-2 | PE | 585/40 nm | 675 | Giriş |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670nm (uzun bir pas) | 600 | Giriş |
| FL-4 | APC | 675/25 nm | 735 | Giriş |
Tablo 1: Akış sito için Voltaj detektörü ayarları4 renk akış sitometresini metrik veri toplama. Genlik kazanç tüm dedektörleri için 1 olarak belirlenmiştir. FSC: İleri dağılım, SSC: yan dağılım, FITC: Floresein isothyocyanante, PE: Fikoeritrin APC: Allophycocyanine.
| Hücre alt kümesi | Hücre İşaretleyiciler | Ayırıcı Algoritması |
| Boncuk | R1 | |
| Enkaz | R2 | |
| Hücreler (pan-lökositler) | CD45 + | -R2 |
| Lenfositler | SSC karşı CD45 + FSC | R3 * -R2 |
| Monositler | SSC karşı CD45 + FSC | R4 * -R2 |
| Nötrofiller | SSC karşı CD45 + FSC | R5 * -R2 |
| T hücreleri (toplam) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| CD8 pozitif T cells | CD45 + / CD3 + / + CD8a | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| B hücreleri | CD45 + / CD3 / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| CD4 pozitif T hücreleri | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 * R3, * - (R7 * R3 * -R2) |
| Doğal Katil hücreler, | CD45 + / CD3 / CD161a + | R3, * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)] |
Tablo 2: Hücre işaretleri ve yolluk algoritmaları her bağışıklık hücre alt kümesini tanımlamak için yolluk algoritması için '+' sembolü anlamına gelen 'ya da' iki ayrı nüfusları tepkiler örtüşmeyen bile birbirine eklenecek sağlar.. '-' Sembolü 'değil' anlamına ve başka tanımlanmış nüfus ya da daha önce açıklanan nüfus ters içinden tek nüfusu çıkarabilirsiniz. '*' Sembolü anlamına 've' iki reaksiyonları örtüşüyor sadece mevcut bir alanı tanımlar.
Tablo 3:., Kan, ul başına sağlıklı kontrol farelerinde ortalama ve immün hücre aralığı (n = 5) ve II-45 implante edilmiş sıçanlar uç nokta (n = 4) sonuçları gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda plevral mezotelyoma bir sıçan singenik ortotopik model ve boyuna kan örneklemesi yoluyla hastalığın ilerlemesini izlemek için basit bir yöntem oluşturulması için bir yöntem ayrıntıları.
II-45 modeli asbest liflerine 13 Fischer 344 fareleri açığa tarafından geliştirilmiştir. Bu poz mezotelyoma patogenezinde konak-asbest bağışıklık sistemi etkileşimlerinin gerçek dinamiklerini temsil rağmen, uzun bir gecikme süresi (üretmek için yıllar alarak) nedeniyle asbest liflerine maruz kalma potansiyeli araştırmacılar için tehlikeli olabilir sahiptir. Hayvanların plevra boşluğuna II-45 hücrelerinin Ortotopik implantasyonu bir bağışıklık yetkili konak 11 insan hastalığı taklit kanser ilerleme güvenli ve hızlı bir model sağlar. Ancak kesin usul ve esaslar bu deneysel prosedürler iyi tanımlanmış değildir sırasında uymaları. Prosedür rela bir yüksek tekrarlanabilir model sonuçları açıklananoperatörün tecrübesi tif bağımsız. Kritik adımlar 1 üstel büyüme fazında ve canlı hücrelerin doğru sayma, hasat II-45 hücreleri; 2 doğru implantasyon sitenin konumlandırma ve bakımını ve hayvanların refahını izleme, çok derinden nüfuz ve akciğerleri delinme veya kalbe zarar ve 3 değil iğne sağlanması.
II-45 hücre çizgisi, hızlı implantasyon için hazırlanırken, bu nedenle, hücre alt-kültür olmalıdır ve büyüme günlük olarak izlenmiş büyüyen ve kültür, 3 ila 4 gün pasaj gerektirir. Hücreler, yaklaşık% 70 birleştiği, yani, hasat edilmiş ve ne zaman üslü büyüme fazında sayılmalıdır. Sayma ve implante edilmesi için hazırlık sırasında yerine PBS daha sonra serumsuz ortamdaki hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmesinden hücreleri üzerinde stresi azaltır. Doğru hücre sayımları özellikle düşük hücre sayıları (örneğin, 100 1.000'e) ile dozlama sırasında, tekrarlanabilir için çok önemlidir. SusEmeklilik homojen ve tek hücre (hayır kümeleri) oluşmalıdır. 100 ul bir implantasyon hacmi plevra boşluğunda aşırı sıvı yoluyla akciğer genişleme bozmadan doğru dozlama sağlar. Implantasyonunda önemli işlemler doğru konumlandırılması ve en fazla 12 mm kadar bir derinliğe kadar iğne penetrasyonu sınırlayıcı değildir. Enjeksiyon yerinde iğne doğru konumlandırılması hücreleri plevral boşluğuna olup periton boşluğuna implant sağlamak için son derece önemlidir. Yanlış karaciğer ve periton boşluğuna, diyafram üzerinden büyüyen mezotelyoma tümörlerde neden olabilir Çok düşük hücrelerin implante. Iğne penetrasyon derinliğini kısıtlayan iç organ hasarı sonucu mortaliteyi önlemek için de son derece önemlidir. Bu kısıtlama, (gösterildiği gibi) uzun bir iğne ya da 12 mm, 5 mm bir şaft uzunluğu ile kısa bir iğne kullanımı üzerinde bir aralayıcı kullanımı yoluyla elde edilebilir. Bizim ellerde, hiçbir advers olaylar meydana gelmiştirHücre implantasyonu sırasında. Her implantasyonu sonrası iğneyi yerine de esastır. Bunu yapmamak enjeksiyon hattı boyunca göğüs boşluğunun dışında büyüyen tümörlerde neden olabilir. Plevral boşluğun dışında Bu büyüme, iğne şaftı üzerinde kalan hücreler nedeniyle ve uzayan yaşamda kalma ile sonuçlanabilir.
≥ 1 x 10 3 hücre uygulanırken elimizde bu model% 100 tümör melezleme oranına sahiptir. II-45 mezotelyoma modelinde hastalık ilerlemesi 1 x 10 4 hücreleri 5 x 10 5 hücre bir doz için en az 20 gün ve implante edildiğinde en az 40 gün olmak oldukça hızlıdır. Bu, bazı tedavilerin klinik öncesi testleri için, bu modelin faydasını sınırlar. II-45 hücreleri, süre piyasada mevcut değil yaratıcısı 13 izni ile kaynaklı olabilir. Bununla birlikte, aynı yerleştirme teknikleri ve prensipleri de hücre çizgisi repolarının temin edilebilen diğer sıçan mezotelyoma hücre çizgileri tatbik edilebiliritories ilgili singenik sıçan suşları ile eşleşti zaman. Uygun hücre miktarı, hücre hattı ile değişebilir ve her çizgi için tespit edilmesi gerekir.
Hastalığın ilerlemesini ve hayvanların refahını İzleme tümörler, iç ve boyutuna göre takip edilemez zordur. Fiziksel belirtiler görünür hale önce Dolayısıyla böyle NLR veya immün hücre belirteçleri diğer değişim bir artış olarak durumun bozulmasını tahmin olabilir hayvanların izlenmesi için bir yöntem geliştirmeye çalıştılar. Düzenli örnekleme hayvana en az sıkıntı ile yapılabilir ve böylece geliştirilen kan ekranı periferik kandan sadece 25 ul kullanır. Açıklanan örnekleme tekniği gerekli uzmanlık kazanmak için pratik gerektirir. Ancak, bir kez hızlı ve minimal invaziv bir hakim.
Kan analizinde kritik bir safha, bir EDTA tüpüne hızlı bir şekilde aktarılmasını kan örneğinin pıhtılaşmasını önlemek içindir. Pıhtılaşmış numunelersayımlar yanlış olacak gibi atılmalıdır. Başka kritik bir adım hücre analizi öncesinde eritrosit lizis olduğunu. Kırmızı hücreler tamamen parçalanmış değilseniz, artan fon yanlış sayılarını yükseltmek olacaktır. Nokta araziler ve yolluk ilk kurulum süresi tüketen iken ayarları ve şablon kaydedilir kez, tahlil küçük ayarlanması gerekir. Kullanılan yolluk strateji verilerini deconvolute için çok parametreli Boole cebirsel yaklaşım kullanır. Özel bilinen kombinasyonları kullanarak ve paylaşılan bu rasyometrik boncuk tabanlı teknoloji 15-17 kurulan doğruluğu ile birleştiğinde bir avantaja sahiptir. Bu altı boyutlu karekod 14 ayrı hücre tipini tanımlamak kapı stratejisi her satırından algoritmaları antijenleri hücrelerin bir bölümü ve ul başına mutlak sayısı, hem herhangi bir belirli hücre tipi numaralandırılmasına etkinleştirme.
Giderek bağışıklık sistemi p olduğu olma yolunda hızla ilerliyorkanser 18 patogenezinde önemli bir rol bırakır. Hem malign hücreler ve tümör bağışıklık hücrelerinin bastırılmasına tanıyan ve yok etmek için bağışıklık sisteminin hata kontrol dışı, tümör büyümesinin neden olabilir. Kanser modelleme ve genetik olarak özdeş kanser modellerinde önemli bir avantajdır Dolayısıyla, bir bağışıklık-kompetan tümör mikro dahil kritik husustur. Bunlar, bağışıklık yetkin modeller ksenogeneik model eksiktir tümör büyümesi ve bağışıklık etkileşim için gerçekçi ve klinik olarak anlamlı bir ortam yaratmak.
Yani hastalığın ilerlemesini, lenfosit sayımları, monosit sayıları ve NLR eşlik bu çalışmada belirlenen bağışıklık parametreleri de yoksul insan mezotelyoma modelinin alaka için kanıt sağlama 19-21 prognoz ve kan testi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir . Sunulan modellerde, bağışıklık parametrelerin izlenmesi klinik yarar zekâ arttıh uzun bir zaman ders (düşük dozda) ve daha fazla hastalığın ileriki aşamalarında daha sık örnekleme ile iyileştirilebilir. Bu kağıt mezotelyoma bir model üzerinde odaklanırken, periferik kan örnekleme yoluyla tümör ilerlemesini izlemek için yeteneği tüm Singeneik kanser modelleri için kullanılabilir. Bundan başka, deney aynı zamanda farklı tedavilere immünolojik yanıtı değerlendirmek için de kullanılabilir. Daha önce, bir genetik olarak özdeş glioma modelinde (9L) 22, bir anti-kanser aşısı tedavisine yanıtını izlemek için bu tahlil kullanılmıştır. Bu çalışmada, CD4 ve CD8 T hücreleri, en çok bilgi belirteçler idi. Ayrıca, farklı kemoterapötik 11 dirençli tümörlere immün yanıt olarak tanımlayabilmek için bu tahlil ve II-45 mezotelyoma modelini kullandık. Bu çalışmada, CD8 T hücrelerinin dışındaki tüm parametreler anlamlı farklılık gösterdi. Burada tarif edilen hastalık ilerlemesi sırasında, uzunlamasına izleme kor farklı immün hücre parametrelerinin potansiyelini vurgularsıçanlarda kanser singenik ortotopik modelleme yapılırken kanser progresyonu ve hayvanların refahı ile ilgilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
