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Medicine

II-45同系ラット中皮腫モデルにおける同所移植と末梢免疫細胞の監視

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

免疫適格ラットの胸膜腔にII-45中皮腫細胞の移植による胸膜悪性中皮腫の同所性ラットモデルの生成が示されています。 25μlの血液試料から、これらの動物において7の免疫細胞サブセットを分析するためのフローサイトメトリー方法も記載されています。

Abstract

このようなワクチンおよび免疫チェックポイント阻害剤として癌の免疫ベースの治療に関心の巨大な盛り上がり、一括前臨床試験のための免疫適格同所モデルの必要性を指し、治療応答における腫瘍微小環境の役割の理解を増加これらの新しい治療法の。本論文では、胸膜悪性中皮腫の同所性免疫能のラットモデルを確立する方法を示しています。同所性モデルで監視疾患の進行は、腫瘍の内部の位置によって混乱されます。縦方向に疾患の進行およびこれと他の癌のラットモデルにおける免疫細胞の循環に及ぼす影響を監視するために、単一のチューブは、全血が記載されているだけで25μLを必要とするフローサイトメトリーアッセイ。総リンパ球、単球および好中球、ならびにT細胞サブセット、CD4およびCD8、B細胞およびナチュラルキラー細胞:これは7免疫パラメータの正確な定量化を提供します。別の潜水艦これらのパラメータのETSは、中皮腫モデルにおける疾患の進行をモニタリングするための最大の有用性を有するリンパ球の比率に好中球で、異なる状況やモデルにも有用です。この単一チューブ法を用いて、免疫細胞の循環レベルの分析はまた、免疫系の治療に対する応答をモニターし、治療の成功または失敗を引き起こす根底にあるメカニズムを理解することを助けることができます。

Introduction

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悪性中皮腫(MM)は、膜(中皮)で形質転換された細胞から生じる攻撃的な悪性腫瘍であることライン肺や腹腔、心と内部生殖器官、および肺の空洞または胸膜1,2の最も一般的な原発腫瘍であります。アスベスト繊維への暴露は、全てのMMの80%を占め、およびアスベスト使用の禁止は、ほとんどの西洋諸国で数十年前に導入された一方で、地域社会での広範な使用は、致命的な遺産を残しています。世界保健機関(WHO)は、107,000人が世界的に死亡率が増加し続けると、アスベスト関連疾患から毎年死亡していると推定しています。新しい非職業入射波も浮上している、これは3のピークを迎えたとき、どのようなレベルでのほとんど理解があります。

全身化学療法が唯一の現実的な選択肢4のいずれかを表したとき、MMを持つ人々の大多数は遅く診断されています。最もeffecti化学療法と(シスプラチン5とともにペメトレキセド)現在の「標準治療」をVEのは、10年以上前に同定されました。しかし、この治療の失敗は避けられないと何の実績のある二行目のオプションは、12ヶ月の2の厳しい予後や生存期間の中央値の患者を残して、ありません。したがって、より効果的な治療が緊急に満たされていない必要性が存在します。臨床試験なしでの新しい治療法の数の検査にもかかわらず、実際に変化をもたらしました。これは、一般に、臨床的設定6-8に、異種移植マウスモデルにおいて行わ前臨床結果の低い(5%)転移に一部起因します。このようなモデルを忠実にしばしば機能する免疫系9の非存在下で、非生理的な場所で発生する腫瘍微小環境の複雑な側面を再現しません。

同系同所モデルはCよりもかなり現実的な腫瘍環境を作成します腫瘍が無傷の免疫系10,11で正しい生理場所で起こるようommonly皮下異種移植モデルを使用していました。ラットの大きなサイズは、特にシリアル血液は治療応答および毒性12を評価するために必要とされる描画薬物研究において、齧歯類疾患モデルとしての使用を強化します。さらに、疾患の進行をモニタリングすることにより(例えば、胸腔のように)腫瘍の場所に困難であるモデルにおいて、循環中に見出さ因子を用いて疾患の進行をモニターする能力は、非常に魅力的です。免疫コンピテントラットを用いた胸膜中皮腫の同系同所性モデルの生成について説明します。加えて、循環する免疫細胞を測定することにより、胸膜疾患の進行をモニタリングするための簡単​​で、比較的非侵襲性の方法も記載されています。

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Protocol

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動物に関わるすべての手順は、科学的な目的のための動物の管理と使用に関する実践オーストラリアの規範の勧告に従って実施しました。この研究のためのプロトコルは、ロイヤル・ノースショア病院動物実験倫理委員会によって承認されました。女性のフィッシャー344ラット(F344、150〜200グラム)を標準条件(12時間の明/暗サイクルと食料と水を自由に)下カーンズ施設、Kolling研究所で維持しました。

注:すべての実験手順のフローチャート1に示されています

移植用の細胞の調製

  1. RPMI 1640(RPMI)培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充し、標準的な条件で増殖(37°、培養(クロシドライトアスベストの腹膜導入することによって誘導される、またIL-45としても知られる)は、ラット中皮腫II-45細胞株を5%CO 2でC加湿インキュベーター)。 Mainta75cm 2のフラスコに週二回、約1時50分で継代およびサブ培養することによってインチ
  2. 37℃で細胞培養と暖かいアリコートための試薬を準備します。必要な試薬は、10%のFBS、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)および0.5%トリプシン-EDTAを用いて無血清RPMI培地(SFM)、RPMIが含まれます。
  3. 約70〜80%コンフルエンスに移植のための培養細胞。これは、線形成長段階にある保証します。
  4. 、培地を捨て、滅菌PBS 5mlで1回洗浄した後、3 mlの0.5%のトリプシン-EDTAを添加することにより、収穫細胞。
  5. すべての細胞が非接着性になるまで約5分間インキュベーターにフラスコを返します。
  6. 細胞は非付着したら、トリプシンを不活性化するために10%FBSを含むRPMIの3ミリリットルを追加します。 3分間300×gで細胞を収集し、遠心します。
  7. 3分間300×gで再びSFMと遠心の10mlに細胞ペレットを洗浄します。
  8. 上記のようにSFMと遠心の10mlで再び洗浄細胞ペレット。
  9. SFM 10mlに細胞を再懸濁し、血球計または類似の機器を用いて細胞数を実行します。
  10. 100μlを注入する細胞の量を含むように細胞を希釈します。
    注:腫瘍の成長は、100μlの100個の細胞という低用量で実証されているが、標準用量は100μl中500,000個の細胞です。
  11. プライミングおよび針のデッドボリュームによる損失を補償するために余分に移植されるように、ラットの数( すなわち、100μL/ラット)、プラス少なくとも0.5ミリリットルのメディアで十分な細胞を準備します。
  12. 余分なコントロールラット( すなわち、100μL/ラット)、プラス少なくとも0.5ミリリットルに移植する(細胞なし)十分なSFMを準備します。
    注:細胞とSFMが今移植のための準備ができています。彼らは、37 O℃に維持し、生存を維持するために、収穫の2時間内に移植されるべきです。

細胞の生体移植2.

  1. 誘導室へのF344ラット(> 13週齢)を配置し、1.4%イソフルラン吸入(または施設で使用されている方法)を使用して麻酔。ラットは(流れて1.4%イソフルランで)ノーズコーンに室から眠って動きそれであることが表示されたら、(腹ビュー)を上に向け、胸と背中の上に置きます。これは、内部​​の臓器が胸腔から離れて決済することができます。ラットが完全に麻酔をかけていることを確認するために制度的プロトコルに従って反射神経をチェックしてください。
  2. 毛皮を除去する権利レジオの肋骨(胸)の領域を剃ります。
  3. 80%(v / v)のエタノールで剃っエリアを清掃してください。
  4. 注射部位を特定します。右側に、頭蓋を開始する2番目の腺を見つけます。注射部位は、胸郭の尾の端から3番目と4番目の肋骨の間に、この0.5〜センチ近位です。 ( 図2A)。
  5. 静かに再懸濁し、II-45細胞を混ぜます。ゆっくりと1 mlの&に(対照ラットまたはSFM)細胞懸濁液を描きます#160;取り付けられた針のない注射器。針が細胞の描画アップに接続されている場合は、細胞が、針注入ラインに沿って成長するための可能性があります。 23Gのx 1.25針を取り付けます。プライム針と任意の気泡を除去。
  6. 注射器と針がプライミングされると、針軸の上に長さ20mmと直径5mmのスペーサーを配置します。これは、注入中の胸腔内に深く浸透する針を防ぐために使用されます。露出した針の約5mm、12 mmの任意の器官に損傷を与えることなく、リブを貫通するのに十分です。
  7. ゆっくりと、リブの間に針を挿入して血管が(何の血液が注射器に表示されないはずです)、その後、100μlの細胞やSFMを注入パンクチャーされていない保証するために、注射器に戻って描画します。 ( 図2B)。
  8. 針を外し、ゆっくりと胸腔内のセルを広めるために左右にラットをロールバックします。
  9. ケージにラットを置き、回復のために確認してください。目Eラットは、1分以内に起きてもよく、周りに移動を開始する必要があります。
  10. 新しい針を用いて各ラットについて、この手順を繰り返します。同じ針を再利用すると、針の注入ラインに沿って細胞の成長になります。
  11. 毎日の動物の幸福を監視します。
  12. 制度的動物倫理委員会によって支配されるよう倫理的に定義されたエンドポイントで、動物を安楽死させます。これらの実験におけるラットについての倫理的エンドポイントは、10%以上、又は呼吸困難の体重減少でした。

3.尾静脈採血

  1. 血液はすぐに後細胞移植を収集する場合は、麻酔したラットを保ちます。別の時点で血液をサンプリングした場合、1.4%イソフルラン吸入を用いてラットを麻酔。ラットが完全に麻酔をかけていることを確認するために制度的プロトコルに従って反射神経をチェックしてください。
  2. その側にラットを置き、外側尾静脈を探します。
  3. 80%エタノールで尾部を消毒し、0.5 mlのEDTA cをラベル付けollectionチューブ。
  4. 血液を収集するには、常に(沿った道の約3分の1)、尾の尾方端から始まります。これは最初の試みが失敗した場合の尾の頭蓋最後にさらに試み近づくことができます。これは血液凝固を引き起こすことができるように尾側にリサンプリングすることはありません。
  5. 横静脈に23Gのx 1.25針を平行に配置し、それが約10mm( 図3A)を貫通するように浅い角度で静脈の中にスライドさせます。
  6. 注意:静脈が正常にパンクしてきた場合、血液が針( 図3B)の取り付け端に表示されます。
  7. 一滴の血液は、針穿刺部位の尾に形成することになります。ラベル0.5ミリリットル(以下)のEDTA収集チューブにピペットと転送を使用して、この血液を収集します。免疫細胞アッセイ25μlのに十分です。出血が止まるまでサイトを穿刺する圧力とガーゼを適用します。
  8. PRするために、血液およびEDTAを混合するために血液チューブをフリックイベント凝固。採血と血液凝固を防ぐためにできる限り短く、EDTAと混合の間の時間をおいてください。
  9. 複数のラットから血液を収集する場合、分析まで室温でラックにEDTA-血液サンプルを保存します。コレクションの2時間内のプロセスの血液。

ビーズベースの方法を使用した免疫細胞のプロファイリング4.サンプル調製

注:この単一プラットフォーム方法は、各サンプルのビーズの既知の数を持っている市販の絶対計数管を使用することに依存しています。これらの管は、ビーズを放出する、サンプル調製中に溶解し、凍結乾燥ペレットを含みます。ビーズは、蛍光標識されたビーズ集団に対してゲーティングすることによって、絶対数を算出することができます。

  1. EDTA全血試料は、数分間ゆっくりとロータリーミキサー上に配置することにより十分に混合することを確認します。各サンプルごとに1絶対計数管にラベルを付けます。ビーズを含むペレットは、Tの下に表示されるはずですチューブの底にある彼は、金属製のビーズホルダー。
  2. ラベル絶対計数管にEDTA全血25μlのを転送します。ビーズペレットは、血液の添加時に溶解します。
  3. 各チューブに抗ラットT / B /ナチュラルキラー(NK)細胞カクテル20μlの、抗ラットCD8a PE10μlの、抗ラットCD4(ドメイン1)FITC及び抗ラット10μlの10μlのを追加CD45 PE / Cy7の( 図4A)。フルオロフォア 、表1に定義されています。
  4. 抗体および細胞がチューブの底にあり、チューブの側面に貼り付けていない確実にするために遠心チューブに簡単に(300 XG)。渦は、混合し、室温で15分間インキュベートします。
  5. 赤血球を溶解するには、10 mMトリス、0.15Mの塩化アンモニウム緩衝液(pH 7.5)と混合する渦の400μlを添加します。サンプルは半透明で曇りのない( 図4BおよびC)が表示されたときに溶解は完了です。サンプルを溶解しないと、完全な増加につながりますDの背景とフローサイトメトリーで分析するときに誤ってカウントを上昇。

サンプルの5フローサイトメトリーの処理

注意:フローサイトメーター4色に実行します。

  1. 取得モードと、図5に示すように8プロットで新しいテンプレートのソフトウェアを開きます。
  2. 表1に記載されているものに機器の設定を調整し、蛍光ビーズをカウントするゲートR1(APC [FL-4] FITC [FL-1])、 図5Ai)を設定 。他のゲートは、この買収段階で同様に重要ではありませんが、分析のために必要とされます。このプロトコルで使用される絶対計数ビーズは蛍光色素を含み、青のチャネルで最も弱いもののいずれかのチャネルで検出することができます。
  3. 調製した対照血液サンプル、渦を使用して、フローサイトメーター上にロードして、データ収集ゲートを調整することができるので、セットアップモードの低速(12μL/分)で動作します。
  4. 買収に設定しますR1ビーズゲート10,000イベントを収集。
  5. データを記録するフォルダを設定し、取得メニューのファイル番号とラベルサンプルファイルを設定します。
  6. サイトメーター上で分析されるべきサンプルをロードし、メディアに流量を設定します(35μL/分)。同じ流速で各サンプルを実行します。流量が低い(12μL/分)または高(60μL/分)に変化させることが必要になることがありますが、中には、一般的に適切です。このレートでは、各サンプルを10,000ビーズイベントを取得するために、約90〜120秒かかります。
  7. サンプルがロードされるとすると、必ずイベントをR1ビーズゲートに登場されていることを確認するために散布図を見ます。最初は散布図にドリフトを引き起こすサンプル圧力のいくつかの不安定性がある場合もあります。これが安定するのを待ちます。
  8. 安定したら、取得をクリックして、サンプルを実行することができます。サイトメーターサイトメーターを取得停止し、すべてのデータが保存され、R1 10,000ビーズイベントを取得完了したら。
  9. サンプルを削除し、TUを流す捨てますこと。サイトメーターは現在、次のサンプルの準備ができています。すべてのサンプルを実行してから、分析モードに進みます。

前記免疫細胞分析

注:ゲーティング戦略とブール代数は、各細胞集団を定義するために使用されます。ブール代数は、単一の定義に複数の操作を可能にするロジックベースの分析方法です。フローサイトメーター例えば、BD CellQuestソフト)の解析ソフトウェアは、ブール代数の使用を可能にします。方程式は、より具体的に各細胞集団を同定するために、セルを定義するのに役立つ重要な負の反応のために積極的に考慮するために使用されます。 「領域」は「ゲート」を定義するために使用されます。 ( - 、 表2に定義された+、*、)ゲートは代数演算子で接続多数の領域から構成することができ、一方の領域は、2次元空間を定義します。

  1. 分析モードにソフトウェアを切り替えます。分析テンプレートが一致するように生成されるべきです
  2. 個別に個々のファイル( すなわち、それぞれの個々のサンプル)を分析します。 表2で定義されるように設定し、ゲートR1 R9を介して、その後に(また、図5に示されている)は、各細胞型のためのアルゴリズムを設定します。
  3. ゲートとアルゴリズム( 表2および図5)で定義された個々の細胞集団を計算するために、セルの統計カウンタを使用してください。アルゴリズムは、セル統計カウンタに自動的に細胞数を調整します。
  4. 以下の式を使用して、細胞サブセットを計算します。
    式(1)
    注:細胞計数事象の数例えば、CD4 T細胞のイベント)は、血液1μl当たりの細胞数を得るために上記の式を使用して列挙されています。例としては、 図5に示されています。

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Representative Results

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II-45細胞を用いた胸膜中皮腫の同所性モデルを生成するために、本論文で使用した方法には、ラットは、注入法のために死んでいないで、再現性と迅速な時間枠内で中皮腫に屈した動物をもたらしました。 1×10 3個の細胞が完全に浸透モデル(100%生着)に必要な最小数であると判断した移植細胞の数の滴定。ラットに移植された細胞の異なる数は、疾患の重症度に影響を与えるように見えることなく、疾患の時間経過を変更しました。 1×10 3を受けた動物、1×10 4〜5×10 5 40日によって倫理的に定義されたエンドポイントに達した細胞、30とそれぞれ20日目(図6)。

血液は、コレクションに関連する観察されなかった合併症で約2倍、毎週ラットから採取しました。これは、全血液量の10%以下に注意することが重要である(または約2 ml)を2週間の期間に収集することができる必要があります。ゲーティング戦略を組み合わせて、ブール代数は、リンパ球、単球および好中球およびリンパ球サブセットT、CD4 + T、CD8 T、BおよびNK細胞を同定するために設立されたフローサイトメトリー分析。各細胞型についての平均および範囲は、対照ラット(n = 5)を、エンドポイントにII-45移植したラットの平均値と範囲と比較した(表3)を用いて確立されました。終点の値は最初の相違が健康と病気の動物の間の免疫細胞数に存在するかどうかを決定するために比較されました。リンパ球比(NLR)への単球、好中球及び好中球が増加したのに対し、健康な対照ラットと比較して、総リンパ球は、CD4 T細胞は、Bリンパ球およびNK細胞は、エンドポイントでのII-45移植したラットにおいて減少しました。

また、このようにして疾患の進行とともに変化し、これらの免疫細胞パラメータをf代理マーカーとして使用することができるかどうかを決定するために又は疾患をモニタリングする、長手方向のサンプル 、( 図7)と比較しました。最も有益な縦パラメータは、倫理的なエンドポイント(図7A)の7日前までに検出された増加にNLRました。低用量細胞とラットのために、NLRは、18日目および22総リンパ球数との間で増加し始めたのに対し、高用量細胞とラットのために、高NLRsは、7日目と12日目移植後の間で検出されたラットにおける疾患の進行に伴って減少し長い病気の時間経過モデル(低細胞用量:1×10 4、 図7B)。この減少は、急速な時間経過とともにラットで明らかではなかった(高細胞投与量:5×10 5)。著しく増加数は、多くの場合(図7C)を観察したときの単球は、ターミナルコレクションまで、通常のレベルで推移しました。他の免疫細胞数(好中球、NK、B細胞およびCD4とCD8 T細胞)が複数の可変ので、あまり有益でした。


図1.実験手順のフローチャートである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.場所と移植部位。ラットはまず、麻酔をかけ、その背中の上に置き、右のレジオの肋骨(胸)エリアは毛皮を除去するために削られています。右側には、上から2 番目の乳首が識別され、注射部位は、胸郭(A)の下から3 番目と4 番目の肋骨の間に、これに0.5センチメートルの近位に位置します。スペーサーは、その後、胸膜に深く浸透する針を防止するために準備された針と注射器の上に配置され、キャビティ及び細胞やSFMの100μlを(B)を注入されている この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3.尾から血液を採取するためのサンプリング技術は 、横静脈(A)に23Gのx 1.25針を平行に配置します。 、浅い角度で約10mm深部静脈に針をスライドさせ、血液が見える(B)があるまで、針を取り外し、数秒のためにそこに保持します。ピペット(C)を用いて血液を採取します。必要に応じて静かにストローク尾静脈に血液が流れ続けるようにします。 0.5ミリリットルのEDTA収集チューブにピペット血液(D)、あなたは凝固を防ぐために行くように混合。 arge.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4のフローサイトメトリー分析のために絶対的な計数管中の血液サンプルの標識血液 (25μL)および抗体は、絶対的な計数管(A)に添加します。次いで、チューブをボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。赤血球を溶解するために塩化アンモニウム緩衝液の添加前に、サンプルは、(B)、混濁又は不透明に見えます。一度溶解し、試料は半透明表示され、フローサイトメトリー分析(C)の準備ができている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ES / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
フローサイトメトリー解析のために、図5のゲーティング戦略。6次元データセットは、リンパ球、単球および好中球およびリンパ球サブセットT、CD4 + T、CD8 T、BおよびNK細胞を同定することができます。定義されたゲーティング戦略とアルゴリズムは、特定の識別を可能とする各細胞型を定義し、負と正の反応の両方を組み込んでいます。 (各管用パウチに見られる)の各絶対カウントチューブ中のビーズの数は、各試料について記録され、図示のように、各サブセットのための血液1μl当たりの細胞数を計算するために必要とされます。各細胞サブセットのための完全なゲーティングアルゴリズムは、解析プロットの右側に表示されている。(愛)ビーズ(R1)最初は、APC(FL-4) に対する FITC(FL-1)でカウントされます。取得が約1万イベント(この例では9960)に設定されている。(AII)デブリ(R2)SSC FSCによって識別され、その後のすべてのグラムから削除されますレーティング(BI)デブリの除去に続いはSSC (R2)FSCは、リンパ球(R3)、単球(R4)と好中球(R5)に白血球細胞集団を区別します。(BII)(バイ)で同定された細胞集団が使用して確認しますSSC PE / Cy7の(FL-3)上の共通白血球抗原CD45ゲーティング。(BIII)リンパ球集団(R3)は、さらに、SSC APC(FL-4)に、CD3ゲーティングを用いたT細胞(R6)に分化されています。( BIV)CD8 T細胞は、リンパ球(R3)は、CD8a(R9)を発現し、SSC に対する PE(FL-2)上でゲーティングされる(R6)T細胞に分化される。(CI)B細胞およびNK細胞は、(リンパ球のように定義されますCD3陰性であるR3)。これらはCD45RAを発現し、FITC(FL-1) に対する APC(FL-4)によってゲートされるB細胞(R7)は、NK細胞から分化されている。(CII)CD4 T細胞は、リンパ球(R3)のように定義される同時発現CD3 (T細胞、R6)とCD4(R8)が、使用される他のマーカーのいずれかを発現しません。これらは、PE(FL-2)ゲートに対する FITC(FL-1)を使用して区別されます。 NK細胞は、すでにもCD161aを発現することが定義されていない残りのリンパ球のように定義されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
II-45中皮腫細胞の異なる用量で注入したラットについては、図6の生存曲線は、ラットのグループはpleurallyを移植した5×10 5(N = 6)、1×10 4(N = 2)、1×10 3( N = 2)、または1×10 2(N = 4)II-45中皮腫細胞を100μLの体積で、 ​​その後、彼らは安楽死させた倫理的なエンドポイントまでモニター。生存は、ログランク(マンテル・コックス)Gehan-ブレスロー - ウィルコクソンの方法を使用してグラフにしました。 P>

図7
水平切れ目のない黒線(値は右Y軸上に示されるように、健康な対照ラットの平均と範囲に中皮腫の相対的でラットから免疫細胞の数を循環図7.縦断。健全なコントロールは各細胞型のための意味が示されています各グラフ)と範囲が灰色の斜線で示されています。 Y軸は述べた細胞型、またはNLRの値のために血液のマイクロリットルあたりのカウント数を示しています。 X軸は、0日目に、移植の日であり、疾患の進行の時間経過です。 1×10 4細胞(A、B)と、5×10 5細胞 (C、D)を移植2匹のラットを移植2ラットについて縦結果を示す。(A)NLR、(B)、総リンパ球数、(C)単球数。ge.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

検波器フルオロフォア細部電圧モード
FSC --- --- E00 直線状の
SSC --- --- 450 直線状の
FL-1 FITC 30分の533 nmの 670 ログイン
FL-2 PE 40分の585 nmの 675 ログイン
FL-3 PE / Cy7の 670nmの(ロングパス) 600 ログイン
FL-4 APC 25分の675 nmの 735 ログイン

表1:フローCYTOための電圧検出器の設定4色フローサイトメーター使用してメトリックデータ収集。振幅ゲインは、全ての検出器の場合は1に設定されています。 FSC:前方散乱、SSC:側方散乱、FITC:フルオレセインisothyocyanante、PE:フィコエリトリン、APC:アロフィコシアニン

細胞サブセット細胞マーカーゲーティングアルゴリズム
ビーズ R1
デブリ R2
細胞(汎白血球) CD45 + -R2
リンパ球 SSC対CD45 + FSC R3 * -R2
単球 SSC対CD45 + FSC R4 * -R2
好中球 SSC対CD45 + FSC R5 * -R2
T細胞(合計) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
CD8陽性T CELLS CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
B細胞 CD45 + / CD3- / CD45RA + R7 * R3 * -R2
CD4陽性T細胞 CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2)
ナチュラルキラー細胞 CD45 + / CD3- / CD161a + R3 * - [(R2 + R6)+(R7 * R3 * -R2)]

表2:細胞マーカーおよびゲーティングのアルゴリズムは、各免疫細胞サブセットを特徴付けるためにゲーティングのアルゴリズムは、「+」記号手段」または「2つの別々の集団は、その反応が重なっていても一緒に追加することを可能にします ' - '記号は「ない」を意味し、別の定義された集団または以前に説明した人口の逆の中から1の人口を引くことができます。 '*'記号は意味 'と'と二つの反応が重なっている場合にのみ存在する空間を規定します。 免疫細胞サブセット対照ラット(n = 5)をエンドポイントでのII-45移植されたラット(N = 4) 意味します域意味します域総リンパ球 165.7 111.5から207.0 97.9 54.4から137.0 CD4 Tリンパ球 72.9 45.4から111.4 38.4 25.6から50.0 CD8 Tリンパ球 36.6 26.0から48.3 32.1 16.1から46 Bリンパ球 56.6 36.0から83.9 24.7 11.2から36.0 NK細胞 9.3 3.1から15.7 4.0 1.34から7.7 単球 27.1 12.7から39.0 373。3 42.4から575.8 好中球 51.4 24.3から87.0 159.2 51.1から366.0 NLR 0.3 0.18から0.42 1.8 0.94から2.66

表3:血液1μl当たりの健常な対照ラットの平均および免疫細胞の範囲(N = 5)、II-45移植したラットでのエンドポイント(N = 4)の結果が示されています。

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Discussion

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本論文では、胸膜中皮腫のラット同系同所モデルと縦採血を介して疾患の進行をモニタリングするための簡単​​な方法を生成するための方法を詳述します。

II-45モデルは、アスベスト繊維13にフィッシャー344ラットを暴露することによって開発されました。この暴露は、中皮腫の病因のためのホスト - アスベストの免疫系の相互作用の真のダイナミクスを表しているが、それは(生成するために年を取って)長い遅延時間を有しており、アスベスト繊維への潜在的なエクスポージャーに起因する研究者のための危険なことができます。動物の胸膜腔へのII-45細胞の同所移植は、免疫適格ホスト 11にヒト疾患を模倣癌の進行の安全かつ迅速なモデルを提供します。しかし、これらの実験手順の間に付着する正確な方法と原則は十分に定義されていません。手順はRELAで再現性の高いモデルで結果を説明しましたオペレータの経験のtively独立しました。重要なステップは、指数増殖期および生存細胞の正確なカウントで1、収穫II-45細胞です。 2、移植部位の正確な位置決めと針を確保するには、維持し、動物の幸福を監視し、あまりにも深く浸透し、肺に穴を開けたり、心臓を損傷し、3ません。

II-45細胞株は、急速に成長し、文化の中で3〜4日ごとに継代する必要、移植のために準備するとき、したがって、細胞は継代培養し、成長を毎日監視する必要がありますされています。細胞は、約70%のコンフルエンス、すなわち 、収穫したときに、指数増殖期のカウントされるべきです。カウントし、移植のために準備している間、無血清培地中の細胞の再懸濁ではなく、PBSは、細胞へのストレスを軽減します。正確な細胞数は、特に低細胞数例えば、100〜1000)の投与時に、再現性のために重要です。 SUS年金は、均質であることと、単一細胞(無塊)で構成する必要があります。 100μLの注入量は、胸膜腔に過度の流体を通って肺の拡張を損なうことなく、正確な投与を可能にします。移植で重要なステップは、正確な位置決めと超えない12mmの深さに針貫通を制限しています。注射部位での針の正確な位置決めは、細胞が胸腔内にはなく、腹腔内に注入されることを確実にするために極めて重要です。誤って肝臓や腹腔内に、ダイヤフラムを介して成長中皮腫の腫瘍をもたらす可能性が低すぎると細胞を移植します。ニードルの侵入深さを制限する内部器官の損傷の結果として死亡を防ぐためにも極めて重要です。この制限は、長い針(図示のように)、または12ミリメートル5mmの軸長の短い針の使用上のスペーサの使用を介して達成することができます。私たちの手では、有害事象は発生していません細胞注入時。これはすべての移植後、針を交換することも不可欠です。これを怠ると、注入ラインに沿って胸腔外に増殖する腫瘍になることがあります。胸膜腔の外側のような成長は、針軸上の残留細胞によるもので、拡張された生存をもたらす可能性があります。

≥1×10 3個の細胞を投与する場合、私たちの手で、このモデルは、100%の腫瘍生着率を有します。 II-45中皮腫モデルにおける疾患の進行は、1×10 4細胞を5×10 5細胞の用量のために20日以内に移植されたときに40日未満であること、非常に迅速です。これは、いくつかの治療法の前臨床試験のためのこのモデルの有用性を制限することができます。 II-45細胞は、しばらく市販されていないが、発信元13から許可を得て調達することができます。しかし、同じ注入技術と原理は、細胞株のリポジトリから利用可能な他のラット中皮腫細胞株に適用することができます関連同系ラット系統と一致itories。最適な細胞量は、細胞株に応じて変化することができ、各ラインについて決定される必要があります。

腫瘍は内部であり、大きさによって監視することができないように、疾患の進行及び動物の健康を監視することは困難です。そこで我々は、物理的な症状が見えるようになった前に、免疫細胞マーカーで、そのようなNLRの増加または他の変化として彼らの状態の悪化を予測できる動物を監視する方法を開発しようとしました。定期的なサンプリングを動物に最小限の苦痛を行うことができるように開発された血液の画面には、末梢血のわずか25μLを使用しています。説明サンプリング技術は、必要な専門知識を得るために練習が必要です。しかし、一度それは、高速かつ低侵襲性で習得。

血液分析における重要なステップは、EDTAチューブに迅速な移動により血液試料の凝固を防止するためです。凝固したサンプルカウントが不正確になりますように破棄されるべきです。別の重要なステップは、細胞分析の前に、赤血球溶解です。赤血球が完全に溶解されていない場合は、増加した背景には、誤ってカウントを高めます。ドットプロットとゲーティングの初期設定は時間がかかりますが設定、テンプレートが保存された後、アッセイは少し調整が必要です。採用ゲーティング戦略は、データをデコンボリューションするためにマルチパラメータブール代数アプローチを採用しています。排他的、共有の既知の組合せを使用することにより、ゲート戦略の各ラインのためのアルゴリズムは、レシオメトリックビーズベースの技術15-17の確立された精度と相まってこれは利点を有するこの6次元データマトリックス14に個別の細胞タイプを定義抗原細胞の割合と1μl当たり絶対数の両方として定義された任意の細胞型の列挙を可能にします。

これは、ますます免疫系のpと認識されてきています癌18の病因において重要な役割を産みます。腫瘍による悪性細胞を認識し破壊する免疫系の障害や免疫細胞の抑制の両方が制御されていない腫瘍の成長につながることができます。このように、免疫能の腫瘍微小環境を含めることは、癌をモデル化する際の重要な考慮事項であると同系癌モデルの主要な利点です。これらの免疫能のモデルは、異種モデルで欠損した腫瘍の増殖および免疫相互作用のための現実的かつ臨床的に関連する環境を作成します。

疾患の進行を伴う、本研究で同定さ免疫パラメーター、 すなわち、リンパ球数、単球数とNLRは、また、19-21、モデルの妥当性と血液検査の証拠を提供するヒト中皮腫において予後不良と相関することが示されています。提示されたモデルでは、免疫パラメータを監視するの臨床的有用​​性は、ウィットを増加しました時間より長い時間経過(低用量)とは、さらに、疾患の後期段階において、より頻繁にサンプリングすることによって改善することができます。この論文では、中皮腫のモデルに焦点を当てているが、末梢血採取を介して腫瘍の進行を監視する能力は、すべての同系腫瘍モデルのために利用することができます。さらに、アッセイはまた、別の治療に対する免疫学的応答を評価することができます。以前に我々は、神経膠腫の同系モデル(9L)中の22の抗癌ワクチン療法に対する応答をモニターするために、このアッセイを使用しています。その研究では、CD4およびCD8 T細胞が最も有益なマーカーでした。また、別の化学療法剤11への耐性腫瘍に対する免疫応答の違いを識別するために、このアッセイおよびII-45中皮腫モデルを使用しています。その研究では、CD8 T細胞を除くすべてのパラメータは、有意な差を示しました。ここに記載の疾患の進行の間の長手方向の監視がCORに異なる免疫細胞パラメータの可能性を強調しラットにおける癌の同系同所モデリングを行う際、癌の進行や動物の幸福と関連しています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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II-45同系ラット中皮腫モデルにおける同所移植と末梢免疫細胞の監視
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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