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Medicine

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

Die Erzeugung eines orthotopischen Rattenmodell der pleuralen malignes Mesotheliom durch Implantation von II-45 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle von immunkompetenten Ratten dargestellt. Eine durchflusszytometrische Verfahren zu sieben Immunzelluntergruppen in diesen Tieren aus einem 25 & mgr; l Blutprobe zu analysieren, wird ebenfalls beschrieben.

Abstract

Die enorme Zunahme des Interesses an immun-basierte Behandlungsmethoden für Krebs wie Impfstoffe und Immun Checkpoint-Inhibitoren und einem besseren Verständnis der Rolle der Tumor-Mikroumgebung in Ansprechen auf die Behandlung, die gemeinsam auf den Bedarf an immunkompetenten orthotopen Modelle zur präklinischen Versuchsreihen zeigen dieser neuen Therapien. Dieses Papier zeigt, wie Sie eine orthotope immunkompetenten Ratten-Modell von Pleura malignen Mesotheliom zu etablieren. Verlaufskontrolle in orthotopische Modell wird durch die interne Anordnung der Tumoren confounded. In Längsfortschreiten der Krankheit und ihre Wirkung auf zirkulierende Immunzellen in dieser und anderen Rattenmodellen von Krebs zu überwachen, ein einziges Rohr Durchflusscytometrieassay erfordert nur 25 ul Vollblut beschrieben. Dies stellt eine genaue Quantifizierung von sieben Immunparameter: Gesamt Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile, sowie die T-Zell-Untergruppen CD4- und CD8, B-Zellen und natürliche Killerzellen. Verschiedene U-Booteets dieser Parameter sind nützlich bei verschiedenen Umständen und Modelle mit Neutrophilen Lymphozytenverhältnis mit dem größten Nutzen für die Überwachung der Progression der Erkrankung in der Mesotheliom Modell. Analysieren zirkulierenden Immunzellen Ebenen mit diesem einzigen Röhre Verfahren kann auch bei der Überwachung der Reaktion auf immunbasierten Behandlungen und das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, die den Erfolg oder Misserfolg der Behandlung zu unterstützen.

Introduction

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Malignes Mesotheliom (MM) ist eine aggressive Krebserkrankung, die aus transformierten Zellen in der Membran (Mesothel) entsteht, die Linien der Lunge und der Bauchhöhle, des Herzens und inneren Geschlechtsorgane, und ist die häufigste primäre Tumor der Lunge Hohlraum oder Pleura 1,2 . Die Exposition gegenüber Asbestfasern einen Anteil von 80% der MM, und während Verbote Asbest Verwendung wurden vor Jahrzehnten in den meisten westlichen Ländern eingeführt wurde, hat seine weit verbreitete Verwendung in der Gemeinschaft ein tödliches Erbe hinterlassen. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass 107.000 Menschen weltweit sterben jedes Jahr an asbestbedingten Krankheiten, mit Sterblichkeit weiter zu. Eine neue Nichtberufseinfallswelle wird auch Schwellen- und gibt es wenig Verständnis bei, und auf welcher Ebene dies 3 Höhepunkt erreichen.

Die Mehrheit der Menschen mit MM spät diagnostiziert, wenn eine systemische Chemotherapie ist eine der einzige praktikable Möglichkeiten 4. Die effective Chemotherapie und aktuelle "Standardtherapie" (zusammen mit Cisplatin 5 Pemetrexed) wurde vor über 10 Jahren identifiziert. Allerdings Scheitern dieser Behandlung ist unvermeidlich, und es gibt keine bewährten zweiten Zeilenoptionen, so dass Patienten mit einem grimmigen Prognose und mediane Überlebenszeit von nur 12 Monate 2. Daher besteht ein dringender ungedeckten Bedarf nach effektiveren Behandlungen. Trotz der Untersuchung einer Reihe von neuartigen Therapien in klinischen Versuchen keine entsprechen Veränderungen in der Praxis geführt. Dies ist zum Teil auf den niedrigen (5%) Übertragung der vorklinischen Ergebnissen, im allgemeinen in Xenotransplantat-Mausmodellen durchgeführt, um die klinische Einstellung 6-8. Solche Modelle nicht getreu rekapitulieren die komplexen Aspekte der Tumor-Mikroumgebung in unphysiologischen Orten auftreten, häufig in Abwesenheit eines funktionierenden Immunsystems 9.

Syngenen orthotopen Modelle schaffen eine deutlich realistischere Tumorumgebung als die commonly verwendet subkutane Xenograft-Modellen als die Tumoren in der korrekten physiologischen Ort mit einem intakten Immunsystem 10,11 erfolgen. Der größere Umfang der Ratte erhöht seine Verwendung als Nagetierkrankheitsmodell, vor allem in der Arzneimittelstudien, in denen serielle Blutabnahmen erforderlich sind, um die Behandlung angesprochen und Toxizität 12 zu bewerten. Ferner ist in Modellen, in dem Verlaufskontrolle schwierig ist aufgrund der Lage der Tumoren (wie zum Beispiel in der Pleurahöhle), die Fähigkeit zur Überwachung Krankheitsprogression über Faktoren im Blutkreislauf gefunden ist äußerst attraktiv. Die Erzeugung eines syngenen orthotopen Modell des Pleuramesotheliom mit immunkompetenten Ratten beschrieben. Darüber hinaus ist eine einfache und relativ nicht-invasive Verfahren zur Überwachung pleuralen Fortschreiten der Krankheit durch Messen zirkulierenden Immunzellen beschrieben.

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Protocol

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Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken durchgeführt. Das Protokoll für diese Studie wurde von der Royal North Shore Hospital Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt. Weiblich Fischer 344 Ratten (F344, 150-200 g) wurden am Kearns Einrichtung gepflegt, Kölling Institute unter Standardbedingungen (12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklen und den freien Zugang zu Nahrung und Wasser).

Hinweis: Ein Flussdiagramm für alle experimentellen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Herstellung von Zellen zur Implantation

  1. Kultur die Ratte Mesotheliom II-45-Zelllinie (auch als IL-45 bekannt, durch peritoneale Einführung von Krokydolith Asbest abgeleitet) in RPMI 1640 (RPMI) Medien mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und wachsen in Standardbedingungen (37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2). Maintain von Passagieren und Sub-Kultur bei etwa 01.50 zweimal in der Woche in einem 75 cm 2-Kolben.
  2. Vorbereitung Reagenzien für die Zellkultur und warme Aliquots bei 37 ° C. Erforderlichen Reagenzien umfassen serumfreiem RPMI-Medium (SFM), RPMI mit 10% FBS, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 0,5% Trypsin-EDTA.
  3. Kulturzellen für die Implantation auf etwa 70-80% Konfluenz. Dies gewährleistet, die sie in der linearen Wachstumsphase befinden.
  4. Ernten der Zellen durch Verwerfen der Medien, einmaliges Waschen mit 5 ml steriler PBS und dann Zugabe von 3 ml 0,5% Trypsin-EDTA.
  5. Zurückzukehren Kolben in den Inkubator für ungefähr 5 min, bis alle Zellen sich nicht haft.
  6. Sobald Zellen nicht adhärente, 3 ml RPMI mit 10% FBS, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln und Zentrifuge Zellen bei 300 × g für 3 min.
  7. Waschen Sie das Zellpellet in 10 ml SFM und Zentrifuge wieder bei 300 × g für 3 min.
  8. Wash Zellpellet wieder mit 10 ml SFM und Zentrifuge wie oben.
  9. Resuspendieren der Zellen in 10 ml SFM und führen eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers oder ähnliche Instrumente.
  10. Verdünnte Zellen, so dass 100 & mgr; l der Menge an zu implantierenden Zellen enthält.
    Hinweis: Das Tumorwachstum wurde in einer Dosis von nur 100 Zellen in 100 & mgr; l, aber eine Standarddosis beträgt 500.000 Zellen in 100 & mgr; l nachgewiesen.
  11. Eine ausreichende Zellen in Medien für die Anzahl der Ratten, implantiert werden (dh 100 ul / Ratte), plus mindestens 0,5 ml zusätzliches, um Verluste aus Grundierung und das Totvolumen der Nadel zu kompensieren.
  12. Bereiten Sie ausreichend SFM (ohne Zellen), um in den Kontrollratten (dh 100 & mgr; l / Ratte) implantiert werden, plus mindestens 0,5 ml Kosten.
    Hinweis: Die Zellen und SFM sind nun bereit für die Implantation. Sie sollten bei 37 ° C gelagert und innerhalb von 2 h nach der Ernte implantiert, um die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten.

2. In-vivo-Implantation von Zellen

  1. Setzen Sie den F344-Ratte (> 13 Wochen alt) in die Induktionskammer und betäuben mit 1,4% Isofluran Einatmen (oder das Verfahren im Einsatz in der Anlage). Sobald die Ratte scheint eingeschlafen verschieben Sie es von der Kammer auf einen Nasenkegel (mit 1,4% Isofluran fließt) zu sein, legen Sie es auf seiner Rückseite mit der Brust nach oben (ventral). Dies ermöglicht der inneren Organe von Brustkorb zu regeln. Überprüfen Reflexe nach institutionellen Protokolle, um die Ratte zu gewährleisten ist vollständig betäubt.
  2. Rasieren sich das Recht regio costalis (Brust) Bereich, um den Pelz zu entfernen.
  3. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit 80% v / v Ethanol.
  4. Identifizieren Sie die Injektionsstelle: auf der rechten Seite, finden Sie die 2. Drüse starting Schädel. Die Injektionsstelle ist 0,5 cm proximal dazu, zwischen der 3. und 4. Rippe vom kaudalen Ende des Brustkorbs. (2A).
  5. Vorsichtig mischen die II-45-Zellen zu resuspendieren. Langsam ziehen die Zellsuspension (oder SFM für Kontrollratten) in ein 1 ml &# 160; Spritze ohne Nadel auf. Wenn eine Nadel für die Erstellung von Zellen angebracht gibt es das Potenzial für die Zellen entlang des Nadeleinspritzleitung zu wachsen. Befestigen Sie eine 23G x 1¼ Nadel. Prime die Nadel, und entfernen Sie alle Luftblasen.
  6. Sobald die Spritze und Nadel grundiert sind, legen Sie eine 20 mm lange und 5 mm Durchmesser Distanzstück über den Nadelschaft. Dies wird verwendet, um die Nadel zu tiefes Eindringen in die Pleurahöhle während der Injektion zu verhindern. Ca. 5 mm-12 mm der freiliegende Nadel ist ausreichend für Penetration durch die Rippen ohne Beschädigung keine Organe.
  7. Langsam die Nadel zwischen den Rippen, zurückziehen auf der Spritze, um sicherzustellen, ein Blutgefäß gestochen haben (kein Blut sollte in der Spritze angezeigt) dann spritzen 100 ul Zellen oder SFM. (2B).
  8. Entfernen Sie die Nadel und sanft rollen die Ratte von Seite zu Seite, um Zellen in der Brusthöhle zu verbreiten.
  9. Legen Sie die Ratten in einen Käfig und überprüfen Sie für die Wiederherstellung. The rat sollte wach innerhalb von 1 min und Starten zu bewegen sein.
  10. Wiederholen Sie für jede Ratte mit einer neuen Nadel. Wiederverwendung der gleichen Nadel wird in das Zellwachstum entlang der Einspritzleitung der Nadel führen.
  11. Überwachen Sie das Wohlbefinden der Tiere täglich.
  12. Euthanize Tiere auf ethisch definierten Endpunkten, wie durch die institutionelle Tierethikkommission geregelt. Die ethischen Endpunkte für die Ratten in diesen Experimenten waren Gewichtsverlust von mehr als 10% oder Atemnot.

3. Schwanzvene Blutentnahme

  1. Wenn Blut sofort nach der Zellimplantation gesammelt werden, halten Sie die Ratten betäubt. Wenn Blutentnahme zu einem anderen Zeitpunkt, zu betäuben die Ratten mit 1,4% Isofluran Einatmen. Überprüfen Reflexe nach institutionellen Protokolle, um die Ratte zu gewährleisten ist vollständig betäubt.
  2. Legen Sie die Ratte auf die Seite und suchen Sie eine laterale Schwanzvene.
  3. Sterilisieren Sie den Schwanz mit 80% Ethanol und kennzeichnen einen 0,5 ml EDTA collection Rohr.
  4. Um Blut zu sammeln, immer an der kaudalen Ende des Schwanzes zu starten (etwa ein Drittel des Weges entlang). Hierdurch lassen sich weitere Versuche näher an dem kranialen Ende des Schwanzes, falls der erste Versuch fehlgeschlagen ist. Resample nie kaudal, da dies ein Blutgerinnsel verursachen.
  5. Positionieren Sie eine 23G x 1¼ Nadel parallel zur Seiten Vene und schieben Sie sie in die Vene in einem flachen Winkel, damit es etwa dringt 10 mm (3A).
  6. Hinweis: Wenn die Vene wurde erfolgreich punktiert Blut wird in der Anlage Ende der Nadel (3B) zu sehen sein.
  7. Ein Tropfen Blut wird auf dem Schwanz an der Stelle der Punktion zu bilden. Sammeln Sie diese Blut mit einer Pipette und Transfer in den markierten 0,5 ml (oder kleiner) EDTA Sammelröhrchen. Für die Immunzelltest 25 ul ausreichend. Bewerben Gaze mit Druck, um vor Ort, bis die Blutung aufhört zu punktieren.
  8. Flick das Blutröhrchen, um das Blut und EDTA zu mischen, um prVeranstaltung Blutgerinnung. Halten die Zeit zwischen Blutentnahme und Mischen mit dem EDTA so kurz wie möglich, um ein Gerinnen zu verhindern.
  9. Beim Sammeln von Blut von mehreren Ratten store EDTA-Blutproben in einem Rack bei RT bis zur Analyse. Prozess Blut innerhalb von 2 h der Sammlung.

4. Probenvorbereitung für die Immunzell-Profiling Mit dem Bead-basierte Verfahren

Anmerkung: Diese Plattform Verfahren beruht auf der Verwendung von kommerziell erhältlichen absoluten Zählrohre, die eine bekannte Anzahl von Kügelchen für jede Probe zu haben. Diese Röhren enthalten lyophilisierte Pellets, die während der Probenvorbereitung zu lösen, die Freigabe der Perlen. Die Perlen werden fluoreszenzmarkierte und durch Gating auf dem Beadpopulation können absolute Zählungen berechnet werden.

  1. Stellen Sie sicher, das EDTA Vollblut-Probe ist, indem sie auf eine langsame Rotationsmischer für mehrere min gut gemischt. Beschriften Sie eine absolute Zählrohr für jede Probe. Ein Pellet, das die Kügelchen sollten unter t sichtbar seiner Metallwulst Halter an der Unterseite des Rohres.
  2. Übertragen Sie 25 ul EDTA-Vollblut in ein beschriftetes absolute Zählrohr. Der Wulst Pellet wird nach Zugabe des Blutes zu lösen.
  3. Zu jedem Röhrchen werden 20 ul Anti-Ratten-T / B / Natural Killer (NK) Cocktail wurden 10 ul Anti-Ratten-CD8a PE, 10 ul anti-Ratten-CD4 (Domäne 1) FITC und 10 ul Anti-Ratten CD45 PE / Cy7 (4A). Fluorophore sind in Tabelle 1 definiert.
  4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz (300 × g), um sicherzustellen, dass die Antikörper und Zellen in der Unterseite des Rohres und nicht auf die Seite der Röhre stecken. Vortex mischen und Inkubation für 15 min bei RT.
  5. Lyse der roten Blutzellen werden 400 ul 10 mM Tris, 0,15 M Ammoniumchloridpuffer (pH 7,5) und Vortex gemischt. Lyse abgeschlossen ist, wenn die Probe wird durchlässig und nicht trübe (4B und C). Nichtbeachtung Lyse die Probe vollständig führen wird zunehmend Hintergrund und falsch erhöhten zählt bei der Analyse mittels Durchflusszytometrie.

5. Durchflusszytometrische Verarbeitung von Proben

Hinweis: Führen Sie auf einem Farb 4 Durchflusszytometer.

  1. Öffnen Sie die Software im Erfassungsmodus und eine neue Vorlage mit 8 Parzellen, wie in Abbildung 5 dargestellt.
  2. Anpassen von Geräteeinstellungen mit den in Tabelle 1 aufgelistet sind und bis Gate R1 gesetzt (FITC [FL-1] gegenüber APC [FL-4]), Abbildung 5Ai), um die fluoreszierende Kügelchen zählen. Die anderen Tore sind nicht so wichtig in dieser Erfassungsstufe wird aber für die Analyse erforderlich. Die absolute Zählung mit Beads in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten fluoreszierende Farbstoffe und kann in jedem Kanal erkannt werden, obwohl schwächsten im Blaukanal sind.
  3. Mit Hilfe eines vorbereiteten Steuer Blutprobe, Wirbel und dann auf das Zytometer laden und bei niedriger Geschwindigkeit (12 & mgr; l / min) auf Setup-Modus laufen, so dass die Datenerfassung Gates eingestellt werden kann.
  4. Stellen Sie die Übernahme zusammeln 10.000 Veranstaltungen in der R1-Wulst Tor.
  5. Einen Ordner, um Daten aufzuzeichnen und setzen Dateinummer und Label Beispieldatei in Nahme-Menü eingestellt.
  6. Legen Sie die Probe auf die Durchflusszytometer analysiert werden und stellen Sie die Durchflussrate bis mittel (35 & mgr; l / min). Ausführung jeder Probe bei der gleichen Fließgeschwindigkeit. Die Durchflussmenge muss möglicherweise zu niedrig (12 & mgr; l / min) oder hohe (60 & mgr; l / min) variiert werden, aber im allgemeinen Medium geeignet ist. Bei diesem Tempo etwa 90 bis 120 Sekunden dauert es bis zu 10.000 Wulst Ereignisse für jede Probe zu erwerben.
  7. Sobald die Probe geladen beobachten Sie die Streudiagramme, um sicherzustellen, Ereignisse werden in der R1-Wulst-Gate erscheinen. Ursprünglich es kann einige Instabilität in der Probendruck verursachen Drift der Streudiagramme können. Warten auf diese zu stabilisieren.
  8. Einmal stabilisiert, klicken Sie erwerben und ermöglichen Probe zu laufen. Sobald das Zytometer Erwerb 10.000 Wulst Veranstaltungen in R1 beendet das Zytometer stoppt den Erwerb und speichern Sie alle Daten.
  9. Entfernen Sie die Probe und entsorgen fließen tusein. Das Durchflusszytometer ist nun bereit für die nächste Probe. Führen Sie alle Proben und dann den Analysemodus gehen.

6. Immune Cell Analysis

Hinweis: Gating Strategien und Boolesche Algebra werden verwendet, um jede Zellpopulation zu definieren. Boolesche Algebra ist ein Logik-Analyseverfahren, die für mehrere Operationen in einer einzigen Definition erlaubt. Die Analysesoftware des Durchflusszytometers (zB BD Cellquest) ermöglicht die Verwendung der Booleschen Algebra. Die Gleichungen werden verwendet, um aktiv für die erheblichen negativen Reaktivität, die bei der Definition der Zelle, um genauer zu identifizieren jede Zellpopulation unterstützt Konto. "Regionen" werden verwendet, um ein "Tor" zu definieren. Regionen definieren einen 2-dimensionalen Raum in der Erwägung, Tore können aus zahlreichen Regionen, die von algebraischen Operatoren verbunden zusammengesetzt sein (+, *, -, die in Tabelle 2 definiert ist).

  1. Schalten Sie die Software den Analysemodus. Eine Analyse Vorlage sollte erzeugt werden, um zu entsprechen
  2. Analyse jede einzelne Datei (dh jeder einzelnen Probe) getrennt. Richten Toren R1 bis R9 und dann die Algorithmen für jeden Zelltyp festgelegt, wie in Tabelle 2 definiert ist (auch in 5 gezeigt).
  3. Verwenden Sie den Zellstatistikzähler, um einzelne Zellpopulationen durch Tore und Algorithmen (Tabelle 2 und Abbildung 5) definiert berechnen. Die Algorithmen werden Zellzahlen automatisch in der Zelle Statistikzähler einzustellen.
  4. Berechnen Zell-Untergruppen unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    Gleichung 1
    Hinweis: Die Anzahl der Zellereignisse gezählt wird (zB CD4 T-Zell-Ereignisse) wird unter Verwendung der obigen Gleichung auf die Zellzahl pro Mikroliter Blut zu geben zählt. Beispiele sind in Abbildung 5 dargestellt.

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Representative Results

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Die in dieser Studie für die Erzeugung eines orthotopische Modell Pleuramesothelioms mit II-45-Zellen verwendete Verfahren resultierte in Tieren erliegen Mesotheliom auf reproduzierbare und schnelle Zeitrahmen, wobei keine Ratten sterben aufgrund der Implantationsverfahren. Titration der Anzahl der Zellen bestimmt, dass implantierte 1x 10 3 Zellen war die Mindestanzahl für eine vollständige Penetranz Modell (100% Verpflanzung) nötig. Die unterschiedliche Anzahl von Zellen in den Ratten implantiert verändert die zeitliche Verlauf der Krankheit ohne erscheinen, um die Schwere der Erkrankung zu beeinflussen. Tiere, die mit 1 x 10 3 aufgenommen, 1 x 10 4 und 5 x 10 5 Zellen erreicht ethisch definierten Endpunkten für Tag 40, 30 und Tag 20 jeweils (Abbildung 6).

Blut wurde von Ratten etwa doppelt Jede Woche ohne Komplikationen der Sammlung beobachtet verwandten gesammelt. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht mehr als 10% des gesamten Blutvolumens (bzw.ca. 2 ml) sollten in einem Zeitraum von 2 Wochen gesammelt werden. Eine durchflusszytometrische Assays, die Gating-Strategien kombiniert und Boolesche Algebra wurde gegründet, um Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen und die Lymphozytensubpopulationen T, CD4 T, CD8 T, B und NK-Zellen zu identifizieren. Der Mittelwert und die Palette für jeden Zelltyp wurde mit den Kontrollratten (n = 5) und wurde in den mittleren und den Bereich der II-45-implantierten Ratten Endpunkt verglichen (Tabelle 3) hergestellt. Endpoint-Werte wurden zum ersten Mal im Vergleich zu festzustellen, ob Unterschiede in der Immunzellzahlen zwischen gesunden und kranken Tieren bestand. Im Vergleich zu gesunden Kontrollratten, insgesamt Lymphozyten, CD4-T-Zellen, B-Lymphozyten und NK-Zellen verringerte sich im II-45 implantierten Ratten am Endpunkt in der Erwägung, Monozyten, Neutrophilen und neutrophilen um Lymphozyten-Verhältnis (NLR) erhöht.

Um festzustellen, ob diese Immunzell-Parameter auch mit Fortschreiten der Krankheit verändert und somit könnte als Surrogatmarker f verwendet werdenoder Überwachungs Krankheit wurden Längsproben ebenfalls verglichen (Figur 7). Die aussageLängsParameter war NLR mit Steigerungen bis zu 7 Tage vor ethischen Endpunkte (7A) detektiert. Für Ratten mit hohen Dosen von Zellen wurden hohe NLRs zwischen Tag 7 und Tag 12 nach der Implantation festgestellt, während bei Ratten mit niedrig dosiertem Zellen, begann der NLR zwischen Tag 18 und 22 Gesamtlymphozytenzahlen zu erhöhen nahm mit Fortschreiten der Krankheit bei Ratten mit ein längere krankheitsZeitVerlauf Modell (geringe Zell Dosis: 1 x10 4, 7B). Dieser Rückgang war nicht ersichtlich, bei Ratten mit einer schnellen Zeitverlauf (hohe Zelldosis: 5 x 10 5). Monozyten blieb auf normalem Niveau, bis das Terminal Sammlung, wenn grob erhöhte Zählungen wurden oft beobachtet (7C). Die anderen Immunzellzahlen (Neutrophile, NK, B-Zellen und CD4- und CD8-T-Zellen) wurden mehr variabel und daher weniger informativ.


Abbildung 1. Flussdiagramm der Versuchsdurchführung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Lage und Ort der Implantation. Die Ratte wird zunächst betäubt, auf den Rücken gelegt und der rechte regio costalis (Brust) Bereich wird rasiert, um Fell zu entfernen. Auf der rechten Seite wird der 2. Nippel von oben identifiziert, und die Injektionsstelle wird 0,5 cm proximal hierzu und liegt zwischen dem 3. und 4. Rippe von der Unterseite des Brustkorbs (A). Ein Abstandhalter wird dann auf der vorbereiteten Nadel und Spritze gegeben, um die Nadel zu tiefes Eindringen in den Pleuraraum verhindern Hohlraum und 100 ul Zellen oder SFM eingespritzt wird (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Sampling-Technik zum Sammeln von Blut vom Schwanz. Positionieren Sie eine 23G x 1¼ Nadel parallel zur Seitenader (A). Schieben Sie die Nadel in die Vene in einem flachen Winkel, ca. 10 mm tief, und halten Sie es für ein paar Sekunden, bis das Blut sichtbar ist (B) entfernen Sie dann Nadel. Blutentnahme mit einer Pipette (C). Bei Bedarf sanft berühren Schwanzvene, um sicherzustellen, Blut fließt weiter. Pipette Blut in ein 0,5 ml EDTA-Collection-Tube (D), Mischen, wie Sie gehen, um die Gerinnung zu verhindern. arge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Figur 4. Kennzeichnung Blutprobe in einem absoluten Zählrohr zur durchflusszytometrischen Analyse. Blut (25 ul) und Antikörper, auf ein absolutes Zählrohr (A) zugegeben. Das Rohr wird dann gevortext und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Vor der Zugabe von Ammoniumchlorid-Puffer, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, wird die Probe trübe oder opake (B). Sobald lysiert, wird die Probe durchlässig und ist bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse. Ein 6-dimensionalen Datensatzes können Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen und die Lymphozytensubpopulationen T, CD4 T, CD8 T, B und NK-Zellen zu identifizieren. Die festgelegten Gating-Strategien und Algorithmen integrieren sowohl die negative und positive Reaktivität dass jeder Zelltyp, die eine gezielte Identifikation definieren. Die Zahl der Raupen in jeder absolute Zählrohr (auf dem Beutel für jede Röhre festgestellt) wird für jede Probe aufgezeichnet und zur Berechnung der Anzahl von Zellen pro Mikroliter Blut für jede Teilmenge, wie gezeigt erforderlich. Der komplette Gating Algorithmus für jede Zellenteilsatz ist an der rechten Seite der Analysestücke aufgeführt. (Ai) Beads (R1) werden zunächst von FITC (FL-1) in Abhängigkeit von APC (FL-4) gezählt. Akquisition rund 10.000 Veranstaltungen (9960 in diesem Beispiel) gesetzt. (AII) Debris (R2) wird von FSC gegen SSC identifiziert und von allen späteren g entfernttriebs. (Bi) Nach Entfernung von Debris (R2) FSC gegen SSC unterscheidet Population weißer Blutkörperchen in Lymphozyten (R3), Monozyten (R4) und Neutrophilen (R5). (Bii) der Zellpopulationen in (Bi) identifiziert werden unter Verwendung bestätigte der gemeinsame Leukozyten-Antigen CD45 Gating auf PE / Cy7 (FL-3) gegenüber der SSC. (Biii) Die Lymphozytenpopulation (R3) wird weiter in T-Zellen (R6) mit CD3-Gating auf APC (FL-4) gegenüber der SSC unterschieden. ( BIV) CD8 T-Zellen sind Lymphozyten (R3) in T-Zellen (R6), die auch zum Ausdruck CD8a (R9) und auf PE (FL-2) gegen SSC gated differenziert. (Ci) B-Zellen und NK-Zellen als Lymphozyten definiert ( R3), die CD3 negativ sind. B-Zellen (R7) von NK-Zellen differenziert, wie sie zum Ausdruck bringen CD45RA und werden von APC (FL-4) Gated gegen FITC (FL-1). (CII) CD4-T-Zellen als Lymphozyten (R3) definiert ist, dass die gleichzeitige ausdrückliche CD3 (T-Zellen, R6) undCD4 (R8), aber nicht zum Ausdruck einer der anderen Markern verwendet wird. Sie sind mit FITC (FL-1) in Abhängigkeit von PE (FL-2) Gating differenziert. NK-Zellen sind als alle verbleibenden Lymphozyten, die noch nicht definiert wurde, die auch zum Ausdruck CD161a. Definierten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Figur 6. Lebenskurve für Ratten, die mit verschiedenen Dosen von II-45 Mesotheliomzellen implantiert. Gruppen von Ratten wurden pleurally implantiert 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) oder 1 x 10 2 (n = 4), II-45 Mesotheliomzellen in Volumen von 100 ul und dann bis zum Endpunkt ethischen als sie getötet wurden überwacht. Das Überleben wurde unter Verwendung des Log-Rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon Methode grafisch dargestellt. p>

Figur 7
Abbildung 7. Längs zirkulierenden Immunzellzahlen von Ratten, die mit Mesotheliom relativ zum Mittelwert und Bereich für gesunde Kontrollratten. Die gesunden Kontroll bedeuten für jeden Zelltyp wird als horizontale ununterbrochene schwarze Linie (angezeigte Wert ist auf der rechten Y-Achse dargestellt Jede Grafik) und der Bereich wird durch die grau unterlegten Fläche dargestellt. Die Y-Achse zeigt die Zählungen pro ul Blut zu dem genannten Zellentyp oder dem Wert für NLR. Die X-Achse ist der Zeitverlauf zum Fortschreiten der Krankheit, wobei Tag 0 ist der Tag der Implantation. Längs Ergebnisse für 2 Ratten mit 1 x 10 4 Zellen (A, B) und 2 Ratten mit 5 × 10 5 Zellen (C, D) gezeigt implantiert. (A) NLR, (B) Gesamtlymphozytenzahl, (C) Monozyten zählt.ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Detektor Fluorophor Einzelheiten Spannung Mode
FSC --- --- E00 Linear
SSC --- --- 450 Linear
FL-1 FITC 533/30 nm 670 Log
FL-2 PE 585/40 nm 675 Log
FL-3 PE / Cy7 670nm (Langlauf) 600 Log
FL-4 APC 675/25 nm 735 Log

Tabelle 1: Spannungsdetektor-Einstellungen für Durchfluss Zytometrische Datenerfassung mit einer Farb 4 Durchflusszytometer. Amplitudenverstärkung wird auf 1 für alle Detektoren gesetzt. FSC: Vorwärtsstreuung, SSC: Seitenstreuung, FITC: Fluorescein isothyocyanante, PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanin.

Zell-Untergruppe Zellmarker Gating-Algorithmus
Beads R1
Schutt R2
Zellen (pan-Leukozyten) CD45 + -R2
Lymphozyten CD45 + FSC gegen SSC R3 * -R2
Monozyten CD45 + FSC gegen SSC R4 * -R2
Neutrophile CD45 + FSC gegen SSC R5 * -R2
T-Zellen (gesamt) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
CD8-positiven T-cells CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
B-Zellen CD45 + / CD3- / CD45RA + R7 * R3 * -R2
CD4-positiven T-Zellen CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * R2)
Natürlichen Killerzellen CD45 + / CD3- / CD161a + R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R 2)]

Tabelle 2: Zellmarkern und Gating-Algorithmen, um jeden Immunzelluntergruppe charakterisieren Für die Gating-Algorithmus, bedeutet, dass die "+" Symbol "oder" und ermöglicht zwei getrennte Populationen zu addieren, auch wenn ihre Reaktionen nicht überlappen werden.. Das '-' Symbol bedeutet "nicht" und kann eine Population aus einer anderen definierten Population oder der Rückseite eines zuvor beschriebenen Bevölkerung zu subtrahieren. Der '*' Symbol bedeutet, "und" und definiert einen Raum, der vorhanden ist, wenn nur zwei Reaktionen überlappen. Immunzelluntergruppen Kontrollratten (n = 5) II-45 implantierten Ratten am Endpunkt (n = 4) Bedeuten Angebot Bedeuten Angebot Gesamt-Lymphozyten 165,7 111,5-207,0 97,9 54,4-137,0 CD4 T-Lymphozyten 72,9 45,4-111,4 38,4 25,6-50,0 CD8 T-Lymphozyten 36,6 26,0-48,3 32,1 16,1-46 B-Lymphozyten 56,6 36,0-83,9 24,7 11,2-36,0 NK-Zellen 9.3 3,1-15,7 4.0 1,34-7,7 Monozyten 27,1 12,7-39,0 373.3 42,4-575,8 Neutrophile 51,4 24,3-87,0 159,2 51,1-366,0 NLR 0,3 0,18-0,42 1.8 0,94-2,66

Tabelle 3:. Der Mittelwert und die Reihe von Immunzellen bei gesunden Kontrollratten (n = 5) und II-45 implantierten Ratten am Endpunkt (n = 4) Ergebnisse pro ul Blut gezeigt.

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Dieses Papier Details eines Verfahrens zur Erzeugung eines Ratten syngenen orthotopische Modell Pleuramesothelioms und ein einfaches Verfahren zur Überwachung der Krankheitsfortschritt durch Längs Blutentnahme.

Der II-45-Modell wurde durch Aussetzen Fischer 344 Ratten, die Asbestfasern 13 entwickelt. Obwohl diese Exposition stellt die wahre Dynamik der Host-asbest Immunsystem Wechselwirkungen für Mesotheliom Pathogenese, hat es eine lange Verzögerungszeit (unter Jahre zur Erzeugung) und kann für die Forscher gefährlich sein wegen der möglichen Exposition gegenüber Asbestfasern. Orthotope Implantation von II-45-Zellen in die Brusthöhle von Tieren stellt eine sichere und schnelle Modell der Tumorprogression, die den menschlichen Erkrankung in einem immunkompetenten Wirt 11 nachahmt. Jedoch sind die exakten Methoden und Prinzipien während dieser experimentellen Verfahren sind nicht gut definiert, haften. Die Vorgehensweise beschrieben, ergibt sich eine hohe Reproduzierbarkeit der Modell, das rela isttiv unabhängig von der Erfahrung der Bedienungsperson. Die kritischen Schritte 1, Ernten II-45-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase und genaue Zählung der lebensfähigen Zellen; 2, die korrekte Positionierung der Implantationsstelle und der Gewährleistung der Nadel nicht zu tief durchdringen und zu durchstechen die Lungen und Herz verursachen und 3, die Aufrechterhaltung und die Überwachung des Wohlbefindens der Tiere.

Die II-45 Zellinie wächst schnell und erfordert Passagierung alle 3 bis 4 Tage in Kultur, also bei der Vorbereitung zur Implantation sollten die Zellen subkultiviert und Wachstums täglich überwacht. Zellen sollten geerntet und gezählt, wenn sie in der exponentiellen Wachstumsphase, also bei ca. 70% Konfluenz. Resuspendieren der Zellen in serumfreiem Medium statt PBS reduziert die Belastung der Zellen, während zählen und die Vorbereitung für die Implantation. Genaue Zellzählungen sind entscheidend für die Reproduzierbarkeit, insbesondere bei der Dosierung mit niedrigen Zellzahlen (beispielsweise 100 bis 1.000). Die susPensions sollte homogen sein und bestehen aus einzelnen Zellen (keine Klumpen). Eine Implantation von 100 ul ermöglicht eine genaue Dosierung ohne Lunge Expansion durch übermäßige Flüssigkeits beeinträchtigen in der Pleurahöhle. Die wichtigsten Schritte bei der Implantation sind die richtige Positionierung und die Begrenzung der Nadelpenetration zu einer Tiefe von nicht mehr als 12 mm. Korrekte Positionierung der Nadel an der Injektionsstelle ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen in der Pleurahöhle und nicht in die Bauchhöhle implantiert. Falsch Implantation Zellen zu niedrig in Mesotheliom Tumoren wachsen durch die Membran, in der Leber und Bauchhöhle führen. Begrenzen der Eindringtiefe der Nadel ist auch extrem wichtig, um die Sterblichkeit infolge von Schäden an inneren Organen zu verhindern. Diese Einschränkung kann durch die Verwendung eines Abstandshalters über einen langen Nadel (wie dargestellt) oder die Verwendung einer kürzeren Nadel mit einer Schaftlänge von 5 mm bis 12 mm erreicht werden. In unseren Händen, wurden keine unerwünschten Ereignisse aufgetretenwährend der Zellimplantation. Es ist auch wichtig, um die Nadel nach jeder Implantation ersetzen. Andernfalls kann in Tumoren aus der Brusthöhle entlang der Einspritzleitung wachsenden führen. Ein solches Wachstum außerhalb der Pleurahöhle beruht auf der restlichen Zellen auf dem Nadelschaft und können in längeren Überleben führen.

In unseren Händen hat dieses Modell eine 100% Tumor-Transplantationsrate bei Verabreichung von ≥ 1 x 10 3 Zellen. Fortschreiten der Krankheit in der II-45-Mesotheliom Modell ist ziemlich schnell, wobei weniger als 40 Tagen, als 1 x 10 4 Zellen implantiert werden und weniger als 20 Tage mit einer Dosis von 5 x 10 5 Zellen. Dies kann die Nützlichkeit dieses Modells für präklinische Prüfung von einigen Therapien beschränken. Die II-45-Zellen, die zwar nicht im Handel erhältlich mit Erlaubnis des Urhebers 13 bezogen werden. Jedoch können die gleichen Implantationstechniken und Prinzipien auch auf andere Ratte Mesotheliom Zellinien Zellinie repos verfügbar aufgebracht werdenitories, wenn sie mit den einschlägigen syngenen Rattenstämmen abgestimmt. Die optimale Dosis kann Zelle mit Zelllinie unterschiedlich sein und müssten für jede Zeile bestimmt werden.

Verlaufskontrolle und das Wohlbefinden der Tiere ist schwierig, da die Tumoren interner Zustand und kann nicht nach Größe überwacht werden. Deshalb haben wir versucht, ein Verfahren zur Überwachung der Tiere, die eine Verschlechterung ihrer Erkrankung vorhersagen zu entwickeln, wie beispielsweise eine Erhöhung der NLR oder andere Veränderung der Immunzellmarker, bevor körperliche Symptome sichtbar. Das Blutbild entwickelt, verwendet nur 25 ul der peripheren Blut, so dass regelmäßige Probenahme mit minimalem Qualen des Tieres durchgeführt werden. Die beschriebenen Sampling-Technik erfordert Übung, um das nötige Know-how zu gewinnen. Doch sobald sie beherrscht es schnell und minimal-invasive.

Ein kritischer Schritt bei der Blutanalyse ist, um ein Gerinnen der Blutprobe durch eine schnelle Übertragung auf eine EDTA-Röhrchen zu verhindern. Clotted Probenverworfen werden sollte, wie die Zählungen ungenau. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Auflösung der roten Blutkörperchen vor der Zellanalyse. Wenn die roten Zellen nicht vollständig aufgelöst, wird die erhöhte Hintergrund fälschlich erhöhen die zählt. Während der Ersteinrichtung des Dot-Plots und Gating ist zeitaufwendig, wenn die Einstellungen und Vorlage gespeichert werden, der Test erfordert wenig Anpassung. Die Gating-Strategie eingesetzt verwendet eine Multi-Parameter Boolean algebraischen Ansatz, um die Daten zu entfalten. Unter Verwendung von bekannten Kombinationen ausschließliche und geteilte Antigene, die Algorithmen für jede Zeile des Gatters Strategie definieren die diskreten Zelltyp in diesem sechsdimensionalen Datenmatrix 14. Dies in Verbindung mit den festgelegten Genauigkeit der ratiometrische Wulstes basierte Technologie 15-17 hat den Vorteil, der Ermöglichung der Aufzählung einer definierten Zelltyp, da beide einen Anteil von Zellen und die absolute Zählung pro ul.

Es wird zunehmend anerkannt, dass das Immunsystem plegt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Krebs 18. Sowohl das Versagen des Immunsystems, um bösartige Zellen und die Unterdrückung von Immunzellen, die von Tumoren erkennen und zerstören kann zu unkontrollierten Tumorwachstum führen. Somit ist der Einschluss eines immunkompetenten Tumor-Mikroumgebung ein wichtiger Aspekt bei der Modellierung Krebs und ist ein Hauptvorteil der syngenen Krebsmodellen. Diese immunkompetenten Modelle schaffen eine realistische und klinisch relevante Umfeld für Tumorwachstum und Immun Wechselwirkung, die einen Mangel an xenogenen Modellen ist.

Die in dieser Studie, das Fortschreiten der Erkrankung, das heißt, Lymphozyten, Monozyten zählt und die NLR begleitet identifiziert Immunparameter, haben auch gezeigt, dass mit einer schlechten Prognose in der menschlichen Mesotheliom 19-21 Erbringung von Beweisen für die Relevanz des Modells und der Bluttest korrelieren . In den vorgestellten Modellen, dem klinischen Nutzen der Kontrolle der Immunparameter erhöht with die längere Zeitverlauf (niedrigere Dosis) und kann weiterhin durch häufigere Probennahme in späteren Stadien der Krankheit verbessert. Während dieses Papier konzentriert sich auf ein Modell der Mesotheliom kann die Fähigkeit zur Tumorprogression durch periphere Blutentnahme Überwachung für alle syngenen Krebsmodellen genutzt werden. Ferner kann der Test auch verwendet, um die immunologische Antwort auf verschiedene Therapien zu bewerten. Zuvor haben wir diesen Assay verwendet, um die Antwort auf eine Anti-Krebs-Impfstoff-Therapie in einer syngenen Gliommodell (9L) 22 zu überwachen. In dieser Studie wurden CD4 und CD8 T-Zellen, die informative Marker. Wir haben auch diesen Assay und den II-45 Mesotheliom Modell verwendet, um Unterschiede in der Immunantwort gegen Tumoren resistent gegen verschiedene Chemotherapeutika 11 identifizieren. In dieser Studie werden alle Parameter außer CD8 T-Zellen zeigten signifikante Unterschiede. Die Längs Überwachung während der hier beschriebenen Krankheitsprogression unterstreicht das Potenzial der verschiedenen Immunzellparameter corbetreffen mit Tumorprogression und das Wohlbefinden der Tiere bei der Durchführung von syngenen orthotopen Modellierung von Krebs bei Ratten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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