Summary
Поколение ортотопической крысиной модели плевральной мезотелиомы по злокачественной имплантации II-45 мезотелиомы клеток в плевральной полости иммунокомпетентных крыс представлены. Метод цитометрии потока для анализа семь подмножеств иммунных клеток в этих животных из 25 мкл пробы крови также описывается.
Abstract
Огромный всплеск интереса в иммунной основе лечения рака, таких как вакцины и ингибиторы иммунных контрольно-пропускной пункт, и более глубокого понимания роли микроокружения опухоли в ответ на лечение, в совокупности указывают на необходимость иммунокомпетентных ортотопических моделей доклинических испытаний из этих новых методов лечения. Эта статья показывает, как установить ортотопическая иммунокомпетентных крыс модель плевральной злокачественной мезотелиомы. Прогрессирование заболевания Мониторинг в ортотопических моделей посрамлен внутренним расположением опухоли. Для продольно контролировать прогрессирование заболевания и его влияние на циркулирующие иммунные клетки в этой и других моделей крыс рака, один трубки проточной цитометрии анализа требует только 25 мкл описан весь в крови. Это обеспечивает точную количественную оценку параметров иммунного семи: Общий лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов, а также Т-клеточного подмножества CD4 и CD8, В-клеток и естественных клеток-киллеров. Различные подводные лодкиETS этих параметров являются полезными в различных обстоятельствах и моделей, с нейтрофилов соотношения лимфоцитов, имеющего наибольшую ценность для мониторинга прогрессирования заболевания в модели мезотелиомы. Анализ уровня циркулирующего иммунных клеток, используя этот метод однотрубный может также помочь в мониторинге ответа иммунной основе лечения и понимание основных механизмов, ведущих к успеху или неудаче лечения.
Introduction
Злокачественная мезотелиома (ММ) является агрессивным злокачественности, который возникает из трансформированных клеток в мембрану (мезотелием), что линии легких и брюшной полостей, сердце и внутренних половых органов, и является наиболее распространенным первичная опухоль полости легких или плевре, 1,2 , Воздействие асбестовых волокон составляет 80% всех ММ, и в то время запретов на использование асбеста были введены десятилетия назад в большинстве западных стран, его широкое использование в сообществе оставил смертоносного наследия. Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что во всем мире 107000 человек умирают каждый год от болезней, связанных с асбестом, с смертности продолжает расти. Новый без профессиональной заболеваемости волна также новых и мало понимания того, когда и на каком уровне это будет пик 3.
Большинство людей с ММ диагностируется поздно, когда системная химиотерапия является одним из немногих жизнеспособных вариантов 4. Самые effectiве химиотерапии и текущий 'стандарт медицинской помощи »(пеметрекседом вместе с цисплатином 5) идентифицировали более 10 лет назад. Однако неудача этого лечения является неизбежным и нет доказанных вариантов второй линии, оставляя пациентов с мрачным прогнозом и медиана выживаемости составляет всего 12 месяцев 2. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная потребность в более эффективных методов лечения. Несмотря на рассмотрении ряда новых методов лечения в клинических испытаниях никто не привело к изменениям в практике. Это отчасти из-за низкой (5%) переноса доклинических результатов, как правило, выполняется в моделях ксенотрансплантата мыши, чтобы клинической 6-8. Такие модели не точно повторять сложные аспекты опухолевого микроокружения, происходящих в не-физиологических местах, часто в отсутствие функционирующего иммунной системы 9.
Сингенные Ортотопическая модели создания значительно более реалистичное окружение опухоли, чем Commonly используется подкожные модели ксенотрансплантатов как опухоли встречаются в правильном физиологическом месте с неповрежденной иммунной системы 10,11. Чем больше размер крысы повышает его использование в качестве модели заболевания грызунов, особенно в исследованиях, где наркотики серийный забор крови требуется для оценки эффективности лечения и токсичность 12. Кроме того, в модели, в которой контроль прогрессирование болезни затруднено из-за расположения опухоли (например, в плевральной полости), способность контролировать развитие болезни с использованием коэффициентов, найденные в обращении является очень привлекательным. Поколение сингенной ортотопического модели мезотелиомы плевры с использованием иммунной компетентные крыс описана. Кроме того, это простой и относительно неинвазивный метод для мониторинга прогрессирования заболеваний плевры путем измерения циркулирующих иммунных клеток также описано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с рекомендациями в австралийском кодекса практики по уходу и использованию животных в научных целях. Протокол для этого исследования был одобрен Комитетом по Королевский North Shore Hospital Уход за животными и этике. Женский Фишер 344 (F344, 150-200 г) были сохранены в Кернс фонда, Kölling институт при стандартных условиях (12 ч свет / темнота циклов и свободным доступом к пище и воде).
Примечание: Блок-схема для всех экспериментальных процедур представлена на рисунке 1.
1. Подготовка клетки для имплантации
- Культура крыса мезотелиомы II-45 клеточной линии (также известный как IL-45; получены путем перитонеального введения крокидолита асбеста) в среде RPMI 1640 (RPMI), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и расти в стандартных условиях (37 ° С увлажненный инкубатор с 5% СО 2). Maintaв по пассирования и к югу от культивирования примерно 1:50 дважды в неделю в 75 см 2 колбу.
- Подготовка реагентов для клеточной культуры и теплых аликвотах при 37 ° С. Необходимые реагенты включают бессывороточной RPMI носитель (SFM), RPMI с 10% FBS, фосфатным буферным раствором (PBS) и 0,5% трипсин-ЭДТА.
- Культуры клеток для имплантации примерно 70-80% слияния. Это гарантирует, что они находятся в линейном фазе роста.
- Урожай клетки путем отбрасывания носитель, промывания один раз 5 мл стерильной PBS в с последующим добавлением 3 мл 0,5% трипсин-ЭДТА.
- Вернуться колб для инкубатора в течение примерно 5 мин, пока все клетки становятся не соблюдают.
- После клетки не соблюдают, добавить 3 мл RPMI с 10% FBS для инактивации трипсина. Сбор и центрифуги клетки при 300 мкг в течение 3 мин.
- Вымойте осадок клеток в 10 мл SFM и центрифуги снова при 300 мкг в течение 3 мин.
- Вымойте осадок клеток снова с 10 мл УЛП и центрифуги, как указано выше,
- Ресуспендируют клеток в 10 мл SFM и выполнять подсчет клеток с помощью гемоцитометра или аналогичный приборов.
- Развести клетки таким образом, чтобы 100 мкл содержали количество, клеток для имплантации.
Примечание: Рост опухоли была продемонстрирована в дозе, как низкий, как 100 клеток в 100 мкл но стандартная доза составляет 500000 клеток в 100 мкл. - Подготовьте достаточное количество клеток в средствах массовой информации, так как число крыс для имплантации (т.е. 100 мкл / крысу), плюс по крайней мере 0,5 мл больше, чтобы компенсировать потери от грунтовки и мертвого объема иглы.
- Подготовьте достаточное SFM (без клеток), чтобы имплантировать в контрольных крыс (т.е. 100 мкл / крыса), плюс по крайней мере 0,5 мл дополнительное.
Примечание: клетки и SFM готовы к имплантации. Они должны храниться в 37 о С и имплантировали в 2 ч уборки поддерживать жизнеспособность.
2. В естественных условиях имплантацию клеток
- Поместите крысу F344 (> 13 недель) в индукции камеры и обезболить с помощью 1,4% ИФ ингаляции (или метод их использования в объекте). После того, как появится крыса спит шаг его из камеры в носовой конус (с 1,4% изофлуран течет), поместите его на спину с груди вверх (вид снизу). Это позволяет внутренние органы урегулировать от грудной полости. Проверьте рефлексы в соответствии с институциональными протоколов для обеспечения крыса полностью под наркозом.
- Бритье правильный регио costalis (грудь) области, чтобы удалить шерсть.
- Очистите бритую область с 80% об / об этанола.
- Определить место инъекции: на правой стороне, найти 2-ой железы, начиная черепно. Сайт инъекции 0,5 см проксимальнее это, между 3-м и 4-м ребром от хвостового конца грудной клетке. (2А).
- Аккуратно перемешать II-45 клетки ресуспендируют. Медленно привлечь клеточной суспензии (или SFM для контрольных крыс) в 1 мл и# 160; шприц без иглы прилагается. Если игла прилагается для составления клеток есть потенциал для клетки расти вместе инъекционной иглой линии. Приложите 23G х 1¼ иглу. Премьер-игла и удалить пузырьки воздуха.
- После того, как шприц и игла загрунтованы, разместить в длину 20 мм и диаметром 5 мм проставка над вала иглы. Это используется для предотвращения проникновения иглы от слишком глубоко в плевральную полость во время инъекции. Приблизительно 5 мм 12 мм оголенного иглы является достаточным для проникновения через ребра без повреждения органов.
- Медленно вставьте иглу между ребер, отступать от шприца, чтобы обеспечить кровеносный сосуд не был проколот (кровь не должна появиться в шприце), то придать 100 мкл клеток или SFM. (2В).
- Снимите иглу и аккуратно свернуть крысу из стороны в сторону, чтобы распространять клетки в грудной полости.
- Поместите крысу в клетку и проверить на восстановление. Чте крысы должны проснуться в течение 1 мин и начинают передвигаться.
- Повторите для каждой крысы, используя новую иглу. Повторное использование той же иглы приведет к росту клеток по нагнетательной линии иглы.
- Daily Monitor благосостояния животных.
- Эвтаназии животных на этически определенных конечных точек, как регулируется институциональной комитета по этике животных. Этические конечных точек для крыс в этих экспериментах были потеря веса больше, чем 10% или затрудненным дыханием.
3. хвостовой вены кровь Коллекция
- Если кровь должна быть собрана сразу после имплантации клеток, держать крысу наркозом. Если отбор проб крови в другом момент времени, обезболить крысы, используя 1,4% ИФ ингаляции. Проверьте рефлексы в соответствии с институциональными протоколов для обеспечения крысу полностью анестезии.
- Поместите крысу на бок и найти боковую хвостовую вену.
- Стерилизовать хвост с 80% этанола и маркировать 0,5 мл ЭДТА Collection трубки.
- Для сбора крови, всегда начинайте с хвостового конца хвоста (приблизительно одна треть пути вдоль). Это позволяет дальнейшие попытки ближе к черепной конце хвоста в случае первая попытка будет неудачной. Никогда не ресэмплировать каудально, так как это может привести к сгусток крови.
- Подставьте 23G х 1 ¼ иглы параллельно боковой вены и сдвиньте его в вену под небольшим углом, так что проникает примерно на 10 мм (рис 3A).
- Примечание: Если вены успешно проколоты крови будет видно в конце крепления иглы (рис 3B).
- Каплю крови образуют на хвосте на месте пункционной иглы. Соберите эту кровь с помощью пипетки и передачи в меченых 0,5 мл (или меньше) сбора ЭДТА трубки. Для иммунной клеточном анализе 25 мкл достаточно. Применить марлю с давлением не прокола сайт до остановки кровотечения.
- Флик трубку крови смешивать кровь и ЭДТА ргМероприятие свертывания. Сохранить время между сбором крови и смешиванием с ЭДТА как можно короче, чтобы предотвратить свертывание.
- Когда не сбора крови из нескольких крыс магазин образцов ЭДТА-крови в стойке при комнатной температуре до анализа. Процесс в крови в пределах 2 ч сбора.
4. Подготовка проб для иммунной профилирования клеток с использованием бисера, в основе метода
Примечание: Этот метод платформа одного зависит от использованием коммерчески доступных абсолютные подсчета трубы, которые имеют известное число бусин для каждого образца. Эти трубки содержат лиофилизированные гранулы, которые растворяют в ходе подготовки образца, выпуская бусы. Гранулы флуоресцентно меченных и стробирования по населению борта, абсолютного количества могут быть рассчитаны.
- Убедитесь, что ЭДТА образец цельной крови хорошо перемешать, поместив его на медленном роторный смеситель для нескольких мин. Этикетка одного абсолютного подсчета трубки для каждого образца. Гранулы, содержащие шарики должны быть видны под тОн металла держатель шарика на дне пробирки.
- Трансфер 25 мкл ЭДТА цельной крови в меченого абсолютной счетной трубки. Осадком из гранул будет растворяться при добавлении крови.
- В каждую пробирку добавляют 20 мкл анти-крысиного коктейль Т / В / естественных киллеров (NK) клетки, 10 мкл анти-крысиного CD8a PE 10 мкл анти-крысиного CD4 (домен 1) FITC и 10 мкл анти-крыса CD45 РЕ / Cy7 (4А). Флуорофоры определены в таблице 1.
- Центрифуга кратко трубка (300 мкг в) обеспечение антитела и клетки находятся в нижней части трубки, а не прилипли к стороне трубки. Вихревой смешивать и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Лизировать красные кровяные клетки добавления 400 мкл 10 мМ Трис, 0,15 М хлорида аммония (рН 7,5) и вихревые перемешать. Лизис завершена, когда образец появляется полупрозрачный и не облачный (цифры 4B и C). Отказ лизировать образец полностью приведет к увеличениюd фон и ложно повышенные рассчитывает при анализе с помощью проточной цитометрии.
5. Цитометрический Обработка образцов
Примечание: Выполнение на цвет 4 проточного цитометра.
- Откройте программное обеспечение в режиме приобретения и нового шаблона с 8 участков, как показано на рисунке 5.
- Настройка параметров прибора в перечисленных в таблице 1, и установить ворота R1 (FITC [FL-1] по сравнению с БТР [FL-4]), Рис 5Ai) рассчитывать флуоресцентные шарики. Другие ворота не так важны, на данном этапе приобретения, но будут необходимы для анализа. Абсолютные шарики подсчета, используемые в этом протоколе содержит флуоресцентные красители и могут быть обнаружены в любой канал, хотя это слабое в синем канале.
- Использование подготовленный образец крови, контроль вихрь, а затем загрузить на цитометром и работать на низкой скорости (12 мкл / мин) на режиме настройки, так ворота сбора данных могут быть скорректированы.
- Установите приобретение длясобрать 10.000 события в бортовой ворот R1.
- Установите папку для записи данных и установить номер файла и образец файла ярлык в меню приобретения.
- Загрузить образец для анализа на цитометр и установить скорость потока в среде (35 мкл / мин). Запуск каждого образца при той же скорости потока. Скорость потока может потребоваться изменяться до низкой (12 мкл / мин) или высокой (60 мкл / мин), но, как правило, средний необходимости. В этом случае, это занимает около 90 сек до 120, чтобы приобрести 10000 шарик события для каждого образца.
- После того, как образец загружен смотреть разброс участков, чтобы убедиться, события появляются в шарик ворот R1. Первоначально могут быть некоторые нестабильности в давлении образца, вызывающего дрейф в разброс участков. Подождите, чтобы это стабилизировать.
- После стабилизации, нажмите на приобретать и позволяют образец для запуска. После того, как цитометр закончил приобретение 10.000 шарик события в R1 цитометр остановится приобретения и сохранения всех данных.
- Снимите и выбросьте образец потока втбыть. Цитометр теперь готов к следующей выборки. Выполнить все образцы, а затем перехода в режим анализа.
6. Иммунный анализ сотового
Примечание: стробирования стратегии и Булева алгебра используются для определения каждого клеточной популяции. Булева алгебра является метод анализа на основе логики, что позволяет несколько операций в одном определении. Анализ программного обеспечения в цитометром потока (например, BD CellQuest) позволяет использовать булевой алгебры. Уравнения используются активно учесть значительное отрицательное реактивности, который помогает в определении клетку, более конкретно идентифицировать каждый клеточной популяции. «Регионы» используются для определения 'ворота'. Области определить 2-мерном пространстве, тогда как ворота могут быть составлены из многочисленных областей, связанных алгебраическими операторов (+, *, -, определенный в таблице 2).
- Переключение в режим программного обеспечения анализа. Шаблон анализ должен быть создан, чтобы соответствовать
- Анализ каждого файла (т.е., каждый человек образец) отдельно. Настройка ворота R1-R9 через, а затем настроить алгоритмы для каждого типа клеток, как определено в таблице 2 (также показано на рисунке 5).
- Используйте счетчик статистики клеток для расчета отдельных клеточных популяций, определенных ворот и алгоритмов (таблица 2 и рисунок 5). Алгоритмы будет регулировать число клеток автоматически в счетчике статистики клеток.
- Рассчитать клеток подмножества, используя следующее уравнение:
Примечание: Количество клеток событий, подсчитанных (например, лимфоцитов CD4 события) перечисляется с помощью приведенного выше уравнения, чтобы дать ряд клеток на мкл крови. Примеры приведены на рисунке 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, используемый в данной работе для генерации модели ортотопической мезотелиомы плевры, используя II-45 клеток в результате животных поддаваясь мезотелиомы воспроизводимым и быстрым сроки, без крыс не умирает из-за метода имплантации. Титрование числа клеток, имплантированных установлено, что 1x 10 3 клеток было минимальное количество, необходимое для полностью пенетранта модели (100% приживление). Различное число клеток, имплантированных в крысах изменили время течения заболевания как будто не влияет на тяжесть заболевания. Животные, которые получили 1 х 10 3, 1 х 10 4 и 5 х 10 5 клеток, достигнутые с этической точки зрения, определенные конечные точки в день 40, 30 и 20 день соответственно (рис 6).
Кровь собирали из крыс примерно в два раза в неделю без каких-либо осложнений, наблюдаемых, связанные с коллекции. Важно отметить, что не более чем 10% от общего объема крови (илипримерно 2 мл) должны быть собраны в 2-недельного периода. Поток цитометрии анализа, который в сочетании стробирования стратегии и Булева алгебра была создана для выявления лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов и лимфоцитов подмножества T, CD4 Т, CD8 T, B и NK клеток. Было установлено среднее значение и диапазон для каждого типа клеток с помощью контрольных крыс (N = 5) и по сравнению со средним и диапазон II-45, имплантированных в конечной точке крыс (Таблица 3). Значения Endpoint впервые были по сравнению с определения, существует ли разница в счете между клеток иммунной здоровых и больных животных. По сравнению с здоровых контрольных крыс, всего лимфоциты, Т-клетки CD4, лимфоциты и NK-клетки снизилась в II-45, имплантированных крысам в конечной точке, тогда как моноциты, нейтрофилы и нейтрофилов в соотношении лимфоцитов (РНБ) увеличивается.
Чтобы определить, можно ли использовать эти иммунные параметры ячейки также изменены с прогрессированием заболевания и, таким образом, в качестве суррогатных маркеров Fили мониторинга заболевания, продольные образцы также сравнивают (рисунок 7). Наиболее информативным продольной показатель был РНБ с увеличением обнаруженных до 7 дней до этические концами (рис 7А). Для крыс с высоким клеток доз, высокие NLRs были обнаружены между день 7 и день 12 после имплантации, тогда как для крыс с низким клеток доз, РНБ начал расти между днем 18 и 22. Всего лимфоцитов уменьшилось с прогрессированием заболевания у крыс с больше модель, конечно время болезни (низкая доза клеток: 1 x10 4, 7В). Это снижение не было видно, у крыс с быстрым времени курса (высокие дозы клеток: 5 x10 5). Моноциты оставался на нормальном уровне до терминала сбора, когда грубо увеличились на счету часто наблюдается (7С). Другие счету иммунных клеток (нейтрофилы, НК, В-клеток и CD4 и CD8 Т-клеток) были более изменчивыми и, таким образом, менее информативны.
Рисунок 1. Блок-схема экспериментальной процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Место и сайт имплантации. Крыса сначала под наркозом, его кладут на спину и право регио costalis (грудь) площадь побрился, чтобы удалить шерсть. На правой стороне, 2-й сосок сверху идентифицируется и участок инъекции находится 0,5 см проксимальнее этого, между 3-м и 4-го ребра из нижней части грудной клетки (А). Прокладка помещают по подготовленной иглы и шприца, чтобы игла проникающей слишком глубоко в плевральную полости и 100 мкл клеток или SFM вводят (Б). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Отбор проб методика сбора крови из хвоста. Поместите в 23G х 1 ¼ иглы параллельно боковой вены (А). Слайд иглу в вену под небольшим углом, глубоко приблизительно 10 мм, и держать там в течение нескольких секунд, пока кровь не видно (Б), то удалить иглу. Собирают кровь с помощью пипетки (C). При необходимости нежно поглаживать хвостовую вену, чтобы кровь продолжает течь. Внесите крови в 0,5 мл EDTA пробирку (D), смешивая, как вы идете, чтобы предотвратить свертывание. arge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Маркировка образца крови в абсолютном счета трубки для анализа проточной цитометрии. Кровь (25 мкл) и антитела добавляют к абсолютному подсчета трубки (A). Затем трубку встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Перед добавлением буфера хлорида аммония для лизиса эритроцитов, образец появляется мутный или непрозрачным (B). После того, как лизируются, образец появится полупрозрачная и готов к проточной цитометрии анализа (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ES / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Память стратегия проточной цитометрии. 6-мерный набор данных может определить лимфоциты, моноциты и нейтрофилы и лимфоциты подмножества T, CD4 Т, CD8 T, B и NK клеток. Определенные стратегии стробирования и алгоритмы включать как негативное и положительную реактивность, которые определяют каждый тип клеток благоприятных специфической идентификации. Количество шариков в каждой абсолютного подсчета трубки (находится на сумке для каждой трубки) записывается для каждого образца и требуется для расчета количества клеток на мкл крови для каждого подмножества, как показано. Полный алгоритм стробирования для каждой ячейки подмножество в списке справа от анализа участков. (Ай) Бисер (R1) первоначально учитываются по FITC (FL-1) по сравнению с БТР (Флорида-4). Приобретение устанавливается примерно 10000 событий (9960 в данном примере). (ОКИ) Мусор (R2), определяется в зависимости от FSC SSC и удаляется из всех последующих гтем создания. (Bi) После удаления мусора (R2), FSC против SSC отличает население лейкоцитов в лимфоциты (R3), моноцитов (R4) и нейтрофилов (R5). (Бий) клеточных популяций, выявленные в (Bi) подтверждены с помощью общий лейкоцитов антиген CD45 стробирования на ПЭ / Cy7 (FL-3) в зависимости от SSC. (B-III) популяции лимфоцитов (R3), далее дифференцируются в Т-клеток (R6) с использованием CD3 стробирования на БТР (FL-4) в зависимости от SSC. ( Biv) CD8 Т-клетки-лимфоциты (R3) дифференцировались в Т-клетки (R6), что также выразить CD8a (R9) и закрытого типа на ПЭ (FL-2) по сравнению с SSC. (C) В-клетки и NK-клетки определяются как лимфоциты ( R3), которые CD3 отрицательный. В-клетки (R7) отличаются от НК-клеток, поскольку они выражают CD45RA и закрытого АРС (FL-4) по сравнению с FITC (FL-1). (CII) лимфоцитов CD4 определяются как лимфоциты (R3), что совместное экспресс CD3 (Т-клетки, R6) иCD4 (R8), но не выражают какой-либо из других маркеров, используемых. Они дифференцированы с помощью FITC (FL-1) по сравнению с ПЭ (FL-2) стробирования. NK клетки определяется как любой оставшейся лимфоцитов, что уже не было определено, что также выражает CD161a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Выживание кривой для крыс, имплантированных различными дозами II-45 клеток мезотелиомы. Группы крыс pleurally имплантировали 5 × 10 5 (N = 6), 1 х 10 4 (N = 2), 1 х 10 3 ( п = 2) или 1 х 10 2 (п = 4) II-45 мезотелиомы клеток в 100 мкл объема, а затем отслеживаемые до конечной точки этического, когда они были эвтаназии. Выживание графике с помощью лог-ранг (Мантеля-Кокса) метод Gehan-Бреслоу-Вилкоксона. р>
Рисунок 7. Продольный циркулирующих иммунных клеток рассчитывает крыс мезотелиомы по отношению к среднему и диапазона для здоровых контрольных крыс. Здоровой контрольной означает для каждого типа клеток показана в виде горизонтальной линии непрерывной черной (значение отображается на правой оси ординат по каждый график) и спектр изображен серым затененной области. Y-ось показывает число импульсов за мкл крови для указанного типа клеток, или значения для NLR. X-ось времени курс для прогрессирования заболевания, где день 0 является днем имплантации. Продольные Результаты 2 крыс с имплантированными 1 х 10 4 клеток (A, B) и 2 крыс с имплантированными 5 х 10 5 клеток (C, D) показаны. (A) РНБ, (Б) от общего числа лимфоцитов, (С) моноцитов на счету.ge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Детектор | Флуорофорные | Детали | напряжение | Режим |
| FSC | --- | --- | E00 | Линейный |
| SSC | --- | --- | 450 | Линейный |
| FL-1 | FITC | 533/30 нм | 670 | Журнал |
| ФЛ-2 | ФИЗ РА | 585/40 нм | 675 | Журнал |
| FL-3 | ПЭ / Cy7 | 670 нм (длинный пас) | 600 | Журнал |
| ФЛ-4 | APC | 675/25 нм | 735 | Журнал |
Таблица 1: Напряжение настройки детектора для потока цитоМетрика сбора данных с помощью цветной 4 проточного цитометра. Амплитуда усиления устанавливается на 1 для всех детекторов. FSC: вперед разброс, ГНЦ: боковое рассеивание, FITC: Флуоресцеин isothyocyanante, ЧП: Фикоэритрин, APC: Allophycocyanine.
| Сотовый подмножество | Сотовые Маркеры | Память Алгоритм |
| Бисер | R1 | |
| Мусор | R2 | |
| Клетки (панорамирование-лейкоциты) | CD45 + | R2- |
| Лимфоциты | CD45 + ЛПС против SSC | R3 * R2- |
| Моноциты | CD45 + ЛПС против SSC | R4 * R2- |
| Нейтрофилы | CD45 + ЛПС против SSC | R5 * R2- |
| Т-клетки (всего) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * R2- |
| CD8 Т положительный CEзаполняет | CD45 + / CD3 + / + CD8a | R9 * R6 * R3 * R2- |
| В-клетки | CD45 + / CD3- / CD45RA + | R7 * R3 * R2- |
| CD4 позитивных Т-клетках | CD45 + / CD3 + / CD4 + лимфоцитов | R8 * R6 * R3 * - (R 7 * R3 * R2-) |
| Естественных клеток-киллеров | CD45 + / CD3- / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * R2-)] |
Таблица 2: маркеры клеточной и алгоритмы стробирования для характеристики каждого подмножества клеток иммунной Для алгоритма стробирования, то символ '+' означает "или" и позволяет два отдельных популяции должны быть добавлены вместе, даже если их реакции не перекрываются.. Символы '-' символ означает "не" и может вычесть одну популяцию из другой определенной группы населения или оборотной описанной ранее населения. Символ '*' символ означает 'и' и определяет пространство, которое присутствует только тогда, когда две реакции пересекаются.
Таблица 3:. Среднее значение и диапазон иммунных клеток у здоровых контрольных крыс (п = 5) и II-45, имплантированных крысам в конечной точке (п = 4) Результатов на мкл крови показаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья детализирует метод для генерации крысы сингенной ортотопического модели мезотелиомы плевры и простой способ для мониторинга прогрессирования заболевания с помощью выборки продольного крови.
Модель II-45 был разработан подвергая Фишер 344 асбестовых волокон 13. Хотя это воздействие представляет истинную динамику хост-асбеста иммунной системы взаимодействий для мезотелиомы патогенезе, он имеет много времени задержки (с лет для создания) и может быть опасно для исследователей из-за потенциального воздействия асбестовых волокон. Ортотопическая имплантация II-45 клеток в плевральной полости животных обеспечивает быстрое и безопасное модель прогрессии рака, которые имитирует человеческую болезнь иммунной в-компетентного хозяина 11. Однако точные методы и принципы, придерживаться во время этих экспериментальные процедуры четко не определены. Процедура, описанная результаты в высокой воспроизводимостью модели, которая РЕЛАственно зависит от опыта оператора. Критические шаги 1, сбор II-45 клеток в экспоненциальной фазе роста и точного подсчета жизнеспособных клеток; 2, правильное позиционирование в месте имплантации и обеспечения иглу не проникает слишком глубоко и проткнуть легкие или повредить сердце, и 3, сопровождение и мониторинг благосостояния животных.
Клеточная линия II-45 быстро растет и требует пересева каждые 3 до 4 дней в культуре, поэтому при подготовке к имплантации, клетки должны быть субкультивироваться и рост контролировали ежедневно. Клетки должны быть собраны и подсчитаны при в экспоненциальной фазе роста, то есть, примерно на 70% слияния. Ресуспендирование клеток в сыворотке крови свободных средств массовой информации, а не PBS уменьшает нагрузку на клетки, считая и подготовка к имплантации. Точные счету сотовые имеют решающее значение для воспроизводимости, особенно когда дозирования с низким числом клеток (например, от 100 до 1000). СКПпенсия должна быть однородной и состоит из отдельных клеток (нет комков). Том со имплантация 100 мкл позволяет точное дозирование без ущерба расширение легких в результате чрезмерного жидкости в плевральной полости. Ключевые шаги в имплантации являются правильное позиционирование и ограничения проникновения иглы на глубину не более 12 мм. Правильное позиционирование иглы в месте инъекции чрезвычайно важно для того, чтобы клетки имплантируют в плевральную полость, а не в брюшную полость. Неправильно имплантации клеток слишком низко может привести к мезотелиомы опухолей, растущих через диафрагму, в печени и брюшной полости. Ограничение глубины проникновения иглы также очень важно, чтобы предотвратить смертность в результате внутреннего повреждения органов. Это ограничение может быть достигнуто за счет использования спейсера над длинной иглой (как показано) или использование более короткой игле длиной вала 5 мм до 12 мм. В наших руках, нет побочных эффектов не произошлово клеток имплантации. Важно также, чтобы заменить иглу после каждой имплантации. Невыполнение этого требования может привести к опухоли, растущие из груди полости вдоль нагнетательной линии. Такой рост пределами плевральной полости из-за остаточных клеток на игле вала и может привести к увеличению выживаемости.
В наших руках эта модель имеет 100% скорость приживления опухоли при введении ≥ 1 х 10 3 клеток. Прогрессирование заболевания в мезотелиомы модели II-45 происходит достаточно быстро, будучи меньше, чем 40 дней, когда 1 х 10 4 клетки имплантируют и менее чем за 20 дней при дозе 5 × 10 5 клеток. Это может ограничить полезность этой модели для доклинических испытаний некоторых методов лечения. В II-45 клетки, в то время как нет в продаже могут быть получены с разрешения создателя 13. Тем не менее, те же самые методы и принципы имплантации может быть также применено к другим клеточных линий крыс мезотелиомы доступных из линии клеток РЕПОitories при сопоставлении с соответствующими сингенным штаммов крыс. Оптимальная доза клеток может изменяться в зависимости клеточной линии и должны были бы быть определены для каждой строки.
Мониторинг прогрессирования заболевания и благополучия животных трудно, как опухоли внутренней и не может контролироваться по размеру. Поэтому мы стремились разработать метод мониторинга животных, которые могли бы предсказать ухудшение их состояния, такие как увеличение РНБ или других изменений в маркеров иммунных клеток, прежде чем физические симптомы стали видны. Экран крови разработана использует только 25 мкл периферической крови, так что регулярное выборки могут быть выполнены с минимальными дистресс к животному. Техника отбора проб описаны требует практики, чтобы получить необходимый опыт. Однако, как только освоил это быстро и минимально инвазивной.
Важным шагом в анализе крови, чтобы предотвратить свертывание образца крови быстрым переводом на EDTA трубки. Свернувшейся пробыдолжны быть отброшены, как графы будут неточными. Еще одним важным шагом является красный лизис клеток до анализа клеток. Если эритроциты не полностью лизированы, повышенная фон будет ложно поднять отсчеты. В то время как первоначальная настройка точечных участков и стробирования времени, когда настройки и шаблон сохраняются, анализ требует немного настройки. Стратегия стробирования используются использует многопараметрическое логическое алгебраический подход к к deconvolute данные. С помощью известных комбинаций эксклюзивным и поделился антигенов алгоритмы в каждой строке стратегии ворота определить дискретный тип клеток в этой шестимерного матрицы данных 14. Это в сочетании с установленной точностью логометрической борта основе технологии 15-17 имеет преимущество стимулирующих перечисление какой-либо определенной типа клеток и как часть клеток и абсолютным количеством в мкл.
Это становится все более признается, что иммунная система рлежит важную роль в патогенезе рака 18. И отказ иммунной системы распознавать и уничтожать раковые клетки и подавление иммунных клеток опухолей может привести к неконтролируемому росту опухоли. Таким образом, включение иммунного компетентных микросреды опухоли является важным фактором при моделировании рака и является основным преимуществом сингенным моделях рака. Эти иммунные компетентных модели создания реалистичного и клинически значимых условий для роста опухоли и иммунной взаимодействия, которая дефицитом ксеногенных моделях.
Иммунные параметры, определенные в данном исследовании, которые сопровождали прогрессирование заболевания, т.е. число лимфоцитов, моноцитов рассчитывает и РНБ, также коррелируют с плохим прогнозом в человеческой мезотелиомы 19-21 предоставление доказательств для актуальности модели и анализа крови , В представленных моделей, клиническая полезность мониторинга иммунные параметры увеличился остроумиеч тем больше времени, конечно (низкая доза) и может быть дополнительно улучшена путем более частого отбора проб на более поздних стадиях заболевания. В то время как эта статья фокусируется на модели мезотелиомы, способность контролировать прогрессирование опухоли через проб периферической крови может быть использован для всех моделей сингенных рака. Кроме того, анализ также может быть использован для оценки иммунного ответа к различным терапии. Ранее мы использовали эту пробу для контроля ответа на терапию противораковой вакциной в сингенной модели глиомы (9L) 22. В этом исследовании, CD4 и CD8 Т-клетки наиболее информативные маркеры. Мы также использовали эту пробу и мезотелиомы модель II-45, чтобы определить различия в иммунном ответе на опухолей, резистентных к химиотерапевтическим средствам различных 11. В этом исследовании все параметры, кроме лимфоцитов CD8 показали значительные различия. Продольная мониторинг во время прогрессирования заболевания, описанного здесь подчеркивает потенциал различных параметров клеток иммунной Коротносятся с прогрессированием рака и благополучия животных при проведении сингенную ортотопическая моделирования рака у крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
