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Medicine

Ortotopico impianto e periferico immunitario monitoraggio cellulare nel Modello II-45 Singenico Rat mesotelioma

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto.

Abstract

L'enorme aumento di interesse nei trattamenti immuno-based per il cancro, come i vaccini e gli inibitori checkpoint del sistema immunitario, e una maggiore comprensione del ruolo del microambiente tumorale in risposta al trattamento, collettivamente puntare l'esigenza di modelli ortotopici immuno-competenti per i test pre-clinici di queste nuove terapie. Questo documento dimostra come stabilire un modello di topo immuno-competenti ortotopico di pleurico mesotelioma maligno. La progressione della malattia di monitoraggio nei modelli ortotopici è confuso dalla posizione interna dei tumori. Per monitorare longitudinalmente progressione della malattia e il suo effetto sulle cellule immunitarie circolanti in questo e altri modelli di ratto di cancro, un unico tubo citometria a flusso saggio che richiede solo 25 ml di sangue intero è descritto. Ciò fornisce la quantificazione accurata dei sette parametri immunitari: linfociti totali, monociti e neutrofili, così come i sottoinsiemi di cellule T CD4 e CD8, cellule B e le cellule natural killer. Diversi Subsets di questi parametri sono utili in diverse circostanze e modelli, con il neutrofili rapporto dei linfociti, con il massimo di utilità per monitorare la progressione della malattia nel modello mesotelioma. Analizzare i livelli circolanti di cellule immunitarie che utilizzano questo metodo del tubo singolo può anche aiutare a monitorare la risposta ai trattamenti immuno-based e la comprensione dei meccanismi sottostanti che determinano il successo o il fallimento del trattamento.

Introduction

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Mesotelioma maligno (MM) è un tumore aggressivo che deriva da cellule trasformate nella membrana (Mesotelio) che riveste la cavità addominale e polmonare, cuore e gli organi riproduttivi interni, ed è il tumore primario più comune della cavità polmonare o pleura 1,2 . L'esposizione a fibre di amianto rappresenta l'80% di tutte le MM, e mentre sono stati introdotti anni fa il divieto di uso di amianto nella maggior parte dei paesi occidentali, il suo uso molto diffuso nella comunità ha lasciato un'eredità letale. L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha stimato che 107.000 persone nel mondo muoiono ogni anno per malattie legate all'amianto, con tassi di mortalità continuano ad aumentare. Una nuova ondata di incidenza non professionale è anche emergendo e c'è poca comprensione di quando, ea quale livello questo raggiungerà il picco 3.

La maggior parte delle persone con MM viene diagnosticato tardi, quando la chemioterapia sistemica rappresenta una delle uniche opzioni valide 4. La maggior parte effective la chemioterapia e la corrente 'standard di cura' (pemetrexed in combinazione con cisplatino 5) è stato identificato più di 10 anni fa. Tuttavia il fallimento di questo trattamento è inevitabile e non ci sono provati opzioni della riga di secondo, lasciando i pazienti con una prognosi infausta e la sopravvivenza mediana di soli 12 mesi 2. Pertanto, non vi è un urgente bisogno insoddisfatto per trattamenti più efficaci. Nonostante l'esame di un numero di nuove terapie in studi clinici, nessuno ha portato a cambiamenti nella pratica. Ciò è dovuto in parte al basso (5%) trasferimento dei risultati pre-clinici, generalmente eseguiti in modelli murini xenotrapianto, per l'impostazione della clinica 6-8. Tali modelli non fedelmente ricapitolano i complessi aspetti del microambiente tumorale si verificano in posizioni non fisiologiche, spesso in assenza di un sistema immunitario funzionante 9.

Modelli ortotopici singenico creare un ambiente tumorale significativamente più realistico rispetto alla commonly usato modelli di xenotrapianto sottocutanei come i tumori si verificano nella posizione fisiologica corretta con un intatto 10,11 sistema immunitario. Le maggiori dimensioni del ratto esalta il suo uso come un modello di malattia roditore, soprattutto negli studi di droga in cui il sangue di serie trae sono necessari per valutare la risposta al trattamento e la tossicità 12. Inoltre, in modelli in cui il monitoraggio della progressione della malattia è difficile a causa della posizione dei tumori (come nella cavità pleurica), la possibilità di monitorare la progressione della malattia utilizzando fattori trovati in circolo è estremamente attraente. La generazione di un modello ortotopico singenici del mesotelioma pleurico utilizzando ratti immuno-competenti è descritto. Inoltre, un metodo semplice e relativamente non invasivo per monitorare la progressione della malattia pleurica misurando circolanti cellule immunitarie è anche descritto.

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Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti in conformità alle raccomandazioni del Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici. Il protocollo per questo studio è stato approvato dal ospedale cura degli animali e Comitato Etico Royal North Shore. Femmina ratti Fischer 344 (F344, 150-200 g) sono stati mantenuti presso l'impianto di Kearns, Kolling Istituto in condizioni standard (cicli giorno / notte 12 ore di luce e il libero accesso a cibo e acqua).

Nota: Un diagramma di flusso per tutte le procedure sperimentali è presentato in Figura 1.

1. Preparazione di cellule per l'impianto

  1. Culture mesotelioma rat II-45 linea cellulare (noto anche come IL-45; derivato dall'introduzione peritoneale di amianto crocidolite) in RPMI 1640 (RPMI) supporto integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e crescere in condizioni standard (37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2). Maintain da passaging e sub-coltura di circa 01:50 due volte alla settimana in un pallone 75 cm 2.
  2. Preparare i reagenti per la coltura cellulare e delle aliquote caldo a 37 ° C. Reagenti necessari sono i media siero libero RPMI (SFM), RPMI con 10% FBS, tampone fosfato salino (PBS) e 0,5% tripsina-EDTA.
  3. Celle di coltura per l'impianto a circa il 70-80% di confluenza. Questo assicura che siano in fase di crescita lineare.
  4. Celle di raccolta scartando media, lavare una volta con 5 ml di PBS sterile e quindi aggiungendo 3 ml di 0,5% tripsina-EDTA.
  5. Fiaschi Rientro in incubatrice per circa 5 minuti fino a quando tutte le cellule diventano non-aderenti.
  6. Una volta che le cellule non sono aderenti, aggiungere 3 ml di RPMI con 10% FBS per inattivare la tripsina. Raccogliere e cellule centrifugare a 300 xg per 3 min.
  7. Lavare il pellet cellulare in 10 ml di SFM e centrifugare di nuovo a 300 xg per 3 min.
  8. Pellet Lavare nuovamente con 10 ml di gestione sostenibile delle foreste e centrifugare come sopra.
  9. Risospendere le cellule in 10 ml di SFM ed eseguire una conta di cellule utilizzando un emocitometro o strumentazione simile.
  10. Diluire le cellule in modo che il 100 microlitri contiene la quantità di cellule da impiantare.
    Nota: La crescita tumorale è stata dimostrata alla dose partire da 100 cellule in 100 microlitri ma una dose standard è di 500.000 cellule in 100 microlitri.
  11. Preparare cellule sufficiente in mezzi per il numero di ratti da impiantare (cioè, 100 microlitri / ratto), più almeno 0,5 ml extra per compensare le perdite di innesco e il volume morto dell'ago.
  12. Preparare sufficiente SFM (senza celle) da impiantare in ratti di controllo (ad esempio, 100 l / ratto), maggiorato di almeno 0,5 ml in più.
    Nota: Le celle e SFM sono ora pronti per l'impianto. Essi dovrebbero essere tenuti a 37 ° C e impiantati in 2 ore di raccolta per mantenere la vitalità.

2. In vivo impianto di cellule

  1. Posizionare il ratto F344 (> 13 settimane di età) nella camera di induzione e anestetizzare con l'1,4% inalazione isoflurano (o il metodo in uso nella struttura). Una volta che il topo sembra essere mossa addormentato dalla camera di un cono (con 1,4% isoflurano scorre), posizionarlo sul dorso con petto rivolto verso l'alto (vista ventrale). Ciò permette gli organi interni di stabilirsi lontano dalla cavità toracica. Controllare riflessi secondo protocolli istituzionali per garantire il ratto è completamente anestetizzato.
  2. Shave il diritto regio costalis (petto) zona per rimuovere il pelo.
  3. Pulire la zona rasata con l'80% v / v di etanolo.
  4. Identificare il sito di iniezione: a destra, trova il 2 ° ghiandola partire cranica. Il sito di iniezione è di 0,5 cm dalla presente, tra il 3 ° e 4 ° costola dalla fine caudale della gabbia toracica. (Figura 2A).
  5. Mescolare delicatamente le cellule II-45 per sospendere di nuovo. Disegnare lentamente la sospensione cellulare (o SFM per ratti di controllo) in un 1 ml &# 160; siringa senza ago inserito. Se l'ago è fissato per l'elaborazione di cellule vi è la possibilità per le cellule di crescere lungo la linea di iniezione ago. Collegare un 23G x 1¼ ago. Prime l'ago e rimuovere eventuali bolle d'aria.
  6. Una volta che la siringa e l'ago sono pronti, inserire lungo a 20 mm e 5 mm di diametro distanziale sull'albero ago. Questo è utilizzato per evitare che l'ago penetri troppo in profondità nella cavità pleurica durante l'iniezione. Circa 5 mm-12 mm dell'ago esposto è sufficiente per la penetrazione attraverso le nervature senza ledere organi.
  7. Lentamente inserire l'ago tra le costole, disegnare di nuovo sulla siringa per assicurare un vaso sanguigno non è stato perforato (sangue dovrebbe apparire nella siringa) iniettare 100 cellule microlitri o SFM. (Figura 2B).
  8. Rimuovere l'ago e rotolare delicatamente il topo da un lato all'altro per diffondere le cellule nella cavità toracica.
  9. Posizionare il topo in una gabbia e verificare la presenza di recupero. The ratto dovrebbe essere sveglio entro 1 min e iniziando a muoversi.
  10. Ripetere l'operazione per ogni ratto con un nuovo ago. Riutilizzo lo stesso ago si tradurrà in crescita cellulare lungo la linea di iniezione dell'ago.
  11. Monitorare il benessere degli animali quotidiana.
  12. Eutanasia animali a endpoint eticamente definiti come disciplinato dalla commissione etica animale istituzionale. Gli endpoint etiche per i ratti in questi esperimenti sono stati la perdita di peso superiore al 10% o respiro affannoso.

3. Coda Vena Raccolta di sangue

  1. Se il sangue deve essere raccolto subito l'impianto post-cellule, mantenere il topo anestetizzato. Se il campionamento del sangue in un altro punto del tempo, anestetizzare il topo con l'1,4% inalazione isoflurano. Controllare riflessi secondo protocolli istituzionali per garantire il ratto è completamente anestetizzato.
  2. Posizionare il ratto su un lato e individuare una vena della coda laterale.
  3. Sterilizzare la coda con l'80% di etanolo e l'etichetta di un 0,5 ml di EDTA ctubo ollection.
  4. Per raccogliere il sangue, avviare sempre alla fine caudale coda (circa un terzo del cammino lungo). Questo permette ulteriori tentativi più vicino alla fine craniale della coda nel caso il primo tentativo non è riuscito. Mai ricampionamento caudalmente come questo può causare un coagulo di sangue.
  5. Posizionare un 23G x 1 ¼ ago parallelamente alla vena laterale e farlo scorrere in vena con un angolo basso in modo che penetra circa 10 mm (figura 3A).
  6. Nota: Se la vena è stato perforato con successo sangue sarà visibile alla fine fissaggio dell'ago (Figura 3B).
  7. Una goccia di sangue si forma sulla coda al sito della puntura. Raccogliere questo sangue con una pipetta e trasferimento nelle etichettati 0,5 ml (o più piccolo) tubo di raccolta EDTA. Per i test delle cellule immunitarie di 25 ml è sufficiente. Applicare una garza con la pressione di perforare sito fino a quando si arresta l'emorragia.
  8. Flick il tubo di sangue per mescolare il sangue e EDTA a prcoagulazione evento. Mantenere il tempo tra la raccolta del sangue e la miscelazione con l'EDTA più breve possibile per prevenire la coagulazione.
  9. Quando raccolta di sangue da più ratti negozio campioni EDTA di sangue in un rack a temperatura ambiente fino al momento dell'analisi. Sangue processo in 2 ore di raccolta.

4. Preparazione del campione per immunitario Profiling cellulare applicando il metodo di-Bead

Nota: Questo metodo piattaforma singola si basa sull'utilizzo in commercio tubi di conteggio assoluti che hanno un numero noto di perline per ogni campione. Questi tubi contengono pastiglie liofilizzate che si sciolgono durante la preparazione dei campioni, rilasciando le perline. Le perle sono fluorescente e gating sulla popolazione di sfere, conte assolute può essere calcolato.

  1. Assicurarsi che il campione di sangue intero EDTA è ben mescolato ponendolo su un miscelatore rotante lento per diversi minuti. Etichettare una provetta di conteggio assoluto per ogni campione. Un pellet contenente le perline dovrebbe essere visibile sotto tegli titolare tallone metallico sul fondo della provetta.
  2. Trasferire 25 ml di EDTA sangue intero in una provetta di conteggio assoluto etichettati. Il pellet tallone si dissolverà dopo l'aggiunta del sangue.
  3. Per ogni tubo aggiungere 20 ml di anti-ratto cocktail T / B / Natural Killer (NK), 10 ml di anti-ratto CD8a PE, 10 ml di anti-topo CD4 (dominio 1) FITC e 10 ml di anti-ratto CD45 PE / Cy7 (Figura 4A). Fluorofori sono definiti in Tabella 1.
  4. Centrifugare brevemente tubo (300 xg) per assicurare gli anticorpi e le cellule sono nella parte inferiore del tubo e non attaccato al lato del tubo. Vortex per miscelare e incubare per 15 minuti a RT.
  5. Per lisare i globuli rossi aggiungono 400 ml di 10 mM Tris, 0,15 M tampone cloruro di ammonio (pH 7.5) e agitare per mescolare. Lysis è completa quando il campione appare traslucido e non nuvoloso (figure 4B e C). La mancata lisare il campione completamente porterà ad aumentared fondo e falsamente elevati conteggi durante l'analisi mediante citometria a flusso.

5. citometria a flusso Trattamento dei campioni

Nota: eseguire su un colore 4 citofluorimetro.

  1. Aprire il software in modalità di acquisizione e un nuovo modello con 8 lotti come illustrato nella Figura 5.
  2. Regolare le impostazioni dello strumento a quelli elencati nella Tabella 1 e impostare cancello R1 (FITC [FL-1] contro APC [FL-4]), figura 5Ai) per contare le perline fluorescenti. Le altre porte non sono importanti in questa fase di acquisizione ma saranno necessari per l'analisi. Il conteggio assoluto sfere utilizzate in questo protocollo contengono coloranti fluorescenti e possono essere rilevati in qualsiasi canale, anche se sono più deboli nel canale blu.
  3. Utilizzando un campione di sangue di controllo preparato, vortice e poi caricare sul citometro e correre a bassa velocità (12 ml / min) su modalità di configurazione in modo da porte di acquisizione dati può essere regolata.
  4. Impostare l'acquisizione diraccogliere 10.000 eventi nella porta tallone R1.
  5. Impostare una cartella per registrare i dati e impostare il numero di file e file di esempio etichetta nel menu di acquisizione.
  6. Caricare il campione da analizzare sul citometro e impostare la velocità di flusso medio (35 microlitri / min). Eseguire ogni campione alla stessa portata. La portata può essere necessario variare a bassa (12 ml / min) o alto (60 microlitri / min), ma è generalmente appropriata medio. A questo ritmo ci vogliono circa 90 a 120 secondi per acquisire 10.000 eventi tallone per ciascun campione.
  7. Una volta che il campione è stato caricato guardare i grafici a dispersione per assicurarsi che gli eventi appaiono nella porta tallone R1. Inizialmente ci può essere una certa instabilità nella pressione del campione provocando deriva nelle trame dispersione. Attendere che questo si stabilizzi.
  8. Una volta stabilizzato, clicca su acquisire e consentire campione per l'esecuzione. Una volta che il citometro ha terminato l'acquisizione di 10.000 eventi tallone nella R1 citometro si fermerà l'acquisizione e salvare tutti i dati.
  9. Rimuovere il campione e gettare flusso tuessere. Il citometro è ora pronto per il campione successivo. Eseguire tutti i campioni e poi procedere alla modalità di analisi.

6. immunitario Analisi cellulare

Nota: le strategie di gating e algebra booleana vengono utilizzate per definire ogni popolazione cellulare. Booleana è un metodo di analisi logica based che consente più operazioni in un'unica definizione. Il software di analisi del citometro di flusso (ad esempio, BD CellQuest) consente l'utilizzo di booleana. Le equazioni sono usati per rappresentare attivamente per il notevole reattività negativa che assiste nella definizione della cella per identificare più specificamente ciascuna popolazione cellulare. 'Regioni' sono usati per definire una 'porta'. Regioni definiscono uno spazio bidimensionale 2 mentre porte possono essere composti di numerose regioni collegate da operatori algebrici (+, *, -, definito nella tabella 2).

  1. Passare il software di modalità di analisi. Un modello di analisi dovrebbe essere generato in modo che corrisponda
  2. Analizzare ogni singolo file (ad esempio, ogni singolo campione) separatamente. Impostare cancelli R1 fino alla R9 e quindi impostare gli algoritmi per ogni tipo di cellula, come definito nella tabella 2 (mostrato anche in figura 5).
  3. Utilizzare il contatore statistiche cella per calcolare popolazioni di cellule individuali definiti da cancelli e algoritmi (Tabella 2 e Figura 5). Gli algoritmi regoleranno automaticamente i numeri di cellulari nel contatore statistiche cellulari.
  4. Calcola sottopopolazioni cellulari utilizzando la seguente equazione:
    Equazione 1
    Nota: Numero di eventi cellulari contati (ad esempio, gli eventi di cellule T CD4) viene enumerato utilizzando l'equazione di cui sopra per indicare il numero di cellule per ml di sangue. Esempi sono mostrati in Figura 5.

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Representative Results

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Il metodo usato in questo documento per la generazione di un modello ortotopico di mesotelioma pleurico utilizzando cellule II-45 ha determinato animali soccombono a mesotelioma in tempi riproducibile e rapido, senza ratti morire a causa del metodo di impianto. Titolazione del numero di cellule impiantate determinato che 1x 10 3 cellule era il numero minimo richiesto per modello pienamente penetrante (100% attecchimento). Il diverso numero di cellule impiantate nei ratti cambiato il decorso della malattia senza sembrare influenzare la gravità della malattia. Gli animali che hanno ricevuto 1 x 10 3, 1 x 10 4 e 5 x 10 5 cellule raggiunti endpoint etico definiti dal giorno 40, 30 e 20 giorni rispettivamente (Figura 6).

Il sangue è stato raccolto da ratti circa due volte ogni settimana senza complicanze osservate relativi alla collezione. È importante notare che non più del 10% del volume totale del sangue (ocirca 2 ml) devono essere raccolti in un periodo di due settimane. Un test di citometria di flusso che ha unito le strategie gating e l'algebra booleana è stato istituito per individuare i linfociti, monociti e neutrofili e linfociti T sottoinsiemi, T CD4, CD8 T, cellule B e NK. La media e la gamma per ogni tipo di cellula è stato stabilito utilizzando ratti di controllo (n = 5) ed è stata confrontata con la media e la gamma di II-45 ratti impiantati all'endpoint (Tabella 3). I valori endpoint sono stati confrontati prima di determinare se le differenze esistessero della conta delle cellule del sistema immunitario tra animali sani e malati. In confronto ai ratti di controllo sani, i linfociti totali, cellule T CD4, linfociti B e le cellule NK sono diminuiti nel II-45 ratti impiantati all'endpoint mentre monociti, neutrofili e dei neutrofili al rapporto di linfociti (NLR) sono aumentati.

Per determinare se questi parametri di cellule immunitarie modificate anche con la progressione della malattia e, quindi, potrebbero essere usati come marcatori surrogati fo il monitoraggio della malattia, i campioni sono stati confrontati longitudinali (Figura 7). Il parametro più informativo longitudinale era NLR con aumenti rilevati fino a 7 giorni prima endpoint etici (Figura 7A). Per i ratti con celle alte dosi, sono stati rilevati alti NLRs tra il giorno 7 e il giorno 12 dopo l'impianto, mentre per i ratti con celle a basso dosaggio, il NLR ha cominciato ad aumentare tra il giorno 18 e 22. Totale conta dei linfociti è diminuito con la progressione della malattia nei topi con una più modello decorso della malattia (dose cella basso: 1 x10 4, Figura 7B). Questa diminuzione non era evidente nei ratti con un corso a tempo rapido (dose elevata cella: 5 x10 5). I monociti sono rimasti a livelli normali fino a quando la raccolta terminale quando grossolanamente aumento della conta sono stati spesso osservati (Figura 7C). Gli altri conta delle cellule del sistema immunitario (neutrofili, NK, cellule B e le cellule CD4 e CD8 T) sono stati più variabili e quindi meno informativo.


Figura 1. Diagramma di flusso di procedura sperimentale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Ubicazione e sito dell'impianto. Il ratto è prima anestetizzati, collocato sul dorso e sul diritto regio costalis (petto) zona è rasato per rimuovere pelliccia. Sul lato destro, il capezzolo 2 ° dall'alto è identificato e il sito di iniezione si trova 0,5 cm prossimale a questo, tra il 3 ° e 4 ° costola dal fondo della gabbia toracica (A). Un distanziatore viene quindi posto sopra l'ago preparato e della siringa per evitare che l'ago penetrare troppo profondamente nel pleurico cavità e 100 ml di cellule o SFM viene iniettato (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. tecnica di campionamento per la raccolta di sangue dalla coda. Posizione A 23G x 1¼ ago parallelamente alla vena laterale (A). Far scorrere l'ago nella vena con un angolo basso, circa 10 mm di profondità, e tenere premuto per alcuni secondi fino a quando il sangue è visibile (B) e rimuovere ago. Raccogliere il sangue con una pipetta (C). Se necessario delicatamente corsa vena della coda per garantire il sangue continua a scorrere. Sangue Pipettare in un tubo di raccolta da 0,5 ml di EDTA (D), mescolando, come si va per prevenire la coagulazione. arge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. L'etichettatura di campione di sangue in un tubo conteggio assoluto per analisi citofluorimetrica. Sanguigno (25 mL) e gli anticorpi vengono aggiunti ad un tubo di conteggio assoluto (A). Il tubo viene quindi incubato in agitazione e per 15 minuti a temperatura ambiente. Prima l'aggiunta di tampone di cloruro di ammonio per lisare i globuli rossi, il campione appare torbido o opaco (B). Una volta lisato, il campione appare traslucido ed è pronto per l'analisi di citometria di flusso (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. strategia di gating per l'analisi di citometria a flusso. Un set di dati 6-dimensionale in grado di identificare i linfociti, monociti e neutrofili e linfociti T sottoinsiemi, T CD4, CD8 T, cellule B e NK. Le strategie di gating definite ed algoritmi incorporano sia la reattività negativo e positivo che definiscono ogni tipo di cellula che consente l'identificazione specifica. Il numero di perline in ciascun tubo di conteggio assoluto (sul sacchetto per ogni tubo) viene registrata per ciascun campione ed è necessario per calcolare il numero di cellule per ml di sangue per ogni sottoinsieme come mostrato. L'algoritmo gating completa per ogni sottoinsieme di cellule è elencata alla destra degli appezzamenti di analisi. (Ai) Perle (R1) sono inizialmente conteggiati per FITC (FL-1) rispetto APC (FL-4). L'acquisizione è impostata su circa 10.000 eventi (9960 per questo esempio). (Aii) Debris (R2) è identificato da FSC contro SSC e rimosso da tutte le successive gDELL'INDICE DI. (Bi) Dopo la rimozione dei detriti (R2) FSC contro SSC differenzia popolazione globulo bianco in linfociti (R3), monociti (R4) e neutrofili (R5). (Bii) Le popolazioni di cellule individuate in (Bi) sono confermate con il leucociti comune antigene CD45 gating su PE / Cy7 (FL-3) vs SSC. (BIII) La popolazione linfocitaria (R3) viene ulteriormente differenziate in cellule T (R6) con CD3 gating su APC (FL-4) contro SSC. ( cellule biv) CD8 T sono linfociti (R3) differenziate in cellule T (R6) che esprimono anche CD8a (R9) e sono gated su PE (FL-2) rispetto SSC. (Ci) cellule B e le cellule NK sono definiti come i linfociti ( R3) che sono CD3 negative. Cellule B (R7) sono differenziati dalle cellule NK quanto esprimono CD45RA e sono gated da APC (FL-4) rispetto FITC (FL-1). Cellule (CII) CD4 T sono definiti come i linfociti (R3) che co-esprimono CD3 (cellule T, R6) eCD4 (R8), ma non esprimono uno qualsiasi degli altri marcatori utilizzati. Essi sono differenziati utilizzando FITC (FL-1) rispetto a PE (FL-2) gating. Le cellule NK sono definiti come qualsiasi linfociti residua che non sia già stato definito che esprime anche CD161a. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Curva di sopravvivenza per i ratti impiantati con differenti dosi di cellule mesotelioma II-45. Gruppi di ratti sono stati impiantati con pleurally 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) o 1 x 10 2 (n = 4) II-45 cellule di mesotelioma in 100 microlitri di volume e quindi monitorati fino al punto finale etico quando sono stati sacrificati. La sopravvivenza è stata rappresentata graficamente con il log-rank (Mantel-Cox) Metodo Gehan-Breslow-Wilcoxon. p>

Figura 7
Figura 7. longitudinale circolanti conta delle cellule immunitarie di ratti con mesotelioma rispetto alla media e autonomia ratti sani di controllo. Il controllo sano significa per ciascun tipo di cella è indicato come una ininterrotta linea nera orizzontale (valore viene mostrato sulla destra asse Y ogni grafico) e la gamma è raffigurato dalla zona ombreggiata grigia. L'asse Y mostra i conteggi per ml di sangue per il tipo di cellulare indicato, o il valore di NLR. L'asse X è l'andamento nel tempo di progressione della malattia, dove il giorno 0 è il giorno di impianto. Risultati longitudinali per 2 ratti impiantati con 1 x 10 4 cellule (A, B) e 2 ratti impiantati con 5 x 10 5 cellule (C, D) sono indicati. (A) NLR, (B) totale conta dei linfociti, (C) conta dei monociti.ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Rivelatore Fluoroforo Dettagli Voltaggio Modo
FSC --- --- E00 Lineare
SSC --- --- 450 Lineare
FL-1 FITC 533/30 nm 670 Log
FL-2 PE 585/40 nm 675 Log
FL-3 PE / Cy7 670nm (passaggio lungo) 600 Log
FL-4 APC 675/25 nm 735 Log

Tabella 1: Tensione impostazioni del rivelatore di flusso citol'acquisizione dei dati metrici utilizzando un flusso di colore 4 citometro. guadagno ampiezza è impostato a 1 per tutti i rivelatori. FSC: forward scatter, SSC: side scatter, FITC: isothyocyanante fluoresceina, PE: Ficoeritrina, APC: Allophycocyanine.

Sottoinsieme delle cellule Marcatori Cellulari Gating Algoritmo
Perline R1
Detriti R2
Celle (pan-leucociti) CD45 + -R2
Linfociti CD45 + FSC contro SSC R3 * -R2
I monociti CD45 + FSC contro SSC R4 * -R2
I neutrofili CD45 + FSC contro SSC R5 * -R2
Cellule T (totale) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
CD8 T positivo cells CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
Cellule B CD45 + / CD3- / CD45RA + R7 * R3 * -R2
Cellule T CD4 positive CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2)
Cellule Natural Killer CD45 + / CD3- / CD161a + R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * * R3 -R2)]

Tabella 2: cella marcatori e gli algoritmi di gating per caratterizzare ogni sottoinsieme delle cellule immunitarie per l'algoritmo di gating, il simbolo '+' significa 'o' e permette a due popolazioni separate da aggiungere insieme anche se le loro reazioni non si sovrappongano.. Il simbolo '-' significa 'non' e può sottrarre uno popolazione dall'interno di un'altra popolazione definita o il contrario di una popolazione precedentemente descritto. Il simbolo '*' significa 'e' e definisce uno spazio che è presente solo quando due reazioni sovrappongono. Sottoinsiemi di cellule immunitarie I ratti di controllo (n = 5) II-45 ratti impiantati all'endpoint (n = 4) Significare Gamma Significare Gamma Totale linfociti 165.7 111,5-207,0 97,9 54,4-137,0 Linfociti T CD4 72.9 45,4-111,4 38.4 25,6-50,0 CD8 linfociti T 36.6 26,0-48,3 32.1 16,1-46 Linfociti B 56,6 36,0-83,9 24.7 11,2-36,0 Cellule NK 9.3 3,1-15,7 4.0 1,34-7,7 I monociti 27.1 12,7-39,0 373.3 42,4-575,8 I neutrofili 51.4 24,3-87,0 159.2 51,1-366,0 NLR 0.3 0,18-0,42 1.8 0,94-2,66

Sono indicati la media e la gamma di cellule immunitarie in ratti sani di controllo (n = 5) e II-45 ratti impiantati all'endpoint (n = 4) Risultati per ml di sangue: Tabella 3..

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Dettagli Questo documento un metodo per la generazione di un ratto singenici modello ortotopico di mesotelioma pleurico e un metodo semplice per monitorare la progressione della malattia attraverso longitudinale prelievo di sangue.

Il modello II-45 è stato sviluppato da esponendo ratti Fischer 344 alle fibre di amianto 13. Anche se questa esposizione rappresenta le vere dinamiche delle interazioni ospite-amianto sistema-immunitario per il mesotelioma patogenesi, ha un ritardo di tempo lungo (tenendo anni per generare) e può essere pericolosa per i ricercatori a causa della potenziale esposizione alle fibre di amianto. L'impianto ortotopico di cellule II-45 nella cavità pleurica di animali fornisce un modello sicura e rapida progressione del cancro che imita malattia umana in un ospite immuno-competenti 11. Tuttavia i metodi ei principi esatti ad aderire durante queste procedure sperimentali non sono ben definiti. La procedura descritta risultati in un modello che è altamente riproducibile relarelativamente indipendente dalla esperienza dell'operatore. I punti critici sono 1, raccolta II-45 cellule in fase di crescita esponenziale e conteggio preciso delle cellule vitali; 2, il corretto posizionamento del sito di impianto e di garantire l'ago non penetra troppo in profondità e forare i polmoni o danneggiare il cuore, e 3, mantenere e controllare il benessere degli animali.

La linea cellulare II-45 è in rapida crescita e richiede passaging ogni 3 o 4 giorni in cultura, quindi durante la preparazione per l'impianto, le cellule devono essere sub-colta e la crescita monitorati quotidianamente. Le cellule devono essere raccolti e contati quando nella fase di crescita esponenziale, cioè, approssimativamente il 70% di confluenza. Risospensione delle cellule in media liberi siero anziché PBS riduce lo stress sulle cellule, mentre il conteggio e la preparazione per l'impianto. Conta delle cellule accurate sono fondamentali per la riproducibilità, in particolare quando il dosaggio con il numero di cellule bassi (ad esempio, da 100 a 1.000). Il suspensione deve essere omogenea e sono composti da singole cellule (nessun grumi). Un volume di 100 microlitri di impianto consente un dosaggio accurato senza compromettere espansione polmonare attraverso eccessivo liquido nella cavità pleurica. I passaggi chiave presso l'impianto sono corretto posizionamento e limitando la penetrazione dell'ago ad una profondità non superiore a 12 mm. Il corretto posizionamento dell'ago nel sito di iniezione è estremamente importante assicurare che le cellule sono impiantati nella cavità pleurica e non nella cavità peritoneale. Correttamente impiantare cellule troppo basso può causare tumori mesotelioma crescono attraverso il diaframma, nel fegato e cavità peritoneale. Limitare la profondità di penetrazione dell'ago è anche estremamente importante per prevenire la mortalità a causa di danni agli organi interni. Questa limitazione può essere realizzato attraverso l'uso di un distanziatore per un lungo ago (come mostrato) o l'uso di un ago più corto della lunghezza dell'albero di 5 mm a 12 mm. Nelle nostre mani, si sono verificati eventi avversidurante l'impianto delle cellule. È anche essenziale per sostituire l'ago dopo ogni impianto. In caso contrario si può portare a tumori che crescono fuori dalla cavità toracica lungo la linea di iniezione. Tale crescita di fuori della cavità pleurica è dovuto alle cellule residue sullo stelo dell'ago e può determinare la sopravvivenza prolungata.

Nelle nostre mani questo modello ha un tumore al tasso di attecchimento del 100% quando si somministra ≥ 1 x 10 3 cellule. La progressione della malattia nel modello mesotelioma II-45 è abbastanza rapida, essendo meno di 40 giorni quando 1 x 10 4 cellule sono impiantati e meno di 20 giorni per una dose di 5 x 10 5 cellule. Ciò può limitare l'utilità di questo modello per i test pre-clinico di alcune terapie. Le cellule II-45, pur non essendo disponibili in commercio possono essere di provenienza con il permesso dal cedente 13. Tuttavia, le stesse tecniche e principi di impianto possono essere applicati anche ad altre linee di cellule di ratto mesotelioma disponibili da repos linee cellulariitories quando abbinato con i relativi ceppi di ratto singenici. La dose ottimale di cellule può variare con linea cellulare e avrebbe bisogno di essere determinato per ogni linea.

Monitoraggio progressione della malattia e il benessere degli animali è difficile in quanto i tumori sono interni e non possono essere monitorate in base alle dimensioni. Quindi abbiamo cercato di sviluppare un metodo di monitoraggio degli animali in grado di predire il deterioramento della loro condizione, come un aumento della NLR o qualsiasi altro cambiamento di marcatori di cellule del sistema immunitario prima che i sintomi fisici divennero visibili. Lo schermo sangue sviluppato utilizza solo 25 ml di sangue periferico in modo che il campionamento regolare può essere eseguita con il minimo disagio per l'animale. La tecnica di campionamento descritto richiede pratica per acquisire le competenze necessarie. Tuttavia, una volta padroneggiato è veloce e poco invasiva.

Un punto critico nella analisi del sangue è per prevenire la coagulazione del campione di sangue da un rapido trasferimento in un tubo EDTA. Campioni coagulatidovrebbe essere scartato come i conteggi saranno imprecisi. Un altro punto critico è la lisi dei globuli rossi prima dell'analisi delle cellule. Se i globuli rossi non sono completamente lisati l'aumento dello sfondo falsamente elevare i conteggi. Mentre la configurazione iniziale del dot plot e gating è che richiede tempo, una volta che le impostazioni e il modello sono salvati, il test richiede piccolo aggiustamento. La strategia di gating impiegato utilizza un multi-parametro booleano approccio algebrico di deconvolute i dati. Utilizzando combinazioni note di esclusiva e condivisa antigeni gli algoritmi per ogni riga della strategia porta definire il tipo di cellula discreta in questa matrice di dati a sei dimensioni 14. Questa accoppiata con precisione costante della raziometrico tecnologia basata bead-15-17 ha il vantaggio di consentire l'enumerazione di qualsiasi tipo di cellula definito sia come percentuale di cellule e un conteggio assoluto per microlitri.

Sta diventando sempre più riconosciuto che il sistema immunitario pstabilisce un ruolo importante nella patogenesi del cancro 18. Sia il fallimento del sistema immunitario di riconoscere e distruggere le cellule maligne e la soppressione delle cellule immunitarie da tumori può portare alla crescita del tumore incontrollata. Pertanto, l'inclusione di un microambiente tumorale immuno-competente è una considerazione critica durante la modellazione cancro ed è uno dei principali vantaggi di modelli di cancro singenici. Questi modelli immuno-competenti di creare un ambiente realistico e clinicamente rilevanti per la crescita del tumore e l'interazione immunitario, che è carente in modelli xenogene.

I parametri immunitari identificati in questo studio che ha accompagnato la progressione della malattia, vale a dire, la conta dei linfociti, monociti e la conta NLR, hanno anche dimostrato di correlare con prognosi sfavorevole nel mesotelioma umano 19-21 fornendo prove per la rilevanza del modello e il test del sangue . Nei modelli presentati, l'utilità clinica di monitorare i parametri immunitari aumentato ingegnoh corso di tempo più lungo (dose bassa), e può essere ulteriormente migliorata con campionamento più frequente nelle fasi successive della malattia. Mentre questo documento si concentra su un modello di mesotelioma, la capacità di monitorare la progressione tumorale mediante prelievo di sangue periferico può essere utilizzato per tutti i modelli di cancro singenici. Inoltre, il test può anche essere utilizzato per valutare la risposta immunologica a differenti terapie. In precedenza abbiamo utilizzato questo test per monitorare la risposta ad una terapia vaccino contro il cancro in un modello glioma singenici (9L) 22. In questo studio, le cellule CD4 e CD8 T sono stati i marcatori più informativi. Abbiamo anche usato questo test e il modello mesotelioma II-45 per identificare differenze nella risposta immunitaria ai tumori resistenti a diversi chemioterapici 11. In questo studio, tutti i parametri eccetto cellule T CD8 hanno mostrato differenze significative. Il monitoraggio longitudinale durante la progressione della malattia descritta qui mette in evidenza il potenziale di diversi parametri di cella immune da correlazionarsi con la progressione del cancro e il benessere degli animali quando si intraprendono singenico modellazione ortotopico di cancro nei ratti.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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Ortotopico impianto e periferico immunitario monitoraggio cellulare nel Modello II-45 Singenico Rat mesotelioma
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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