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Medicine

Ortotópico Implantación y Seguimiento de la célula inmune periférica en el modelo II-45 Singénico Rata Mesotelioma

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

Se presenta la generación de un modelo de rata ortotópico de mesotelioma maligno pleural mediante la implantación de II-45 células de mesotelioma en la cavidad pleural de ratas inmunocompetentes. Un método de citometría de flujo para analizar siete subconjuntos de células inmunes en estos animales de una muestra de sangre 25 l también se describe.

Abstract

El enorme aumento del interés en los tratamientos de base inmunológica para el cáncer, tales como vacunas e inhibidores de punto de control inmunológico, y un mayor entendimiento del papel del microentorno del tumor en la respuesta al tratamiento, en conjunto apuntan a la necesidad de modelos ortotópico inmuno-competentes para las pruebas preclínicas de estas nuevas terapias. En este trabajo se muestra cómo establecer un modelo de rata inmune competente ortotópico de mesotelioma maligno pleural. Progresión de la enfermedad de Monitoreo en modelos ortotópico es confundida por la ubicación interna de los tumores. Para supervisar longitudinalmente progresión de la enfermedad y su efecto sobre células inmunes circulantes en este y otros modelos de rata de cáncer, el flujo de un solo tubo ensayo de citometría de que requiere sólo 25 l de sangre completa se describe. Esto proporciona la cuantificación exacta de los siete parámetros inmunológicos: linfocitos totales, monocitos y neutrófilos, así como los subconjuntos de células T CD4 y CD8, células B y células asesinas naturales. Diferentes subsets de estos parámetros son útiles en diferentes circunstancias y modelos, con el neutrófilo a la proporción de linfocitos que tiene la mayor utilidad para el seguimiento de progresión de la enfermedad en el modelo de mesotelioma. Analizando los niveles circulantes de células inmunes que utilizan este método solo tubo también puede ayudar en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos de base inmunológica y la comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen al éxito o fracaso de un tratamiento.

Introduction

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El mesotelioma maligno (MM) es una neoplasia agresiva que surge de las células transformadas en la membrana (mesotelio) que recubre el pulmón y la cavidad abdominal, el corazón y los órganos reproductivos internos, y es el tumor primario más frecuente de la cavidad pulmonar o la pleura 1,2 . La exposición a las fibras de amianto representa el 80% del total de MM, y si bien la prohibición de uso del amianto se introdujeron hace décadas en la mayoría de los países occidentales, su uso generalizado en la comunidad ha dejado un legado mortal. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que 107.000 personas en el mundo mueren cada año por enfermedades relacionadas con el amianto, con tasas de mortalidad siguen aumentando. Una nueva ola de incidencia no ocupacional también está emergiendo y hay poca comprensión de cuándo, y en qué nivel esta llegará a su máximo 3.

La mayoría de las personas con MM son diagnosticados tarde cuando la quimioterapia sistémica representa una de las únicas opciones viables 4. Las mayoría de effective la quimioterapia y la corriente 'estándar de atención' (pemetrexed junto con cisplatino 5) fue identificado hace más de 10 años. Sin embargo el fracaso de este tratamiento es inevitable y no hay opciones de segunda línea probadas, dejando los pacientes con un pronóstico sombrío y la supervivencia media de sólo 12 meses 2. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha urgente de tratamientos más eficaces. A pesar del examen de una serie de nuevos tratamientos en ensayos clínicos no se ha traducido en cambios en la práctica. Esto es debido en parte a la baja (5%) transferencia de resultados pre-clínicos, generalmente realizado en modelos de xenoinjerto de ratón, al ajuste de la clínica 6-8. Tales modelos no recapitulan fielmente los complejos aspectos de la microambiente tumoral se producen en lugares no fisiológicas, con frecuencia en la ausencia de un funcionamiento del sistema inmunológico 9.

Modelos ortotópico singeneicos crean un ambiente del tumor significativamente más realista que el commonly utilizado modelos de xenoinjerto subcutáneos como se producen los tumores en el lugar fisiológica correcta con un 10,11 intacta sistema inmunológico. El mayor tamaño de la rata aumenta su uso como modelo de la enfermedad de roedores, especialmente en los estudios de la droga donde la sangre dibuja serie se requieren para evaluar la respuesta al tratamiento y la toxicidad 12. Además, en modelos en los que el seguimiento de la progresión de la enfermedad es difícil debido a la ubicación de los tumores (como en la cavidad pleural), la capacidad de monitorear progresión de la enfermedad utilizando factores que se encuentran en la circulación es extremadamente atractivo. Se describe la generación de un modelo ortotópico singénico de mesotelioma pleural usando ratas inmuno-competentes. Además, también se describe un método fácil y relativamente no invasivo para el seguimiento de progresión de la enfermedad pleural mediante la medición de las células inmunes circulantes.

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Protocol

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Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos. El protocolo de este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el Hospital Royal North Shore de Ética. Mujer ratas Fischer 344 (F344, 150-200 g) se mantuvieron en el Centro de Kearns, Kolling Instituto en condiciones estándar (12 horas de luz / oscuridad ciclos y el libre acceso a los alimentos y el agua).

Nota: Un diagrama de flujo para todos los procedimientos experimentales se presenta en la Figura 1.

1. Preparación de las células para la implantación

  1. Cultura del mesotelioma rata II-45 línea celular (también conocido como IL-45; obtenidas por introducción peritoneal del amianto crocidolita) en medio RPMI 1640 (RPMI) suplementado con suero bovino al 10% fetal (FBS) y crecer en condiciones estándar (37 ° C incubador humidificado con 5% de CO 2). Maintaen por pases y sub-cultivo aproximadamente a las 01:50 dos veces por semana en un matraz de 75 cm2.
  2. Preparar reactivos para cultivo celular y alícuotas caliente a 37 ° C. Reactivos requeridos incluyen medios RPMI sin suero (SFM), RPMI con 10% FBS, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 0,5% de tripsina-EDTA.
  3. Células de cultivo para la implantación de aproximadamente el 70-80% de confluencia. Esto asegura que están en la fase de crecimiento lineal.
  4. Células Cosecha descartando los medios de comunicación, de lavar una vez con 5 ml de PBS estéril y después añadiendo 3 ml de 0,5% de tripsina-EDTA.
  5. Matraces Volver a la incubadora durante aproximadamente 5 min hasta que todas las células se vuelven no adherente.
  6. Una vez que las células son no adherente, añadir 3 ml de RPMI con 10% de FBS para inactivar la tripsina. Recoger y centrifugar las células a 300 xg durante 3 min.
  7. Lavar el sedimento celular en 10 ml de SFM y se centrifuga de nuevo a 300 xg durante 3 min.
  8. Pellet de células de lavado de nuevo con 10 ml de SFM y centrifugar como anteriormente.
  9. Resuspender las células en 10 ml de SFM y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro o instrumentación similar.
  10. Diluir las células de manera que 100 l contiene la cantidad de células para ser implantado.
    Nota: El crecimiento del tumor se ha demostrado en una dosis tan baja como 100 células en 100 l pero una dosis estándar es de 500.000 células en 100 l.
  11. Preparar suficientes células en medios para el número de ratas para ser implantado (es decir, 100 l / rata), además de al menos 0,5 ml extra para compensar las pérdidas de imprimación y el volumen muerto de la aguja.
  12. Preparar suficiente SFM (sin células) para ser implantado en ratas de control (es decir, 100 l / rata), además de al menos 0,5 ml adicional.
    Nota: Las células y SFM están ya listos para su implantación. Deben mantenerse a 37 ° C y se implantaron dentro de 2 horas de la cosecha para mantener la viabilidad.

2. In vivo implantación de células

  1. Coloque la rata F344 (> 13 semanas de edad) en la cámara de inducción y anestesiar utilizando 1,4% inhalación isoflurano (o el método en uso en la instalación). Una vez que la rata parece ser movida dormidos desde la cámara a un cono de la nariz (con 1,4% de isoflurano fluye), colocarla en su espalda con el pecho hacia arriba (vista ventral). Esto permite que los órganos internos se asienten fuera de la cavidad torácica. Compruebe reflejos de acuerdo con los protocolos institucionales para asegurar la rata está totalmente anestesiado.
  2. Afeitarse el área derecha costalis regio (pecho) para quitar la piel.
  3. Limpie la zona afeitada con un 80% v / v de etanol.
  4. Identificar el lugar de la inyección: en el lado derecho, busque la segunda glándula partir craneal. El sitio de inyección es de 0,5 cm proximal a este, entre la tercera y la cuarta costilla desde el extremo caudal de la caja torácica. (Figura 2A).
  5. Mezclar suavemente las células II-45 para volver a suspender. Lentamente dibujar la suspensión celular (o SFM para el control de ratas) en un 1 ml y# 160; jeringa sin aguja. Si una aguja se adjunta para la elaboración de células existe el potencial para que las células crecen a lo largo de la línea de inyección de la aguja. Adjunte una 23G x 1¼ aguja. Primer de la aguja y eliminar cualquier burbuja de aire.
  6. Una vez que la jeringa y la aguja se cebaron, coloque a 20 mm de largo y 5 mm de diámetro espaciador sobre el eje de la aguja. Esto se utiliza para evitar que la aguja penetre demasiado profundamente en la cavidad pleural durante la inyección. Aproximadamente 5 mm-12 mm de aguja expuesta es suficiente para la penetración a través de las costillas sin dañar cualquier órgano.
  7. Lentamente inserte la aguja entre las costillas, retroceder en la jeringa para asegurar un vaso sanguíneo no ha sido perforado (sin sangre debe aparecer en la jeringa) y luego inyectar 100 células mu l o SFM. (Figura 2B).
  8. Retire la aguja y rodar suavemente la rata de lado a lado para difundir las células en la cavidad torácica.
  9. Coloque la rata en una jaula y compruebe si hay recuperación. The rata debe estar despierto dentro de 1 min y empezar a moverse.
  10. Repita el procedimiento para cada rata utilizando una aguja nueva. La reutilización de la misma aguja resultará en el crecimiento celular a lo largo de la línea de inyección de la aguja.
  11. Supervisar el bienestar de los animales diariamente.
  12. La eutanasia a los animales en los criterios de valoración ética definidos como gobernado por el comité de ética animal institucional. Los criterios de valoración éticos para las ratas en estos experimentos eran la pérdida de peso de más de 10% o dificultad para respirar.

3. cola vena extracción de sangre

  1. Si la sangre se debe desechar inmediatamente la implantación de células post, mantener la rata anestesiada. Si el muestreo de sangre en otro punto del tiempo, anestesiar la rata utilizando 1,4% de inhalación de isoflurano. Compruebe reflejos de acuerdo con los protocolos institucionales para asegurar la rata está totalmente anestesiado.
  2. Coloque la rata sobre su lado y localizar una vena lateral de la cola.
  3. Esterilizar la cola con etanol al 80% y la etiqueta de un 0,5 ml de EDTA ctubo ollection.
  4. Para recoger la sangre, siempre comienzan en el extremo caudal de la cola (aproximadamente un tercio del camino a lo largo). Esto permite que nuevos intentos más cerca del extremo craneal de la cola en caso de que el primer intento no tiene éxito. Nunca volver a muestrear caudal ya que esto puede causar un coágulo de sangre.
  5. Coloque una 23G x 1¼ aguja paralela a la vena lateral y deslícela en la vena con un ángulo pequeño por lo que penetra aproximadamente 10 mm (Figura 3A).
  6. Nota: Si la vena se ha perforado con éxito la sangre será visible en el extremo de fijación de la aguja (Figura 3B).
  7. Una gota de sangre se forma en la cola en el sitio de la punción de la aguja. Recoge esta sangre con una pipeta y transferencia a los marcados 0,5 ml (o menor) tubo de recogida de EDTA. Para el ensayo de células inmunes 25 l es suficiente. Aplicar una gasa con la presión para perforar sitio hasta que deje de sangrar.
  8. Flick el tubo de sangre para mezclar la sangre y EDTA a PRcoagulación evento. Mantener el tiempo entre la recogida de sangre y la mezcla con el EDTA lo más corto posible para evitar la coagulación.
  9. Cuando la recogida de sangre a partir de múltiples ratas almacenar muestras de sangre con EDTA en un bastidor a TA hasta el análisis. Sangre Proceso dentro de 2 horas de la recolección.

4. Preparación de muestras para Inmune Profiling celular utilizando el método basado en la gota

Nota: Este método se basa en la plataforma de un solo uso de tubos de conteo absolutos disponibles comercialmente que tienen un número conocido de los granos para cada muestra. Estos tubos contienen gránulos liofilizados que se disuelven durante la preparación de la muestra, la liberación de las cuentas. Las perlas se marcaron fluorescentemente y por gating en la población de perlas, los recuentos absolutos se pueden calcular.

  1. Asegúrese de que la muestra de sangre entera EDTA se mezcla bien colocándolo en un mezclador rotatorio lento durante varios minutos. Etiquetar un tubo de recuento absoluto para cada muestra. Un sedimento que contenía las perlas debe ser visible debajo tél portador del talón de metal en la parte inferior del tubo.
  2. Transferir 25 l de EDTA sangre entera en un tubo de recuento absoluto etiquetado. El sedimento de perlas se disolverá después de la adición de la sangre.
  3. A cada tubo se añaden 20 l de anti-rata cóctel / B / Killer celular (NK) natural T, 10 l de anti-rata CD8a PE, 10 l de anti-rata CD4 (dominio 1) FITC y 10 l de anti-rata CD45 PE / Cy7 (Figura 4A). Los fluoróforos se definen en la Tabla 1.
  4. Centrifugar brevemente el tubo (300 xg) para asegurar que los anticuerpos y las células están en la parte inferior del tubo y no pegados a la pared del tubo. Vortex para mezclar e incubar durante 15 min a TA.
  5. Para lisar las células rojas de la sangre añaden 400 l de Tris 10 mM, 0,15 M tampón de cloruro de amonio (pH 7,5) y agitar para mezclar. La lisis se completa cuando la muestra aparece translúcida y no turbia (figuras 4B y C). La falta de lisar la muestra completamente conducirá a aumentard fondo y falsamente elevados recuentos al analizar por citometría de flujo.

5. citometría de flujo de Procesamiento de Muestras

Nota: Realice un color 4 citómetro de flujo.

  1. Abra el software en modo de adquisición y una nueva plantilla con 8 parcelas como se muestra en la Figura 5.
  2. Ajustar la configuración de instrumentos de los que se enumeran en la Tabla 1 y configurar la puerta R1 (FITC [FL-1] frente APC [FL-4]), Figura 5ai) para contar las perlas fluorescentes. Las otras puertas no son tan importantes en esta etapa de adquisición, pero serán requeridos para el análisis. Los contar bolas absolutos utilizados en este protocolo contienen tintes fluorescentes y pueden detectarse en cualquier canal, aunque son más débiles en el canal azul.
  3. Utilizando una muestra de sangre de control preparado, vórtice y luego cargar en el citómetro y correr a una velocidad baja (12 l / min) en el modo de configuración de modo puertas de adquisición de datos se pueden ajustar.
  4. Establezca la adquisición derecolectar 10.000 eventos en la puerta del grano R1.
  5. Configurar una carpeta para grabar los datos y establecer el número de expediente y archivo de ejemplo de etiqueta en el menú de adquisición.
  6. Cargue la muestra a analizar en el citómetro y establecer el caudal medio (35 l / min). Ejecutar cada muestra a la misma velocidad de flujo. Puede necesitar la velocidad de flujo a ser variada para bajo (12 l / min) o alta (60 l / min), pero es generalmente medio apropiado. A este ritmo que se necesita aproximadamente el 90 a 120 seg para adquirir 10.000 eventos de cuentas para cada muestra.
  7. Una vez que la muestra se carga mirar los gráficos de dispersión para hacer eventos estén apareciendo en la puerta del grano R1. Inicialmente puede haber cierta inestabilidad en la presión de la muestra causando la deriva en los gráficos de dispersión. Espere a que esta se estabilice.
  8. Una vez estabilizado, haga clic en adquirir y permitir la muestra se ejecute. Una vez que el citómetro ha finalizado la adquisición de 10.000 eventos de cuentas en R1 el citómetro dejará de adquirir y guardar todos los datos.
  9. Retire la muestra y descartar fluir tuser. El citómetro está ahora listo para la siguiente muestra. Ejecutar todas las muestras y luego proceder a modo de análisis.

6. Análisis de la célula inmune

Nota: las estrategias de apertura de puerta y álgebra de Boole se utilizan para definir cada población celular. Álgebra de Boole es un método de análisis de la lógica basada que permite múltiples operaciones en una sola definición. El software de análisis de flujo el citómetro (por ejemplo, BD CELLQuest) permite el uso del álgebra booleana. Las ecuaciones se utilizan para tener en cuenta de forma activa para la reactividad negativa significativa que ayuda en la definición de la célula para identificar más específicamente cada población celular. "Regiones" se utilizan para definir una 'puerta'. Regiones definen un espacio de dimensión 2, mientras que las puertas pueden estar compuestas de numerosas regiones conectadas por los operadores algebraicas (+, *, -, definida en la Tabla 2).

  1. Cambiar el software a modo de análisis. Una plantilla de análisis debe ser generado para que coincida
  2. Analizar cada archivo individual (es decir, cada muestra individual) por separado. Configure puertas R1 a través de R9 y luego configurar los algoritmos para cada tipo de células como se define en la Tabla 2 (también se muestra en la Figura 5).
  3. Utilice el contador de estadísticas de células para calcular las poblaciones de células individuales definidos por puertas y algoritmos (Tabla 2 y Figura 5). Los algoritmos se ajustará automáticamente el número de células en el contador de estadísticas de células.
  4. Calcular subconjuntos de células usando la siguiente ecuación:
    Ecuación 1
    Nota: El número de eventos celulares contados (por ejemplo, eventos de células T CD4) se enumeran utilizando la ecuación anterior para dar el número de células por microlitro de sangre. Los ejemplos se muestran en la Figura 5.

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Representative Results

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El método utilizado en este documento para la generación de un modelo ortotópico del mesotelioma pleural utilizando células II-45 dio como resultado en los animales sucumben a mesotelioma en un plazo de tiempo reproducible y rápido, sin ratas morir debido al método de implantación. La titulación del número de células implantadas determinó que 1x 10 3 células fue el número mínimo requerido para un modelo completamente penetrante (100% engraftment). El distinto número de células implantadas en las ratas cambió el curso temporal de la enfermedad sin que parezca que afectará a la gravedad de la enfermedad. Los animales que recibieron 1 x 10, 1 x 3 10 4 y 5 x 10 5 células alcanzaron los puntos finales éticamente definidas por días 40, 30 y 20 días respectivamente (Figura 6).

Se recogió sangre de ratas aproximadamente dos veces cada semana sin complicaciones observadas en relación con la colección. Es importante tener en cuenta que no más del 10% del volumen de sangre total (oaproximadamente 2 ml) se deben recoger en un período de 2 semanas. Un ensayo de citometría de flujo que combina estrategias de activación periódica y se estableció álgebra de Boole para identificar linfocitos, monocitos y neutrófilos y los subgrupos de linfocitos T, T CD4, CD8 T, células B y NK. Se estableció la media y el rango para cada tipo de célula utilizando control de ratas (n = 5) y se comparó con la media y el rango de II-45 ratas implantadas al final del estudio (Tabla 3). Los valores de punto final primera se compararon para determinar si existían diferencias en los recuentos de células inmunes entre animales sanos y enfermos. En comparación con las ratas de control sanos, linfocitos totales, las células CD4 T, linfocitos B y células NK disminuyeron en II-45 ratas implantadas en el punto final mientras que los monocitos, neutrófilos y de neutrófilos a Proporción de linfocitos (NLR) aumentaron.

Para determinar si estos parámetros de células inmunes también cambiaron con progresión de la enfermedad y por lo tanto podrían ser utilizados como marcadores sustitutos fo control de la enfermedad, las muestras longitudinales fueron también compararon (Figura 7). El parámetro longitudinal más informativo fue NLR con aumentos detectados hasta 7 días antes de criterios de valoración ética (Figura 7A). Para las ratas con dosis elevadas de células, se detectaron altos NLRs entre el día 7 y día 12 después de la implantación, mientras que para las ratas con células de dosis bajas, el NLR comenzó a aumentar entre el día 18 y 22. Los recuentos de linfocitos totales disminuyeron con progresión de la enfermedad en ratas con una modelo de mayor tiempo de enfermedad de curso (dosis baja de células: 1 x10 4, Figura 7B). Esta disminución no fue evidente en ratas con un curso de tiempo rápida (dosis alta de células: 5 x10 5). Los monocitos se mantuvieron en niveles normales hasta la recolección terminal cuando groseramente aumento de los recuentos se observan a menudo (Figura 7C). Los otros recuentos de células inmunes (neutrófilos, NK, células B y células T CD4 y CD8) fueron más variables y por lo tanto menos informativas.


Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Localización y lugar de implantación. La rata se anestesió primero, colocado en la espalda y el área costalis regio derecha (en el pecho) se afeita para quitar la piel. En el lado derecho, el pezón 2 nd desde la parte superior y se identifica el sitio de inyección está situado 0,5 cm proximal a este, entre el 3 y 4 de la costilla de la parte inferior de la caja torácica (A). Un espaciador se coloca entonces sobre la aguja y la jeringa preparado para evitar que la aguja penetra demasiado profundamente en la pleural se inyecta cavidad y 100 l de células o SFM (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. técnica de muestreo para la recogida de sangre de la cola. Posicionar una aguja de 23G x 1 ¼ paralelo a la vena lateral (A). Deslice la aguja en la vena con un ángulo pequeño, de aproximadamente 10 mm de profundidad, y mantenerlo allí durante unos segundos hasta que la sangre es visible (B) y luego retire la aguja. Recoger la sangre utilizando una pipeta (C). Si es necesario frotar suavemente vena de la cola para asegurar la sangre continúa fluyendo. Pipeta de sangre en un tubo de recogida de 0,5 ml de EDTA (D), la mezcla sobre la marcha para prevenir la coagulación. arge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Etiquetado de muestra de sangre en un tubo de conteo absoluto para el análisis de citometría de flujo. Blood (25 l) y los anticuerpos se añaden a un tubo de conteo absoluto (A). El tubo se agitó con vórtex a continuación, y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Antes de la adición de tampón de cloruro de amonio para lisar las células rojas de la sangre, la muestra aparece turbia u opaca (B). Una vez zadas, la muestra aparece translúcida y está listo para citometría de flujo análisis (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. La estrategia de apertura de puerta para citometría de flujo análisis. Un conjunto de datos 6 dimensiones puede identificar linfocitos, monocitos y neutrófilos y los subgrupos de linfocitos T, T CD4, CD8 T, células B y NK. Las estrategias y algoritmos de compuerta definidos incorporan tanto la reactividad negativa y positiva que definen cada tipo de célula que permite la identificación específica. El número de cuentas en cada tubo de conteo absoluto (se encuentra en la bolsa para cada tubo) se registra para cada muestra y se requiere para calcular el número de células por microlitro de sangre para cada subconjunto, como se muestra. El algoritmo compuerta completa para cada subconjunto de células aparece a la derecha de las parcelas de análisis. (Ai) Cuentas (R1) se contabilizan inicialmente por FITC (FL-1) frente a APC (FL-4). Adquisición se establece en aproximadamente 10.000 eventos (9960 en este ejemplo). (AII) Escombros (R2) se identifica por el FSC frente a SSC y retirado de todo g subsecuenteCIONES. (Bi) Después de la retirada de escombros (R2) FSC frente a SSC diferencia población de células blancas de la sangre en los linfocitos (R3), monocitos (R4) y neutrófilos (R5). (Bii) Las poblaciones de células identificadas en (Bi) se confirman utilizando la de leucocitos común antígeno CD45 gating en PE / Cy7 (FL-3) frente a SSC. (BIII) La población de linfocitos (R3) se diferencia aún más en las células T (R6) utilizando CD3 gating en APC (FL-4) frente a SSC. ( células Biv) CD8 T son linfocitos (R3) se diferenciaron en células T (R6) que también expresan CD8a (R9) y están cerrada en PE (FL-2) frente a SSC. (Ci) las células B y las células NK se definen como linfocitos ( R3) que son CD3 negativos. Células B (R7) se diferencian de las células NK ya que expresan CD45RA y son cerradas por APC (FL-4) frente a FITC (FL-1). Las células (CII) CD4 T se definen como linfocitos (R3) que co-expresan CD3 (células T, R6) yCD4 (R8), pero no expresan ninguno de los otros marcadores utilizados. Se diferencian utilizando FITC (FL-1) frente a PE (FL-2) gating. Las células NK se definen como cualquier linfocito restante que aún no se ha definido que también expresa CD161a. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Curva de supervivencia para las ratas implantadas con diferentes dosis de II-45 células de mesotelioma. Los grupos de ratas fueron pleurally implanta con 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) o 1 x 10 2 (n = 4) II-45 células del mesotelioma en 100 l de volumen y se controlará hasta punto final ética cuando fueron sometidos a eutanasia. La supervivencia se representa gráficamente mediante el log-rank (Mantel-Cox) Método Gehan-Breslow-Wilcoxon. p>

Figura 7
Figura 7. Longitudinal circulantes recuentos de células inmunes de ratas con mesotelioma respecto a la media y el rango para el control de ratas sanas. El control sano significa para cada tipo de célula se muestra como una línea ininterrumpida negro horizontal (valor se muestra en el eje Y derecho de cada gráfico) y el rango se representa por el área sombreada de color gris. El eje Y muestra los recuentos por l de sangre para el tipo de célula indicada, o el valor de NLR. El eje X es la evolución en el tiempo de progresión de la enfermedad, donde el día 0 es el día de la implantación. Resultados longitudinales para 2 ratas implantadas con 1 x 10 4 células (A, B) y 2 ratas implantadas con 5 x 10 5 células (C, D) se muestran. (A) NLR, (B) el recuento total de linfocitos, (C) los recuentos de monocitos.ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Detector Fluoróforo Detalles voltaje Modo
FSC --- --- E00 Lineal
SSC --- --- 450 Lineal
FL-1 FITC 533/30 nm 670 Iniciar sesión
FL-2 EDUCACIÓN FÍSICA 585/40 nm 675 Iniciar sesión
FL-3 PE / Cy7 670nm (pase de largo) 600 Iniciar sesión
FL-4 APC 675/25 nm 735 Iniciar sesión

Tabla 1: Tensión configuración del detector para cito flujoadquisición de datos de indicadores mediante un color 4 citómetro de flujo. ganancia de amplitud se fija en 1 para todos los detectores. FSC: dispersión frontal, SSC: dispersión lateral, FITC: isothyocyanante fluoresceína, PE: ficoeritrina, APC: aloficocianina.

Subconjunto de células Marcadores de células Supresión Algoritmo
Cuentas R1
Escombros R2
Células (pan-leucocitos) CD45 + -R2
Los linfocitos CD45 + FSC frente a SSC R3 * -R2
Los monocitos CD45 + FSC frente a SSC R4 * -R2
Los neutrófilos CD45 + FSC frente a SSC R5 * -R2
Células T (total) CD45 + / CD3 + R6 * R3 * -R2
T CD8 ce positivolls CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * R3 * -R2
Células B CD45 + / CD3 / CD45RA + R7 * R3 * -R2
Células T CD4 positivas CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2)
Las células asesinas naturales CD45 + / CD3 / CD161a + R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * -R2)]

Tabla 2: Teléfonos marcadores y algoritmos de compuerta para caracterizar cada subconjunto de células inmunes para el algoritmo de compuerta, significa el símbolo '+' 'o' y permite que dos poblaciones separadas que se suman incluso si sus reacciones no se superpongan.. El "-" símbolo significa 'no' y puede restar una población desde otra población definida o el reverso de una población se ha descrito anteriormente. Significa el símbolo '*' 'y' y define un espacio que sólo está presente cuando dos reacciones se superponen. Subconjuntos de células inmunes Las ratas de control (n = 5) II-45 ratas implantadas en el punto final (n = 4) Significar Rango Significar Rango Linfocitos totales 165.7 111,5-207,0 97.9 54,4-137,0 Linfocitos T CD4 72.9 45,4-111,4 38.4 25,6-50,0 Linfocitos T CD8 36.6 26,0-48,3 32.1 16,1-46 Linfocitos B 56.6 36,0-83,9 24.7 11,2-36,0 Células NK 9.3 3,1-15,7 4.0 1,34-7,7 Los monocitos 27.1 12,7-39,0 373.3 42,4-575,8 Los neutrófilos 51.4 24,3-87,0 159.2 51,1-366,0 NLR 0.3 0,18-0,42 1.8 0,94-2,66

Tabla 3:. La media y el rango de las células inmunes en las ratas de control sanos (n = 5) y II-45 ratas implantadas en el punto final (n = 4) Resultados por l de sangre se muestran.

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Este documento detalla un método para la generación de un modelo ortotópico singénico de rata de mesotelioma pleural y un método simple para el seguimiento de la progresión de la enfermedad a través de muestreo de sangre longitudinal.

El modelo II-45 fue desarrollado mediante la exposición de ratas Fischer 344 a fibras de amianto 13. Aunque esta exposición representa la verdadera dinámica de las interacciones del sistema huésped-asbesto inmunológico para la patogénesis mesotelioma, tiene un tiempo de retraso largo (tomar años para generar) y puede ser peligroso para los investigadores debido a la posible exposición a fibras de amianto. Ortotópico la implantación de las células II-45 en la cavidad pleural de los animales proporciona un modelo segura y rápida de la progresión del cáncer que imita la enfermedad humana en un huésped inmune competente-11. Sin embargo los métodos y principios exactas a adherirse a durante estos procedimientos experimentales no están bien definidos. El procedimiento descrito resultados en un modelo altamente reproducible que es relarelativamente independiente de la experiencia del operador. Los pasos críticos son 1, cosechar células II-45 en la fase de crecimiento exponencial y el recuento exacto de células viables; 2, el posicionamiento correcto del sitio de implantación y asegurar la aguja no penetra demasiado profundamente y perforar los pulmones o dañar el corazón, y 3, mantener y monitorear el bienestar de los animales.

La línea de células II-45 está en rápido crecimiento y requiere pases cada 3 a 4 días en la cultura, por lo tanto, cuando se prepara para la implantación, las células deben ser sub-culta y crecimiento monitoreado diariamente. Las células deben ser cosechadas y se contaron cuando en la fase de crecimiento exponencial, es decir, aproximadamente 70% de confluencia. La resuspensión de las células en medio libre de suero en lugar de PBS reduce la presión sobre las células, mientras que el recuento y la preparación para la implantación. Recuentos precisos son cruciales para la reproducibilidad, especialmente cuando la dosificación con el número de células bajas (por ejemplo, de 100 a 1.000). El SUSde pensiones debe ser homogéneo y constar de células individuales (sin grumos). Un volumen de implantación de 100 l permite una dosificación exacta sin perjudicar la expansión pulmonar a través de exceso de líquido en la cavidad pleural. Los pasos clave en la implantación son el correcto posicionamiento y la limitación de la penetración de la aguja a una profundidad de no más de 12 mm. La colocación correcta de la aguja en el sitio de inyección es extremadamente importante para asegurar que las células se implantan en la cavidad pleural y no en la cavidad peritoneal. Incorrectamente la implantación de células demasiado baja puede dar lugar a tumores de mesotelioma en crecimiento a través del diafragma, en el hígado y la cavidad peritoneal. La restricción de la profundidad de penetración de la aguja es también muy importante para prevenir la mortalidad como resultado de daños en órganos internos. Esta restricción se puede lograr a través del uso de un espaciador a través de una aguja larga (como se muestra) o el uso de una aguja más corta con una longitud del eje de 5 mm a 12 mm. En nuestras manos, no se han producido eventos adversosdurante la implantación de la célula. También es esencial para reemplazar la aguja después de cada implantación. El no hacerlo puede dar lugar a tumores que crecen fuera de la cavidad torácica a lo largo de la línea de inyección. Tal crecimiento fuera de la cavidad pleural se debe a las células residuales en el eje de la aguja y puede resultar en la supervivencia prolongada.

En nuestras manos este modelo tiene una proporción de injertos de tumores 100% cuando se administra ≥ 1 x 10 3 células. Progresión de la enfermedad en el modelo de mesotelioma II-45 es bastante rápido, siendo menos de 40 días en que 1 x 10 4 células se implantan y menos de 20 días para una dosis de 5 x 10 5 células. Esto puede limitar la utilidad de este modelo para la prueba pre-clínica de algunas terapias. Las células II-45, mientras que no están disponibles comercialmente pueden ser obtenidos con el permiso del autor 13. Sin embargo, las mismas técnicas y principios de implantación también se pueden aplicar a otras líneas celulares de mesotelioma rata disponible de repos línea celularitories cuando se combina con las cepas de ratas singénicas pertinentes. La dosis óptima de la célula puede variar con la línea celular y tendría que ser determinado para cada línea.

Monitoreo de progresión de la enfermedad y el bienestar de los animales es difícil, ya que los tumores son internos y no pueden ser controlados por tamaño. Por lo tanto hemos tratado de desarrollar un método para el seguimiento de los animales que podrían predecir el deterioro de su condición como un aumento de la NLR u otros cambios en los marcadores de células inmunes antes de los síntomas físicos se hicieron visibles. La pantalla de la sangre desarrollado utiliza sólo 25 l de sangre periférica de manera que el muestreo periódico puede realizarse con un mínimo de angustia al animal. La técnica de muestreo descrito requiere de práctica para adquirir la experiencia necesaria. Sin embargo, una vez dominado, es rápido y mínimamente invasiva.

Un paso crítico en el análisis de sangre es para prevenir la coagulación de la muestra de sangre por transferencia rápida a un tubo de EDTA. Muestras coaguladasdebe ser desechado como los recuentos serán inexactos. Otro paso importante es la lisis de glóbulos rojos antes del análisis celular. Si los glóbulos rojos no están completamente zadas, el aumento del fondo será falsamente elevar los conteos. Si bien la configuración inicial de gráficos de puntos y gating es mucho tiempo, una vez que se guardan los ajustes y plantilla, el ensayo requiere poco ajuste. La estrategia gating empleada utiliza un multi-parámetro booleano enfoque algebraico a deconvolute los datos. Mediante el uso de combinaciones conocidas de exclusiva y compartida antígenos de los algoritmos para cada línea de la estrategia de puerta de definir el tipo de célula discreta en esta matriz de datos de seis dimensiones 14. Esto, junto con la precisión establecida de la tecnología basada en perlas 15-17 de radiométrica tiene la ventaja de permitir la enumeración de cualquier tipo de célula definida como tanto una proporción de células y un recuento absoluto por l.

Está cada vez más reconocido que el sistema inmunitario pestablece un papel importante en la patogénesis del cáncer 18. Tanto el fracaso del sistema inmunitario para reconocer y destruir las células malignas y la supresión de las células inmunes por los tumores puede conducir al crecimiento del tumor no controlada. Por lo tanto, la inclusión de un microambiente tumoral-inmune competente es una consideración crítica al modelar el cáncer y es una ventaja importante de modelos de cáncer singénicos. Estos modelos inmunocompetentes crean un entorno realista y clínicamente relevante para el crecimiento tumoral y la interacción inmunológico, que es deficiente en modelos xenogénicos.

Los parámetros inmunes identificados en este estudio que acompañó progresión de la enfermedad, es decir, los recuentos de linfocitos, los recuentos de monocitos y el NLR, también se han demostrado que se correlaciona con mal pronóstico en el mesotelioma humana 19-21 proporcionar evidencia de la importancia del modelo y la prueba de sangre . En los modelos presentados, la utilidad clínica del seguimiento de los parámetros inmunes aumentó ingenioh el curso de tiempo más largo (dosis más baja) y se puede mejorar aún más por muestreo más frecuente en las etapas posteriores de la enfermedad. Si bien este documento se centra en un modelo de mesotelioma, la capacidad de controlar la progresión del tumor a través de muestreo de sangre periférica se puede utilizar para todos los modelos de cáncer singénicos. Además, el ensayo también se puede utilizar para evaluar la respuesta inmunológica a diferentes terapias. Anteriormente hemos usado este ensayo para monitorizar la respuesta a una terapia de vacuna contra el cáncer en un modelo de glioma singénico (9L) 22. En ese estudio, las células T CD4 y CD8 fueron los marcadores más informativos. También hemos utilizado este ensayo y el modelo de mesotelioma II-45 para identificar diferencias en la respuesta inmune a los tumores resistentes a diferentes agentes quimioterapéuticos 11. En ese estudio, todos los parámetros excepto las células T CD8 mostraron diferencias significativas. El seguimiento longitudinal durante la progresión de la enfermedad se describe aquí destaca el potencial de los diferentes parámetros de las células inmunes, correlacionarse con la progresión del cáncer y el bienestar de los animales al llevar a cabo el modelado ortotópico singénico de cáncer en ratas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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Ortotópico Implantación y Seguimiento de la célula inmune periférica en el modelo II-45 Singénico Rata Mesotelioma
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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