Summary
Het genereren van een orthotopic ratmodel van pleura maligne mesothelioom door implantatie van II-45 mesothelioom cellen in de pleurale holte van immuuncompetente ratten gepresenteerd. Een stroom cytometrische methode zeven immuuncelsubklassen in deze dieren analyseren vanuit een 25 gl bloedmonster wordt ook beschreven.
Abstract
De enorme toename van belangstelling immuun gebaseerde behandelingen voor kanker zoals vaccins en immune controlepunt remmers en beter begrip van de rol van de tumor micro-omgeving in behandelingsrespons collectief wijzen op de noodzaak van immuuncompetente orthotope modellen voor preklinische tests van deze nieuwe therapieën. Dit artikel laat zien hoe u een orthotope immuun-competente rat model van pleura maligne mesothelioom vast te stellen. Monitoring progressie van de ziekte in orthotopische modellen is beschaamd door de interne locatie van de tumoren. Om longitudinaal bewaken ziekteprogressie en zijn effect op circulerende immuuncellen in deze en andere rat modellen van kanker, een enkele buis flowcytometrie test die slechts 25 gl volbloed wordt beschreven. Dit verschaft kwantificatie van zeven immune parameters: totale lymfocyten, monocyten en neutrofielen, en T-cel subsets CD4 en CD8, B-cellen en natuurlijke killer cellen. Verschillende subsets van deze parameters zijn nuttig in verschillende omstandigheden en modellen, met de neutrofielen naar lymfocyt verhouding met de grootste hulpprogramma voor het monitoren van progressie van de ziekte in de mesothelioom model. Analyseren circulerende immuun cel niveaus met behulp van deze enkele buis methode kan ook helpen bij het toezicht op de respons op het immuunsysteem gebaseerde behandelingen en inzicht in de onderliggende mechanismen die leiden tot succes of falen van de behandeling.
Introduction
Maligne mesothelioom (MM) is een agressieve maligniteit die voortvloeit uit getransformeerde cellen in het membraan (mesothelium) die lijnen de longen en de buikholte, hart en inwendige geslachtsorganen, en is de meest voorkomende primaire tumor van de long holte of pleura 1,2 . Blootstelling aan asbestvezels is goed voor 80% van alle MM, en terwijl het verbod op het gebruik van asbest werden decennia geleden geïntroduceerd in de meeste westerse landen, is het wijdverbreide gebruik in de gemeenschap een dodelijke erfenis. De Wereld Gezondheids Organisatie schat dat 107.000 mensen wereldwijd sterven elk jaar van asbest gerelateerde ziekten, met sterftecijfers blijft toenemen. Een nieuwe niet-beroepsmatige incidentie wave is ook in opkomst en er is weinig begrip voor wanneer en op welk niveau dit hoogtepunt zal bereiken 3.
De meerderheid van de mensen met MM te laat gediagnosticeerd als systemische chemotherapie is een van de enige haalbare opties 4. De meest effective chemotherapie en de huidige 'standaard van zorg' (samen pemetrexed met cisplatine 5) werd meer dan 10 jaar geleden geïdentificeerd. Maar het falen van deze behandeling is onvermijdelijk en zijn er geen bewezen tweede regel opties, waardoor patiënten met een grimmige prognose en mediane overleving van slechts 12 maanden 2. Daarom is er een dringende onvervulde behoefte aan effectievere behandelingen. Ondanks het onderzoek van een aantal nieuwe therapieën in klinische studies geen resulteert in veranderingen in de praktijk. Dit is deels te wijten aan de lage (5%) overdracht van pre-klinische resultaten, doorgaans bij xenograft muismodellen om de klinische instelling 6-8. Dergelijke modellen niet getrouw herhalen complexe aspecten van de tumor micro-omgeving voorkomen in niet-fysiologische locaties, vaak met afwezigheid van een functionerend immuunsysteem 9.
Syngene orthotope modellen te maken een aanzienlijk realistischer tumor milieu dan de commonly gebruikt subcutane xenograft modellen als de tumoren zich in de juiste fysiologische locatie met een intact immuunsysteem 10,11. De grotere omvang van de rat verhoogt het gebruik als knaagdier ziektemodel, vooral in drug studies waarbij seriële bloedafnames moeten behandelingsrespons 12 en toxiciteit te beoordelen. Bovendien, in modellen waarin toezicht ziekteprogressie moeilijk vanwege de locatie van de tumoren (bijvoorbeeld in de pleurale holte), het vermogen tot ziekteprogressie controleren middels factoren die in het bloed is zeer aantrekkelijk. Het genereren van een syngene orthotope model borstvliesmesothelioma gebruik immuuncompetente ratten wordt beschreven. Bovendien wordt een eenvoudige en relatief niet-invasieve werkwijze voor het bewaken van pleurale ziekteprogressie door meting van circulerende immuuncellen ook beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden worden uitgevoerd. Het protocol voor dit onderzoek werd goedgekeurd door de Royal North Shore Hospital Animal Care en de ethische commissie. Vrouwelijke Fischer 344 ratten (F344, 150-200 g) werden gehandhaafd op het Kearns Facility, Kolling Instituut onder standaard omstandigheden (12 uur licht / donker cycli en vrije toegang tot voedsel en water).
Opmerking: Een stroomschema voor alle experimentele procedures wordt weergegeven in figuur 1.
1. Bereiding van cellen voor implantatie
- Culture mesothelioom rat II-45 cellijn (ook bekend als IL-45, verkregen door peritoneale introductie van crocidoliet) in RPMI 1640 (RPMI) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en groeien in standaard condities (37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO 2). Maintain door de passage en sub-kweken bij ongeveer 01:50 twee keer per week in een 75 cm 2 kolf.
- Bereid reagentia voor celcultuur en warm porties bij 37 ° C. Benodigde reagentia omvatten serumvrij RPMI-medium (SFM), RPMI met 10% FBS, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 0,5% trypsine-EDTA.
- Kweekcellen voor implantatie ongeveer 70-80% confluentie. Hierdoor zijn ze in het lineaire groeifase.
- Oogst cellen ontdoen van de media, eenmaal wassen met 5 ml steriel PBS en vervolgens toevoegen van 3 ml van 0,5% trypsine-EDTA.
- Terugkeer kolven naar de incubator gedurende ongeveer 5 minuten totdat alle cellen niet hechtende.
- Zodra cellen niet hechtende, voeg 3 ml RPMI met 10% FBS om de trypsine te inactiveren. Verzamel en centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 3 min.
- Was de celpellet in 10 ml SFM en centrifugeer opnieuw bij 300 xg gedurende 3 min.
- Was celpellet opnieuw met 10 ml SFM en centrifuge zoals hierboven.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml SFM en uitvoeren van een aantal cellen met een hemocytometer en dergelijke instrumenten.
- Verdun cellen waardoor 100 gl bevat het aantal cellen te implanteren.
Opmerking: De tumorgroei werd aangetoond bij een dosis zo laag als 100 cellen in 100 pi maar een standaard dosis 500.000 cellen in 100 pi. - Bereid voldoende cellen in de media voor het aantal ratten worden geïmplanteerd (dat wil zeggen, 100 ul / rat), vermeerderd met ten minste 0,5 ml extra te compenseren voor verliezen als gevolg van priming en het dode volume van de naald.
- Bereid voldoende SFM (zonder cellen) te worden geïmplanteerd in controle ratten (dat wil zeggen, 100 ul / rat), vermeerderd met ten minste 0,5 ml extra.
Opmerking: De cellen en SFM zijn nu klaar voor implantatie. Zij moeten bij 37 ° C worden gehouden en geïmplanteerd binnen 2 uur na de oogst om de levensvatbaarheid te behouden.
2. In vivo implantatie van cellen
- Plaats de F344 rat (> 13 weken) in de inductie kamer en het verdoven met behulp 1,4% isofluraan inhalatie (of de werkwijze gebruikt in de faciliteit). Zodra de rat lijkt om in slaap te verplaatsen uit de kamer naar een neuskegel zijn (met 1,4% isofluraan stromen), plaats hem op zijn rug met de borst naar boven (ventrale weergave). Hierdoor kan de interne organen van het borstholte regelen. Controleer reflexen volgens institutionele protocollen bij de rat te garanderen is volledig verdoofd.
- Scheren de juiste regio costalis (borst) gebied om de vacht te verwijderen.
- Reinig het geschoren gebied met 80% v / v ethanol.
- Identificeer de injectieplaats: aan de rechterkant, vindt de 2e klier begint de schedel. De injectie is 0,5 cm proximaal van deze, tussen de 3 en 4 rib van het caudale einde van de ribbenkast. (Figuur 2A).
- Meng het II-45 cellen te mengen. Langzaam trekken de cel suspensie (of SFM voor controle ratten) in een 1 ml &# 160; spuit zonder naald. Als een naald voor het opstellen van cellen is aangesloten is er nog de mogelijkheid van cellen om te groeien langs de naald injectie lijn. Bevestig een 23G x 1¼ naald. Prime de naald en verwijder eventuele luchtbellen.
- Zodra de spuit en naald zijn gevuld, plaats een 20 mm lang en 5 mm diameter spacer over de naald schacht. Hiermee wordt voorkomen dat de naald te diep doordringen in de pleurale holte tijdens de injectie. Ongeveer 5 mm-12 mm blootgestelde naald voldoende voor penetratie door de ribben zonder beschadiging van alle organen.
- Steek langzaam de naald tussen de ribben, trekken terug op de spuit om te zorgen voor een bloedvat heeft aangeprikt (geen bloed zou moeten verschijnen in de spuit) dan injecteer 100 ul cellen of SFM. (Figuur 2B).
- Verwijder de naald en voorzichtig rol de rat van links naar rechts aan cellen in de borstholte te verspreiden.
- Plaats de rat in een kooi en controleer herstel. The rat moet wakker binnen 1 minuut en begint te bewegen zijn.
- Herhaal dit voor elke rat met behulp van een nieuwe naald. Hergebruik dezelfde naald zal resulteren in celgroei langs de injectieleiding van de naald.
- Dagelijks toezicht op het welzijn van de dieren.
- Euthanaseren dieren op ethisch gedefinieerde eindpunten zoals geregeld door de institutionele dier ethische commissie. De ethische eindpunten van de ratten in deze experimenten waren gewichtsverlies van meer dan 10% of zware ademhaling.
3. staartader bloedafname
- Als er bloed moet onmiddellijk worden verzameld na de cel implantatie, houden de rat verdoofd. Als de bemonstering van bloed op een ander tijdstip, verdoven van de rat met behulp van 1,4% isofluraan inademing. Controleer reflexen volgens institutionele protocollen bij de rat te garanderen is volledig verdoofd.
- Plaats de rat op zijn kant en zoek een laterale staartader.
- Steriliseren van de staart met 80% ethanol en label een 0,5 ml EDTA collectie buis.
- Om bloed te verzamelen, beginnen altijd aan het caudale einde van de staart (ongeveer een derde van de weg langs). Dit maakt verdere pogingen dichter bij het craniale einde van de staart bij de eerste poging mislukt. Resample nooit caudaal als dit een bloedstolsel kan veroorzaken.
- Positioneren van een 23G x 1¼ naald parallel aan de laterale ader en schuif het in de ader bij een ondiepe hoek, zodat het doordringt ongeveer 10 mm (figuur 3A).
- Opmerking: Als de ader succesvol doorboord bloed zichtbaar in het bevestigingseinde van de naald (figuur 3B) zijn.
- Een druppel bloed wordt gevormd op de staart op de plaats van de naald punctie. Verzamel dit bloed met behulp van een pipet en de overdracht in de gemerkte 0,5 ml (of kleiner) EDTA collectie buis. Voor de immuuncel assay 25 gl voldoende. Solliciteer gaas met druk om plaats te prikken totdat het bloeden stopt.
- Flick het bloed buis om het bloed en EDTA mengen om prevent stolling. Houd de tijd tussen bloedafname en mengen met de EDTA zo kort mogelijk om stolling te voorkomen.
- Bij het verzamelen van bloed van meerdere ratten winkel EDTA-bloedmonsters in een rek bij RT tot analyse. Proces bloed binnen 2 uur van de collectie.
4. Monstervoorbereiding voor Immune Cell Profiling Met behulp van de Parel-gebaseerde methode
Opmerking: Deze single platform methode is gebaseerd op het gebruik van commercieel beschikbare absolute telbuizen dat een bekend aantal kralen voor elk monster te hebben. Deze buizen bevatten gevriesdroogde pellets die oplossen tijdens de voorbehandeling, het loslaten van de kralen. De korrels werden fluorescent gelabeld en door gating op de korrelpopulatie, kunnen absolute tellingen worden berekend.
- Zorg ervoor dat de EDTA volbloedmonster goed gemengd is door het op een langzaam draaiende mixer gedurende enkele minuten. Label een absolute tellen buis voor elk monster. Een pellet met de kralen moet zichtbaar onder t zijnhij metalen kraal houder aan de onderkant van de buis.
- Breng 25 pl EDTA volbloed in een gemerkte absolute telbuis. De kraal pellet oplost bij toevoeging van bloed.
- Aan elke buis voeg 20 ul van anti-rat T / B / Natural Killer (NK) cellen cocktail, 10 pl anti-rat CD8a PE, 10 pl anti-rat CD4 (domein 1) FITC en 10 pl anti-rat CD45 PE / Cy7 (Figuur 4A). Fluoroforen zijn in tabel 1.
- Centrifugeer de buizen kort (300 xg) zorgen antilichamen en cellen op de bodem van de buis en niet vast aan de zijkant van de buis. Vortex te mengen en incuberen gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Om lyseren rode bloedcellen voeg 400 ul van 10 mM Tris, 0,15 M ammoniumchloride-buffer (pH 7,5) en vortex te mengen. Lysis is voltooid wanneer het monster verschijnt lichtdoorlatend en niet troebel (figuren 4B en C). Niet lyseren van het monster zal volledig leiden tot verhogingd achtergrond en foutief verhoogde tellingen bij de analyse door flowcytometrie.
5. Flowcytometrische verwerking van de monsters
Opmerking: Voer een 4 kleuren flowcytometer.
- Open de software verwervingsmodus en een nieuwe sjabloon met 8 plaatsen zoals weergegeven in figuur 5.
- Pas instrumentinstellingen met die in tabel 1 opgesomd en opzetten gate R1 (FITC [FL-1] versus APC [FL-4]), Figuur 5Ai) aan de fluorescerende beads tellen. De andere poorten zijn niet zo belangrijk in deze overname podium, maar vereist zal zijn voor analyse. De absolute tellen van kralen gebruikt in dit protocol bevatten fluorescerende kleurstoffen en kan worden gedetecteerd in elk kanaal, hoewel zijn zwakst in het blauwe kanaal.
- Met behulp van een voorbereide controle bloedmonster, vortex en vervolgens laden op de cytometer en draaien op een lage snelheid (12 pl / min) op de setup-modus, zodat data-acquisitie poorten kan worden aangepast.
- Stel de overnameverzamelen 10.000 gebeurtenissen in de R1 kraal poort.
- Het opzetten van een map om data op te nemen en stelt dossiernummer en label voorbeeld bestand in overname menu.
- Laad het monster te analyseren op de cytometer en stel het debiet tot middelgrote (35 pl / min). Draaien elk monster op hetzelfde debiet. De stroomsnelheid moet mogelijk worden gevarieerd om laag (12 pl / min) of hoog (60 pl / min), maar medium is algemeen geschikt. In dit tempo duurt het ongeveer 90 tot 120 sec tot 10.000 kraal gebeurtenissen voor elk monster te verwerven.
- Zodra het monster is geladen kijken naar de puntgrafieken om ervoor te zorgen dat evenementen te zien zijn in de R1 kraal poort. Aanvankelijk er enige instabiliteit in het monster onder druk waardoor drift in de puntgrafieken kan zijn. Wacht op dit stabiliseert.
- Eenmaal gestabiliseerd, klik op verwerven en laat het monster uit te voeren. Zodra de cytometer klaar is het verwerven van 10.000 kraal gebeurtenissen in R1 de cytometer zal stoppen met het verwerven en opslaan van alle gegevens.
- Verwijder het monster en gooi stromen tuzijn. De cytometer is nu gereed voor het volgende monster. Lopen alle monsters en vervolgens overgaan tot analyse modus.
6. Immune Cell Analyse
Opmerking: Gating strategieën en Booleaanse algebra worden gebruikt om elke celpopulatie definiëren. Boolean algebra is een logica gebaseerde analyse methode die het mogelijk maakt voor meerdere activiteiten in een enkele definitie. De analysesoftware van de flowcytometer (bijvoorbeeld BD CELLQuest) staat het gebruik van Booleaanse algebra. De vergelijkingen worden gebruikt om actief te verklaren de belangrijke negatieve reactiviteit die helpt bij het definiëren van de cel specifieker identificatie van elke celpopulatie. 'Regio's' worden gebruikt om een 'gate' te definiëren. Gebieden bepalen een 2 dimensionale ruimte dat poorten kunnen bestaan talrijke gebieden verbonden door algebraïsche operatoren (+, *, -, gedefinieerd in tabel 2).
- Schakel de software voor analyse modus. Een analyse template worden gegenereerd overeenkomen
- Analyseer elk individueel bestand (dat wil zeggen, elk individueel monster) afzonderlijk. Instellen poorten R1 tot R9 en stel de algoritmen voor elk celtype zoals gedefinieerd in tabel 2 (ook getoond in figuur 5).
- Gebruik de cel statistiekenteller afzonderlijke celpopulaties gedefinieerd door poorten en algoritmen (Tabel 2 en Figuur 5) te berekenen. De algoritmes zullen mobiele nummers automatisch in de cel statistieken teller aan te passen.
- Bereken cel subsets met de volgende vergelijking:
Opmerking: Aantal cel gebeurtenissen geteld (bijv CD4 T-cel evenementen) wordt opgesomd met behulp van de bovenstaande vergelijking tot het aantal cellen per pl bloed te geven. Voorbeelden zijn getoond in figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De werkwijze die in dit document voor het genereren van een orthotopic model borstvliesmesothelioma gebruik II-45 cellen resulteerde bij dieren bezwijken mesothelioom in een reproduceerbare en snelle tijdsbestek, zonder ratten sterven als gevolg van de implantatie methode. Titratie van het aantal cellen geïmplanteerd vastgesteld dat 1 x 10 3 cellen was het minimum dat vereist is voor een volledig penetrant model (100% engraftment). Het verschillend aantal cellen geïmplanteerd in de ratten veranderde het tijdsverloop van de ziekte zonder dat het lijkt op de ernst van de ziekte beïnvloeden. Dieren die 1 x 3 10 ontvangen, 1 x 10 4 en 5 x 10 5 cellen bereikt ethisch gedefinieerde eindpunten op dag 40, 30 respectievelijk 20 dagen (figuur 6).
Bloed werd verzameld uit ratten ongeveer twee keer per week met geen complicaties waargenomen gerelateerd aan de collectie. Het is belangrijk op te merken dat niet meer dan 10% van het totale bloedvolume (ofongeveer 2 ml) moet worden opgevangen in een periode van 2 weken. Een flowcytometrische bepaling die gating strategieën gecombineerd en Booleaanse algebra opgericht lymfocyten, monocyten en neutrofielen en lymfocyten T, T CD4, CD8 T, B- en NK-cellen te identificeren. De gemiddelde en bereik voor elk celtype werd vastgesteld middels controleratten (n = 5) en vergeleken met de gemiddelde en de reeks II-45 geïmplanteerd in ratten eindpunt (Tabel 3). Eindpunt waarden werden eerst vergeleken om te bepalen of verschillen bestonden immuuncel tellingen tussen gezonde en zieke dieren. In vergelijking met gezonde controleratten, totale lymfocyten, CD4 T-cellen, B-lymfocyten en NK-cellen afgenomen II-45 geïmplanteerd ratten bij eindpunt terwijl monocyten, neutrofielen en neutrofielen aan lymfocyten ratio (NLR) verhoogd.
Om te bepalen of deze immuuncel parameters veranderd met ziekteprogressie en dus kunnen worden gebruikt als surrogaat markers fof bewaken ziekte, werden longitudinale monsters ook vergeleken (Figuur 7). De meest informatieve longitudinale parameter was NLR met stijgingen waargenomen tot 7 dagen vóór ethische eindpunten (Figuur 7A). Voor ratten met een hoge dosis cellen, werden hoge NLR ontdekt tussen dag 7 en dag 12 na de implantatie, terwijl voor ratten met een lage dosis cellen, het NLR begon te stijgen tussen dag 18 en 22. Totaal aantal lymfocyten daalde met progressie van de ziekte bij ratten met een langere ziektevrije tijdsverloop model (lage cel dosis: 1 x10 4, Figuur 7B). Deze daling was niet duidelijk in ratten met een snelle tijdsverloop (hoog cel dosis: 5 x10 5). Monocyten bleef op een normaal niveau, totdat de terminal collectie bij grove verhoogde tellingen vaak waargenomen (figuur 7C). De andere immuuncel tellingen (neutrofielen, NK, B cellen en CD4 en CD8 T-cellen) waren variabel en dus minder informatief.
Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Locatie en de plaats van de implantatie. De rat wordt eerst verdoofd, geplaatst op zijn rug en de juiste regio costalis (borst) gebied wordt geschoren bont verwijderen. Aan de rechterzijde is de tweede nippel 2 van boven geïdentificeerde en de injectieplaats bevindt zich 0,5 cm proximaal ten opzichte hiervan in tussen de 3 en 4 de rib uit de bodem van ribbenkast (A). Een afstandhouder wordt dan over de voorbereide naald en spuit geplaatst om de naald indringende te diep in de pleura voorkomen holte en 100 ul van cellen of SFM wordt geïnjecteerd (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Sampling techniek voor het verzamelen van bloed uit de staart. Plaats een 23G x 1¼ naald parallel aan de laterale ader (A). Schuif de naald in de ader bij een ondiepe hoek, ongeveer 10 mm diep, en houden er voor een paar seconden tot het bloed zichtbaar is (B) en verwijder de naald. Verzamel bloed met behulp van een pipet (C). Eventueel voorzichtig slag staartader te waarborgen bloed blijft stromen. Pipetteer bloed in een 0,5 ml EDTA verzamelbuis (D), het mengen als je om stolling te voorkomen. arge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. etikettering van bloedmonster in absolute telbuis voor flowcytometrische analyse. Blood (25 ui) en antilichamen worden toegevoegd aan een absolute telbuis (A). De buis wordt vervolgens gewerveld en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vóór de toevoeging van ammoniumchloride buffer om de rode bloedcellen te lyseren, wordt het monster troebel of ondoorzichtig (B). Eenmaal gelyseerd, verschijnt het monster doorschijnend en is klaar voor flowcytometrieanalyse (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
es / ftp_upload / 53.019 / 53019fig5.jpg "/>
5. Gating strategie flowcytometrieanalyse fig. 6 een-dimensionale dataset kan lymfocyten, monocyten en neutrofielen en lymfocyten T, T CD4, CD8 T, B- en NK-cellen te identificeren. De gedefinieerde gating strategieën en algoritmen omvatten zowel de negatieve en positieve reactiviteit dat elk celtype waarvan specifieke identificatie definiëren. Het aantal korrels per absolute telbuis (op de zak voor elke buis) wordt bijgehouden voor elk monster en is nodig voor de berekening van het aantal cellen per pl bloed voor elke subset zijn. De volledige gating algoritme voor elke cel subset weergegeven rechts van de analyse plots. (Ai) Beads (R1) worden aanvankelijk geteld door FITC (FL-1) versus APC (FL-4). Acquisitie is ingesteld op ongeveer 10.000 events (9960 in dit voorbeeld). (Aii) Debris (R2) wordt geïdentificeerd door FSC versus SSC en uit alle volgende gAting. (Bi) Na verwijdering van vuil (R2) FSC versus SSC onderscheidt witte bloedcellen populatie in lymfocyten (R3), monocyten (R4) en neutrofielen (R5). (Bii) De celpopulaties die in (Bi) worden bevestigd met behulp van gemeenschappelijke leukocyten antigen CD45 gating op PE / Cy7 (FL-3) versus SSC. (Biii) De lymfocyt populatie (R3) verder onderverdeeld in T-cellen (R6) via CD3 gating op APC (FL-4) versus SSC. ( biv) CD8 T-cellen lymfocyten (R3) gedifferentieerd in T-cellen (R6) dat ook tot expressie CD8a (R9) en worden afgesloten op PE (FL-2) versus SSC. (Ci) B-cellen en NK-cellen worden omschreven als lymfocyten ( R3) die CD3 negatief zijn. B-cellen (R7) worden onderscheiden van NK cellen als ze tot expressie CD45RA en worden afgesloten door APC (FL-4) versus FITC (FL-1). (CII) CD4 T-cellen gedefinieerd als lymfocyten (R3) die co-express CD3 (T-cellen, R6) enCD4 (R8), maar geen van de andere markers gebruikt niet uitdrukken. Ze worden gemaakt met behulp van FITC (FL-1) versus PE (FL-2) gating. NK-cellen worden gedefinieerd als alle resterende lymfocyt die niet al is gedefinieerd, die ook tot uitdrukking CD161a. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Overleving curve voor ratten geïmplanteerd met verschillende doses II-45 mesothelioma cellen. Groepen van ratten werden pleurally geïmplanteerd met 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) of 1 x 10 2 (n = 4) II-45 mesothelioom cellen in 100 pi volume en vervolgens gevolgd tot ethische eindpunt toen ze werden gedood. Overleving werd getekend met behulp van de log-rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon methode. p>
Figuur 7. Longitudinale circulerende immuuncomplexen celtellingen van ratten met mesothelioom van het gemiddelde en het bereik voor gezonde controleratten. De gezonde controlegemiddelde voor elk celtype wordt getoond als een horizontale ononderbroken zwarte lijn (waarde wordt aan de rechter Y-as elke grafiek) en het bereik wordt weergegeven door de grijze gearceerde gebied. De Y-as toont de tellingen per pi van bloed voor de vermelde celtype of de waarde van NLR. De X-as is het tijdsverloop voor ziekteprogressie, waarbij dag 0 is de dag van de implantatie. Longitudinale resultaten 2 ratten geïmplanteerd met 1 x 10 4 cellen (A, B) en 2 ratten geïmplanteerd met 5 x 10 5 cellen (C, D) getoond. (A) NLR, (B) de totale lymfocyten, (C) monocyten telt.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Detector | Fluorofoor | Details | voltage | Mode |
| FSC | --- | --- | E00 | Lineair |
| SSC | --- | --- | 450 | Lineair |
| FL-1 | FITC | 533/30 nm | 670 | Log |
| FL-2 | PE | 585/40 nm | 675 | Log |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670nm (lange pass) | 600 | Log |
| FL-4 | APC | 675/25 nm | 735 | Log |
Tabel 1: Voltage detector instellingen voor stroom cytometrische data-acquisitie met een 4 kleuren flowcytometer. Amplitude winst is ingesteld op 1 voor alle melders. FSC: voorwaartse verstrooiing, SSC: zijwaartse verstrooiing, FITC: Fluorescein isothyocyanante, PE: fycoerythrine, APC: Allophycocyanine.
| Cel subsets | Cel Markers | Gating Algoritme |
| Kralen | R1 | |
| Puin | R2 | |
| Cellen (pan-leukocyten) | CD45 + | R2 |
| Lymfocyten | CD45 + FSC versus SSC | R3 * R2 |
| Monocyten | CD45 + FSC versus SSC | R4 * R2 |
| Neutrofielen | CD45 + FSC versus SSC | R5 * R2 |
| T-cellen (totaal) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| CD8 positieve T-cells | CD45 + / CD3 + / + CD8a | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| B-cellen | CD45 + / CD3 / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| CD4-positieve T-cellen | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 R3 * * - (R7 * R3 * R2) |
| Natural Killer cellen | CD45 + / CD3 / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * R2)] |
Tabel 2: cel merkers en gating algoritmen elke immuuncelsubklasse kenmerkend voor de gating algoritme, het "+" symbool betekent "of" en laat twee afzonderlijke populaties tezamen worden toegevoegd, zelfs als de reactie niet overlappen.. De '-' symbool betekent 'niet' en kan men de bevolking af te trekken vanuit een ander gedefinieerd bevolking of de achterzijde van een eerder beschreven populatie. De '*' symbool betekent 'en' en definieert een ruimte die aanwezig is alleen wanneer twee reacties overlappen.
Tabel 3:. Het gemiddelde en diverse immuuncellen bij gezonde controleratten (n = 5) en II-45 geïmplanteerd in ratten eindpunt (n = 4) Resultaten per gl bloed weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document Gegevens een werkwijze voor het genereren van een rat syngene orthotope model van pleuraal mesothelioom en een eenvoudige methode voor het bewaken van progressie van de ziekte door middel van longitudinale bloedafname.
De II-45 model werd ontwikkeld door het blootstellen Fischer 344 ratten asbestvezels 13. Hoewel deze blootstelling is de werkelijke dynamica van gastheer-asbest-immuunsysteem interacties mesothelioma pathogenese, heeft een lange vertragingstijd (rekening jaar produceren) en kan gevaarlijk zijn voor de onderzoekers vanwege het mogelijke blootstelling aan asbestvezels. Orthotope implantatie van II-45 cellen in de pleurale holte van de dieren biedt een veilige en snelle model kankervooruitgang die menselijke ziekte bij een immuuncompetente gastheer 11 nabootst. Maar de exacte methoden en principes te houden aan tijdens deze experimentele procedures zijn niet goed gedefinieerd. De beschreven procedure resulteert in een zeer reproduceerbare model dat relatief onafhankelijk van de ervaring van de operator. De kritische stappen zijn 1, oogsten II-45 cellen in de exponentiële groeifase en nauwkeurige telling van levensvatbare cellen; 2, de juiste positionering van de implantatie en het waarborgen van de naald niet te diep doordringen en punctie van de longen of het hart beschadigen, en 3, het onderhoud en het toezicht op het welzijn van de dieren.
De II-45 cellijn groeit snel en vereist passeren van iedere 3 tot 4 dagen in cultuur, dus bij de voorbereiding van implantatie, moet sub-cellen worden gekweekt en groei dagelijks gecontroleerd. De cellen worden geoogst en geteld als in de exponentiële groeifase, dat wil zeggen, bij ongeveer 70% confluentie. Resuspensie van de cellen in serumvrij medium in plaats van PBS vermindert de spanning op de cellen terwijl het tellen en het voorbereiden voor implantatie. Accurate celtellingen zijn cruciaal voor reproduceerbaarheid, vooral wanneer toediening van lage aantallen cellen (bijvoorbeeld 100 tot 1000). De suspensioen moet homogeen zijn en bestaan uit enkele cellen (geen klonten). Een implantatie volume van 100 pl maakt een nauwkeurige dosering zonder afbreuk longexpansie door overmatige vloeistof in de borstholte. De belangrijkste stappen van implantatie juiste positionering en het beperken van de naaldpenetratie tot een diepte van maximaal 12 mm. Correcte plaatsing van de naald op de injectieplaats uitermate belangrijk dat de cellen worden geïmplanteerd in de pleurale holte en niet in de peritoneale holte. Verkeerd implanteren van cellen te laag kan leiden tot mesothelioom tumoren groeien door het membraan, in de lever en de buikholte. De beperking van de penetratiediepte van de naald is eveneens van groot belang ter voorkoming van sterfte als gevolg van interne orgaanschade. Deze beperking kan worden bereikt door het gebruik van een afstandhouder op een lange naald (zoals getoond) of het gebruik van een kortere naald met een as lengte van 5 mm tot 12 mm. In onze handen, hebben geen bijwerkingen opgetredentijdens inplanting. Het is ook essentieel om de naald te vervangen na elke implantatie. Doet u dit niet kan resulteren in tumoren groeien uit de borstholte langs de injectie lijn. Dergelijke groei buiten de borstholte wordt veroorzaakt door residuele cellen op de naaldschacht en kan leiden tot langere overleving.
In onze handen dit model heeft een 100% tumor implantatie tarief bij het toedienen van ≥ 1 x 10 3 cellen. Ziekteprogressie in II-45 mesothelioom model is tamelijk snel, minder dan 40 dagen bij 1 x 10 4 cellen geïmplanteerd en minder dan 20 dagen een dosis van 5 x 10 5 cellen. Dit kan de bruikbaarheid van dit model voor pre-klinische testen van bepaalde behandelingen beperken. II-45 cellen, terwijl het niet in de handel verkrijgbaar kan afkomstig zijn met toestemming van de opdrachtgever 13. Echter, dezelfde implantatie technieken en principes kunnen ook worden toegepast op andere ratten mesothelioom cellijnen verkrijgbaar cellijn repositories wanneer gekoppeld aan de relevante syngene stammen rat. De optimale dosis cel kan variëren met cellijn en zou moeten worden vastgesteld voor elke lijn.
Monitoring ziekteprogressie en het welzijn van de dieren is moeilijk als de tumoren zijn inwendige en kan niet worden gecontroleerd op grootte. Daarom zochten we een werkwijze voor het bewaken van de dieren die verslechtering van hun toestand kon voorspellen zoals een verhoging NLR of andere wijziging immuuncel markers voor lichamelijke symptomen zichtbaar. Het bloed scherm ontwikkeld, gebruikt slechts 25 ul van perifere bloed, zodat regelmatige bemonstering kan worden uitgevoerd met een minimale nood aan het dier. De bemonstering techniek beschreven vereist oefening om de nodige expertise te krijgen. Echter, eenmaal onder de knie is een snelle en minimaal invasieve.
Een cruciale stap in de bloedanalyse is om stolling van het bloedmonster te voorkomen door de snelle overdracht naar een EDTA buis. Gestolde monstersmoet worden weggegooid als de graven onjuist zal zijn. Een andere belangrijke stap is de rode cel lysis voorafgaand aan celanalyse. Als de rode cellen niet volledig gelyseerd de verhoogde achtergrond valselijk verheffen de graven. Terwijl de eerste installatie van de dot percelen en gating is tijdrovend, zodra de instellingen en de template worden opgeslagen, de test vereist weinig aanpassing. De gating strategie die gebruik maakt van een multi-parameter Boolean algebraïsche benadering van de data deconvolute. Door bekende combinaties van exclusieve en gedeelde antigenen algoritmen voor elke lijn van de strategie poort hier de discrete celtype deze zesdimensionale gegevensmatrix 14. Dit in combinatie met vastgestelde nauwkeurigheid van de ratiometrische-bead gebaseerde technologie 15-17 heeft het voordeel van waardoor de opsomming van elk gedefinieerd celtype als zowel een deel van de cellen en een absolute telling per il.
Het wordt steeds meer erkend dat het immuunsysteem pligt een belangrijke rol bij de pathogenese van kanker 18. Zowel het falen van het immuunsysteem te herkennen en te vernietigen kwaadaardige cellen en het onderdrukken van immune cellen van tumoren kan leiden tot ongecontroleerde tumorgroei. Zo is de toevoeging van een immuun-competente tumor micro-omgeving een cruciale overweging bij het modelleren van kanker en is een groot voordeel van syngene kankermodellen. Deze immuuncompetente modellen te maken een realistische en klinisch relevante omgeving voor tumorgroei en immunologische interactie, die deficiënt is in xenogene modellen.
De immune parameters die in deze studie dat ziekteprogressie, namelijk lymfocyten, monocyten tellingen en NLR begeleid, is ook getoond te correleren met een slechte prognose bij humane mesothelioma 19-21 bewijs voor het belang van het model en het bloedonderzoek . In de gepresenteerde modellen is de klinische bruikbaarheid van controle op de immuunparameters verhoogde with langere tijdsverloop (lagere dosis) en kan verder worden verbeterd door vaker bemonstering in latere stadia van de ziekte. Terwijl dit document is gericht op een model van mesothelioom, kan het vermogen om tumor ontwikkeling door perifere bloedmonsters bewaken worden gebruikt voor alle modellen syngene kanker. Verder kan de test ook worden gebruikt om de immunologische respons op verschillende therapieën te beoordelen. Eerder hebben we deze test gebruikt om de reactie op een anti-kankervaccin therapie in een syngene glioma model (9L) 22 volgen. In deze studie, CD4 en CD8 T-cellen waren de meest informatieve merkers. We hebben ook deze test en de II-45 mesothelioma model verschillen in de immuunrespons op tumoren resistent tegen verschillende chemotherapeutica 11 identificeren. In deze studie, alle parameters behalve CD8 T cellen vertoonden significante verschillen. De longitudinale monitoring tijdens de progressie van de ziekte hier beschreven onderstreept het potentieel van verschillende immuun cel parameters aan Corverband met kanker progressie en het welzijn van de dieren bij het uitvoeren syngene orthotope modellering van kanker bij ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
