Summary
Genereringen av en ortotopisk rottemodell av ondartet pleural mesothelioma ved implantering av II-45 mesothelioma celler inn i pleurahulen av immunkompetente rotter er presentert. En strømningscytometrisk metode for å analysere syv immuncelleundergrupper i disse dyrene fra et 25 mL blodprøve er også beskrevet.
Abstract
Den enorme utbruddet av interesse i immunbaserte behandlinger for kreft som vaksiner og immunsjekkpunkt hemmere, og økt forståelse av rollen av svulsten mikromiljøet i behandlingsrespons, kollektivt peke på behovet for immun-kompetente ortotopiske modeller for pre-klinisk testing av disse nye terapier. Dette papiret demonstrerer hvordan å etablere en orthotopic immunkompetente rotte modell av pleural ondartet mesothelioma. Overvåking sykdomsprogresjon i ortotopiske modeller er forvirret av den interne plasseringen av svulster. Slik langs overvåke sykdomsprogresjon og dens effekt på sirkulerende immunceller i denne og andre rottemodeller for kreft, et enkelt rør strømningscytometri-analyse krever bare 25 pl fullblod er beskrevet. Dette gir nøyaktig kvantifisering av syv immunparametere: samlede lymfocytter, monocytter og neutrofiler, samt T-celleundergrupper CD4 og CD8, B-celler og naturlige drepeceller. Ulike ubåterets av disse parametrene er nyttige i ulike situasjoner og modeller, med nøytrofile å lymfocytt ratio ha størst nytte for overvåking av sykdomsprogresjon i mesothelioma modell. Analysere sirkulerende immuncellenivå ved hjelp av denne ene røret metoden kan også bistå i å overvåke responsen på immunbaserte behandlinger og forstå de underliggende mekanismene som fører til suksess eller fiasko for behandling.
Introduction
Ondartet mesothelioma (MM) er en aggressiv malignitet som oppstår fra transformerte celler i membranen (mesothelium) som linjer i lungen og bukhulen, hjerte og indre kjønnsorganer, og er den mest vanlige primære svulst i tette hulrom eller pleura 1,2 . Eksponering for asbest fiber står for 80% av all MM, og mens forbud mot asbest bruk ble introdusert tiår siden i de fleste vestlige land, har utbredt bruk i samfunnet igjen en dødelig arv. Verdens helseorganisasjon har anslått at 107.000 mennesker over hele verden dør hvert år av asbestrelaterte sykdommer, med dødeligheten fortsetter å øke. En ny ikke-yrkes forekomst bølgen er også voksende, og det er liten forståelse for når og på hvilket nivå dette vil peak tre.
Flertallet av mennesker med MM er diagnostisert sent når systemisk kjemoterapi representerer en av de eneste levedyktige alternativer 4. De fleste effective kjemoterapi og nåværende "standard of care" (pemetrexed sammen med cisplatin 5) ble identifisert over 10 år siden. Men svikt i denne behandlingen er uunngåelig, og det er ikke påvist andre linjen, forlater pasienter med dystre prognose og median overlevelse på bare 12 måneder 2. Derfor er det stort udekket behov for mer effektive behandlinger. Til tross for undersøkelse av en rekke nye behandlingsformer i kliniske studier har ingen ført til endringer i praksis. Dette skyldes delvis den lavt (5%) overføring av pre-kliniske resultater, vanligvis utført i xenograft musemodeller, for å klinisk setting 6-8. Slike modeller har ikke trofast repetere de komplekse deler av tumor mikromiljøet som forekommer i ikke-fysiologiske steder, ofte i fravær av et fungerende immunsystem 9.
Syngene ortotopiske modeller skape et betydelig mer realistisk tumormiljøet enn commonly brukt subkutane xenograft-modeller som svulstene forekommer i den korrekte fysiologiske sted med et intakt immunsystem 10,11. Jo større størrelsen på rotte hever dens bruk som en gnager sykdomsmodell, spesielt i legemiddelstudier hvor serie blod uavgjorte er pålagt å vurdere behandlingsrespons og toksisitet 12. Videre er der overvåkning progresjon av sykdommen er i modeller som vanskelig på grunn av plasseringen av tumorer (for eksempel i pleurahulen), evnen til å overvåke sykdomsprogresjon ved hjelp av faktorer som finnes i sirkulasjonen er svært attraktiv. Genereringen av en syngen ortotopisk modell av pleuralt mesoteliom ved hjelp av immun-kompetente rotter er beskrevet. I tillegg, er en enkel og relativt ikke-invasiv metode for å overvåke sykdomsprogresjon pleural ved å måle sirkulerende immuncellene også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i samsvar med anbefalingene i den australske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål. Protokollen for denne studien ble godkjent av Royal North Shore Hospital Animal Care og etikkomiteen. Kvinne Fischer 344 rotter (F344, 150-200 g) ble opprettholdt på Kearns Facility, Kolling Institute under standardbetingelser (12 timers lys / mørke sykluser og fri tilgang til mat og vann).
Merk: Et flytskjema for alle eksperimentelle prosedyrer er presentert i figur 1.
1. Utarbeidelse av celler for Implantasjon
- Kultur rotte mesothelioma II-45-cellelinje (også kjent som IL-45; avledet ved peritoneal innføring av crocidolite asbest) i RPMI 1640 (RPMI) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og vokse i standardbetingelser (37 ° C fuktet inkubator med 5% CO 2). Maintai ved aging og sub-dyrking ved ca. 1:50 to ganger i uken i en 75 cm2 kolbe.
- Forbered reagenser for cellekultur, og varme alikvoter ved 37 ° C. Nødvendige reagenser innbefatter serumfritt RPMI-medium (SFM), RPMI med 10% FBS, fosfatbufret saltvann (PBS) og 0,5% trypsin-EDTA.
- Kultur celler for implantasjon til ca 70-80% samløpet. Dette sikrer at de er i den lineære vekstfasen.
- Høste celler ved kassering av media, vaske en gang med 5 ml steril PBS og deretter tilsetning av 3 ml av 0,5% trypsin-EDTA.
- Returner kolber til inkubatoren i ca. 5 min inntil alle cellene blir ikke-adherente.
- Når cellene er ikke-klebende, tilsett 3 ml RPMI med 10% FBS for å inaktivere trypsin. Samle og sentrifuger cellene ved 300 xg i 3 min.
- Vask cellepelleten i 10 ml SFM og sentrifuger på nytt ved 300 xg i 3 min.
- Vask cellepelleten på nytt med 10 ml SFM og sentrifuger som ovenfor.
- Suspender cellene i 10 ml SFM og utføre en celletelling ved hjelp av et hemocytometer eller lignende instrumentering.
- Fortynn cellene slik at 100 ul inneholder mengden av celler som skal implanteres.
Merk: Tumorvekst er blitt demonstrert ved en dose så lav som 100 celler i 100 ul, men en standarddose er 500.000 celler i 100 ul. - Forbered tilstrekkelig antall celler i media for antall rotter som skal implanteres (dvs. 100 ul / rotte), pluss minst 0,5 ml ekstra for å kompensere for tap fra priming og dødvolumet av nålen.
- Forbered tilstrekkelig SFM (uten celler) som skal implanteres i kontrollrottene (dvs. 100 ul / rotte), pluss minst 0,5 ml ekstra.
Merk: Cellene og SFM er nå klar for implantasjon. De bør holdes ved 37 o C og implantert innen 2 timer fra høsting til å opprettholde levedyktighet.
2. I vivo Implantasjon av celler
- Plasser F344-rotte (> 13 uker gamle) inn i induksjonskammeret og bedøve ved hjelp av 1,4% isofluran inhalasjon (eller den metode som brukes i anlegget). Når rotta ser ut til å være sover flytte den fra kammer til en nesen membran (med 1,4% isofluran flyter), plasser den på ryggen med brystet vendt opp (ventral view). Dette gjør at de indre organene til å bosette seg bort fra brysthulen. Sjekk reflekser i henhold til institusjonelle protokoller for å sikre rotta er fullt bedøvet.
- Barbere høyre regio costalis (brystet) området for å fjerne pelsen.
- Rengjør barbert området med 80% v / v etanol.
- Identifisere injeksjonsstedet: på høyre side, finne andre kjertel starter kranie. Injeksjonsstedet er 0,5 cm proksimalt til denne, mellom tredje og fjerde ribben fra hale enden av brystkassen. (Figur 2A).
- Bland forsiktig de II-45 celler til å suspendere. Sakte trekke cellesuspensjonen (eller SFM for kontrollrotter) i en 1 ml-# 160; sprøyte uten kanyle. Hvis en nål er festet til tegningen opp av celler som det er mulighet for celler å vokse langs nålen innsprøytningsledningen. Fest en 23G x 1¼ nål. Prime nålen og fjern eventuelle luftbobler.
- Når sprøyten og kanylen er primet, plasserer en 20 mm lang og 5 mm diameter spacer over nålen akselen. Dette brukes for å hindre nålen i å trenge for dypt inn i pleuralhulrommet under injeksjonen. Omtrent 5 mm-12 mm av eksponert nålen er tilstrekkelig for penetrasjon gjennom ribbeina uten å skade noen organer.
- Settes nålen mellom ribbeina, trekke tilbake på sprøyten for å sikre en blodåre ikke har blitt punktert (ingen blod skal vises i sprøyten) deretter injisere 100 ul celler eller SFM. (Figur 2B).
- Fjern nålen og forsiktig rulle rotta fra side til side for å spre cellene i brysthulen.
- Plasser rotte inn i et bur og sjekk for utvinning. The rotte bør være våken i 1 min og begynner å bevege seg rundt.
- Gjenta for hver rotte ved hjelp av en ny nål. Gjenbruk av den samme nålen vil resultere i cellevekst langs injeksjonsledning av nålen.
- Overvåke trivsel for dyrene daglig.
- Avlive dyrene på etisk definerte endepunkter som styres av den institusjonelle dyreetikk komité. De etiske endepunkter for rotter i disse eksperimentene var vekttap på mer enn 10% eller tung pust.
3. Tail Vein Blodprøvetaking
- Hvis blod er å bli samlet umiddelbart etter celle implantasjon, holder rotten bedøvet. Dersom prøvetaking blod på et annet tidspunkt, bedøve rotte bruker 1,4% isofluran innånding. Sjekk reflekser i henhold til institusjonelle protokoller for å sikre rotta er fullt bedøvet.
- Plasser rotte på sin side og finne en lateral halevenen.
- Steril halen med 80% etanol og merke en 0,5 ml EDTA collection tube.
- For å samle blod, alltid starte ved kaudal enden av halen (ca. en tredjedel av veien langs). Dette gjør at ytterligere forsøk nærmere kranie enden av halen i tilfelle det første forsøket er mislykket. Aldri resample caudally da dette kan forårsake en blodpropp.
- Plasser en 23G x 1¼ nål parallelt med side venen og skyv den inn i venen på en grunne vinkel så det trenger omtrent 10 mm (figur 3A).
- Merk: Hvis vene har blitt punktert blod vil være synlig i vedlegget enden av nålen (figur 3B).
- En dråpe blod vil danne på halen på stedet av nålen punktering. Samle dette blodet ved hjelp av en pipette og overføring til de merkede 0,5 ml (eller mindre) EDTA samling rør. For immunceller 25 ul analyse er tilstrekkelig. Påfør gasbind med press for å punktere området før blødningen stopper.
- Flick blodet rør for å blande blod og EDTA til prhendelse clotting. Hold tiden mellom blodprøvetaking og blanding med EDTA så kort som mulig for å hindre koagulering.
- Ved innsamling av blod fra flere rotter butikk EDTA-blodprøver i et stativ på RT til analyse. Prosessen blod innen 2 timer av samlingen.
4. Prøvepreparering for Immune Cell Profilering Bruke Bead-basert metode
Merk: Denne felles plattform metoden er avhengig av anvendelse av kommersielt tilgjengelige absolutte telle rør som har et kjent antall perler for hver prøve. Disse rørene inneholder lyofiliserte pellets som oppløses i løpet av prøveopparbeidelse, slippe perler. Perlene blir fluorescensmerket og ved gating på perlepopulasjon, kan absolutte tellinger beregnes.
- Sørg for at EDTA fullblodprøven er godt blandet ved å plassere den på en langsom roterende mikser for flere min. Merk av et absolutt telling tube for hver prøve. En pellet inneholdende kulene skal være synlig under tHan metall perle holderen ved bunnen av røret.
- Overfør 25 ul EDTA fullblod til et merket absolutte telling røret. Vulsten pellet oppløses ved tilsetning av blodet.
- Til hvert rør legge til 20 ul av anti-rotte-T / B / Natural killer (NK) celle cocktail, 10 ul av anti-rotte-CD8a PE, 10 ul av anti-rotte-CD4 (domene 1) FITC og 10 ul anti-rotte CD45 PE / Cy7 (figur 4A). Fluoroforer er gitt i tabell 1.
- Sentrifuger kort rør (300 xg) for å sikre at antistoffer og celler som er i bunnen av røret og ikke fast til siden av røret. Vortex å blande og inkuberes i 15 min ved RT.
- For å lysere røde blodceller Tilsett 400 ul av 10 mM Tris, 0,15 M ammoniumklorid-buffer (pH 7,5) og vortex-bland. Lysis er fullført når prøven synes gjennomsiktig og ikke uklar (figurene 4B og C). Unnlatelse av å lysere prøven fullstendig vil føre til økningd bakgrunnen og falskt forhøyet teller når analysere ved flowcytometri.
5. Flowcytometriske behandling av prøver
Merk: Utfør på en 4 farge strømningscytometer.
- Åpne programvaren i anskaffelse modus og en ny mal med 8 plott som vist i figur 5.
- Justere instrumentinnstillinger til de som er oppført i tabell 1 og sette opp port R1 (FITC [FL-1] versus APC [FL-4]), figur 5Ai) for å telle de fluoriserende perler. De andre portene er ikke like viktig på dette oppkjøpet stadiet, men vil være nødvendig for analyse. De absolutte telle perler som brukes i denne protokollen inneholder fluorescerende fargestoffer, og kan påvises i en kanal, men er svakest i den blå kanalen.
- Ved hjelp av en forberedt kontroll blodprøve, Vortex og deretter laste inn cytometeret og kjør med lav hastighet (12 mL / min) på oppsettmodus slik datainnsamling porter kan justeres.
- Sett oppkjøpet tilsamle 10.000 hendelser i R1 perleporten.
- Sett opp en mappe for å registrere data og satt filnummer og etiketten eksempelfilen i anskaffelses menyen.
- Installering av prøven som skal analyseres på cytometer og sette strømningshastigheten til mediet (35 mL / min). Kjøre hver prøve ved den samme strømningshastighet. Strømningshastigheten kan trenge å bli variert til lav (12 mL / min) eller høy (60 mL / min), men mediet er vanligvis hensiktsmessig. Med dette tempoet tar det ca 90 til 120 sekunder for å skaffe 10.000 perle hendelser for hver prøve.
- Når prøven er lastet se spredningsplott for å sørge for at hendelser dukker opp i R1 perleporten. I første omgang kan det være noe ustabilitet i prøvetrykket forårsaker drift i spredningsplott. Vente på denne for å stabilisere seg.
- Når stabilisert, klikk på erverve og la prøven for å kjøre. Når cytometeret er ferdig anskaffe 10.000 perle hendelser i R1 cytometeret vil slutte å anskaffe og lagre alle data.
- Fjern prøven og kast flyte tuvære. Cytometeret er nå klar for den neste prøven. Kjør alle prøvene, og deretter gå videre til analyse modus.
6. Immune Cell Analysis
Merk: gating strategier og Boolsk algebra brukes til å definere hver celle populasjonen. Boolsk algebra er et logikk basert analysemetode som gjør det mulig for flere operasjoner i en enkelt oppløsning. Analysen Programvaren av strømningscytometer (f.eks BD Cellquest) tillater bruk av boolsk algebra. Ligningene blir brukt for å ta hensyn aktivt for den betydelige negative reaktivitet som bistår i å definere cellen til mer spesifikt identifisere hver celle populasjonen. «Regionenes brukes til å definere en" gate ". Regioner definerer en to-dimensjonalt rom, mens portene kan være sammensatt av en rekke regioner er forbundet med algebraiske operatorene (+, *, -, er definert i tabell 2).
- Slå programvare til analyse modus. En analyse malen skal genereres for å matche
- Analysere hver enkelt fil (dvs. hver enkelt prøve) separat. Sett opp porter R1 gjennom til R9 og deretter sette opp algoritmene for hver celletype som definert i tabell 2 (også vist i figur 5).
- Bruk celle statistikk telleren til å beregne de enkelte cellepopulasjoner definert av porter og algoritmer (Tabell 2 og figur 5). Algoritmene vil justere celle tall automatisk i celle statistikk teller.
- Beregn celleundergrupper ved hjelp av følgende ligning:
Merk: Antall cellehendelser telles (f.eks CD4 T-celle-arrangement) er nummerert ved hjelp av ovenstående ligning, slik at celletall per ul blod. Eksempler er vist i figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som brukes i denne artikkelen for dannelse av en ortotopisk modell av pleuralt mesoteliom ved hjelp II-45-celler resulterte i dyr bukker under for mesothelioma på en reproduserbar og rask tidsramme, med ingen rotter dør på grunn av den implantasjon metoden. Titrering av antall celler implantert fastslått at 1 x 10 3-celler var det minimale antall som kreves for en fullstendig penetrant modell (100% innpoding). De ulike antall celler implantert i rotter forandret tidsforløpet av sykdommen uten å virke til å påvirke graden av sykdommen. Dyr som fikk 1 x 10 3 1 x 10 4 og 5 x 10 5 celler nådd etisk definert endepunkter ved dag 40, 30 og dag 20 henholdsvis (figur 6).
Blod ble samlet inn fra rotter ca to ganger hver uke uten komplikasjoner observert relatert til samlingen. Det er viktig å merke seg at ikke mer enn 10% av det totale blodvolum (ellerca 2 ml) skal samles i en to ukers periode. En flowcytometrisk analyse som kombinert gating strategier og boolsk algebra ble etablert for å identifisere lymfocytter, monocytter og nøytrofile og lymfocytter undergrupper T, CD4 T, CD8 T, B og NK-celler. Den midlere og rekkevidde for hver celletype ble etablert ved bruk av kontrollrotter (n = 5), og ble sammenlignet med gjennomsnittet og rekkevidden til II-45 implanterte rotter ved endepunkt (Tabell 3). Endepunkt verdier ble først i forhold til å avgjøre om forskjellene fantes i immunceller mellom friske og syke dyr. Sammenlignet med friske kontrollrotter, total lymfocytter, CD4 T-celler, B-lymfocytter og NK-celler redusert i II-45 implanterte rotter ved endepunkt, mens monocytter, neutrofiler og lymfocytter, nøytrofile celler til forholdet (NLR) økes.
For å finne ut om disse immuncelleparametre også endret med sykdomsprogresjon og dermed kunne brukes som surrogatmarkører feller overvåke sykdommen, ble langsgående prøver også sammenlignet (figur 7). Den mest informative lengde parameter var NLR med økninger oppdaget opp til 7 dager før etiske endepunkter (Figur 7A). For rotter med høydose celler, ble høye NLRs oppdaget mellom dag 7 og dag 12 innlegg implantasjon, mens for rotter med lavdose celler, begynte NLR å øke mellom dag 18 og 22. Totalt antall lymfocytter redusert med sykdomsprogresjon hos rotter med en lengre sykdoms tidsforløpet modell (lav celle dose: 1 x10 4, figur 7B). Denne reduksjonen var ikke tydelig i rotter med en rask tid kurset (høy celle dose: 5 x10 5). Monocytter holdt seg på normalt nivå inntil terminalen samlingen når grovt økte tellinger ble ofte observert (Figur 7C). De andre immunceller (neutrofiler, NK, B-celle og CD4 og CD8 T-celler) var mer variable og dermed mindre informative.
Figur 1. Flytskjema for eksperimentell prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Plassering av implantasjonsstedet. Rotten blir først bedøvet, plassert på ryggen og høyre regio costalis (brystet) område er barbert for å fjerne pelsen. På høyre side er det 2 nd brystvorten fra toppen identifisert og injeksjonsstedet ligger 0,5 cm proksimalt for dette, mellom 3. og 4. ribben fra bunnen av brystkassen (A). Et avstandsstykke blir deretter plassert over den fremstilte nål og sprøyte til å hindre at nålen å trenge for dypt inn i pleural hulen og 100 mL av celler eller SFM injiseres (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Prøvetakings teknikk for oppsamling av blod fra halen. Plasser en 23G x 1¼ nål parallelt til side vene (A). Skyv nålen inn i venen på en grunne vinkel, ca 10 mm dypt, og hold der i noen sekunder før blodet er synlig (B) og fjern nålen. Blodprøve ved hjelp av en pipette (C). Om nødvendig stryk halevenen for å sikre at blodet fortsetter å strømme. Pipette blod inn i en 0,5 ml EDTA samling rør (D), blanding som du går for å forhindre blodpropp. arge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Merking av blodprøven i en absolutt telle rør for flowcytometrisk analyse. Blood (25 ul), og antistoffer som blir tilsatt til et absolutt telle rør (A). Røret ble deretter vortex-blandet og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Før tilsetningen av ammoniumklorid buffer for å lysere røde blodceller, vises prøven uklare eller ugjennomsiktige (B). Når lysert, vises prøven gjennomskinnelig og er klar for flowcytometri analyse (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
es / ftp_upload / 53019 / 53019fig5.jpg "/>
Figur 5. gating strategi for strømningscytometri-analyse. En 6-dimensjonalt datasett kan identifisere lymfocytter, monocytter og neutrofiler og lymfocytt-delmengdene T, T CD4, CD8 T, B og NK-celler. De definerte port strategier og algoritmer inkludere både de negative og positive reaktivitet som definerer hver celletype som muliggjør spesifikk identifikasjon. Antall perler i hver absolutte telle rør (finnes på posen for hvert rør) registreres for hver prøve, og er nødvendig for beregning av antall celler per mL blod for hver undergruppe som vist. Den komplette gating algoritme for hver celle undersett er oppført til høyre for analyse plott. (Ai) Perler (R1) blir først telles av FITC (FL-1) som funksjon av APC (FL-4). Oppkjøpet er satt til ca 10.000 hendelser (9960 for eksempel). (Aii) Debris (R2) er identifisert av FSC versus SSC og fjernet fra alle etterfølgende ggen. (Bi) Etter fjerning av rusk (R2) FSC versus SSC skiller hvite blodcellepopulasjon i lymfocytter (R3), monocytter (R4) og nøytrofile (R5). (Bii) De cellepopulasjonene identifisert (Bi) er bekreftet ved hjelp den felles leukocytt antigen CD45 gating på PE / Cy7 (FL-3) som funksjon av SSC. (BIII) Lymfocyttpopulasjonen (R3) er videre differensiert i T-celler (R6) ved hjelp av CD3 gating på APC (FL-4) som funksjon av SSC. ( Biv) CD8 T-celler er lymfocytter (R3) differensieres i T-celle (R6) som også uttrykker CD8a (R9) og er innkoplet PE (FL-2) som funksjon av SSC. (Ci) B-celler og NK-celler er definert som lymfocytter ( R3) som er CD3 negative. B-celler (R7) blir differensiert fra NK-celler som uttrykker de CD45RA, og blir styrt av APC (FL-4) som funksjon av FITC (FL-1). (Cii) CD4 T-celler er definert som lymfocytter (R3) som co-uttrykte CD3 (T-celler), R6 ogCD4 (R8), men ikke uttrykker noen av de andre markører anvendt. De er differensiert ved hjelp av FITC (FL-1) som funksjon av PE (FL-2) gating. NK-celler er definert som enhver gjenværende lymfocytt som ikke allerede er definert som også uttrykker CD161a. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Overlevelseskurven for rotter implantert med forskjellige doser av II-45 mesothelioma celler. Grupper av rotter ble pleurally implantert med 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2), eller en 10 x 2 (n = 4) II-45 mesothelioma celler i 100 ul volum og deretter overvåket inntil etisk punktet når de ble avlivet. Overlevelse ble tegnes ved hjelp av log-rank (Mantel-Cox) Gehan-Breslow-Wilcoxon metoden. p>
Figur 7. Lengde sirkulerende immunceller fra rotter med mesothelioma i forhold til gjennomsnittet og rekkevidde for friske kontrollrotter. Den sunne kontroll bety for hver celletype er vist som en horisontal ubrutt svart linje (verdien vises på høyre Y-aksen hver graf) og utvalget er avbildet i den grå skraverte området. Y-aksen viser tellinger per mL blod for den angitte celletype, eller verdien for NLR. X-aksen er tidsforløpet for sykdomsprogresjon, hvor dag 0 er dagen for implantasjon. Langsgående resultater for 2 rotter implantert med 1 x 10 4 celler (A, B) og 2 rotter implantert med 5 x 10 5 celler (C, D) er vist. (A) NLR, (b) totalt antall lymfocytter, (C) monocytter teller.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Detector | Fluorophore | Detaljer | Spenning | Mode |
| FSC | --- | --- | E00 | Lineær |
| SSC | --- | --- | 450 | Lineær |
| FL-1 | FITC | 533/30 nm | 670 | Logg |
| FL-2 | PE | 585/40 nm | 675 | Logg |
| FL-3 | PE / Cy7 | 670nm (langpasning) | 600 | Logg |
| FL-4 | APC | 675/25 nm | 735 | Logg |
Tabell 1: Spenning detektorinnstillinger for flyt CYTOmetrisk datainnsamling ved hjelp av en fire farge strømningscytometer. Amplitude forsterkningen er innstilt på en for alle detektorene. FSC: forover scatter, SSC: side scatter, FITC: Fluorescein isothyocyanante, PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanine.
| Cell undergruppe | Cell Markers | Gating Algoritme |
| Perler | R1 | |
| Debris | R2 | |
| Celler (pan-leukocytter) | CD45 + | -R2 |
| Lymfocytter | CD45 + FSC versus SSC | R3 * -R2 |
| Monocytter | CD45 + FSC versus SSC | R4 * -R2 |
| Nøytrofile | CD45 + FSC versus SSC | R5 * -R2 |
| T-celler (totalt) | CD45 + / CD3 + | R6 * R3 * -R2 |
| CD8 positive T cells | CD45 + / CD3 + / CD8a + | R9 * R6 * R3 * -R2 |
| B-celler | CD45 + / CD3- / CD45RA + | R7 * R3 * -R2 |
| CD4-positive T-celler | CD45 + / CD3 + / CD4 + | R8 * R6 * R3 * - (R7 * R3 * -R2) |
| Natural Killer celler | CD45 + / CD3- / CD161a + | R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * R3 * R2)] |
Tabell 2: Celle markører og port algoritmer for å karakterisere hver immuncelle undergruppe For gating algoritmen, betyr '+' symbol 'eller' og lar to separate bestander som skal legges sammen selv om deres reaksjoner ikke overlapper.. The '-' symbolet betyr "ikke", og kan trekke fra én populasjon fra en annen definert populasjon eller det motsatte av en tidligere beskrevet befolkning. The '*' symbolet betyr 'og' og definerer en plass som er bare til stede når to reaksjoner lapper.
Tabell 3:. Den midlere og utvalg av immunceller hos friske kontroll rotter (n = 5) og II-45 implantert rotter ved endepunkt (n = 4) Resultater per mL blod vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret detaljer en metode for generering av et rotte syngen ortotopisk modell av pleuralt mesoteliom og en enkel metode for å overvåke sykdomsprogresjon gjennom langsgående blodprøvetaking.
II-45 modellen ble utviklet ved å utsette Fischer 344 rotter til asbestfibre 13. Selv om denne eksponeringen representerer den sanne dynamikken i host-asbestimmunsystemet interaksjoner for mesothelioma patogenesen, har det en lang lag tid (tar år å generere) og kan være farlig for forskerne på grunn av potensiell eksponering for asbestfibre. Ortotopisk implantasjon av II-45-celler inn i pleuralhulrommet av dyr gir en sikker og hurtig modell av kreft progresjon som etterligner den humane sykdommen i en immun-kompetent vert 11. Men de eksakte metoder og prinsipper for å følge løpet av disse eksperimentelle prosedyrer ikke er godt definert. Fremgangsmåten som er beskrevet resulterer i en meget reproduserbar modell som er relasvis uavhengig av opplevelsen av operatøren. De kritiske trinnene er en, høsting II-45 celler i eksponentiell vekstfase og nøyaktig telling av levedyktige celler; 2, riktig plassering av implantasjonsstedet og sikre at nålen ikke trenge for dypt og punktere lungene eller skade hjertet, og tre, vedlikehold og overvåking av trivsel for dyrene.
II-45 cellelinje er raskt voksende og krever aging hver 3 til 4 dager i kultur, derfor når du forbereder for implantasjon, bør celler subdyrkes og vekst overvåkes daglig. Celler bør høstes og telles når i eksponentiell vekstfase, dvs. at ca 70% samløpet. Oppvirvling av celler i serumfritt medium snarere enn PBS reduserer stress på cellene mens telling og forberede for implantasjon. Nøyaktige legemer er avgjørende for reproduserbarhet, spesielt når dosering med lave celle tall (for eksempel 100 til 1000). Den suspensjonen skal være homogen og består av enkeltceller (ingen klumper). En implantasjon volum på 100 ul muliggjør nøyaktig dosering uten å redusere lunge ekspansjon gjennom overdreven væske i pleurahulen. De viktigste trinn ved implantasjon er korrekt posisjonering og begrensning av nålepenetrering til en dybde på ikke mer enn 12 mm. Riktig plassering av nålen på injeksjonsstedet er svært viktig for å sikre at cellene blir implantert i brysthulen og ikke inn i bukhulen. Feilaktig implantering av celler for lavt kan resultere i mesothelioma tumorer som vokser gjennom membranen og inn i leveren og bukhulen. Begrenser inntrengningsdybden av kanylen er også meget viktig for å forhindre dødelighet som et resultat av indre organskade. Denne begrensning kan oppnås ved hjelp av en avstandsholder over en lang nål (som vist), eller ved bruk av en kortere nål med en aksel lengde på 5 mm til 12 mm. I våre hender, har ingen bivirkninger inntraffunder celle implantasjon. Det er også viktig å erstatte nålen etter hvert implantasjon. Unnlatelse av å gjøre dette kan resultere i svulster vokser ut av brysthulen langs injeksjonslinjen. En slik vekst utsiden av pleurahulen er på grunn av gjenværende celler på nålskaftet og kan resultere i forlenget overlevelse.
I våre hender denne modellen har en 100% svulst engraftment rente ved administrering av ≥ 1 x 10 3 celler. Sykdomsprogresjon i II-45 mesothelioma modellen er ganske hurtig, blir mindre enn 40 dager ved 1 x 10 4 celler er implantert og mindre enn 20 dager etter en dose på 5 x 10 5 celler. Dette kan begrense anvendeligheten av denne modellen for preklinisk testing av noen terapier. De II-45 celler, mens ikke kommersielt tilgjengelig kan være hentet med tillatelse fra opphavs 13. Imidlertid kan de samme implantasjon teknikker og prinsipper også brukes på andre rotte mesothelioma cellelinjer som er tilgjengelige fra cellelinje repositories når matchet med de relevante syngeniske rottestammer. Den optimale celle Dosen kan variere med cellelinje og trenger å bestemmes for hver linje.
Overvåking sykdomsutvikling og trivsel for dyrene er vanskelig som svulstene er interne og kan ikke overvåkes av størrelse. De søkte vi å utvikle en fremgangsmåte for overvåking av dyr som kunne forutsi forverring av tilstanden for eksempel en økning i NLR eller annen endring i immuncellemarkører før fysiske symptomer kom til syne. Blodet skjermen utviklet bruker bare 25 ul av perifert blod, slik at regelmessig prøvetaking kan utføres med minimalt ubehag for dyret. Prøvetakingen teknikken beskrevet krever øvelse for å få den nødvendige kompetanse. Men når mestret den er rask og minimal invasiv.
Et kritisk trinn i analyse av blodet er for å forhindre koagulasjon av blodprøven ved hurtig overføring til en EDTA-rør. Koagulerte prøverskal kastes som teller vil være unøyaktig. Et annet kritisk punkt er den røde cellelyse før celle analyse. Dersom de røde blodcellene ikke er fullstendig lysert, vil den økte bakgrunns feilaktig heve teller. Mens det første oppsettet av dot plott og gating er tidkrevende, når innstillingene og mal lagres, analysen krever litt justering. Portstyringsstrategi anvendt anvender en multi-parameter boolsk algebraisk tilnærming til deconvolute dataene. Ved bruk av kjente kombinasjoner av eksklusive og felles antigener algoritmer for hver linje av porten strategien definerer diskrete celletype i denne seks-dimensjonal datamatrise 14. Dette kombinert med etablerte nøyaktigheten av ratiometrisk perle-basert teknologi 15-17 har den fordel for å muliggjøre bestemmelse av en hvilken som helst celletype som defineres både en andel av celler og et absolutt telling per mL.
Det blir stadig mer anerkjent at immunsystemet pdanner et viktig rolle i patogenesen av kreft 18. Både svikt i immunsystemet til å gjenkjenne og ødelegge maligne celler og undertrykkelse av immunceller ved tumorer kan føre til ukontrollert tumorvekst. Således er inkluderingen av en immun-kompetente tumor mikro en kritisk faktor når modellering kreft og er en betydelig fordel med syngeniske cancermodeller. Disse immunkompetente modeller skape en realistisk og klinisk relevante miljø for tumorvekst og immun interaksjon, som er mangelfull i xenogene modeller.
Immun parametrene identifisert i denne studien som fulgte sykdomsprogresjon, dvs. antall lymfocytter, monocytter teller og NLR, har også vist seg å korrelere med dårlig prognose i menneskelig mesothelioma 19-21 gir bevis for relevansen av modellen og blodprøve . I modellene som er presentert, den kliniske nytten av å overvåke immunparametere økt viddh lengre tidsforløpet (lavere dose), og kan bli ytterligere forbedret ved hyppigere sampling på senere stadier av sykdommen. Mens denne artikkelen fokuserer på en modell av mesothelioma, kan evnen til å overvåke tumorprogresjon gjennom perifere blodprøvetaking benyttes for alle syngeniske kreft modeller. Videre kan analysen også brukes til å vurdere den immunologiske responsen til forskjellige behandlinger. Tidligere har vi brukt dette assay for å overvåke responsen på en anti-kreft-vaksine terapi i en syngen glioma modell (9L) 22. I den studien, CD4 og CD8 T-celler var de mest informative markører. Vi har også benyttet denne analyse og II-45 mesothelioma modellen for å identifisere forskjeller i immunrespons mot tumorer som er resistente mot forskjellige kjemoterapeutika 11. I den studien, alle parametre unntatt CD8 T-celler viste signifikante forskjeller. Lengde oppfølging under sykdomsprogresjon beskrevet her fremhever potensialet i ulike immuncelleparametre til correlatere med kreft progresjon og trivsel for dyrene når gjennomføre syngenisk orthotopic modellering av kreft hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA Collection tube (0.5 ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur 4 color | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail? Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
