Summary
Estimulação do nervo vago (VNS) emergiu como uma ferramenta para induzir plasticidade sináptica alvejado na parte frontal do cérebro para modificar uma série de comportamentos. Este protocolo descreve como implementar VNS para facilitar a consolidação da memória de extinção do medo.
Introduction
Medo condicionado clássico fornece um modelo animal amplamente utilizado para estudar a função biológica de perturbações de ansiedade. Durante o condicionamento do medo, um estímulo aversivo (o estímulo não condicionado, EUA, por exemplo, um choque eléctrico na pata) é apresentada em conjunto com um estímulo neutro, tal como um tom e / ou um quadro (o estímulo condicionado; CS). Durante o condicionamento do medo, as associações entre o CS e os EUA são formadas. Eventualmente, a apresentação do CS sozinho induz uma resposta de medo (resposta condicionada; CR). Em extinção medo, o CS é apresentada repetidamente na ausência de os EUA, fazendo com que o CR a diminuir gradualmente 1. Assim, a extinção do medo condicionado é um processo ativo em que as respostas comportamentais medo de estímulos neutros são atenuados quando já não prever resultados aversivos. Extinção de respostas condicionadas requer a consolidação de novas memórias que competem com as associações aprendidas. Uma característica dos transtornos de ansiedade é impaextinção Ired 2-4. Assim, a extinção do medo condicionado em modelos animais serve como um paradigma importante tanto para a aprendizagem inibidor e como um modelo de terapia comportamental para transtornos de ansiedade humanos 5,6.
Porque existe uma estreita correspondência entre o medo ea ansiedade humana, pensa-se que estes estudos podem fornecer insights sobre a natureza biológica de distúrbios relacionados com a ansiedade como o transtorno de estresse pós-traumático e ajudará a desenvolver estratégias para tratá-los. Um objetivo importante da pesquisa pré-clínica é ajudar aprendizagem extinção e para induzir plasticidade alvejado em circuitos de extinção para consolidar a aprendizagem extinção. Estimulação do nervo vago (VNS) é uma abordagem neuroprosthetic minimamente invasivo que pode ser usado para fornecer modulação temporal e específico do circuito apertado de áreas do cérebro e sinapses envolvidos em uma tarefa contínua. Uma série de estudos recentes do grupo de Michael Kilgard na Universidade do Texas em Dallas temmostraram que o emparelhamento VNS com estímulos sensoriais ou motoras discretas (por exemplo, um tom ou um puxão alavanca) é altamente eficaz na promoção da plasticidade cortical para tratar o zumbido 7, ou para superar os défices motores após acidente vascular cerebral 8-10. Além disso, não contingente VNS que ocorre dentro de um intervalo de tempo curto depois de saber semelhante promove plasticidade cortical e melhora a consolidação da memória em ratos e em seres humanos 11-13.
Considerando o papel do nervo vago na via parassimpático, não é surpreendente que possa participar na modulação da plasticidade sináptica e memórias. Altamente eventos emocionais tendem a produzir memórias mais fortes do que as memórias não-emocionais. Isto é provavelmente devido à influência dos hormônios do estresse sobre a consolidação da memória. Pós-treino administração da adrenalina hormônio do estresse aumenta a consolidação da memória em animais humanos e não-humanos, mas a adrenalina não atravessar a barreira sangue-cérebro-barreira 14, 15 16 acharam que a administração sistêmica da adrenalina aumentou disparo do nervo vago, e aumento dos níveis de norepinefrina na amígdala 17. A administração sistémica de adrenalina não melhora a consolidação da memória quando os receptores β-adrenérgicos são bloqueados na amígdala 18 sugerindo que o nervo vago desempenha um papel importante no caminho que se transforma experiências emocionalmente carregadas em memórias de longo prazo.
Assim, o emparelhamento com VNS treinamento tem o potencial de melhorar as mudanças do cérebro que suportam a consolidação da memória e exposição a estímulos condicionados, na ausência de reforço aumenta a consolidação da aprendizagem extinção em ratos 19,20. Aqui descreve-se a utilização de um VNSsa ferramenta para promover a plasticidade cortical e facilitar a extinção de uma resposta de medo condicionada.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e eles foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade do Texas em Dallas animal Institucional.
1. Construção de VNS Punhos
- Criar uma ferramenta de perfuração por serrar a ponta de uma agulha 22 G ½.
- Execute o fim agora sem corte dos 22 ½ G agulha sobre um arquivo de metal várias vezes para achatá-lo. Segure a agulha em um ângulo de 45º para o arquivo e executá-lo várias vezes sobre o arquivo enquanto gira-lo. Isso fará com que o metal para tornar-se mais fino e enrolar para dentro. CUIDADO: Insira a ponta do bisturi na extremidade cortada da agulha e girar com alguma força para baixo para desfraldar o metal.
- Use binóculos de ampliação para as etapas restantes na seção 1.
- Utilizando um escalpelo (10 ou 15 da lâmina) cortar quatro milímetros segmentos de tubagem.
- Coloque um segmento de quatro milímetros ao longo de umbroca pequena ou outra ferramenta de forma semelhante. Isto é para manter o tubo no lugar enquanto está a ser manipulado.
- A broca 4 orifícios na tubagem (Figura 1A). Furos devem fazer os quatro pontos de um 2 milímetros por 2 milímetros quadrados e deve ser limpa, sem arestas.
NOTA: A ferramenta de perfuração tem de ser afiadas (passo 1.2) a cada 2 ou 3 buracos. Dificuldade com este passo é quase certamente devido a uma ferramenta de perfuração que não é nítida o suficiente. - Com o tubo ainda sobre a broca, usar um bisturi para cortar o tubo longitudinalmente entre os orifícios, de modo que dois furos acabam em ambos os lados do corte (Figura 1B).
- Usando uma agulha de costura e fio de sutura, passa através dos orifícios de sutura para criar o equipamento para o posicionamento final da braçadeira em torno do nervo vago. Comece com a agulha no interior da bainha e passá-la através de um dos furos, em seguida, voltar através do orifício adjacente do lado de fora (Figura 1C). Amarre a thread juntos ~ 2 cm do plástico de modo que o tubo e fio fazer um triângulo. Permitir ~ 8 centímetros da linha após o nó e guarnição. Repita o processo para os buracos no lado oposto do corte. O tubo está agora pronto para ser ligado.
- Prepare os fios de algemas.
- Cortar o fio de irídio platina em 70 segmentos mm.
- Usando a melhor dica para a tocha de jóias, criar uma chama afiado com o azul centro que é tão refinado quanto possível e usá-lo para tirar ~ 1 cm do revestimento plástico do fio. Aplique o centro azul da chama ao fim listrada do fio para criar uma pequena bola. Aplicar o centro azul da chama a vários pontos da parte descarnada para fundir os sete fios juntos. O fio nestes pontos aparece a dobrar.
- Na extremidade oposta do fio, aplicar o centro azul da chama ao fim para criar uma pequena bola. Minimizar a decapagem plástico nesta extremidade.
- Conectar o manguito (Figura 1D).
NOTA: Steps no ponto 1.10 deve ser feito sob binóculos de ampliação.- Tape o punho para baixo usando os fios de modo a que está orientado com o corte funcionando horizontalmente. Puxe os fios rígido para que o manguito é puxado aberto e fita adesiva para baixo os fios.
- Segure a extremidade do lado enrolado listrada do fio preparado com # 5 fórceps e empurre através do orifício inferior direito. Puxar a pinça para fora do furo, deixando a extremidade do fio no meio do punho.
- Re-agarrar o fim enrolado do fio descascado (agora no meio do manguito) e empurrá-lo através do orifício superior direito. Puxar a pinça para fora do furo, deixando o fio passou completamente através da braçadeira e solto no lado superior do punho.
- Re-agarrar o fim enrolado do fio descascado (agora fora do manguito na parte superior) e empurre-a de volta através do orifício superior direito do interior. Continue fazendo isso até que o fio é firmemente no lugar: teste puxando na extremidade oposta do fio.
NOTA:Durante este processo, é crítico para diferenciar as porções isoladas / descascada do fio. O fio que está posicionada na última análise 'calha' do punho deve ser removido, mas tudo abaixo dos orifícios de fundo (fora do balonete na extremidade inferior) deve ser isolada. Isto assegura o fornecimento de corrente apenas para o nervo vago. - Agarrar a extremidade do lado enrolado isolado e empurrá-lo através do orifício inferior direita a partir do interior da manga, em torno de looping que uma vez.
- Repita os passos 1.10.2 - 1.10.5, no lado esquerdo da braçadeira de modo que dois fios de acabar fixo ao tubo, uma do lado direito e outra do lado esquerdo.
- Coloque um alfinete de ouro no braço da mão de ajuda com o buraco virado para cima. Encha o buraco com fluxo.
- Soldar a extremidade isolada do cabo (agora ligado ao punho) para o pino.
- Permitir que a solda arrefecer, e em seguida fundir de novo. Isto assegura uma boa ligação entre a extremidade do fio e a inside do pino. Aplique mais de solda, se necessário. Repita o procedimento para segundo fio.
- Com as pontas de correr para a direita, marcar a parte superior do punho com marcador permanente. Também marca o alfinete de ouro ligado ao topo de chumbo.
2. Construção de headcap para VNS Input do Site
- Cortar 30 mm segmentos de 26 AWG fio de cobre. Tira uma pequena porção em cada extremidade.
- Corte a extremidade estreita off pinos de ouro soltas e solda final listrada do fio à extremidade cortada do alfinete de ouro. Criar dois compostos fio / pino para cada local de entrada desejado. Coloque um conector nas mãos ajudando e soldar a extremidade do fio de um fio de composto / pino para a cada um dos dois dentes fluxado do conector (Figura 2G).
- Mark um dos fios com sharpie. Durante a cirurgia, a posição do implante com o rostral fio marcante com o fio isolado.
3. VNS Cirurgia
- Criar ferramentas de vidro sob encomenda para manuseio de vagus nervo durante a cirurgia.
- Use de vidro de borossilicato para puxar uma micropipeta de modo que tenha uma longa ponta afunilada. Se não está disponível extrator pipeta, quebrar o vidro para criar uma borda mais.
- Segure a extremidade não afilada da pipeta com um pano grosso (para evitar queimaduras) e pressione a / final quebrado cônico em uma superfície resistente ao fogo suave durante a aplicação da chama azul da tocha jóias para a extremidade cónica. O vidro vai dobrar, uma vez que é pressionado para dentro da superfície. Aplicar chama até um gancho ou formas forma J.
- Procedimentos cirúrgicos VNS
- Reúna e esterilizar todas as ferramentas. Prepare a área cirúrgica sanitária, aquecida.
- Anestesiar animais com cetamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Avaliar a profundidade do plano anestésico, monitorando vocalizações do animal e de abstinência-reflexos em resposta aos pés e / ou cauda beliscar.
- Raspar a parte superior da cabeça e do lado esquerdo do pescoço do animal. Proteger os olhos do animal com a mineradoraóleo al ou pomada. Aplicar solução de iodo a limpeza com gaze e álcool, em seguida, com gaze para as áreas raspadas. Repetir uma vez.
- Injectar 0,05 ml marcaína subcutaneamente no topo da cabeça e permitir que o bólus se dispersar ao mesmo tempo a colocação do animal no instrumento estereotáxico.
- Usar um bisturi para fazer uma incisão na pele sobre o crânio para expor ambos lambda e bregma. Prepara-se uma via para a braçadeira, utilizando fórceps rombas para túnel subcutaneamente a partir do local de incisão para o lado esquerdo em frente da orelha do lado esquerdo do pescoço.
- Puxe o local da incisão aberta com hemostats. Usando cotonetes, aplicar o peróxido de hidrogênio ao crânio exposta para remover qualquer tecido remanescente.
- Usando um bisturi, faça dois furos de arranque rasas no crânio para colocar parafusos de fixação. Eles devem ser colocados longe o suficiente para permitir espaço para o implante, mas não muito perto do tecido circundante. Evite colocar parafusos diretamente na linha média.
- Com vigorps e chave de fenda, dirigir um parafuso de osso em ambos os buracos. Os parafusos devem ser apertados nos orifícios, com as tampas de 2 - 3 mm acima da superfície do crânio para permitir espaço para o acrílico para preencher sob e em torno dos parafusos.
- Encher o espaço debaixo, em torno, e entre os parafusos com uma pequena quantidade de acrílico, evitando o tecido circundante. Em seguida, coloca uma maior quantidade do acrílico no meio do crânio entre os dois parafusos.
- Agarre o implante de modo que o fio marcado é orientada rostral ao fio sem marcação e rapidamente colocar o implante no acrílico, tomando cuidado para não ficar acrílico para os pinos de ouro, a área de fecho, ou o local de entrada no topo. Uma vez posicionado deixar solidificar ~ 5 min até secar. Isto também pode ser feito usando o braço de suporte para o estereotáxico. Preencha todas as rachaduras ou lacunas entre o implante eo crânio com uma baixa viscosidade de mistura de acrílico. Deixe secar.
- Use binóculos de ampliação para as etapas restantes na seção 3.2.
- Remover the animais do instrumento estereotáxico. Colocar o animal em seu lado direito, girando-o levemente para a posição ventral.
- Fazer uma pequena incisão de aproximadamente sobre a veia jugular esquerda. O osso da mandíbula e clavícula deve ser mais ou menos equidistante ao local da incisão. Alargar a incisão utilizando uma dissecção romba até que a camada muscular é atingido. Os Sternomastoid, esterno hioideo, e omo-hióideo músculos devem estar visíveis. Use afastadores musculares para manter o local aberto.
- Continue dissecação romba ao longo dos sulcos naturais entre os músculos. Olhe para a pulsação da artéria carótida. A posição através do músculo para a pulsação irá revelar a artéria carótida. Puxe os músculos de volta com o retrator muscular. O invólucro que contém a artéria carótida também contém o nervo vago. Cuidadosamente neutralizar dissecar a bainha com a tesoura.
- Identificar o nervo vago. É o maior dos nervos na bainha carótida e é, geralmente, para o lado esquerdo do animal da artériamas pode ser encontrado em qualquer lado. Mudar para as ferramentas de vidro personalizados e separar o nervo vago a partir da artéria carótida. O nervo deve estar livre de qualquer outro tecido durante pelo menos 5 mm.
- A partir da incisão na cabeça, utilizando-se as roscas no lado oposto do manguito as ligações, puxar a manga através do túnel subcutâneo anteriormente com fórceps hemostáticos ou pequenos. Empurra-o através do tecido no local de incisão no pescoço.
- Suavemente levantar o nervo-se usando as ferramentas de vidro e empurrar os fios do lado oposto do manguito os fios sob o nervo. Puxe os fios durante todo o tempo, tomando cuidado para não esfregar contra o nervo. O balonete deve ser imediatamente adjacente ao nervo.
- Verifique se o manguito está orientada com o 'top' lado marcado superior. Largar o nervo para o meio do manguito. O nervo deve agora se encontram em ambos os fios na calha do manguito (Figura 2B). Amarre os fios em conjunto para fechar o punho.
- No headcap, conecte os pinos ligados à braçadeira para os pinos de ouro no local de entrada de estimulação. Conecte o pino marcado para o alfinete de ouro anexado ao dente mais anterior no site entrada simulação.
- Para verificar que a braçadeira estimula adequadamente o nervo vago, realizar um teste de cessação de respiração por, o estimulador de ligação para o local de entrada de estimulação sobre o headcap e executando estimulação (0,2 mA, 60 Hz, até 10 segundos). A respiração deve parar momentaneamente e freqüência cardíaca deve cair, verificando função manguito.
- Prenda os pinos no local de entrada estimulação com acrílico. Cobrir os fios e verifique se os pinos e fios expostos não provocar curto-circuitos. Use acrílica para alisar todas as colisões ou para preencher eventuais lacunas. Deixe secar.
- Sutura fechada ambos os locais de incisão. Injectar 0,05 ml por via subcutânea marcaína perto do local da incisão no pescoço. Aplicar pomada antibiótica à incisão sites. Opcionalmente, deixe um conector macho no lugar no site de entrada para estimulaçãoevitar danos ou obstrução durante o processo de cura.
- Tratar com antibiótico e siga cuidados pós-operatórios padrão, incluindo analgesia adequada. Retorno animais para instalação de alojamento dos animais depois que eles recuperar a mobilidade. Permitir 5 dias para recuperação. Para assegurar a longevidade máxima e função do headcap, animais domésticos individualmente durante o resto da experiência.
NOTA: ratos Sham-VNS submeter o mesmo a cirurgia, no entanto, o circuito é concebido para curto no plano da headcap (isto é, um headcap é implantado e o nervo vago é separado a partir da artéria carótida, mas sem balonete eléctrodo é colocado em torno do nervos).
4. Auditivo Medo Condicionado
NOTA: Este protocolo medo condicionado é mais intensa do que a maioria 21 porque o objetivo desses experimentos é aumentar extinção. Com medo condicionado leve que pode ser facilmente extinto, um efeito chão pode obscurecer esse aprimoramento.
- Siga as apresentações iniciais com tom tom 8-footshock (1 seg, 0,5 mA) pares em cada um dos dois dias consecutivos. Repita os emparelhamentos tom-choque nas patas novamente no segundo dia. Varie a inter-estímulo-intervalo (ISI) entre 2 e 4 min, com média de 3 min para cada julgamento. Randomizar o ponto em que ocorre durante o choque do tom.
- Tapar os ratos para o estimulador, inserindo os conectores macho do stimulator no sítio de entrada de estimulação. Colocar os animais na câmara (Figura 2A, 2C). Defina o estimulador para 0,4 mA, 500 mS largura de pulso em 30 Hz. Definir estimulação para uma duração total de 30,15 segundos, a partir de 150 ms antes do início do tom. Jogar animais 4 tons (como na etapa 4.6) e emparelhar cada apresentação tom com VNS ou Sham VNS.
- Ligue o animal como normal e em dividir a saída do estimulador para o osciloscópio.
- Defina o intervalo no osciloscópio como -20 V a +20 V e executar a estimulação. A forma de onda da estimulação de 30 Hz deve ser visível no osciloscópio. Estímulos superiores a 10 V em tamanho indicam alta impedância e um manguito não está funcionando corretamente ou conexão no local de entrada de estimulação.
5. In Vivo As gravações de campo Potenciais evocados
Nota: Esta etapa é opcional. Potenciais de campo evocada (EFPs) são registados 24 horas depois de testes de recuperação (Dia 5) em ratos anestesiados com isoflurano montados num aparelho estereotáxico, seguindo procedimentos padrão 23,24.
- Reúna e esterilizar todas as ferramentas.
- Induzir a anestesia com isoflurano (5% em 100% de oxigénio, caudal 1l / min) numa câmara de plástico transparente. Avaliar a profundidade do plano anestésico, monitorando vocalizações do animal e de abstinência-reflexos em resposta aos pés e / ou cauda beliscar. Use óleo mineral ou pomada para proteger os olhos.
- Injectar 0,05 ml marcaína subcutaneamente no topo da cabeça e permitir que o bólus se dispersar. Usar um bisturi e hemostáticos para remover o headcap do crânio. Use o mínimo de força possível para evitar obscurecer bregma.
- Colocar o animal no instrumento estereotáxico. Usar um bisturi para alargar a incisão para expor ambos lambda e bregma. Manter plano anestésico com isoflurano (3% em 100% de oxigénio, caudal de 1 L / min) através de um cone de nariz.
- Faça furos no crânio acima do córtex pré-frontal infralimbic (IL) ea amígdala basolateral (BLA). Abaixe um microeletrodos de vidro (KCl 2M; 1-2 MOhms resistência) na BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4.9 de bregma) e um stimulateléctrodo de iões para a região de IL do córtex pré-frontal medial (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 a partir da bregma) (Figura 4A).
- Estimular a IL evocar EFPs no BLA. Os dados apresentados na Figura 4 foi adquirida com as seguintes definições: Um pulso de estimulação de 0,3 mseg de duração, utilizando uma intensidade de estimulação que correspondeu a 40% da intensidade de corrente mínima que provocou uma resposta máxima de campo (com base em uma curva de entrada-saída determinada antes recolha de dados de base), entregue a cada 15 segundos.
- Coletar dados de base para um mínimo de 10 - 15 min antes de induzir plasticidade sináptica.
NOTA: O protocolo utilizado para evocar a plasticidade sináptica irá variar de acordo com os requisitos das experiências e deve ser cuidadosamente seleccionada por cada experimentador. Os dados na Figura 4C mostra mudanças na EFP seguinte três rajadas de 100 pulsos a 50 Hz (2 seg), com intervalos inter-burst 20 seg na intensidade mínima corrente que evocamd a resposta máxima campo. - Medir a amplitude de EFP como a diferença entre a média de uma janela de 5 ms antes de o artefacto de estímulo e a média de uma janela de 5 mseg em torno de 20 - 25 mseg após o artefacto de estimulação, correspondente ao pico negativo do campo potencial. Normalizar os dados da linha de base e para definir a média de uma linha de base de 10 minutos como 100%. Use as amplitudes EFP médios de outro período de 10 minutos após a indução de plasticidade (por exemplo, 40 - 50 minutos após a indução) para avaliar as mudanças de longo prazo na amplitude EFP.
- Após o fim da gravação decapitar o animal anestesiado e extrai-se o cérebro. Prepare tecido para verificação histológica de colocação do eletrodo.
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Representative Results
Esta secção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através da utilização de VNS em combinação com a aprendizagem extinção para reduzir a expressão da resposta de medo condicionado em ratos. Para Dias 1 e 2 (Auditivo Medo Condicionado), os ratos foram treinados em uma tarefa auditiva medo condicionado em choques nas patas que foram pareados com um tom. No Dia 3 (Pré-Tratamento de teste), tons foram apresentados na ausência de choques nas patas para medir os níveis de congelamento e inferir aquisição resposta de medo condicionado. No Dia 4 (tratamento) os ratos receberam treinamento extinção específico do grupo e tratamento: 4 apresentações de tom foram pareados com qualquer VNS ou sham-estimulação ou, no grupo extinção prorrogado, apresentações 20 de tom com sham-estimulação. Níveis de congelamento foram testados novamente no dia 5, em resposta a 4 apresentações de sozinho o CS (teste de pós-tratamento) (cf cronograma na Figura 3A). Os animais que receberam um número limitado (4) das exposições não reforçado ao conditioned tom durante a fase de extinção mostrar apenas uma pequena redução no medo condicionado no seguinte dia reintegração (Figura 3B). Em contraste, os ratos tratados com VNS demonstrar uma redução significativa da congelação após uma única sessão de treino de extinção (Figura 3B). A quantidade de redução da resposta de medo condicionado de animais tratados com VNS é comparável à observada em animais tratados de forma simulada os que receberam cinco vezes a quantidade de exposição não reforçado (20 tons) durante o treino de extinção (grupo EE na Figura 3B). Utilizando a montagem experimental específico acima indicado, VNS também pode facilitar a extinção ao contexto. Como mostrado na Figura 3C, animais VNS também mostraram uma redução comportamento de congelação fora da apresentação do tom condicionado, sugerindo que a sua formação extinção também generalizados para o contexto. Mostramos também que o emparelhamento VNS com formação extinção altera a metaplasticity no caminho between córtex infralimbic (IL) e da amígdala basolateral (BLA) em animais anestesiados (Figura 4). Em animais com ar-medo que não se submeteram a treinamento de extinção, estimulação breve explosão (HFS) do LTD IL induzida do campo local, evocado na BLA (Figura 4). Se eles receberam treinamento extinção prorrogado ou VNS durante uma única sessão extinção, esta depressão sináptica foi revertida em animais exibindo extinção significativa do medo condicionado; No entanto, a administração de VNS durante a extinção promovida a indução da LTP enquanto que os animais do grupo de extinção prolongado mostrou nenhuma alteração em resposta à SAH. Este resultado foi também observado em animais que foram estimuladas com sham no grupo de extinção de quatro tons. Importante, VNS única alterou a plasticidade na via entre a IL eo BLA quando foi entregue em um contexto de extinção. Em contraste, VNS entregues aos animais não treinadas nas suas gaiolas não teve efeito sobre synaptic plasticidade na via IL-BLA (Figura 4B).
Figura 1. Construção de Vago punhos do Nervo. (A) de posicionamento da peça de 4 milímetros de tubagem sobre a broca para a estabilidade, mostrando o uso de uma agulha modificado para fazer furos na tubagem. (B) Os buracos foram feitos no tubo, e o tubo foi cortada ao meio. (C) A colocação do fio de sutura através dos orifícios da manga. Note-se que o fio passa sobre o lábio do manguito. (D) Inserção dos fios de platina irídio para o manguito. Completada no topo mostra a fiação, inferior mostra a fiação no processo. (E, F) O manguito completado com os pinos de ouro ligados à extremidade dos fios. Veja inserir em (F) para a escala. (G) Mostra a cpeça headcap orresponding que se apega ao crânio durante a cirurgia descrita no passo 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. estimulação do nervo vago e experimental set-up. (A) Esquema do set-up usado para a estimulação do nervo vago (VNS). Os animais são ligados a uma unidade de isolamento de estímulo através de um headcap a partir do qual dois fios de platina-Iridum levar subcutaneamente para o manguito-eléctrodo feito à medida que é enrolada em torno do nervo vago. (B) colocação do manguito-eléctrodo em volta do nervo vago. Fotomicrografia da incisão cirúrgica e do nervo vago expostos antes do eletrodo cuff é suturada ao redor dele. (C) Fotografia da configuração usada paraauditivo condicionamento pelo medo, com o animal ligado ao estimulador. (Figura modificado a partir de Referência 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. VNS aumenta extinção do medo condicionado auditivo. (A) cronograma Experimental. Dias 1 e 2: Auditivo Medo Condicionado, 8 tom (CS) / emparelhamentos de choque (EUA) por dia. Dia 3: Medo condicionado Teste Pre, congelamento medida durante quatro apresentações tom desemparelhados. Dia 4: Tratamento, 3 grupos: quatro apresentações tom emparelhado com VNS, 4 apresentações tom emparelhado com sham-estimulação, apresentações 20 tom emparelhado com sham-estimulação (EE). Dia 5: Medo condicionado Teste Post, congelamento medida durante quatro apresentações tom desemparelhados (B). (C) Porcentagem do tempo gasto congelamento durante os intervalos inter-tom (ITI) no dia 3 (D3, barras brancas ) e Dia 5 (D5) para os mesmos grupos apresentados em animais B. VNS também mostraram uma redução comportamento de congelação fora da apresentação do tom condicionado. (* P <0,05, as barras de erro representam o erro padrão da média). (Figura modificado a partir de Referência 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. VNS altera metaplasticity na via IL-BLA. (A) estimulação Representante e locais de gravação no IL e BLA e traços representativos de uma curva de potenciais de campo registados no seguimento da estimulação da IL BLA. Input-output (B ) A plasticidade sináptica na via IL-BLA em resposta à estimulação de explosão curta em 4 grupos de ratos. Superior direito: Em ratos com ar-medo breve estimulação de explosão do IL induz LTD no BLA. Médio esquerdo: ratos que receberam treinamento extinção 4 tom com a estimulação sham também mostram LTD. Inferior esquerdo: ratos que receberam treinamento extinção prolongado com a estimulação sham não mostram nenhuma mudança, ou uma recuperação da LTD, que foi induzida no medo condicionado único grupo e do grupo de estimulação sham. Direita do meio: em ratos tratados com VNS durante um único extsessão inction, força sináptica é ainda potenciado, levando a LTP. Canto inferior direito: VNS entregue na gaiola provoca nenhuma mudança na plasticidade. Abreviaturas: IL, córtex infralimbic; PL, córtex prelimbic; BLA, núcleo basolateral da amígdala, LA, núcleo lateral da amígdala; CE, do núcleo central da amígdala. (* P <0,05, as barras de erro representam o erro padrão da média). (Figura modificado a partir de Referência 20). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Esquema simplificado da inervação do tronco cerebral pelo nervo vago e segunda projecções ou de ordem mais elevada. Através da modulação indirecta de núcleos de monoamina no tronco cerebral, incluindo o locus coeruleus (LC) e o Nucle rafei (DRN), o nervo vago pode modular componentes importantes do circuito de extinção, o que inclui o córtex pré-frontal (PFC), a amígdala (Amyg), o hipocampo (Hipp) e núcleo accumbens (NAc). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos aqui um protocolo que é usado para facilitar a extinção do medo condicionado durante uma única sessão de exposição a estímulos condicionados 19 e modular a plasticidade na via entre o córtex infralimbic ea amígdala basolateral que podem mediar a aprendizagem extinção 20. Um passo crucial para o sucesso deste protocolo é a entrega dos VNS durante o treinamento de extinção. Portanto, um cuidado especial deve ser dada para a construção dos eléctrodos de punho e a colocação da manga em torno do nervo vago. No processo de construção do eléctrodo braçadeira é importante para assegurar que a porção exposta dos fios estão no lugar certo. Da mesma forma, durante a cirurgia, devem ser feitos esforços especiais para colocar a manga na posição correcta e para ancorar suficientemente no lugar de modo que o circuito entre o punho e o estimulador permanece intacta ao longo do curso do experimento. O funcionamento adequado do manguito deve be verificado após a cirurgia (como descrito na etapa 3.2.20) e de novo após o teste comportamental (como descrito no passo 4.8).
Os mecanismos através dos quais VNS modula a actividade no sistema nervoso central não são completamente compreendidos. O nervo vago cervicais é composto por fibras motoras sensoriais aferentes e eferentes no aproximadamente uma proporção de 4 para 1, respectivamente 25. Vagal aferentes transmitem os sinais para o núcleo do trato solitário (NTS), que, em seguida, projetos para parabraquial núcleo, hipotálamo, tálamo, a amígdala, o hipocampo e 26,27. Importante, núcleos de monoamina no tronco cerebral, o locus coeruleus (LC) e os núcleos da rafe, receber projeções diretas e / ou indiretas do NTS (Figura 5). Assim VNS pode modular a plasticidade cortical e memória através da ação sinérgica de vários neuromoduladores. Efeitos propostos relacionados com a estimulação vagal incluem alteração da norepinefrina (NE) liberação por projeções dos NTS para oLC, níveis elevados de inibidor de GABA, e a inibição da actividade aberrante cortical por activação do sistema reticular 28,29,30. Papéis importantes para a acetilcolina, a serotonina, e factor neurotrófico derivado do cérebro têm também mostrado 31-35. Para a modulação de memórias do medo extinção e, em geral, os efeitos sobre a libertação de VNS transmissor no córtex pré-frontal (CPF), amígdala, hipocampo e são susceptíveis de ser particularmente relevante 36,37. Aguda VNS aumenta noradrenalina e serotonina libertação tanto no medial PFC 33,38 ea amígdala 39,30. Aguda VNS também aumenta os níveis de norepinefrina 38 e melhora a transmissão sináptica no hipocampo 40-42. A noradrenalina foi anteriormente mostrado para ser envolvido na modulação da expressão de medo. Lesões das projeções NE da LC para o cérebro anterior prejudicar a extinção de esquiva ativa sem alterar a aquisição ou retenção de original aprendizagem 43,44. A consolidação do medo condicionado depende activação β-adrenérgico no BLA 43, e vários relatórios sugerem um papel para ambos os receptores α- e β-adrenérgicos no PFC medial na consolidação da memória de ambos drogas e medo-extinção formação 46-49. Assim, quando o emparelhamento formação extinção com VNS, a libertação induzida de VNS-neuromoduladores como NE ou 5-HT parece facilitar a plasticidade sináptica que resulta da formação só, levando a um aumento da consolidação de extinção.
Uma grande vantagem de VNS reside na sua especificidade temporal e espacial. Ao contrário de aplicação da droga sistêmica ou mesmo local, que muitas vezes têm um início lento e deslocamento de ação, VNS pode ser emparelhado seletivamente com comportamentos específicos para facilitar a plasticidade sináptica nessas redes ativas que regulam o comportamento de interesse. Descrevemos aqui um protocolo VNS que usa parâmetros também usado clinicamente para o tratamnt de epilepsia em humanos (0,4 mA, 500 mS largura de pulso em 30 Hz, ciclo de estimulação de 30 segundos e em 5 min off). Experiências de microdiálise mostram que VNS usando esses parâmetros leva a um aumento de longa duração, a cerca de 2 vezes de libertação NE na amígdala 39. Este aumento grande e relativamente lento na NE pode explicar por que VNS emparelhado com formação extinção, ao contrário de treinamento extinção estendida por si só, também facilitou a extinção do comportamento congelamento fora da apresentação do estímulo condicionado (o intervalo entre tentativas). Porque em nossos experimentos animais foram submetidos a treinamento extinção no mesmo contexto como o medo condicionado auditivo, a redução do comportamento de congelamento durante o ITI indica que VNS facilitado generalização da aprendizagem extinção ao contexto.
No entanto, apesar dos efeitos potencialmente longa duração sobre a libertação de NE, efeitos sobre o comportamento de VNS ou plasticidade sináptica são apenas aparentes quando eles são combinados wom um comportamento específico. Aplicação de VNS a ratos nos seus homecages logo após a extinção do medo de formação não facilitar extinção de 20, e de forma semelhante, VNS aplicada do lado de fora de um contexto comportamental específica não alterou a plasticidade sináptica na via IL-BLA (cf Figura 3C). Por outro lado, mesmo breves aplicações de VNS (por exemplo, 0,8 mA como um trem de impulsos 15, 100 ms de largura de impulso a 30 Hz durante 500 ms) provocar alterações específicas e de longa duração em redes sensoriais ou motoras quando são entregues contingente com o comportamento em curso.
Um papel seminal por grupo de Michael Kilgard 7 mostrou que o emparelhamento exacto de VNS temporalmente com a apresentação de um único tom leva a plasticidade no mapa córtex auditivo de frequência de tom. Estes efeitos foram já utilizados clinicamente para inverter plasticidade patológico no córtex auditivo para tratar o zumbido 50. Similarmente, Emparelhamento repetida de ENV com um comportamento motor foi mostrado para reorganizar córtex motor 8 e esta plasticidade alvo é altamente eficaz na recuperação da função em diferentes modelos animais de acidente vascular cerebral 9,10.
No entanto, atrasou VNS entregues 2 horas após as sessões de treinamento de reabilitação ou várias vezes maiores quantidades de VNS resultou em melhoria comparativamente menos do que precisamente cronometrado VNS 51. Assim, estudos futuros precisam otimizar tanto o tempo ea quantidade de VNS para maximizar os benefícios terapêuticos. Os nossos resultados mostram que VNS, que é clinicamente aprovados para o tratamento de epilepsia e depressão resistente ao tratamento multi-resistente, pode ser utilizado como um tratamento adjuvante para a terapia de exposição porque ele modula a plasticidade específicos de aprendizagem para aumentar o efeito de exposição de extinção de medo condicionado de responder.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
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