Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

القنوات الأيونية التي أعرب عنها في ظهارة أنبوبي كلوي تلعب دورا هاما في علم الأمراض من مرض الكلى المتعدد الكيسات. نحن هنا وصف البروتوكولات التجريبية استخدامها لإجراء التحليل ومستوى الكالسيوم داخل الخلايا القياسات التصحيح، المشبك في ظهارة الكيسي المعزولة حديثا من الكلى القوارض.

Abstract

بدء الكيس والتوسع خلال مرض الكلى المتعدد الكيسات هي عملية معقدة تتميز شذوذ في تكاثر الخلايا أنبوبي، وتراكم السوائل اللمعية وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. آخر من القنوات الأيونية وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا والمعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي تحدد مهام خلايا الطلائية. طورنا طريقة مناسبة لمراقبة الوقت الحقيقي من النشاط القنوات الأيونية مع تقنية التصحيح، المشبك وتسجيل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية المعزولة حديثا من الكيسات الكلوية. الفئران PCK، وهذا نموذج الجيني للراثي مقهور مرض الكلى المتعدد الكيسات (ARPKD)، استخدمت هنا لخارج الحي تحليل القنوات الأيونية وتدفق الكالسيوم. وصف هنا هو إجراء مفصلة خطوة بخطوة تهدف إلى عزل الطبقات الوحيدة الكيسي والأنابيب غير متسعة من PCK أو العادية سبراغ داولي (SD) الفئران، ومراقبة نشاط قناة واحدة والكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات.هذه الطريقة لا تتطلب المعالجة الأنزيمية ويسمح تحليل في وضع الأصلي للالمعزولة حديثا أحادي الطبقة الظهارية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية حساسة جدا للتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. وأخيرا، ظهارة الكيسي المعزولة يمكن أيضا استخدامها لتلطيخ مع الأجسام المضادة أو الأصباغ، وإعداد الثقافات الأولية وتنقية لمختلف فحوصات البيوكيميائية.

Introduction

القنوات الأيونية تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. مقهورة أمراض الكلى المتعدد الكيسات السائدة والمتنحية (ADPKD وARPKD، على التوالي) هي اضطرابات وراثية تتميز تطوير مملوءة بسائل الكيسات الكلوية من أصل الخلايا الظهارية أنبوبي. ويتسبب ADPKD بواسطة طفرات من PKD1 أو PKD2 الجينات التي تكود polycystins 1 و 2، والبروتينات غشاء تشارك في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز. PKD2 في حد ذاته أو مجمع مع PKD1 تعمل أيضا بمثابة الكالسيوم 2+ الموجبة -permeable قناة 1. الطفرات من PKHD1 ترميز الجين fibrocystin (أ-مثل مستقبلات البروتين المرتبط أهداب المشاركة في tubulogenesis و / أو صيانة قطبية ظهارة) هي دفعة الجيني للARPKD 2. هو ظاهرة معقدة رافقت نمو الكيس مع انتشار اضطراب 3،4، 5 الأوعية الدموية، فقد التمايز وفقدان القطبيةإيتي الخلايا الأنبوبية 6-8.

عيب استيعاب وإفراز المعزز في ظهارة الكيسي يسهم في تراكم السوائل في التجويف والكيس التوسع 9،10. ضعف تعتمد على تدفق [كا 2+] وقد تم ربط ط يشير أيضا إلى تكون الكيسة خلال PKD 11-15.

هنا، نحن تصف طريقة مناسبة لقياس التصحيح، المشبك النشاط قناة واحدة والخلايا مستويات الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المعزولة من الفئران PCK. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح من قبلنا لوصف النشاط من قناة الظهارية نا + (عناق) 10 و [كا 2+] أنا معتمد على العمليات الناجمة عن الكالسيوم 2+ TRPV4 -permeable وpurinergic يشير شلال 13.

في هذه الدراسات استخدمنا الفئران PCK، وهذا نموذج من ARPKD الناجمة عن طفرة تلقائية في الجين PKHD1. كان من سلالة PCK اصلاذ المستمدة من سبراج داولي (SD) الفئران تستخدم 16 الجرذان وبالتالي التنمية المستدامة باعتبارها الرقابة المناسبة للمقارنة بسلالة PCK. ونتيجة لذلك، يمكن على حد سواء SD الفئران شرائح كليون والقنوات غير المتوسعة جمع المعزولة من الفئران PCK نفس بمثابة مجموعتين مقارنة مختلفة لتجارب على ظهارة الكيسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان في كلية الطب في ويسكونسن وجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الشكل 1 يوضح الخطوات الرئيسية لعزل الأنسجة وإجراء المعالجة. لفترة وجيزة، وتستخدم الكلى من PCK أو SD الفئران لعزل اليدوية من الطبقات الوحيدة الظهارية من جمع مجاري صحية سواء من الأنابيب غير التي تم الاتصال بها أو الخراجات. نحن هنا درس الكلى 4-16 أسابيع الفئران القديمة PCK 10،13.

1. عزل الكلى الخراجات والأنابيب الصغيرة توصيل (CNT) / جمع مجاري (CD) قطاعات

  1. تخدير حيوانات التجارب مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية 2 أو طريقة أخرى معتمدة. يجب مراقبة الحيوانات باستمرار لضمان جنيه كافيةفيل من التخدير. تستخدم مستقر التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
  2. أداء البطن وطرد الكلى مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال الشريان الأورطي البطني 17.
    1. إعداد القسطرة أنابيب البولي ايثيلين (PE50) وتوصيله إلى جهاز ضخ حقنة مليئة PBS. قطع الجلد وجدار البطن على طول الخط ألبا، ثم إجراء شق في البطن عرضية عبر البطن من جانب إلى آخر وتحول أعضاء البطن مع مسحات القطن للوصول إلى الشريان الأورطي النازل مع المتفرعة المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين. بلل الأعضاء الداخلية مع المياه المالحة الدافئة خلال مزيد من الإجراءات لمنع جفاف بهم.
    2. وضع رباط واحد (رقم 1) حول المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين وضمد آخر (رقم 2) حول الأبهر تحت الحجاب الحاجز (لا ربط). فصل بلطف. البطنية التي تخفف من حدة تشريح الأنسجة الضامة المحيطة بها مع ملقط رقيقة ووضع اثنين من اربطة ~ 3مم أسفل الشريان الكلوي الأيسر (رقم 3) وفوق التشعب الشرايين الحرقفية (رقم 4).
    3. ربط رباط رقم 4 وإرفاق المشبك السفينة في جميع أنحاء الشريان الأورطي بين الشريان الكلوي الأيسر ورباط # 3. إجراء شق بين الشبك ورباط رقم 4 ليقثطر الشريان الأبهر، واستخدام رباط رقم 3 لإصلاح بحزم القسطرة.
    4. الافراج عن المشبك والتأكد من أن نبض الدم مرئيا في القسطرة لضمان التركيب الصحيح. بدء نضح بمعدل 6 مل / دقيقة، وربط الحروف المركبة رقم 1 ورقم 2، وقطع الوريد الكلوي الأيسر. تواصل التنظيف لمدة 1-2 دقيقة حتى يتم المقشر أجهزة تماما.
    5. قطع الأوعية الدموية الكلوية، مجرى البول والأنسجة المحيطة الضام والدهنية مع مقص لجمع الكلى. ثم جعل المسيل للدموع قصيرة في كبسولة الكلى وقشر الكلى لdecapsulate لهم. وضع الكلى في PBS الجليد الباردة. تأكيد القتل الرحيم قبل بضع الصدر.
  3. إعداد 5 × 5 مم رقائق الزجاج غطاء المغلفة مع بولي-L-ليسين. قطع غلا غطاءSS مع قلم رصاص الماس ومكان ما يقرب من 20 ميكرولتر من 0.01٪ العقيمة التي تمت تصفيتها حل بولي-L-ليسين على كل شريحة زجاجية. إعداد المالحة واثنين من أزواج من ملقط ساعاتي للتشريح.
  4. قطع الكلى بشفرة حلاقة على طول الطائرة الأمامية إلى شرائح من ~ 1-2 مم. مكان واحد من شرائح تحت stereomicroscope. وينبغي أن يتم عزل الأنسجة في المياه المالحة الجليد الباردة.
  5. تحديد الخراجات تحت stereomicroscope كما تجاويف مستديرة الشكل (الشكل 2A). غالبا ما تحتوي على جدرانها شبكة بارزة من الأوعية الدموية انتشرت. باستخدام ملقط غرامة ذات الرؤوس تشريح طبقة الطلائية الداخلية للمثانة رقيقة قدر الإمكان للحصول على منطقة أحادي الطبقة. إرفاقه شريحة زجاجية مغطاة بولي-L-ليسين. مثبت سطح بولي-L-ليسين يسمح الباحث لوضع بحزم طبقة الكيس الداخلية على الزجاج. كشف الكيس مع الجانب قمي لتوفير وصول ماصات (الشكل 2B).
  6. استخدام PCK أو الفئران SD طفلشرائح الناي المركزية التي تحتوي على حليمة لعزل غير المتوسعة-CNT / CCDsegments 18-21.
    ملاحظة: الأنسجة حليمي هي أكثر دواما من القشرة وعقد عصابات أنبوبي حليمي مع ملقط وتمزق على طول شعاعي محور شريحة يمكن المشقوق إلى قطاعات رقيقة. الأنابيب الفردية واضحة ويمكن انسحبت لتوضع على رقائق الزجاج غطاء.
  7. تحديد قطاعات CNT / CCD التي كتبها التشعبات والشفافية أعلى من الأنابيب القريبة والخلايا المرئية بشكل بارز كبيرة (الشكل 2C). وضع رقاقة غطاء زجاجي مع الأنابيب المرفقة تحت المجهر مجهزة micromanipulators مناسبة لقيادة بال micropipettes. باستخدام بال micropipettes حادة الأنابيب تقسيم مفتوحة ونعلق حوافها على الزجاج لجعل سطح القمي الوصول (الشكل 2D).

الكهربية 2. قناة واحدة التصحيح، المشبك

  1. ملء غرفة التصحيح المشبك مع حل حمام ونقل الغطاء الزجاجي رقاقةمع الأنسجة المعزولة إلى الغرفة. ضمان بال micropipettes التصحيح، المشبك لديها مقاومة 7-10 MΩ للمقاييس (الخلية المرفقة) موثوقة عن خلايا.
  2. للقياسات الخلية المرفقة، تعيين نسبة الربح مكبر للصوت ل20X والمنخفضة تمرير التيارات في 300 هرتز على فلتر من ثماني قطب بسل. للقنوات ENAC المراقبة، واستخدام محلول حمام، في ملي: 150 كلوريد الصوديوم، CaCl 2 1، 2 MgCl 2، 10 HEPES (7.4 درجة الحموضة)؛ ماصة: 140 LiCl، 2 MgCl 2 و 10 HEPES (7.4 درجة الحموضة).
  3. إجراء تجربة التصحيح، المشبك التقليدية في وضع الخلية المرفقة 10. حدد خلية في أحادي الطبقة الظهارية والاقتراب من ماصة للالغشاء القمي. شكل خاتم عالية المقاومة بين ماصة وغشاء الخلية من خلال تطبيق طيف الامتصاص. مرة واحدة يتم تشكيل مقاومة عالية ختم gigaOhm، يجب أن تبدأ بروتوكول خالية من فجوة في إمكانية عقد لنشاط الرصد للقناة المثيرة للاهتمام.
  4. البيانات قناة واحدة حرة الفجوة متجر الحالية من غيغاالأختام أوم لتحليلها لاحقا. تحليل الأحداث القناة باستخدام حزمة البرنامج الذي تم توفيره بشكل عام مع الاجهزة التصحيح، المشبك 18. حساب النشاط قناة كما NPO حيث تشير N إلى عدد من القنوات النشطة في التصحيح وP س متوسط ​​احتمال فتح القنوات.
    ملاحظة: استخدام الأكياس المعزولة أو الأنابيب في تجارب التصحيح، المشبك مدة لا تزيد عن 30 دقيقة.

3. القياسات Ratiometric Epifluorescence من جواني تركيز الكالسيوم في الخلايا الظهارية

  1. استخدام 5 ملي FURA-02:00 الذائبة في DMSO. حل سهم قسامة الفردية 500 ميكرولتر أنابيب مخروطية (حوالي 10 ميكرولتر). يحفظ بعيدا عن الضوء وتخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  2. احتضان الأكياس المعزولة والأنابيب انقسام مفتوحة لمدة 30-40 دقيقة في جهاز الأمن الوقائي (في ملي: 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 2 CaCl 2 و 10 HEPES في درجة الحموضة 7.35) تحتوي على 5 ميكرومتر FURA-02:00 صبغ و 0.05٪ حمض pluronic للمساعدة في تفريق استرات acetoxymethyl. لذلك، الأنسجة مكان في 3.5 سم صحن يحتوي على كوكتيل تحميل، بعيدا عن الضوء واحتضان على شاكر بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تغيير FURA-02:00 تحتوي على وسائل الإعلام لتنظيف PSS بعد الحضانة ووضع النسيج تحت المجهر لزيادة أداء التصوير epifluorescence.
  4. تشغيل كاميرا CCD ومصدر ضوء ثابت (نظام مستوحد اللون) مجهزة عجلة تصفية (كل موقف مرشح يمكن أن تترافق مع مستوى التوهين الخاص به، اختار كل مرة يتم استدعاء فلتر).
  5. العثور على الأنسجة في حقل مشرق. التبديل إلى الكشف عن إشارة مضان وضبط شدة مصدر الضوء باستخدام مرشحات الكثافة محايدة والطاقة مصباح لتجنب تشبع الإشارة.
  6. مراقبة FURA-02:00 مضان في عينات الأنسجة مع الإثارة ratiometric في 340/380 نانومتر مع تواتر 0.125 هرتز أو أعلى. استخدام 40 × / NA 1.3 أو ما شابه عدسة موضوعية لresolu السليمنشوئها الصورة.
  7. لمعالجة الصور وحسابات استيراد تسلسل الصور. تأكد لتقسيم القنوات واستخدام وضع hyperstack الرمادي. اختر العديد من المناطق ذات الاهتمام (خلايا كيس واحد أو مناطق مختارة من النسيج الكيسي) وحساب قيم الكثافة لكل قناة (340 و 380 نانومتر) في فضل برمجيات تحليل البيانات؛ طرح قيم الكثافة الخلفية من كل نقطة البيانات.
  8. لكل نقطة زمنية حساب نسبة كثافة من FURA-2:00 340-380 القنوات. مؤامرة مبعثر / خط التغييرات في الوقت نقطة من الكالسيوم 2+ عابرة لكل منطقة وحساب متوسط ​​القيم / SE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد ثبت تورط محتمل في عناق تكون الكيسة من قبل العديد من الدراسات أن لوحظ تعطل عامل نمو البشرة (EGF) يشير في PKD تقدم 22-25 وغير طبيعي استيعاب الصوديوم في ARPKD نماذج الفئران والثقافات الأنسجة 26-28. على سبيل المثال، Veizis وآخرون أظهرت أن تراعي الأميلوريد نا + امتصاص وانخفاض في خلايا CD من النموذج غير orthologous الماوس BPK من ARPKD 29. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن ضعف الصوديوم واستيعاب المياه في الخراجات هو عامل مهم في تفاقم تكون الكيسة 10. على وجه التحديد، قمنا بتوظيف تحليل الكهربية والمناعى، ووجدت أن الخراجات تمارس اضعافها استيعاب الصوديوم. أظهر نهج الدوائية التي انتقائية الحصار عناق تفاقم بشكل ملحوظ الكيس تقدم 10.

أثبتنا كذلك تأثير إدارة benzamil، وهو مانع عناق، سالنشاط ن من القنوات في جدار الكيس. تم تزويد 4 أسابيع الفئران PCK القديمة مع مركبة أو المياه التي تحتوي على benzamil (15 ملغ / مل) libitum الإعلانية الشرب. بعد 12 أسبوعا من العلاج ومعالجة الحيوانات وفقا لبروتوكول المذكورة أعلاه. تم إجراء التصحيح، المشبك على الطبقات الوحيدة الكيسي معزولة عن المركبات وbenzamil المجموعات المعالجة الشكل 3 يبين آثار الحالية ممثلة النشاط عناق المسجلة من الأغشية القمية. يوضح الرسم البياني ملخص أن متوسط ​​النشاط عناق (NP س) كان 0.91 ± 0.15 10 في الخراجات من المجموعة الضابطة، بينما انخفضت الإدارة benzamil نشاط القناة إلى 0.32 ± 0.05. نستنتج أنه في ARPKD (تتميز انتفاخ منتشي من الأقراص المدمجة لتشكيل العديد من على شكل مغزل الكيسات الكلوية 30) benzamil بالنظر في مياه الشرب تصل الكيسات الكلوية مع تدفق البول 30. هذا التأثير يسمح benzamil لتقليل امتصاص الصوديوم من السائل كيس، مقاولات ibuting لتكون الكيسة 10.

بالإضافة إلى مسار EGF، كما تم تحديد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) والبيورينات الأخرى كمكون يشير نظير الصماوي الأهمية بمكان أن يتم التضمين بشكل غير لائق في نماذج PKD وفي المرضى الذين يعانون من هذا المرض. وأفيد أن يشير purinergic تلعب دورا مهما في تكون الكيسة خلال كل ADPKD وARPKD 31،32. سبق أظهرت خلايا كيس من الفئران PCK لعرض منخفض القاعدية [كا 2+] ط وفقدان [كا 2+] ط اشارة مقارنة بوساطة تدفق إلى مجاري صحية غير المتوسعة لجمع من الفئران SD 13. P2 منبهات مستقبلات تعدل تطوير الكيسات الكلوية في نموذج في المختبر لتشكيل الكيس المستمدة من الماوس CPK / CPK 33. وقد وجد أن تركيز ATP عالية في السائل الكيسي من المرضى ADPKD 34 و في وسائل الإعلام مشروطة ظهائر الكلى الكيسي مثقف من الفئران CPK / CPK 35.

_content "> لقد اختبرنا تدفق الكالسيوم ردا على إدارة ATP الخارجية. وقد تم عزل الخراجات PCK والقنوات القشرية الطبيعية من الفئران SD للقياسات الكالسيوم قبل وبعد تطبيق 10 ميكرومتر ATP. البيانات هو موضح في الشكل (4) كشف عن أثر من 10 ميكرومتر ATP في الأنابيب الكيسي من الفئران PCK درس مع نهجين مختلفين: ويبين الشكل 4A قياسات FURA-2:00 كثافة مضان في 340 و 380 نانومتر في الإعداد epifluorescence مجهزة مستوحد اللون، والشكل 4B يمثل تسجيل فلوو-8 صبغ تلطيخ مع متحد البؤر المجهر. كلا تقنيات تثبت حركية مماثلة من الكالسيوم استجابة عابرة للتطبيق ATP في ظهارة الكيسي 10.

الشكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول التجريبية بعدومخدرة الحيوان بشكل صحيح وعلى استعداد لعملية جراحية، يتم مسح الكلى مع PBS لإزالة الدم. ثم، يتم استئصال الكلى، decapsulated، ويتم عزل الطبقات الوحيدة الكيسي أو الأنابيب غير المتوسعة يدويا مع ملقط تحت stereomicroscope. يتم تقسيم فتح الأنابيب غير المتوسعة مع بال micropipettes يقودها micromanipulators بينما ظهارة الكيسي كما السطح الداخلي من الخراجات ستكون مفتوحة في الحصول على الجانب قمي.

الرقم 2
الشكل 2: عزل وإعداد الطبقات الوحيدة القناة المرارية وجمع (A) شريحة تمثيلية الكلى من 16 أسبوعا الفئران PCK القديم. (B) أحادي الطبقة الكيسي على شريحة زجاجية غطاء نقلها إلى مجهر لتحليل التصحيح، المشبك أو التصوير الكالسيوم (60X). شريحة / CCD (C) A CNT مع التشعب المعزولة من الفئران SD. (

الشكل (3)
الرقم 3: تأثير العلاج benzamil على النشاط عناق في ظهارة الكيسي. (A) آثار الحالية التمثيلية للنشاط عناق تقاس في الخلية المرفقة بقع من الأكياس المعزولة حديثا من 16 أسبوع الفئران PCK القديمة تدار 12 أسبوعا من benzamil في مياه الشرب. وقد عقدت هذه البقع في إمكانية اختبار V ح = -V ص = -40 بالسيارات. الداخل التيارات لي + لأسفل. الخطوط المتقطعة تشير إلى الحالة الراهنة ذات الصلة مع "ج" و "س ن" تدل على الدول المغلقة والمفتوحة. (B) ملخص الرسم البياني للنشاط الملحوظ عناق (NP س) (مستنسخة جزئيا من 10 بإذن). * P <0.05 هاءسيارة rsus.

الرقم 4
الرقم 4: آثار ATP على تدفق الكالسيوم في الخلايا الكيسية من الفئران PCK (A) صور الممثل أحادي الطبقة الكيسي محملة FURA-02:00 قبل وبعد تطبيق 10 ميكرومتر ATP. الرسم البياني يلخص تأثير ATP على مستويات الكالسيوم في أحادي الطبقة خلية من خلايا الفئران PCK وSD جمع القنوات (N = 38 الخلايا). (B) أحادي الطبقة الكيسي محملة فلوو-8 صبغ قبل وبعد تطبيق 10 ميكرومتر ATP وملخص بياني ل استجابة الكالسيوم داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفنا هنا تطبيقات التقليدية تقنية التصحيح، المشبك والتصوير epifluorescence الكالسيوم إلى الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المستمدة من نموذج الجيني الفئران من ARPKD. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات، والتي ينبغي أن تدفع معظم الاهتمام إلى عزل الخراجات (الخطوة 1.5 من قسم البروتوكولات) والدراسات الكهربية. تتطلب هذه الإجراءات الرئيسية التدريب والصبر واسعة النطاق، ويجب أن لا يكون القارئ بالإحباط في آن واحد.

أولا وقبل كل شيء، ينبغي إيلاء أكبر قدر من الاهتمام في عملية عزل الكيس أحادي الطبقة. هذا الجزء من إعداد يتطلب المهارات اليدوية وإلى حد كبير الآثار مزيد من العمل، وسمك العينة وحتى تمسكه شريحة زجاجية أمر حاسم لتسليط الضوء على الخلايا. سمك جدران الكيس معزولة تختلف في أجزاء مختلفة من العينة، وينصح بالتركيز على الخراجات أكبر مع المناطق أحادي الطبقة أكبر ملائمة لالعك. للمساعدة على تنظيف العينة والوصول إلى أحادي الطبقة، ينبغي مقشر الأنسجة المحيطة بها مع ملقط تحت stereomicroscope. وينبغي التأكيد على أن هذه التقنية تعني الاستفادة من stereomicroscope جودة عالية تتميز عمق الحقل كبير والقدرة على تغيير التكبير في طائفة واسعة لاستيعاب أحجام مختلفة من الكائنات أثناء تشريح. قيود آخر من الأسلوب هو أن هذه التقنيات المتطورة كما التصحيح، المشبك والتصوير الكالسيوم تتطلب الأفراد على دراية بهذه الأساليب. ونقترح أن التجربة الأولى يمكن الحصول على جمع مزارع الخلايا لاصق مثل متاحة تجاريا خلايا M1 وIMCD medullar القشرية لأنها تشكل أحادي الطبقة الظهارية مماثلة لالخراجات.

نهجنا يسمح بقياس النشاط القنوات الأيونية و[كا 2+] أنا المستويات في البيئة المحلية من الأنسجة المعزولة حديثا. والميزة الرئيسية لهذا الإجراء هو أن إعداد العينات للسينغلتحليل قناة الإلكتروني أو صبغ التحميل لا يتطلب العلاج الأنزيمية، وإلحاق أضرار إجراءات ميكانيكية أو غيرها من الخطوات التي يحتمل أن تكون ضارة. يتم تنفيذ ذلك يدويا مع ملقط في المياه المالحة ويقدم عينات التالفة كبيرة. هذه العينات يمكن استخدامها ليس فقط لتقنيات وصفها. في الواقع، ظهارة الكيسي معزولة تمثل طبقة رقيقة من الخلايا أنبوبي نقية ويحافظ على خصائص أحادي الطبقة الأم، مما يجعل من كائن سليمة قيما للتجارب في الوقت الحقيقي التي تنتج من الناحية الفسيولوجية الملاحظات ذات الصلة. إذا يبدو أن العزلة الخراجات التي يصعب مطلوب إجراء للباحث أو كمية كبيرة من الأنسجة الكيسي في آن واحد، والعلاج الأنزيمية (على سبيل المثال، مع dispase وكولاجيناز، كما هو موضح هنا 38 لالقشرية جمع الأنابيب لاصق) يمكن استخدامها لتبسيط عملية العزل. ومع ذلك، يجب أن يكون الباحث حذرين جدا أثناء أداء هذا العلاج، والإنزيمات، وخاصة البروتياز، يمكن أن تؤثر بشكل كبير channe أيونالنشاط ليرة سورية "أو تلف مستقبلات الغشاء. وهذا هو، على سبيل المثال، من المهم جدا للدراسات من الإشارات purinergic، كما هي هذه البروتينات الغشاء معروف جدا أن تتحلل بسرعة تحت العلاج الأنزيمية 39،40.

بالإضافة إلى ذلك، ظهارة الكيسي يمكن أن تستخدم لأغراض أخرى، مثل المناعية أو تلطيخ أحادي الطبقة ثابتة مع الأصباغ (مثل رودامين phalloidin)، أو تحميل أنسجة جديدة مع علامات مادة داخل الخلايا، مثل DAF-FM لNO الكشف أو الأصباغ المختلفة ل رصد إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. ويقترح استخدام جزء نقي من ظهارة الكيسي معزولة عن النشاف الغربي للقضاء على تأثير العوامل غير المحددة موجودة في مجموع لست] الكلى. نقترح أيضا أن ظهارة الكيسي يمكن عزل مشابه من الفئران أو غيرها من الأنواع التي تتوفر للدراسات نماذج مختلفة ليس فقط ARPKD، ولكن أيضا ADPKD. عينات الكيس طازجة معزولة لها لا يمكن إنكارهامزايا لعلم الأحياء الجزيئي النهج مقارنة مع الخلايا الكيسية مثقف، لأنها استدامة أفضل خصائص الأنسجة الكيسي داخل الجهاز، ومما لا شك فيه توفير بيانات أكثر مبررة بشأن عمليات المرض في الجسم الحي.

واحدة من المزايا الهامة لهذه التقنية هو إمكانية استخدام غير المتوسعة جمع القنوات من نفس الكلى، أو الفئران SD الأنابيب (حصة هذه الفئران الخلفية الوراثية للفئران PCK) العادية، والأنسجة السيطرة. وتستخدم التصحيح، المشبك والكالسيوم قياسات مماثلة في قطاعات كليون على نطاق واسع على الكلى غير الكيسي في العديد من المختبرات 41-43. اعتمادا أيون قنوات نوع أو تعديلات مختلفة من طريقة التصحيح، المشبك يمكن استخدام (خلية كاملة، من الداخل إلى الخارج، خارج التدريجي)؛ على سبيل المثال، عناق وROMK (الكلوي الخارجي النخاع البوتاسيوم قناة) النشاط يمكن تقييمها من قبل تكوين خلية كاملة 44،45. وFURA-2:00 التصوير الكالسيوم المقترحة في epifluorescence واسعة المجال مع monocلا يمكن أن يؤديها hromator أيضا مع أي تعديل آخر مماثل التصوير الكالسيوم مثل تحليل مع المجهر متحد البؤر أو اثنين الفوتون مع الأصباغ الكالسيوم الأخرى. هذه الأنظمة المجهر أقل بأسعار معقولة ولكن توفر أعلى جودة التصوير وهي أكثر حساسية من المجهر واسعة المجال. تم تطبيق نهج مماثل أيضا لدراسة النشاط قنوات TRPC وإشارات الكالسيوم في podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا 17،46،47. التصوير الكالسيوم الأخرى التي يمكن تطبيقها تشمل استخدام فلوو-8 كما هو موضح في الشكل 4B أو قياس متحد البؤر ratiometric مع Fluo4 / الأصباغ الفلورية FuraRed كما هو موضح في Ilatovskaya وآخرون. 46 من الناحية الفنية، فمن الممكن لأداء كل التصحيح، المشبك والتصوير الكالسيوم في وقت واحد على نفس الخلية إذا تم تجهيز المجهر مع كل الاجهزة. وهكذا، فإن تقنية وصفها هو نهج عمليا لالملاحظات ذات جودة عالية في مجال PKD، والتي يمكن تعديلها بمرونة وفقا لالاحتياجات ه من البحوث الخاصة بك محددة وتوافر المعدات. وعلاوة على ذلك، تعديلات مختلفة من التصوير الكالسيوم يمكن استخدامها هنا، بما في ذلك القياسات متحد البؤر ratiometric مع Fluo4 / الأصباغ الفلورية FuraRed (كما هو موضح في Ilatovskaya وآخرون. 46) أو فلوو-8 كما هو موضح في الشكل 4B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (الصكوك نيكون المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL108880 (لAS)، R01 DK095029 (لOPO) وK99 HL116603 (لTSP)، المؤسسة الوطنية للكلى IG1724 (لTSP)، وجمعية القلب الأميركية 13GRNT16220002 (لOPO) و وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

الطب، العدد 103، التصحيح، المشبك، وأمراض الكلى المتعدد الكيسات، ARPKD، ADPKD والكلى والكالسيوم داخل الخلايا، FURA-02:00، كليون والتنمية الكيس، polycystin
تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,… More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter