Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

Abstract

ייזום ציסטה והתרחבות במחלת כליות פוליציסטיות הוא תהליך מורכב המתאפיין בהפרעות בשגשוג תאי צינורי, הצטברות נוזלים והיווצרות luminal מטריקס. פעילות של תעלות יונים ואיתות סידן תוך תאי פרמטרים פיסיולוגיים מפתח הקובעים פונקציות של האפיתל צינורי. אנחנו פיתחנו שיטה מתאימה לתצפית בזמן אמת של פעילות תעלות יונים עם טכניקת תיקון מהדק ורישום של Ca 2 + רמה תאית בmonolayers אפיתל המבודדים טרי מציסטות כליות. חולדות PCK, מודל גנטי של מחלה אוטוזומלית רצסיבית פוליציסטיות כליות (ARPKD), שמשו כאן לניתוח vivo לשעבר של תעלות יונים ושטף סידן. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט שנועד לבודד את monolayers פיברוזיס וצינוריות-מורחב שאינם מPCK או חולדות נורמליות ספראג Dawley (SD), ולעקוב אחר פעילות ערוץ אחד וCa 2 + דינמיקה תאית.שיטה זו אינה דורשת עיבוד האנזימטית ומאפשרת ניתוח בהגדרת יליד monolayer אפיתל מבודד טרי. יתר על כן, טכניקה זו היא רגישה מאוד לשינויי סידן תוך תאי ויוצרת תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות. לבסוף, האפיתל פיברוזיס המבודד יכול לשמש עוד לצביעה עם נוגדנים או צבעים, הכנת תרבויות עיקריות וטיהור למבחנים ביוכימיים שונים.

Introduction

תעלות יונים לשחק תפקיד משמעותי בהרבה פונקציות פיסיולוגיות, כוללים צמיחת תאים והתמיינות. מחלות אוטוזומלית דומיננטיות ורצסיבי פוליציסטיות כליות (ADPKD וARPKD, בהתאמה) הן הפרעות גנטיות המתאפיינות בפיתוח של שלפוחיות מלאות נוזל כליות של מקור תאי אפיתל צינורי. ADPKD נגרמים על ידי מוטציות של גני PKD1 או PKD2 קידוד polycystins 1 ו -2 חלבונים, קרום מעורב בוויסות של התפשטות תאים והתמיינות. PKD2 על ידי עצמו או כמורכב עם PKD1 גם לתפקד כערוץ קטיון -permeable Ca 2 + 1. מוטציות של fibrocystin PKHD1 גן המקודד (חלבון כמו קולט-הקשורים cilia המעורב בtubulogenesis ו / או התחזוקה של קוטביות של אפיתל) הן הדחף הגנטי של ARPKD 2. צמיחת ציסטה היא תופעה מורכבת בליווי התפשטות מופרעת 3,4, אנגיוגנזה 5, dedifferentiation ואובדן הקוטבity של תאי צינורי 6-8.

ספיגה פגומה והפרשה מוגברת באפיתל פיברוזיס לתרום להצטברות נוזלים בהרחבת הלום וציסטה 9,10. זרימה תלויה פגום [Ca 2 +] איתות אני כבר קשור גם לcystogenesis במהלך PKD 11-15.

כאן, אנו מתארים שיטה מתאימה למדידות תיקון מהדק של פעילות ערוץ אחד וCa 2 + רמות תאיות בmonolayers אפיתל פיברוזיס מבודד מחולדות PCK. שיטה זו יושמה בהצלחה על ידינו לאפיין פעילות של ערוץ אפיתל Na + (ENaC) 10 ו[ Ca 2 +] אני -dependent תהליכים הנגרמים על ידי Ca 2 + TRPV4 -permeable ומפל איתות purinergic 13.

במחקרים אלה השתמשנו חולדות PCK, מודל של ARPKD נגרמים על ידי מוטציה ספונטנית בגן PKHD1. זן PCK היה originally נובע מSprague-Dawley (SD) חולדות 16 חולדות ובכך SD משמשות כבקרה נאותה להשוואה עם מתח PCK. כתוצאה מכך, שני מגזרי SD עכברוש נפרון וצינורות איסוף מורחב שאינם מבודדים מאותו חולדות PCK יכולים לשמש כשתי קבוצות השוואה שונות לניסויים באפיתל פיברוזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ואוניברסיטת מרכז מדע בריאות טקסס ביוסטון והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. איור 1 מדגים את שלבים עיקריים של בידוד הרקמות והליך עיבוד. בקצרה, כליות מחולדות PCK או SD משמשות לבידוד ידני של monolayers אפיתל של איסוף צינורות או מצינוריות-חייג אינן בריאה או ציסטות. כאן למדנו כליות 4-16 שבועות חולדות PCK ישנים 10,13.

1. צינוריות מגזרי בידוד של ציסטות בכליות וקשיות חיבור (CNT) / איסוף (CD)

  1. להרדים בעלי חיים ניסיוניים עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח le ההולםvel של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה.
  2. בצע laparotomy ולשטוף את הכליות עם מי מלח פוספט (PBS) דרך אב העורקים בבטן 17.
    1. הכן קטטר צינורות פוליאתילן (PE50) ולחבר אותו למשאבת מזרק מלאה PBS. חותך את העור וקיר בטן לאורך Linea alba, ואז לעשות חתך רוחבי בבטן פני הבטן מצד לצד ולהעביר את אברי בטן עם צמר גפן כדי לקבל גישה לאב העורקים היורדים עם הסתעפות עורקי mesenteric וצליאק. להרטיב את האיברים הפנימיים עם מי מלח חם במהלך הליכים נוספים כדי למנוע היובש שלהם.
    2. הנח מייתר אחד (מס '1) סביב עורקי mesenteric וצליאק ומייתר אחר (מס' 2) סביב אב העורקים מתחת לסרעפת (לא לקשור). בעדינות להפריד. abdominalis ידי להקהות לנתח רקמות חיבור סביבו עם מלקחיים דקים ומניח את שני חיבורים אותיות ~ 3מ"מ מתחת לעורק הכליה השמאלי (# 3) ומעל הסתעפות עורקי הכסל (מס '4).
    3. לקשור # מייתר 4 ולצרף מהדק כלי סביב אב העורקים בין עורק הכליה השמאלי ומייתר # 3. עושה חתך בין המהדק ו# מייתר 4 לצנתר את אב העורקים, להשתמש מייתר # 3 כדי לתקן את הצנתר בתקיפות.
    4. שחרר את המהדק ולוודא כי דופק הדם גלוי בקטטר כדי להבטיח התקנה נכונה. התחל זלוף בשיעור של 6 מיליליטר / דקה, לקשור ליגטורה # 1 ומס '2, ולחתוך את וריד הכליה השמאלי. המשך שטיפה במשך 1-2 דקות, עד שהאיברים החווירו לחלוטין.
    5. חותכים כלי דם כליות, שופכה ורקמות חיבור ושומן סביב במספריים כדי לאסוף את הכליות. לאחר מכן לבצע דמעה קצרה בכמוסה בכליות ולקלף את הכליות לdecapsulate. מניחים את הכליות לPBS קר כקרח. המתת חסד הוא אושר על ידי פתיחת בית החזה.
  3. הכן 5 X 5 שבבי זכוכית כיסוי מ"מ מצופים בפולי-L ליזין. לחתוך בשטח בנוי כיסויss עם עיפרון יהלומים ומקום כ 20 μl של 0.01% פתרון פולי-L ליזין מסונן סטרילי על כל שבב זכוכית. הכן מלוח ושני זוגות מלקחיים שען לנתיחה.
  4. חותך את הכליות בסכין גילוח במישור הקדמי לפרוסות של ~ 1-2 מ"מ עובי. מניחים את הפרוסות אחת תחת סטראו. בידוד של רקמות צריך להיעשות במלוח קר כקרח.
  5. אתר ציסטות תחת סטראו כחללים עגולה צורה (איור 2 א); הקירות שלהם לעתים קרובות מכילים רשת בולטת של כלי דם התרבו. קצו מלקחיים העדין באמצעות לנתח את שכבת האפיתל הפנימית של ציסטה דקה ככל האפשר כדי להשיג שטח שכבה. לצרף אותו לשבב זכוכית מכוסה בפולי-L ליזין. משטח פולי-L ליזין דביק מאפשר לחוקר למקם את שכבת ציסטה הפנימית על זכוכית בחוזקה. לחשוף את ציסטה עם הצד עד הפסגה כדי לספק גישה לטפטפות (איור 2).
  6. השתמש בילד PCK או החולדה SDפרוסות מרכזיות ניי מכילות papilla לבידוד של CNT / CCDsegments אינו מורחב 18-21.
    הערה: רקמות papillary הן עמידות יותר מקליפה ועל ידי החזקת להקות צינורי פפילרי עם מלקחיים וקריעות רדיאלי ציר פרוסה ניתן ביקעו לדק מגזרים. tubules פרט גלוי ויכול להיות שלף להיות ממוקם על שבבי זכוכית כיסוי.
  7. זהה את מגזרי CNT / CCD ידי הסתעפויות, שקיפות גבוהה מצינוריות הפרוקסימלי ותאים גדולים בולטת לעין (איור 2 ג). מניחים את שבב מכסה זכוכית עם צינוריות המצורפות תחת מיקרוסקופ מצויד בmicromanipulators המתאימה לנהיגת micropipettes. שימוש micropipettes החד tubules מפוצל פתוח ולצרפם לקצות הזכוכית כדי להפוך את משטח הפסגה נגיש (איור 2 ד).

אלקטרופיזיולוגיה 2. ערוץ יחיד תיקון מהדק

  1. למלא את תא תיקון- clamp עם פתרון אמבטיה ולהעביר את שבב מכסה הזכוכיתעם רקמות מבודדות לתא. ודא שיש לי micropipettes תיקון מהדק התנגדות של 7-10 MΩ למדידות אמינות בתאים (מצורף תא).
  2. למדידות מצורפים תא, להגדיר את יחס רווח המגבר ל20x ונמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. לניטור ערוצי ENaC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ"מ: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7.4); פיפטה: 140 LiCl, 2 MgCl 2 ו -10 HEPES (pH 7.4).
  3. לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 10-מצורף תא. בחר תא בשכבת האפיתל ומתקרב לפיפטה קרום הפסגה. ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום תא על ידי יישום שאיבה עדינה. ברגע שחותם gigaOhm עמיד גבוהה נוצר, פרוטוקול ללא פער בפוטנציאל החזקה יש להתחיל לפעילות ניטור של הערוץ של עניין.
  4. נתונים חנות פער ללא יחידים ערוץ הנוכחי מגיגהחותמות אוהם לניתוח שלאחר מכן. לנתח את אירועי הערוץ באמצעות חבילת תוכנה בדרך כלל מסופקת עם הגדרות תיקון מהדק 18. חישוב פעילות ערוץ כעמותה שבי N מתייחס למספר הערוצים הפעילים בo התיקון וP היא הסתברות פתוחה ממוצעת של הערוצים.
    הערה: השתמש בציסטות או צינוריות בודדות בניסויי תיקון מהדק לא יותר מ -30 דקות.

3. מדידות ratiometric epifluorescence של ריכוז סידן תוך תאים בתאי אפיתל

  1. השתמש 5 מ"מ פורע-2:00 מומסים DMSO. פתרון מניות Aliquot לתוך צינורות חרוטי 500 μl בודדים (כ -10 μl). להגן מפני אור ולאחסן במקפיא ב -20 מעלות עד שישה חודשים.
  2. דגירה ציסטות מבודדות וtubules המפוצל פתוחה במשך 30-40 דקות בPSS (מ"מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 ו -10 HEPES ב- pH 7.35) המכיל 5 מיקרומטר צבע פורע-2 בבוקר ו0.05% חומצת pluronic כדי לעזור לפזר את אסטרים acetoxymethyl. לשם כך, רקמות מקום בצלחת 3.5 סנטימטר המכילות קוקטייל טעינה, להגן מפני אור ודגירה על שייקר איטי בטמפרטורת חדר.
  3. לשנות פורע-2:00 מכיל תקשורת לנקות PSS לאחר דגירה ולמקם את הרקמה תחת מיקרוסקופ כדי לבצע הדמיה epifluorescence נוסף.
  4. הפעל מצלמת CCD ומקור יציב אור (מערכת monochromator) מצויד בגלגל מסנן (כל עמדת מסנן יכולה להיות קשורה לרמה שלו הנחתה, שנבחרה בכל פעם שהמסנן נקרא).
  5. מצא את הרקמה בשדה בהיר. לעבור לזיהוי של אותות הקרינה ולהתאים את עוצמת מקור האור באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים ומנורת כוח כדי למנוע הרוויה של האות.
  6. צג הפורע-2 הקרינה בבוקר בדגימת הרקמה עם עירור ratiometric בננומטר 340/380 בתדירות של 0.125 הרץ ומעלה. השתמש 40 × / עדשה אובייקטיבית NA 1.3 או דומה לresolu הנכוןתמונת tion.
  7. לעיבוד תמונה וחישובים לייבא תמונה ברצף. ודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. בחר כמה אזורים של עניין (תאי ציסטה בודדת או אזורים נבחרים של רקמת פיברוזיס) ולחשב ערכי עוצמה לכל ערוץ (340 ו -380 ננומטר) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לחסר מכל נקודת נתונים.
  8. עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של 340-380 ערוצי הפורע-2 בבוקר. פיזור עלילה / קו שינויי נקודה-זמן של חולף Ca 2 + לכל איזור ולחשב ערכים / SE ממוצעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מעורבות ENaC פוטנציאלית בcystogenesis הודגמה על ידי מספר מחקרים שנצפו גורם גדילה באפידרמיס שיבש (EGF) איתות בהתקדמות PKD 22-25 וספיג החוזר של סודיום חריג בARPKD מודלים עכברי ותרביות רקמת 26-28. לדוגמא, Veizis et al. הראה כי קליטת amiloride רגישה Na + היא ירידה בתאי CD ממודל העכבר הלא-orthologous BPK של ARPKD 29. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי נתרן לקוי וספיגת מים בציסטות הוא גורם חשוב בהחמרת cystogenesis 10. באופן ספציפי, אנחנו מועסקים ניתוח אלקטרו וimmunohistochemical ומצאנו כי ציסטות להפעיל ספיגות חוזרת של סודיום קהה. גישה תרופתית הוכיחה כי מצור ENaC סלקטיבית במידה ניכרת מחריף ציסטה התקדמות 10.

בנוסף, אנו הפגנו את ההשפעה של ממשל של benzamil, חוסם ENaC, oפעילות n של הערוצים בקיר ציסטה. חולדות PCK בן 4 שבועות-סופקו עם רכב או שתיית מים המכילים benzamil (15 מ"ג / מיליליטר) כרצונך מודעה. לאחר 12 שבועות של טיפול בחיות עובדו על פי הפרוטוקול שתואר לעיל. תיקון מהדק בוצע על monolayers פיברוזיס מבודד מהרכב וbenzamil קבוצות מטופלים. איור 3 מראה עקבות הנוכחיות נציג של פעילות ENaC נרשמה מקרומי הפסגה. גרף הסיכום מוכיח כי פעילות ENaC הממוצעת (o NP) הייתה 0.91 ± 0.15 10 בציסטות של קבוצת ביקורת, ואילו ממשל benzamil ירד הפעילות של הערוץ ל0.32 ± 0.05. אנו מסיקים כי בARPKD (מאופיין בנפיחות באקסטזה של תקליטורים כדי ליצור ציסטות רבות-ציר בצורת כליה 30) benzamil ניתנו בשתיית מים מגיע ציסטות כליות עם זרימת שתן 30. אפקט זה מאפשר benzamil להקטין ספיגה חוזרת של נתרן מנוזל הציסטה, contr ibuting לcystogenesis 10.

בנוסף למסלול EGF, אדנוזין טריפוספט (ATP) וpurines אחרת זוהו גם כמרכיב איתות אוטוקריני קריטי שהוא מווסת בלתי הולמת בדגמי PKD ובחולים במחלה זו. נמסר כי איתות purinergic ממלאת תפקיד חשוב בcystogenesis במהלך שני ADPKD וARPKD 31,32. תאי ציסטה של חולדות PCK בעבר הוכחו תערוכה בסיס נמוך [Ca 2 +] i ואובדן בתיווך הזרימה [Ca 2 +] אני איתות לעומת הלא-מורחב צינורות איסוף בריאים של חולדות SD 13. אגוניסטים לקולטן P2 לווסת את הפיתוח של ציסטות בכליות מודל במבחנה של היווצרות ציסטה נגזרת מעכבר CPK / CPK 33. ריכוז ה- ATP גבוה נמצא בנוזל פיברוזיס מחולים במחלה 34 ובתקשורת המותנה בepithelia כליות פיברוזיס תרבית מעכברי CPK / CPK 35.

_content "> בדקנו שטף סידן בתגובה לממשל ATP אקסוגניים. ציסטות PCK וצינורות בקליפת המוח נורמלי מחולדות SD בודדו למדידות סידן לפני ואחרי היישום של 10 מיקרומטר ATP. נתונים באיור 4 לחשוף את ההשפעה של 10 מיקרומטר ATP בtubules פיברוזיס של חולדות PCK למד עם שתי גישות שונות: איור 4 א מציג מדידות של עוצמת הקרינה הפורע-2:00 ב 340 ו 380 ננומטר בהתקנת epifluorescence מצוידת monochromator, ואיור 4 מייצגים רישום של Fluo-8 צביעת צבע עם confocal מיקרוסקופ. שני הטכניקות להפגין קינטיקה דומה של תגובת מעבר סידן ליישום ה- ATP באפיתל פיברוזיס 10.

איור 1
איור 1:. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי לאחרהחיה מורדמת ומוכן לניתוח כראוי, הכליות סמוקות עם PBS להסיר דם. לאחר מכן, הכליות הם נכרת, decapsulated, וmonolayers פיברוזיס או צינוריות-מורחב שאינם מבודדים באופן ידני עם מלקחיים תחת סטראו. tubules ללא הרחם מפוצל-פתוח עם micropipettes מונע על ידי micromanipulators אילו אפיתל פיברוזיס כמשטח פנימי של ציסטות יהיה פתוח לגישה לצד הפסגה.

איור 2
איור 2: בידוד והכנת monolayers צינור פיברוזיס והאיסוף () פרוסת כליות נציג מעכברוש PCK בן 16 בשבוע.. Monolayer פיברוזיס על שבב זכוכית כיסוי הועבר למיקרוסקופ לניתוח תיקון מהדק או הדמיה סידן (60X) (ב). קטע / CCD (C) CNT עם הסתעפות מבודדת מחולדת SD. (

איור 3
איור 3: השפעה של טיפול benzamil על פעילות ENaC באפיתל פיברוזיס. () עקבות הנוכחיות נציג לפעילות ENaC נמדדה בתיקוני תא מצורף של ציסטות מבודדות טרי מחולדות PCK בן 16 בשבוע שמנוהל 12 שבועות של benzamil במי שתייה. תיקונים אלה נערכו בפוטנציאל מבחן h V = -V p = -40 mV. פנימה זרמי Li + הם כלפי מטה. קווים מקווקווים מציינים את המצב הנוכחי בהתאמה עם "ג" ו- "n o" המציין את המדינות הסגורות ופתוחות. גרף (ב) סיכום פעילות שנצפתה ENaC (o NP) (לשכפל באופן חלקי מ -10 באישור). * P <0.05 veרכב rsus.

איור 4
איור 4: אפקטים של ה- ATP על זרימת סידן בתאי פיברוזיס של חולדות PCK () נציג תמונות של monolayer פיברוזיס עמוס פורע-02:00 לפני ואחרי היישום של ה- ATP 10 מיקרומטר.. צינורות גרף המסכם את ההשפעה של ה- ATP על רמות סידן בשכבת התא של חולדות PCK וSD איסוף (N = 38 תאים). (ב) monolayer סיסטיק עמוס לצבוע Fluo-8 לפני ואחרי היישום של גרף ATP והסיכום של 10 מיקרומטר תגובת סידן תוך תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שתארנו כאן יישומים של טכניקת תיקון- clamp הקונבנציונלית וסידן הדמיה epifluorescence לmonolayers אפיתל פיברוזיס נגזר ממודל גנטי בעכברים של ARPKD. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים, שרוב תשומת הלב צריך להיות משולם על הבידוד של ציסטות (שלב 1.5 של סעיף הפרוטוקולים) ומחקרי אלקטרו. נהלי מפתח אלה דורשים אימון וסבלנות רבים, והקורא לא צריך להיות מתוסכל ובעונה אחת.

קודם כל, את עיקר תשומת הלב צריך להיות משולם על התהליך של בידוד monolayer ציסטה. חלק זה של הכנה דורש מיומנויות ידניות ומשמעותי השפעות עבודה נוספת, כעובי של הדגימה ו אפילו קובץ מצורף לשבב זכוכית היא קריטי לנראות של התאים. עובי הקירות מבודדים ציסטה משתנה בחלקים שונים של הדגימה, ומומלץ להתמקד בציסטות גדולות יותר עם אזורי monolayer גדולים יותר נוחים לwork. כדי לעזור לנקות את הדגימה ולגשת monolayer, צריכה להיות קלופות רקמות הסובבות עם מלקחיים תחת סטראו. יודגש כי הטכניקה מרמזת ניצול של סטראו באיכות גבוהה המתאפיין בעומק שדה משמעותי ויכולת לשנות הגדלה במגוון רחב כדי להתאים גדלים שונים של אובייקטים בנתיחה. מגבלה נוספת של השיטה היא שטכניקות מתוחכמות כגון תיקון מהדק והדמיה סידן דורשות כוח אדם מכיר בשיטות אלה. אנו מציעים כי ניתן להשיג ניסיון ראשוני באיסוף תרביות תאי צינור כגון זמין מסחרי תאי M1 וIMCD medullar קליפת המוח כפי שהם יוצרים monolayer אפיתל דומה לציסטות.

הגישה שלנו מאפשרת מדידת פעילות תעלות יונים ואני רמות [Ca 2 +] בסביבה המקורית של רקמות מבודדות טרי. היתרון העיקרי של הליך זה הוא הכנה של דגימות לSinglניתוח דואר ערוץ או לצבוע טעינה אינו דורש טיפול אנזימטי, פגיעה מכאני או נהלי צעדים שעלולים להיות מזיקים אחרים. זה מתבצע באופן ידני עם מלקחיים במלח ומספק דגימות ניזוק גדולות. דגימות מסוג זה יכול לשמש לא רק לטכניקות המתוארות. למעשה, האפיתל פיברוזיס המבודד מייצג שכבה דקה של תאי צינורי טהורים ושומר על תכונות monolayer ילידים, שהופך אותו אובייקט שלם יקר לניסויים בזמן אמת אשר מייצר פיסיולוגי תצפיות רלוונטיות. אם הבידוד של ציסטות נראה קשה הליך לחוקר או כמות גדולה של רקמת פיברוזיס נדרש בבת אחת, טיפול האנזימטית (למשל, עם dispase וcollagenase, כפי שמתואר כאן 38 לקליפת מוח איסוף tubules צינור) יכול לשמש כדי לפשט את תהליך הבידוד. עם זאת, החוקר צריך להיות זהיר מאוד בעת ביצוע טיפול זה, כמו אנזימים, במיוחד פרוטאזות, יכול להשפיע באופן משמעותי channe יוןהפעילות או "ls נזק קולטני הקרום. זה, למשל, חשוב מאוד ללימודים של איתות purinergic, חלבוני קרום אלה גם מאוד ידועים לבזות במהירות תחת טיפול אנזימטי 39,40.

בנוסף, האפיתל פיברוזיס יכול לשמש למטרות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה או הכתמה של monolayer קבוע עם צבעים (למשל phalloidin rhodamine), או טעינת הרקמה הטרי עם סמני חומר תאיים, כגון DAF-FM לNO זיהוי או צבעים שונים ל לפקח על ייצור מיני חמצן תגובתי. הוא הציע להשתמש בחלק הטהור של האפיתל פיברוזיס המבודד למערבי סופג לחסל השפעת גורמים שאינם ספציפיים הנוכחיים בסך lysates כליות. אנחנו גם מציעים כי אפיתל פיברוזיס יכול להיות מבודד באופן דומה מעכברים או מינים אחרים שזמינים למחקרים של מודלים שונים של לא רק ARPKD, אלא גם במחלה. יש לי להכחיש דגימות ציסטה מבודדות טרייתרונות לביולוגיה המולקולרית גישות בהשוואה לתאים בתרבית פיברוזיס, כפי שהם טובים יותר לקיים את המאפיינים של רקמת פיברוזיס בתוך האיבר, וללא ספק לספק נתונים נוספים בנוגע מוצדקים תהליכי המחלה in vivo.

אחד היתרונות המשמעותיים של שיטה זו היא אפשרות לשימוש (רקע גנטי חולדות אלה חולקים עם חולדות PCK) איסוף צינורות מאותו הכליות, או tubules חולדות SD-מורחב שאינם נורמלי, כמו רקמות שליטה. מדידות תיקון מהדק וסידן דומות במגזרי נפרון נמצאות בשימוש נרחב בכליות אינן פיברוזיס במעבדות רבות 41-43. סוג בהתאם יון ערוצים, שינויים שונים של שיטת תיקון מהדק יכול לשמש (כל תא, מבפנים החוצה, מחוץ-החוצה); למשל, ENaC וROMK פעילות (כליות חיצוניות לשדית אשלגן ערוץ) יכולים להיות מוערכת על ידי כל תא תצורה 44,45. סידן ההדמיה הפורע-2:00 המוצעת בepifluorescence שדה רחב עם monochromator ניתן גם הופיע עם כל שינוי דומה אחר של סידן הדמיה כגון ניתוח עם מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים עם צבעי סידן אחרים. מערכות מיקרוסקופ אלה הן פחות סבירים, אבל מספקות הדמיה באיכות גבוהה יותר ורגישות יותר ממיקרוסקופיה הרחב בתחום. גישה דומה חלה גם ללמוד פעילות ערוצי TRPC ואיתות סידן בpodocytes של glomeruli מבודדת טרי 17,46,47. סידן הדמיה אחר שיכולים להיות מיושמת כוללת ניצול של Fluo-8 כפי שמודגם באיור 4 או מדידת confocal ratiometric עם Fluo4 / צבעי ניאון FuraRed כפי שתוארו בIlatovskaya et al. 46 מבחינה טכנית, זה אפשרי לבצע שני תיקון מהדק והדמיה סידן בו זמנית על אותו התא אם מיקרוסקופ מצויד בשתי ההגדרות. כך, הטכניקה המתוארת היא גישה אפשרית לתצפיות באיכות גבוהה בתחום של PKD, אשר יכולה להיות שונה באופן גמיש על פי הצרכי דואר של המחקר הספציפי שלך וזמינות של הציוד. יתר על כן, שינויים שונים של הדמיה סידן יכולים לשמש כאן, כוללים מדידות ratiometric confocal עם Fluo4 / צבעי ניאון FuraRed (כפי שמתוארים בIlatovskaya et al. 46) או Fluo-8 כפי שמודגם באיור 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (מכשירי Nikon Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקים R01 HL108880 (לAS), R01 DK095029 (לOPO) וK99 HL116603 (לכפית), קרן הלאומית לכליות IG1724 (לכפית), איגוד לב האמריקאי 13GRNT16220002 (לOPO) ו בן ג 'יפס מחקר המלגה מהאגודה האמריקנית לנפרולוגיה (ל- DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

רפואה גיליון 103 תיקון מהדק מחלת כליות פוליציסטיות ARPKD ADPKD כליות סידן תוך תאי פורע-2 בבוקר נפרון פיתוח ציסטה polycystin
יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,… More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter