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Biology

पैच दबाना और लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू हौसले से पृथक PKD उपकला के कार्यात्मक संपत्तियों को मॉनिटर करने के लिए

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

गुर्दे ट्यूबलर उपकला में व्यक्त आयन चैनल पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग की विकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ हम हौसले कृंतक गुर्दे से अलग सिस्टिक उपकला में पैच दबाना विश्लेषण और intracellular कैल्शियम के स्तर का मापन का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के दौरान पुटी दीक्षा और विस्तार ट्यूबलर सेल प्रसार, ल्यूमिनल तरल पदार्थ जमा और बाह्य मैट्रिक्स गठन में असामान्यताओं की विशेषता एक जटिल प्रक्रिया है। आयन चैनल और intracellular कैल्शियम सिगनल की गतिविधि ट्यूबलर उपकला के कार्यों को निर्धारित जो महत्वपूर्ण शारीरिक मापदंडों हैं। हम हौसले गुर्दे अल्सर से अलग उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तर का पैच दबाना तकनीक और पंजीकरण के साथ आयन चैनल गतिविधि का वास्तविक समय अवलोकन के लिए उपयुक्त एक विधि विकसित की है। PCK चूहों, ऑटोसोमल रिसेसिव पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (ARPKD) के एक आनुवंशिक मॉडल, आयन चैनलों और कैल्शियम प्रवाह के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए यहां इस्तेमाल किया गया। यहाँ वर्णित एक चैनल गतिविधि और intracellular सीए 2 गतिशीलता सिस्टिक monolayers और PCK या सामान्य Sprague Dawley (एसडी) चूहों से गैर फैली हुई नलिकाओं को अलग, और निगरानी करने के लिए बनाया गया एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया है।इस विधि एंजाइमी संसाधन की आवश्यकता होती है और हौसले से अलग उपकला monolayer के एक देशी सेटिंग में विश्लेषण की अनुमति देता नहीं है। इसके अलावा, इस तकनीक intracellular कैल्शियम परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील है और सटीक मापन के लिए उच्च संकल्प छवियों उत्पन्न करता है। अंत में, अलग-थलग सिस्टिक उपकला आगे एंटीबॉडी या रंजक, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए प्राथमिक संस्कृतियों की तैयारी और शुद्धि के साथ धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

आयन चैनल सेल के विकास और भेदभाव सहित कई शारीरिक कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Autosomal प्रमुख और पीछे हटने का पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोगों (क्रमशः ADPKD और ARPKD,) ट्यूबलर उपकला कोशिका मूल के गुर्दे तरल पदार्थ से भरे अल्सर के विकास के द्वारा होती आनुवंशिक विकार हैं। ADPKD polycystins 1 और सेल प्रसार और भेदभाव के नियमन में शामिल 2, झिल्ली प्रोटीन एन्कोडिंग PKD1 या PKD2 जीन के म्यूटेशन के कारण होता है। स्वयं के द्वारा या PKD1 के साथ एक जटिल रूप PKD2 भी एक सीए 2 पारगम्य कटियन चैनल 1 के रूप में कार्य करते हैं। PKHD1 जीन एन्कोडिंग fibrocystin (tubulogenesis और / या उपकला के polarity के रखरखाव में शामिल एक सिलिया जुड़े रिसेप्टर की तरह प्रोटीन) के उत्परिवर्तन ARPKD 2 की आनुवंशिक प्रोत्साहन कर रहे हैं। पुटी विकास एक जटिल घटना से परेशान प्रसार 3,4, angiogenesis को 5, dedifferentiation और ध्रुवीय की हानि के साथ साथ हैट्यूबलर कोशिकाओं 6-8 की अल्पसंख्यक।

सिस्टिक उपकला में दोषपूर्ण पुनःअवशोषण और संवर्धित स्राव लुमेन और पुटी विस्तार 9,10 में तरल पदार्थ जमा करने के लिए योगदान करते हैं। बिगड़ा प्रवाह पर निर्भर [सीए 2 +] मैं सिगनल भी PKD 11-15 दौरान cystogenesis से जोड़ा गया है।

यहाँ, हम एक चैनल गतिविधि और PCK चूहों से अलग सिस्टिक उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तरों के पैच दबाना माप के लिए उपयुक्त विधि का वर्णन है। इस पद्धति को सफलतापूर्वक उपकला ना + चैनल (ENaC) 10 की गतिविधि के लिए चिह्नित करने के लिए हमारे द्वारा लागू किया गया था और [सीए 2 +] मैं सीए 2 पारगम्य TRPV4 और purinergic संकेत झरना 13 से प्रेरित प्रक्रियाओं निर्भर।

इन अध्ययनों में हम PCK चूहों, PKHD1 जीन में एक सहज उत्परिवर्तन के कारण होता ARPKD के एक मॉडल का इस्तेमाल किया। PCK तनाव originall थाSprague-Dawley (एसडी) चूहों 16 जिससे एसडी चूहों PCK तनाव के साथ तुलना के लिए एक उचित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं से निकाली गई वाई। नतीजतन, एक ही PCK चूहों से अलग एसडी चूहे नेफ्रॉन क्षेत्रों और गैर फैली हुई संग्रह नलिकाओं दोनों सिस्टिक उपकला पर प्रयोगों के लिए दो अलग अलग तुलना समूहों के रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Protocol

नीचे वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विस्कॉन्सिन और ह्यूस्टन में टेक्सास के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय के मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार थे। चित्रा 1 ऊतक अलगाव और प्रसंस्करण प्रक्रिया का मुख्य कदम दर्शाता है। संक्षेप में, PCK या एसडी चूहों से गुर्दे स्वस्थ गैर मिलाया नलिकाओं या अल्सर से या तो नलिकाओं को एकत्रित करने की उपकला monolayers के मैनुअल अलगाव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यहाँ हम 4-16 सप्ताह पुरानी PCK चूहों 10,13 से गुर्दे का अध्ययन किया।

1. गुर्दे अल्सर और कनेक्ट नलिकाओं (सीएनटी) / के अलगाव संग्रह नलिकाओं (सीडी) अनुभाग

  1. Isoflurane (5% प्रेरण, 1.5% से 2.5 रखरखाव) / चिकित्सा ग्रेड हे 2 या किसी अन्य रूप में मंजूरी दे दी विधि के साथ प्रयोगात्मक पशु anesthetize। पशु लगातार पर्याप्त Le सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिएसंज्ञाहरण के वेल। स्थिर सांस की दर और पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया उचित संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  2. Laparotomy प्रदर्शन और उदर महाधमनी के माध्यम से 17 फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ गुर्दे फ्लश।
    1. एक पॉलीथीन ट्यूबिंग कैथेटर (PE50) तैयार करें और पीबीएस के साथ भरा एक सिरिंज पंप से कनेक्ट। पक्ष और mesenteric और सीलिएक धमनियों शाखाओं के साथ उतरते महाधमनी के लिए पहुँच पाने के लिए कपास swabs के साथ पेट अंगों शिफ्ट करने की तरफ से पेट भर में एक अनुप्रस्थ पेट चीरा बनाने तब, लिनिया अल्बा के साथ त्वचा और पेट की दीवार में कटौती। उनकी सूखापन को रोकने के लिए आगे की प्रक्रिया के दौरान गर्म नमक के साथ आंतरिक अंगों को गीला।
    2. एक mesenteric और सीलिएक धमनियों के आसपास संयुक्ताक्षर (# 1) और एक अन्य संयुक्ताक्षर (# 2) डायाफ्राम के तहत महाधमनी के आसपास (टाई नहीं है) रखें। धीरे से एक अलग। पतली संदंश के साथ यह आसपास संयोजी ऊतक विदारक और दो ​​संयुक्ताक्षर जगह कुंद द्वारा उदरतलस्थित ~ 3बाएं गुर्दे धमनी नीचे मिमी (# 3) और श्रोणिफलक धमनियों विभाजन ऊपर (# 4)।
    3. संयुक्ताक्षर # 4 टाई और बाएं गुर्दे धमनी और संयुक्ताक्षर # 3 के बीच महाधमनी के चारों ओर एक पोत दबाना देते हैं। मजबूती से कैथेटर को ठीक करने के लिए संयुक्ताक्षर # 3 का उपयोग करें, दबाना और महाधमनी कैथीटेराइज़ को संयुक्ताक्षर # 4 के बीच एक चीरा।
    4. दबाना जारी है और रक्त नाड़ी उचित स्थापना सुनिश्चित करने के लिए कैथेटर में दिखाई दे रहा है कि सुनिश्चित करें। 6 मिलीलीटर की दर से छिड़काव शुरू / मिनट, संयुक्ताक्षर # 1 और # 2 टाई, और बाएं गुर्दे की नस काट दिया। अंगों पूरी तरह से blanched रहे हैं जब तक 1-2 मिनट के लिए निस्तब्धता जारी रखें।
    5. कैंची से गुर्दे की रक्त वाहिकाओं, मूत्रमार्ग और आसपास के संयोजक और वसा ऊतकों में कटौती गुर्दे इकट्ठा करने के लिए। फिर गुर्दे कैप्सूल में एक छोटे से आंसू बनाने के लिए और उन्हें decapsulate गुर्दे छील। ठंडा पीबीएस में गुर्दे रखें। इच्छामृत्यु एक थोरैकोटॉमी द्वारा पुष्टि की है।
  3. पाली-एल Lysine के साथ लेपित 5 एक्स 5 मिमी कवर कांच चिप्स तैयार करें। एक कवर जीएलए कटएक हीरे पेंसिल और जगह प्रत्येक गिलास चिप पर 0.01% बाँझ फ़िल्टर पाली एल Lysine समाधान के लगभग 20 μl के साथ एस एस। खारा और विच्छेदन के लिए घड़ीसाज़ संदंश के दो जोड़े तैयार करें।
  4. 1-2 मिमी मोटाई ~ की स्लाइस में ललाट विमान के साथ एक धार के साथ गुर्दे में कटौती। एक stereomicroscope के तहत स्लाइस की एक जगह है। ऊतकों के अलगाव ठंडा खारा में किया जाना चाहिए।
  5. गोल आकार गुहाओं (2A चित्रा) के रूप में एक stereomicroscope के तहत अल्सर का पता लगाने; उनकी दीवारों अक्सर प्रचूर मात्रा में रक्त वाहिकाओं के प्रमुख नेटवर्क होते हैं। का प्रयोग ठीक इत्तला दे दी संदंश एक monolayer क्षेत्र प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में पतली एक पुटी के आंतरिक उपकला परत काटना। पाली-एल Lysine के साथ कवर एक गिलास चिप को देते हैं। स्टिकी पाली एल Lysine सतह शोधकर्ता मजबूती से कांच पर आंतरिक पुटी परत की स्थिति के लिए अनुमति देता है। Pipettes (चित्रा 2 बी) के लिए पहुँच प्रदान करने के शिखर की ओर ऊपर के साथ पुटी बेनकाब।
  6. PCK या एसडी चूहे बच्चे का प्रयोग करेंगैर फैली हुई सीएनटी / CCDsegments 18-21 के अलगाव के लिए अंकुरक युक्त Ney केंद्रीय स्लाइस।
    नोट: इल्लों से भरा हुआ ऊतकों कोर्टेक्स से और संदंश के साथ मस्सेदार ट्यूबलर बैंड पकड़ रहा है और टुकड़ा पतली सेक्टरों में विभाजित किया जा सकता अक्ष रेडियल साथ फाड़ से अधिक टिकाऊ होते हैं। व्यक्तिगत नलिकाओं दिखाई दे रहे हैं और कवर कांच चिप्स पर रखा जा करने के लिए बाहर निकाला जा सकता है।
  7. , Bifurcations द्वारा समीपस्थ नलिकाओं और बड़ी प्रमुखता से दिखाई दे कोशिकाओं (चित्रा -2) की तुलना में अधिक पारदर्शिता सीएनटी / सीसीडी खंडों को पहचानें। Micropipettes ड्राइविंग के लिए उपयुक्त micromanipulators से लैस एक खुर्दबीन के नीचे संलग्न नलिकाओं के साथ कवर कांच चिप रखें। कांच के लिए उनके किनारों तेज micropipettes विभाजन खुला नलिकाओं का प्रयोग और संलग्न (चित्रा 2 डी) शिखर सतह सुलभ बनाने के लिए।

2. सिंगल चैनल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. स्नान समाधान के साथ पैच दबाना चैम्बर भरें और कांच कवर चिप हस्तांतरणचैम्बर के लिए पृथक ऊतकों के साथ। पैच दबाना micropipettes विश्वसनीय पर सेल (सेल संलग्न) मापन के लिए 7-10 MΩ का प्रतिरोध किया है कि सुनिश्चित करें।
  2. सेल संलग्न माप के लिए, 20x एम्पलीफायर लाभ अनुपात सेट और एक आठ पोल बेसल फिल्टर द्वारा 300 हर्ट्ज पर धाराओं कम-से गुजरती हैं। ENaC चैनलों की निगरानी के लिए, मिमी में स्नान समाधान, का उपयोग करें: 150 सोडियम क्लोराइड, 1 2 CaCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES (7.4 पीएच); पिपेट: 140 LiCl, 2 2 MgCl और 10 HEPES (7.4 पीएच)।
  3. एक सेल संलग्न मोड 10 में एक पारंपरिक पैच दबाना प्रयोग आचरण। उपकला monolayer में एक कक्ष का चयन करें और शिखर झिल्ली को पिपेट दृष्टिकोण। कोमल चूषण लगाने से एक पिपेट और कोशिका झिल्ली के बीच एक उच्च प्रतिरोध मुहर के रूप में। एक उच्च प्रतिरोधी gigaOhm मुहर का गठन हो जाने के बाद, एक होल्डिंग क्षमता पर एक अंतर-मुक्त प्रोटोकॉल ब्याज के चैनल की निगरानी गतिविधि के लिए शुरू किया जाना चाहिए।
  4. Giga से स्टोर अंतराल मुक्त एक चैनल वर्तमान डेटाबाद के विश्लेषण के लिए ओम जवानों। आम तौर पर पैच दबाना setups के 18 के साथ आपूर्ति की एक सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर चैनल की घटनाओं का विश्लेषण करें। चैनलों की औसत खुले संभावना एन पैच और पी ओ में सक्रिय चैनलों की संख्या को संदर्भित करता है, जहां एनपीओ के रूप में चैनल गतिविधि की गणना है।
    नोट: कोई अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए पैच दबाना प्रयोगों में पृथक अल्सर या नलिकाओं का प्रयोग करें।

उपकला कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम एकाग्रता 3. ratiometric Epifluorescence माप

  1. DMSO में भंग 5 मिमी Fura-02:00 का प्रयोग करें। अलग-अलग 500 μl शंक्वाकार ट्यूबों में विभाज्य शेयर समाधान (लगभग 10 μl)। अप करने के लिए छह महीने के लिए सी -20 पर फ्रीजर में प्रकाश और दुकान से सुरक्षित रखें।
  2. पीएसएस में 30-40 मिनट के लिए पृथक अल्सर और विभाजन खुला नलिकाओं सेते (मिमी: 145 सोडियम क्लोराइड, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 2 2 CaCl और पीएच 7.35 बजे 10 HEPES) 5 माइक्रोन Fura-2 डाई और 0.0 युक्त5% pluronic एसिड acetoxymethyl एस्टर फैलाने में मदद करने के लिए। उस के लिए, लोडिंग कॉकटेल युक्त 3.5 सेमी डिश में जगह ऊतकों, प्रकाश से रक्षा के लिए और कमरे के तापमान पर एक धीमी प्रकार के बरतन पर सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद पीएसएस के लिए स्वच्छ और आगे epifluorescence इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे ऊतक जगह के लिए मीडिया वाले Fura-2 बदलें।
  4. सीसीडी कैमरा और फिल्टर पहिया के साथ सुसज्जित स्थिर प्रकाश स्रोत (मोनोक्रोमेटर सिस्टम) पर बारी (प्रत्येक फिल्टर स्थिति फिल्टर कहा जाता है हर बार चयनित अपने स्वयं के क्षीणन स्तर, के साथ जुड़ा हो सकता है)।
  5. उज्ज्वल क्षेत्र में ऊतक का पता लगाएं। प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए स्विच और संकेत के संतृप्ति से बचने के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर और दीपक शक्ति का उपयोग कर प्रकाश स्रोत की तीव्रता को समायोजित।
  6. 0.125 हर्ट्ज या अधिक की आवृत्ति के साथ 340/380 एनएम पर ratiometric उत्तेजना के साथ ऊतक के नमूने में Fura-2 प्रतिदीप्ति की निगरानी करें। उचित resolu के लिए एक 40 × / एनए 1.3 या इसी तरह के उद्देश्य लेंस का प्रयोग करेंtion के छवि।
  7. इमेज प्रोसेसिंग और गणना के लिए छवि अनुक्रम आयात करते हैं। चैनलों विभाजित है और एक hyperstack स्केल मोड का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें। कई हित के क्षेत्रों (एकल पुटी कोशिकाओं या सिस्टिक ऊतक के चयनित क्षेत्रों) का चयन करें और वरीय डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रत्येक चैनल (340 और 380 एनएम) के लिए तीव्रता मूल्यों की गणना; प्रत्येक डेटा बिंदु से घटाना पृष्ठभूमि तीव्रता मूल्यों।
  8. प्रत्येक समय बिंदु के लिए Fura-2 340-380 चैनलों की तीव्रता के अनुपात की गणना। प्लॉट बिखराव / प्रत्येक क्षेत्र के लिए सीए 2 क्षणिक की लाइन बिंदु समय में परिवर्तन और गणना मतलब / एसई मूल्यों।

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Representative Results

Cystogenesis में संभावित ENaC भागीदारी ARPKD murine मॉडल और ऊतक संस्कृतियों 26-28 में PKD प्रगति 22-25 और असामान्य सोडियम पुनःअवशोषण में संकेत बाधित epidermal वृद्धि कारक (EGF) मनाया कि कई अध्ययनों से प्रदर्शित किया गया है। उदाहरण के लिए, Veizis एट अल। Amiloride के प्रति संवेदनशील ना + अवशोषण ARPKD 29 के गैर orthologous BPK माउस मॉडल से सीडी कोशिकाओं में कमी आई है कि पता चला है। हमने हाल ही में अल्सर में बिगड़ा सोडियम और पानी पुनःअवशोषण cystogenesis 10 उत्तेजक में एक महत्वपूर्ण कारक है कि प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, हम electrophysiological और प्रतिरक्षाऊतकरसायन विश्लेषण कार्यरत हैं और अल्सर पा सोडियम पुनःअवशोषण डालती है कि पाया। एक औषधीय दृष्टिकोण चयनात्मक ENaC नाकाबंदी स्पष्ट रूप से पुटी प्रगति 10 exacerbates कि प्रदर्शन किया।

हम आगे ओ benzamil, एक ENaC अवरोधक, के प्रशासन के प्रभाव का प्रदर्शनपुटी दीवार में चैनलों के एन गतिविधि। 4-सप्ताह पुरानी PCK चूहों वाहन या benzamil (15 मिलीग्राम / एमएल) युक्त पानी यथेच्छ पीने के साथ आपूर्ति की गई। उपचार के 12 सप्ताह के बाद जानवरों ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोसेस किया गया। पैच दबाना वाहन से अलग सिस्टिक monolayers पर और इलाज समूहों benzamil प्रदर्शन किया गया था। 3 शिखर झिल्ली से दर्ज ENaC गतिविधि के प्रतिनिधि वर्तमान निशान से पता चलता है। सारांश ग्राफ benzamil प्रशासन 0.32 ± 0.05 करने के लिए चैनल की गतिविधि में कमी आई है, जबकि औसत ENaC गतिविधि (एनपी ओ), नियंत्रण समूह के अल्सर में 0.91 ± 0.15 10 साल का था कि यह दर्शाता है। हम ARPKD में मूत्र प्रवाह 30 के साथ गुर्दे अल्सर पहुंचता है पीने के पानी में दिए गए benzamil (कई धुरी के आकार गुर्दे अल्सर 30 फार्म करने के लिए सीडी की उन्मादपूर्ण बढ़ाव द्वारा विशेषता) निष्कर्ष है कि। इस आशय benzamil पुटी तरल पदार्थ, contr से सोडियम अवरोध कम करने के लिए अनुमति देता है 10 cystogenesis को ibuting।

EGF मार्ग के अलावा, एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी) और अन्य purines भी अनुपयुक्त PKD मॉडल में और इस रोग के साथ रोगियों में ठीक किया जाता है कि एक महत्वपूर्ण पैराक्राइन संकेतन घटक के रूप में पहचान की गई। यह purinergic संकेतन ADPKD और ARPKD 31,32 दोनों दौरान cystogenesis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि सूचना मिली थी। PCK चूहों के पुटी कोशिकाओं पहले से कम बेसल प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है [सीए 2 +] मैं और के नुकसान के प्रवाह की मध्यस्थता [सीए 2 +] मैं एसडी चूहों 13 के स्वस्थ गैर फैली हुई संग्रह नलिकाओं की तुलना का संकेत है। इस p2 रिसेप्टर एगोनिस्ट CPK / CPK माउस 33 से निकाली गई पुटी गठन के इन विट्रो मॉडल में गुर्दे अल्सर के विकास के व्यवस्थित करना। उच्च एटीपी एकाग्रता ADPKD रोगियों 34 से और CPK / CPK चूहों 35 से सुसंस्कृत सिस्टिक गुर्दा epithelia से वातानुकूलित मीडिया में पित्ताशय तरल में पाया गया था।

_content "> हम बहिर्जात एटीपी प्रशासन के जवाब में कैल्शियम प्रवाह का परीक्षण किया। और 4 चित्र में सचित्र 10 माइक्रोन एटीपी। डेटा के आवेदन के बाद 10 माइक्रोन एटीपी के प्रभाव का पता चलता है पहले एसडी चूहों से PCK अल्सर और सामान्य cortical नलिकाओं कैल्शियम मापन के लिए अलग थे PCK चूहों की सिस्टिक नलिकाओं में दो अलग अलग दृष्टिकोण के साथ अध्ययन किया: चित्रा -4 ए एक मोनोक्रोमेटर से लैस एक epifluorescence सेटअप में 340 और 380 एनएम पर Fura-02:00 प्रतिदीप्ति तीव्रता का माप से पता चलता है, और चित्रा 4 बी कोंफोकल साथ Fluo-8 डाई धुंधला के पंजीकरण का प्रतिनिधित्व करता है माइक्रोस्कोपी। दोनों तकनीकों सिस्टिक उपकला 10 में एटीपी आवेदन करने के लिए कैल्शियम क्षणिक प्रतिक्रिया के समान कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व करने के बादपशु ठीक से anaesthetized और सर्जरी के लिए तैयार है, गुर्दे रक्त को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ प्लावित कर रहे हैं। फिर, गुर्दे, excised decapsulated, और सिस्टिक monolayers या गैर फैली हुई नलिकाओं एक stereomicroscope के तहत संदंश के साथ मैन्युअल अलग कर रहे हैं। गैर फैली हुई नलिकाओं विभाजित खुले रहे हैं अल्सर की आंतरिक सतह शिखर की ओर करने के लिए उपयोग करने के लिए खुला होगा के रूप में पित्ताशय उपकला जबकि micromanipulators द्वारा संचालित micropipettes के साथ।

चित्र 2
चित्रा 2: अलगाव और सिस्टिक और संग्रहण नलिका monolayers की तैयारी (ए) 16 सप्ताह पुरानी PCK चूहे से एक प्रतिनिधि गुर्दे टुकड़ा।। (बी) के पैच दबाना विश्लेषण या कैल्शियम इमेजिंग (60X) के लिए एक माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित कर एक गिलास को कवर चिप पर एक पित्ताशय monolayer। एक एसडी चूहे से अलग विभाजन के साथ (सी) ए सीएनटी / सीसीडी खंड। (

चित्र तीन
चित्रा 3: सिस्टिक उपकला में ENaC गतिविधि पर benzamil उपचार का प्रभाव। (ए) हौसले से 16 सप्ताह पुरानी PCK चूहों से अलग अल्सर की सेल संलग्न पैच में मापा ENaC गतिविधि के लिए प्रतिनिधि वर्तमान निशान पीने के पानी में benzamil के 12 सप्ताह दिलाई। इन पैच वी एच = वी पी = -40 एम वी के एक परीक्षण क्षमता पर आयोजित की गई। आवक ली + धाराओं नीचे हैं। धराशायी लाइनों एक 'सी' और 'ओ एन "बंद और खुले राज्यों को दर्शाने के साथ संबंधित वर्तमान स्थिति से संकेत मिलता है। (आंशिक रूप से अनुमति के साथ 10 से reproduced) मनाया ENaC गतिविधि (एनपी ओ) (बी) सारांश ग्राफ। * पी <0.05 veRSUs वाहन।

चित्रा 4
चित्रा 4: PCK चूहों के पित्ताशय की कोशिकाओं में कैल्शियम बाढ़ पर एटीपी के प्रभाव से पहले और 10 माइक्रोन एटीपी के आवेदन के बाद Fura-2 के साथ भरी हुई सिस्टिक monolayer के (ए) प्रतिनिधि छवियाँ।। PCK चूहों के सेल monolayer में कैल्शियम के स्तर पर एटीपी के प्रभाव का सारांश ग्राफ़ और एसडी संग्रहण वाहिनी (एन = 38 कोशिकाओं)। (बी) के पहले और Fluo-8 डाई के साथ भरी हुई सिस्टिक monolayer के 10 माइक्रोन एटीपी और सारांश ग्राफ के आवेदन के बाद intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया।

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Discussion

हम ARPKD की एक murine आनुवंशिक मॉडल से प्राप्त सिस्टिक उपकला monolayers के लिए यहां पारंपरिक पैच दबाना तकनीक और epifluorescence कैल्शियम इमेजिंग के आवेदनों का वर्णन किया। प्रोटोकॉल सबसे ज्यादा ध्यान अल्सर (प्रोटोकॉल खंड के चरण 1.5) के अलगाव के लिए और electrophysiological अध्ययन करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, जिनमें से तीन चरणों से मिलकर बनता है। इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं व्यापक प्रशिक्षण और धैर्य की आवश्यकता होती है, और पाठक एक बार में निराश नहीं होना चाहिए।

सबसे पहले, सबसे ज्यादा ध्यान पुटी monolayer के अलगाव की प्रक्रिया के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। तैयारी के इस भाग की कोशिकाओं की दृश्यता के लिए महत्वपूर्ण है एक गिलास चिप के लिए नमूना है और इसकी भी कुर्की की मोटाई के रूप में काफी मैनुअल कौशल और प्रभावों आगे काम की आवश्यकता है। पृथक पुटी दीवारों की मोटाई नमूना के विभिन्न भागों में बदलता है, और यह wor के लिए सुविधाजनक बड़ा monolayer के क्षेत्रों के साथ बड़े अल्सर पर ध्यान केंद्रित करने की सिफारिश की हैकश्मीर। नमूना साफ करने में मदद और monolayer का उपयोग करने के लिए, आसपास के ऊतकों को एक stereomicroscope के तहत संदंश के साथ खुली जाना चाहिए। यह तकनीक एक महत्वपूर्ण क्षेत्र गहराई और विच्छेदन के दौरान वस्तुओं की अलग आकार को समायोजित करने के लिए एक विस्तृत श्रृंखला में बढ़ाई बदलने के लिए एक क्षमता की विशेषता एक उच्च गुणवत्ता stereomicroscope के उपयोग का तात्पर्य है कि जोर दिया जाना चाहिए। विधि की एक और सीमा पैच दबाना और कैल्शियम इमेजिंग के रूप में इस तरह के अत्याधुनिक तकनीक इन तरीकों से परिचित कर्मियों की आवश्यकता है। हम वे अल्सर के समान उपकला monolayer फार्म के रूप में प्रारंभिक अनुभव ऐसे कॉर्टिकल एम 1 और medullar IMCD कोशिकाओं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध के रूप में वाहिनी सेल संस्कृतियों इकट्ठा करने पर प्राप्त किया जा सकता है कि सुझाव देते हैं।

हमारा दृष्टिकोण आयन चैनल गतिविधि और हौसले से पृथक ऊतकों की देशी वातावरण में [सीए 2 +] मैं स्तर को मापने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया का मुख्य लाभ singl के लिए नमूनों की है कि तैयारी हैई-चैनल विश्लेषण या, एंजाइमी उपचार की आवश्यकता यांत्रिक प्रक्रियाओं या अन्य संभावित हानिकारक कदम को नुकसान पहुँचाए नहीं है लोडिंग डाई। यह खारा में संदंश के साथ मैन्युअल रूप से प्रदर्शन और बड़े undamaged नमूनों प्रदान करता है। ऐसे नमूनों वर्णित तकनीकों के लिए ही इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। वास्तव में, अलग-थलग सिस्टिक उपकला शुद्ध ट्यूबलर कोशिकाओं की पतली फिल्म का प्रतिनिधित्व करता है और यह physiologically प्रासंगिक टिप्पणियों पैदा करता है जो वास्तविक समय के प्रयोगों के लिए एक मूल्यवान बरकरार वस्तु बनाता है, जो मूल निवासी monolayer गुण रखता है। अल्सर का अलगाव (वाहिनी नलिकाओं एकत्रित कॉर्टिकल के लिए यहां 38 में वर्णित है, के रूप में Dispase और collagenase साथ, उदाहरण के लिए) के लिए मुश्किल शोधकर्ता या सिस्टिक ऊतक की एक बड़ी राशि के लिए एक प्रक्रिया है, एक बार में एंजाइमी उपचार की आवश्यकता है लगता है इस्तेमाल किया जा सकता अलगाव की प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए। एंजाइमों, विशेष रूप से प्रोटिएजों के रूप में, इस उपचार प्रदर्शन करते हुए हालांकि, शोधकर्ता काफी आयन channe प्रभावित कर सकते हैं, बहुत सावधान रहना चाहिएरास 'गतिविधि या झिल्ली रिसेप्टर्स को नुकसान पहुंचा। यह इन झिल्ली प्रोटीन बहुत अच्छी तरह से जल्दी enzymatic उपचार 39,40 के तहत नीचा करने के लिए जाना जाता है, के रूप में, उदाहरण के लिए, purinergic सिगनल की पढ़ाई के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

इसके अतिरिक्त, सिस्टिक उपकला अन्य इस तरह के रंगों के साथ एक निश्चित monolayer के इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री या धुंधला जैसे उद्देश्यों, (जैसे rhodamine phalloidin), या कोई पता लगाने के लिए इस तरह के DAF-वित्त मंत्री के रूप इंट्रासेल्युलर पदार्थ मार्कर, साथ ताजा ऊतक लोड हो रहा है या करने के लिए विभिन्न रंगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन की निगरानी। यह पश्चिमी सोख्ता कुल गुर्दे lysates में उपस्थित गैर विशिष्ट कारकों के प्रभाव को खत्म करने के लिए पृथक सिस्टिक उपकला के शुद्ध अंश का उपयोग करने के लिए सुझाव दिया है। हम यह भी पित्ताशय उपकला इसी तरह यह भी ADPKD चूहों या न केवल ARPKD के विभिन्न मॉडलों के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं कि अन्य प्रजातियों से अलग है, लेकिन हो सकता है कि सुझाव देते हैं। हौसले से पृथक पुटी नमूनों नकारा नहीं जा सकता हैवे बेहतर अंग के भीतर सिस्टिक ऊतक के गुणों को बनाए रखने, और निस्संदेह इन विवो रोग प्रक्रियाओं के बारे में अधिक से उचित डेटा उपलब्ध कराने के रूप में आणविक जीव विज्ञान के लिए फायदे, सुसंस्कृत सिस्टिक कोशिकाओं की तुलना में दृष्टिकोण।

इस तकनीक का महत्वपूर्ण लाभ में से एक नियंत्रण ऊतकों के रूप में, सामान्य गैर फैली हुई ही गुर्दे, या एसडी चूहों नलिकाओं से नलिकाओं एकत्रित (PCK चूहों के साथ इन चूहों साझा आनुवंशिक पृष्ठभूमि) का उपयोग करने के लिए एक संभावना है। नेफ्रॉन खंडों में इसी प्रकार के पैच दबाना और कैल्शियम माप व्यापक रूप से कई प्रयोगशालाओं 41-43 में गैर सिस्टिक गुर्दे पर इस्तेमाल कर रहे हैं। निर्भर करता है आयन चैनल का प्रकार, पैच दबाना विधि के विभिन्न संशोधनों (पूरे सेल, अंदर बाहर, बाहर-बाहर) का इस्तेमाल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, ENaC और ROMK (गुर्दे बाहरी दिमाग़ी पोटेशियम चैनल) गतिविधि पूरे सेल विन्यास 44,45 द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। monoc साथ व्यापक क्षेत्र epifluorescence में प्रस्तावित Fura-2 कैल्शियम इमेजिंगhromator भी इस तरह के अन्य कैल्शियम रंगों के साथ confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण के रूप में कैल्शियम इमेजिंग के किसी भी अन्य इसी तरह के संशोधन के साथ किया जा सकता है। ये खुर्दबीन सिस्टम कम सस्ती कर रहे हैं, लेकिन उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रदान करते हैं और व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं। इसी दृष्टिकोण भी हौसले से पृथक केशिकागुच्छ 17,46,47 की podocytes में TRPC चैनलों गतिविधि और कैल्शियम संकेतन अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। Ilatovskaya एट अल। 46 तकनीकी में वर्णित के रूप में चित्रा 4 बी या Fluo4 / FuraRed फ्लोरोसेंट रंगों के साथ ratiometric कोंफोकल माप पर प्रदर्शन के रूप में लागू किया जा सकता है कि अन्य कैल्शियम इमेजिंग Fluo-8 के उपयोग में शामिल हैं, यह पैच दबाना और कैल्शियम इमेजिंग दोनों प्रदर्शन करने के लिए संभव है एक साथ एक ही सेल पर माइक्रोस्कोप दोनों setups के साथ सुसज्जित है यदि। इस प्रकार, वर्णित तकनीक लचीले ढंग वीं के अनुसार संशोधित किया जा सकता है, जो PKD के क्षेत्र में उच्च गुणवत्ता वाले टिप्पणियों के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है,अपने विशिष्ट अनुसंधान और उपकरणों की उपलब्धता के ई की जरूरत है। इसके अलावा, कैल्शियम इमेजिंग के विभिन्न संशोधनों 4B चित्रा पर प्रदर्शन के रूप में या Fluo-8 (Ilatovskaya एट अल। 46 में वर्णित है) Fluo4 / FuraRed फ्लोरोसेंट रंगों के साथ ratiometric कोंफोकल माप सहित यहां इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

लेखकों माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्लेन Slocum (विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज) और कोलीन ए Lavin (Nikon उपकरण इंक) को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस अध्ययन (एएस) के लिए R01 HL108880, (OPO करने के लिए) R01 DK095029 और (टीएसपी) के लिए K99 HL116603, (टीएसपी) के लिए नेशनल किडनी फाउंडेशन IG1724, (OPO करने के लिए) अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13GRNT16220002 और अनुदान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (डीवीआई करने के लिए) नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की ओर से बेन जे Lipps रिसर्च फैलोशिप।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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References

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चिकित्सा अंक 103 पैच दबाना पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग ARPKD ADPKD गुर्दे intracellular कैल्शियम Fura-2 नेफ्रॉन पुटी विकास polycystin
पैच दबाना और लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू हौसले से पृथक PKD उपकला के कार्यात्मक संपत्तियों को मॉनिटर करने के लिए
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,… More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

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