Summary
신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
다낭성 신장 질환 중 낭종 개시 및 확장은 관 모양의 세포 증식, 내강 유체 축적과 세포 외 기질 형성에 이상을 특징으로하는 복잡한 과정이다. 이온 채널 및 세포 내 칼슘 신호 전달의 활성은 관상 상피의 기능을 결정하는 중요한 생리적 파라미터이다. 우리는 갓 신장 낭종 분리 상피 단층 세포 내 칼슘 수준의 패치 - 클램프 기법 및 등록이 이온 채널 활성을 실시간으로 관찰하기에 적합한 방법을 개발 하였다. PCK 래트, 염색체 열성 다낭성 신장 질환 (ARPKD)의 유전 적 모델은, 이온 채널 및 칼슘 플럭스의 생체 외 분석을 위해 여기에 사용 하였다. 여기에 설명하는 하나의 채널 활동 및 세포 내 칼슘 역학을 낭성 단일 층 및 PCK 또는 일반 스프 라그 돌리 (SD) 쥐에서 비 넓혀 세관을 분리하고 모니터링하도록 설계 자세한 단계별 절차입니다.이 방법은 효소 처리를 필요로 갓 격리 상피 단층의 기본 설정에서 분석이 가능하지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 칼슘의 변화에 매우 민감하고 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성한다. 마지막으로, 고립 된 낭성 상피 더 항체 또는 염료, 각종 생화학 적 분석을위한 차 문화의 준비 및 정제 염색에 사용할 수 있습니다.
Introduction
이온 채널은 세포의 성장과 분화를 포함하여 많은 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 상 염색체 우성과 열성 다낭성 신장 질환 (각각 ADPKD과 ARPKD는) 관 상피 세포 기원의 신 유체로 채워진 낭종의 개발에 의해 특징 유전 질환이다. ADPKD는 polycystins 1 세포 증식 및 분화의 조절에 관여 2, 막 단백질을 코딩 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 발생된다. 그 자체로 또는 PKD1과 복잡한 PKD2 또한 칼슘 -permeable 양이온 채널 1로 작동합니다. PKHD1 유전자 부호화 fibrocystin (세뇨관 및 / 또는 상피의 극성의 유지에 관여 섬모 수용체 - 관련 단백질과 같은)의 돌연변이는 ARPKD 2 유전 자극이다. 낭종의 성장은 복잡한 현상을 방해 확산 3,4, 혈관 신생 (5), 탈분화 및 극성의 손실을 동반한다관 모양의 세포 6-8의 성만.
담낭 상피 세포에 결함이 재 흡수와 분비 증강은 루멘과 낭종 확장 9,10 유체 축적에 기여한다. 손상된 흐름 의존성 [Ca를 2+] I 시그널링도 PKD 11-15 중 cystogenesis 연결되었다.
여기서, 우리는 하나의 채널 활동 및 PCK 래트로부터 단리 낭성 상피 세포 단층의 칼슘 농도의 패치 클램프 측정하기에 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 성공적으로 상피 나 + 채널 (ENAC) 10의 활동의 특성을 우리가 적용하고 [칼슘 2 +] 나는 칼슘 -permeable TRPV4 및 퓨린 신호 캐스케이드 (13)에 의해 유도되는 과정을 의존성.
이러한 연구에서 우리는 PCK 래트, PKHD1 유전자의 자연 돌연변이에 의한 ARPKD의 모델을 사용 하였다. PCK 변형은 originall의했다스프 라그 - 돌리 (SD) 래트 16함으로써 SD 래트 PCK 균주와 비교를위한 적절한 제어로 사용되는 Y로부터 유도. 그 결과, 동일한 PCK 래트로부터 단리 SD 래트 네프론 세그먼트 및 비 팽창 된 포집 관 모두 낭성 상피 실험 두 가지 비교 군으로 사용할 수.
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Protocol
아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 휴스턴 텍사스 건강 과학 센터의 대학의 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 도 1은 조직의 분리 및 처리 과정의 주요 단계를 설명한다. 간단히, PCK 또는 SD 쥐에서 신장 건강이 아닌 다이얼 세관 또는 낭종에서 하나 덕트를 수집 상피 단일 층의 수동 분리를 위해 사용된다. 여기에서 우리는 4-16 주 된 PCK 쥐 10,13에서 신장을 공부했다.
1. 신장 낭종과 연결 세관 (CNT) /의 분리 수집 덕트 (CD) 세그먼트
- 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. 동물은 계속적으로 적절한 제작을 위해 모니터링되어야마취의 VEL. 안정적인 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다.
- 개복술을 수행하고 복부 대동맥 (17)를 통해 인산염 완충 식염수 (PBS)와 신장을 세척하십시오.
- 폴리에틸렌 튜브 카테터 (PE50)을 준비하고 PBS로 가득 주사기 펌프에 연결합니다. 측면 및 장간막과 복강 동맥 분기와 하행 대동맥에 액세스하려면 면봉으로 복부 장기를 이동하는 측면에서 복부에 걸쳐 가로 복부 절개를 한 후, 원격 교육 알바를 따라 피부와 복부 벽을 잘라. 자신의 건조를 방지하기 위해 추가 과정에서 따뜻한 식염수와 내부 장기를 적셔.
- 하나 장간막과 복강 동맥 주위에 합자 (# 1)과 다른 합자 (# 2) 다이어프램에서 대동맥 주위 (넥타이를하지 않는)을 놓습니다. 조심스럽게 분리. 얇은 집게로 주위 결합 조직을 해부하고 두 합자를 배치 무디게하여 abdominalis ~ 3왼쪽 신장 동맥 아래 MM (# 3)과 장골 동맥의 분기점 위 (# 4).
- 합자 # 4 타이 왼쪽 신장 동맥과 합자 # 3 사이의 대동맥 주위 혈관 클램프를 연결합니다. 단단히 카테터를 해결하기 위해 합자 # 3를 사용, 클램프 및 대동맥을 카테 테르를 꽂다하는 합자 # 4 사이에 절개를합니다.
- 클램프를 풀고 혈액 펄스가 올바른 설치를 위해 카테터에 볼 수 있는지 확인하십시오. 6 mL의 속도로 관류 시작 / 분, 합자 # 1, # 2를 묶어, 좌측 신장의 혈관을 절단. 장기가 완전히 희게 될 때까지 1 ~ 2 분 동안 세척을 계속합니다.
- 가위 신장 혈관, 요도 주변 결합과 지방 조직을 절단하는 것은 신장을 수집. 그리고 신장 캡슐에서 짧은 눈물을하고이를 디 캡슐하기 위해 신장을 떼어. 얼음처럼 차가운 PBS로 신장을 놓습니다. 안락사는 개흉술에 의해 확인된다.
- 폴리 -L- 라이신 코팅 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비합니다. 커버 GLA를 잘라다이아몬드 연필과 장소 각 유리 칩에 0.01 % 멸균 여과 폴리 -L- 라이신 솔루션의 약 20 μL와 SS. 생리 및 해부 용 시계 포셉 두 쌍을 준비합니다.
- 1-2mm 두께 ~의 조각으로 정면 평면을 따라 면도날과 신장을 잘라. 실체 현미경에서 조각 중 하나를 놓습니다. 조직의 분리 빙냉 염수에서 수행되어야한다.
- 둥근 모양의 캐비티 (그림 2A)와 같은 실체 현미경 하에서 낭종을 찾습니다; 그 벽은 자주 증식 혈관의 저명한 네트워크를 포함하고있다. 사용 뾰족한 집게 단층 영역을 얻기 위해 가능한 한 얇은 낭종 내부 상피층 해부. 폴리 -L- 라이신으로 덮여 유리 칩에 연결합니다. 스티커 폴리 -L- 라이신 표면은 연구자가 단단히 유리의 내부 낭종 층을 배치 할 수 있습니다. 피펫 (그림 2B)에 대한 액세스를 제공하기 위해 혀끝의면을 위로하여 낭종을 노출.
- PCK 또는 SD 쥐 아이를 사용하여비 팽창 된 탄소 나노 튜브 / CCDsegments 18 ~ 21의 분리를위한 유두를 포함 네이 중앙 조각.
참고 : 유두 조직이 피질 이상과 집게로 유두 관 밴드를 잡고 슬라이스가 얇은 분야로 절단 할 수있다 축 반경 방향을 따라 찢어보다 내구성이 있습니다. 개별 세관은 볼 수 있으며 커버 유리 칩 상에 배치 될 인출 할 수있다. - , 분기점으로 근위 세뇨관과 큰 눈에 띄게 보이는 세포 (그림 2C)보다 높은 투명성을 탄소 나노 튜브 / CCD 세분을 확인하십시오. 마이크로 피펫을 구동하기에 적합한 미세 조작기를 구비 한 현미경을 첨부 tubules와 커버 유리 칩을 배치했다. 유리 가장자리를 선명 가능한 Micropipette에게 분할 오픈 세관를 사용하여 연결하면 (그림 2D) 혀끝의 표면에 액세스 할 수 있도록합니다.
2. 단일 채널 패치 클램프 전기 생리학
- 욕 용액 패치 - 클램프 챔버를 채우고 커버 유리 칩을 전송할실에 격리 된 조직과. 패치 클램프 Micropipette과 신뢰성에 셀 (세포 부착) 측정을 위해 7 ~ 10 MΩ의 저항이 있는지 확인합니다.
- 세포 부착 측정을 위해 20 배 증폭기 이득 비율을 설정하고 여덟 폴 베셀 필터가 300 Hz에서 전류를 저역 통과. ENAC 채널 모니터링의 경우, 밀리미터에서 목욕 솔루션, 사용 : 150의 NaCl, CaCl2를 1, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4); 피펫 : (140)의 LiCl, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4).
- 세포 부착 모드 (10)에 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 상피 단층의 셀을 선택하고 혀끝 막에 피펫을 접근. 부드러운 흡입을 적용하여 피펫 및 세포막 사이에 고 저항 시일을 형성한다. 고 저항 기가 옴 시일이 형성되면, 유지 전위에서 갭이없는 프로토콜은 관심 채널의 모니터링 활동을 시작한다.
- 기가의 저장 간격이없는 단일 채널 현재 데이터이후 분석을위한 옴 씰. 일반적으로 패치 - 클램프 (18)로 공급되는 셋업 소프트웨어 패키지를 사용하여 상기 채널 이벤트를 분석. 채널의 평균 열린 확률 N이 패치 P O 활성 채널의 개수를 의미 여기서 NPO 같은 채널 활성을 계산한다.
참고 : 30 분 동안 패치 클램프 실험에 고립 된 낭종 또는 세관을 사용합니다.
상피 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 3 비례 표면 형광 측정
- DMSO에 용해 5 밀리미터의 Fura - 오전 2시을 사용합니다. 각각 500 μL 원뿔 튜브로 나누어지는 원액 (약 10 μL). 최대 6 개월 -20 ℃에서 냉장고에 빛과 상점에서 보호합니다.
- PSS에 30 ~ 40 분 동안 고립 된 낭종 및 분할 오픈 세관을 품어 (MM의 : (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2의 pH 7.35에서 10 HEPES) 5 μM의 Fura-2 오전 염료 0.0을 포함5 % 플루로 닉 산은 아세 톡시 메틸 에스테르를 분산 도움이됩니다. 이를 위해, 로딩 칵테일을 함유하는 3.5 cm 접시 장소 조직, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 천천히 진탕 배양한다.
- 부화 후 PSS를 청소하고 더 표면 형광 이미징을 수행하기 위해 현미경으로 조직을 배치하는 미디어를 포함하는의 Fura-2 오전 변경합니다.
- CCD 카메라와 필터 휠을 갖추고 안정적인 광원 (단색화 장치)를 켜고 (각 필터의 위치는 필터가 호출 될 때마다 선택된 자체 감쇠 레벨과 연관 될 수있다).
- 밝은 분야에서 조직을 찾을 수 있습니다. 형광 신호의 검출에 전환 신호의 포화를 피하기 위해 감광 필터 및 램프 전력을 이용하여, 광원의 강도를 조정한다.
- 0.125 Hz의 이상의 주파수 380분의 340 nm에서 비율 계량 여기에 조직 샘플에서의 Fura-2 오전 형광을 모니터링합니다. 적절한 resolu위한 40 × / NA 1.3 또는 유사한는 대물 렌즈를 사용하여기 이미지입니다.
- 화상 처리 및 계산 이미지 시퀀스를 가져. 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오. 여러 관심 지역 (단일 낭종 세포 또는 낭성 조직의 선택 영역)를 선택하고 원하는 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (340 및 380 ㎚)에 대한 강도 값을 계산; 각 데이터 포인트에서 빼기 배경 강도 값.
- 각 시점의 Fura-들어 오전 2시 340-380 채널의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각 지역의 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간의 변화와 계산 평균 / SE 값.
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Representative Results
cystogenesis 잠재적 ENAC 개입은 ARPKD 뮤린 모델 및 조직 배양 물에서 26-28 22-25 PKD 진행 비정상적인 나트륨 재 흡수에서 시그널링 중단 표피 성장 인자 (EGF)를 관찰 여러 연구에 의해 입증되었다. 예를 들어,은 등 Veizis. 아밀로 라이드 - 민감성 나트륨 + 흡수는 ARPKD (29)의 비 orthologous BPK 마우스 모델에서 CD 세포에서 감소되는 것으로 나타났다. 우리는 최근 낭종에 손상 나트륨과 수분 재 흡수가 cystogenesis 10 악화에 중요한 요소임을 보여 주었다. 특히, 우리는 전기 생리 및 면역 조직 화학적 분석을 고용 낭종이 무딘 나트륨 재 흡수를 발휘하는 것으로 나타났습니다. 약리학 적 접근 방식은 선택적 ENAC 봉쇄가 현저하게 낭종 진행 (10)을 악화 것을 보여 주었다.
우리는 추가로 O 자밀, ENAC 차단제의 투여의 효과를 입증낭종 벽에 채널 N 활동. 4 주 된 PCK 쥐가 차량이나 자밀 (15 ㎎ / ㎖)을 함유하는 물 광고 무제한 마시는 함께 제공되었다. 처리 12 주 후, 동물은 상기 프로토콜에 따라 처리 하였다. 패치 클램프는 차량에서 분리 낭성 단일 층과 치료 그룹 자밀 하였다. 3 혀끝 막에서 기록 ENAC 활동의 대표 현재 흔적을 보여줍니다. 요약 그래프 자밀 투여 0.32 ± 0.05로 채널의 활성이 감소하는 반면, 평균 ENAC 활동 (NP 오)는, 대조군 낭종에 0.91 ± 0.15 10임을 보여준다. 우리는 ARPKD에 소변 흐름 (30) 신장 낭종에 도달 식수에 주어진 자밀 (다수의 스핀들 모양의 신장 낭종 (30)을 형성하기 위해 CD를 황홀 할 정도로 팽창을 특징으로) 결론. 이 효과는 자밀가 낭종 유체 제어 방식에서 나트륨의 재 흡수를 감소 할 수 있습니다 10 cystogenesis하는 ibuting.
EGF 경로 이외에, 아데노신 삼인산 (ATP) 및 다른 퓨린은 부적절 PKD 모델에서,이 질환을 가진 환자들에서 변조 임계 분비 신호 성분으로 확인되었다. 이 퓨린 및 시그널링 ADPKD ARPKD 31,32 둘 중에 cystogenesis에 중요한 역할을하는 것이보고되었다. PCK 쥐의 낭종 세포가 이전에 낮은 기저을 전시하는 것으로 나타났다 [칼슘 2 +] i와 손실 흐름 매개 [칼슘 2 +] 내가 SD 쥐 13의 건강한 비 넓혀 수집 덕트에 비해 시그널링. P2 수용체 작용제 CPK / CPK 마우스 (33)로부터 유도 낭종 형성의 시험 관내 모델에서 신장 낭종 개발을 변조한다. 높은 ATP 농도는 ADPKD 환자 (34)로부터 및 CPK / CPK 마우스 (35)에서 배양 낭성 신장 상피 세포에 의해 조절 미디어에 낭포 성 액체에서 발견되었다.
_content "> 우리는 외인성 ATP 관리에 대한 응답으로 칼슘의 흐름을 테스트했다. 그림 4에 도시 된 10 μm의 ATP. 데이터의 적용 후 10 μm의 ATP의 효과를 공개하기 전에 SD 쥐에서 PCK 낭종 정상 대뇌 피질의 덕트는 칼슘 측정을위한 분리 하였다 PCK 쥐 낭성 세뇨관에서 두 가지 다른 접근법으로 연구 :도 4a는 단색화 장착 표면 형광 설정에서 340 및 380 nm에서의 Fura-오전 2시 형광 강도의 측정을 도시하고,도 4b는 촛점과 FLUO-8의 염료 염색 등록을 나타낸다 현미경. 두 기술은 낭포 성 상피 10 ATP 응용 프로그램에 칼슘 과도 응답의 비슷한 반응 속도를 보여줍니다.
그림 1 :. 실험 프로토콜의 도식 표현 후동물이 제대로 마취와 수술에 대한 준비가되어, 신장은 혈액을 제거하는 PBS로 플러시됩니다. 그런 다음, 신장, 절제 디 캡슐화, 낭성 단일 층 또는 비 넓혀 세관은 실체 현미경 아래 집게 수동으로 분리되어있다. 비 팽창 세관은 분할 열려있는 낭종의 내부 표면이 혀끝의 측면에 액세스 할 수 있도록 개방하는 것처럼 낭성 상피 반면 미세 조작기에 의해 구동 Micropipette과 함께.
그림 2 : 분리 및 낭포 성 및 수집 덕트 단일 층의 준비 (A) 16주 된 PCK 쥐의 담당자 신장 슬라이스.. (B) 패치 - 클램프 분석 또는 칼슘 이미징 (60X)에 대해 현미경으로 전송 커버 유리 칩 낭성 단층. SD 쥐에서 분리 분기와 (C) 탄소 나노 튜브 / CCD 세그먼트. ( 
그림 3 : 담낭 상피 ENAC 활동에 자밀 치료의 효과. (A) 갓 16주 된 PCK 쥐에서 분리 된 낭종의 세포 부착 된 패치로 측정 ENAC 활동에 대한 대표 현재 흔적 물을 마시는 자밀 12 주 투여. 이러한 패치는 V의 H = -V P = -40 MV의 테스트 가능성에서 개최되었다. 내향 리 + 전류는 하향된다. 점선은 "C"와 "O n을"폐쇄 및 개방 상태를 나타내는과 함께 각각의 현재 상태를 나타냅니다. (부분적으로 허가 (10)으로부터 재생) 관찰 ENAC 활동 (순이익 O)의 (B) 요약 그래프. * P <0.05했습니다rsus 차량. 
그림 4 : PCK 쥐의 낭성 세포에서 칼슘 유입에 ATP의 효과 전에 10 μM의 ATP의 적용 이후의 Fura-오전 2시로드 낭성 단층의 (A) 대표 이미지.. PCK 쥐 세포 단층에서 칼슘 농도에 대한 ATP의 효과를 요약 한 그래프 및 SD 집합관 (N = 38 세포). (B) 전후 FLUO-8의 염료 로케이션 낭성 단층의 10 μM의 ATP 및 요약 그래프의인가 후에 세포 내 칼슘 응답.
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Discussion
우리는 ARPKD의 쥐의 유전자 모델에서 파생 된 담낭 상피 단층 여기에 기존의 패치 클램프 기술과 표면 형광 칼슘 이미징의 응용 프로그램을 설명했다. 프로토콜은 가장 관심 낭종 (프로토콜 부의 단계 1.5)의 단리 및 전기 생리 학적 연구에 지불되어야하는 세 단계로 구성된다. 이러한 주요 절차는 광범위한 훈련과 인내를 필요로하고, 독자는 한 번에 좌절해서는 안됩니다.
우선, 가장 관심 낭종 단층의 절연 처리를 기울여야한다. 준비의이 부분은 세포의 가시성 중요하다 유리 칩의 표본과도 첨부의 두께가 상당히 매뉴얼 기술과 영향 추가 작업을 필요로한다. 격리 된 낭종 벽의 두께는 시편의 다른 부분에서 변화, 그것은 법과 편리 큰 단층 지역에 큰 낭종에 집중하는 것이 좋습니다K. 시편을 청소 도움이 단층에 액세스하려면, 주변 조직은 실체 현미경에서 집게로 벗겨해야합니다. 이는 기술 분야의 상당한 깊이 절개 동안 다양한 크기의 객체를 수용하기 위해 다양한 배율을 변경하는 능력을 특징으로하는 고품질의 입체의 사용량을 의미하는 것이 강조되어야한다. 방법의 다른 제한은 패치 클램프 칼슘 촬상 같은 정교한 기술이 이러한 방법에 익숙 인원을 필요로한다는 것이다. 우리는 그들이 낭종 유사한 상피 단층을 형성하고, 최초 경험은 M1 및 피질 세포 medullar IMCD 시판 같이 덕트 세포 배양 수집에 얻을 수있는 것을 시사한다.
우리의 접근 방식은 이온 채널의 활성과 갓 고립 된 조직의 네이티브 환경에서 [칼슘 2 +] 나는 수준을 측정 허용한다. 이 절차의 가장 큰 장점은 자장하게하기위한 표본의 준비입니다E 채널 분석 또는 효소 처리를 필요로 기계적 절차 또는 다른 잠재적으로 해로운 단계를 손상하지 않는로드를 염색. 그것은 식염수에 집게와 함께 수동으로 수행하고 큰 손상되지 않은 표본을 제공한다. 이러한 시험편 기재된 기술에도 이용할 수있다. 사실, 고립 된 낭성 상피 순수 관 세포의 박막을 대표하고 생리 학적으로 관련 관찰을 생산하고 실시간 실험을위한 가치있는 그대로 개체를 만드는, 기본 단층의 특성을 유지한다. 낭종의 분리는 (덕트 세관를 수집하는 대뇌 피질 여기 38 설명 된 바와 같이, 디스 파제과 콜라겐으로, 예를 들어) 하드 연구원 또는 낭포 조직의 많은 양을위한 절차가 한 번에 효소 처리를 필요 것 같으면 사용할 수 있습니다 분리 프로세스를 단순화한다. 효소, 특히 단백질 분해 효소로,이 처리를 수행하는 동안 그러나, 연구원은 상당히 이온 채널을 활성화에 영향을 미칠 수있는, 매우 조심해야한다LS '활동 또는 막 수용체를 손상. 이는이 막 단백질은 매우 잘 신속 효소 처리 39,40 하에서 분해하는 것으로 알려진 바와 같이, 예를 들면, 퓨린 시그널링의 연구에 매우 중요하다.
또한, 낭성 상피 다른 염료와 고정 된 단분자막 면역 또는 얼룩 등의 목적으로, (예를 들어 로다 민 팔로이 딘), 또는 NO 검출 이러한 DAF-FM과 같은 세포 내 물질 마커와 신선한 조직 로딩 또는 각종 염료를 사용할 수있다 반응성 산소 종의 생성을 감시한다. 그것은 서양 블롯 총 신장 용 해물에 존재하는 비 특정 요인의 영향을 제거하기 위해 고립 된 낭성 상피의 순수한 부분을 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 담낭 상피 세포 유사 또한 ADPKD 마우스 나뿐만 아니라 ARPKD의 다양한 모델의 연구에 사용할 수있는 다른 종으로부터 분리 할 수 있지만 것이 좋습니다. 갓 격리 낭종 표본은 부정 할 수없는이더 나은 기관 내의 낭성 조직의 특성을 유지하고, 의심 할 여지없이 생체 질병 과정에 관한 더 많은 데이터를 제공 정당화으로 분자 생물학 용 이점은 낭성 세포 배양에 비해 접근한다.
이 기술의 중요한 장점 중 하나는 제어 조직으로, 정상적인 비 팽창 된 동일한 신장, 또는 SD 래트의 세뇨관에서 덕트를 수집 (PCK 래트와 이러한 쥐 주 유전 배경)을 사용하는 가능성이다. 네프론 세그먼트에 비슷한 패치 클램프 및 칼슘 측정은 널리 많은 실험실 41-43 비 낭성 신장에 사용된다. 따라서, 이온 채널 타입 패치 - 클램프 방법의 다른 변형은 (전체 세포 내부 아웃 외부 아웃)이 사용될 수있다; 예를 들어, ENAC 및 ROMK은 (신장 수질 외측 칼륨 채널) 활성은 전체 셀 구성 44,45 의해 평가 될 수있다. monoc 넓은 필드 표면 형광의 제안의 Fura-2 오전 칼슘 이미징hromator은 또한 다른 칼슘 염료 촛점 또는 이광자 현미경 분석 칼슘 촬상 임의의 다른 유사한 변형으로 수행 될 수있다. 이 현미경 시스템은 덜 저렴하지만 높은 품질의 영상을 제공하고, 넓은 필드 현미경보다 더 민감하다. 유사한 접근은 갓 절연 17,46,47 사구체의 족 세포에 TRPC 채널 활동 및 칼슘 신호 전달을 연구하기 위해 적용 하였다. Ilatovskaya 외. 46 기술적에 기재된 바와 같이도 4b 또는 Fluo4 / FuraRed 형광 염료 비율 적 공 초점 측정에서 입증 된 바와 같이 적용 할 수있는 다른 칼슘 이미징 FLUO-8의 이용을 포함하는, 그 패치 - 클램프 칼슘 이미징을 모두 수행 할 수있다 동시에 동일한 셀에 현미경은 모두 설정이 장착 된 경우. 따라서, 설명 된 기술은 유연 번째에 따라 수정 될 수 PKD 분야에서 고품질 관측 가능한 방식이며,특정 연구 장비의 가용성 전자해야합니다. 또한, 칼슘의 이미징 다양한 변형도 4b에 설명 된대로 또는 FLUO-8 (Ilatovskaya 외. (46)의 설명 참조) Fluo4 / FuraRed 형광 염료 비율 적 공 초점 측정을 포함하여 여기에서 사용될 수있다.
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Acknowledgments
저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트 Inc의)에 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는 (AS에) R01 HL108880 (OPO에) R01 DK095029과 (TSP에) K99 HL116603 (TSP에) 국립 신장 재단 IG1724 (OPO에) 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13GRNT16220002 및 부여 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다 (DVI에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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