Summary
Canali ionici espressi in renale tubulare svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia del rene policistico. Qui si descrive protocolli sperimentali utilizzati per eseguire patch-clamp analisi e di livello di calcio intracellulare misure in cistico appena isolato da reni di roditori.
Abstract
Cisti di iniziazione e di espansione durante la malattia del rene policistico è un processo complesso, caratterizzata da anomalie nella proliferazione delle cellule tubulari, accumulo di liquidi luminale e la formazione della matrice extracellulare. Attività di canali ionici e di segnalazione intracellulare di calcio sono parametri fisiologici fondamentali che determinano le funzioni di epitelio tubolare. Abbiamo sviluppato un metodo adatto per l'osservazione in tempo reale dell'attività canali ionici con la tecnica patch-clamp e registrazione di Ca2 + intracellulare in monostrati epiteliali livello appena isolate da cisti renali. Ratti PCK, un modello genetico di autosomica recessiva rene policistico (ARPKD), sono stati utilizzati qui per ex vivo l'analisi dei canali ionici e del flusso di calcio. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo progettato per isolare monostrati cistica e tubuli non dilatata da PCK o normali Sprague Dawley (SD) ratti, e monitorare l'attività a canale singolo e intracellulari di Ca 2+ dinamiche.Questo metodo non richiede trattamento enzimatico e consente l'analisi in un ambiente nativo di fresco isolato monostrato epiteliale. Inoltre, questa tecnica è molto sensibile alle variazioni intracellulari di calcio e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise. Infine, isolato cistico può essere ulteriormente utilizzato per la colorazione con anticorpi o coloranti, preparazione di colture primarie e di purificazione per i vari saggi biochimici.
Introduction
Canali ionici svolgono un ruolo significativo in molte funzioni fisiologiche, tra cui la crescita cellulare e la differenziazione. Malattie autosomiche dominanti e recessivi policistiche renali (ADPKD e ARPKD, rispettivamente) sono malattie genetiche caratterizzate dallo sviluppo di cisti renali piene di liquido di origine tubulare delle cellule epiteliali. ADPKD è causata da mutazioni di PKD1 o PKD2 geni che codificano policistine 1 e 2, proteine di membrana coinvolte nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare. PKD2 da solo o come un complesso con PKD1 funzionare anche come Ca 2+ canale cationico -permeable 1. Le mutazioni del gene che codifica PKHD1 fibrocistina (una proteina recettore simil-cilia associata coinvolte nella tubulogenesi e / o manutenzione di polarità di epitelio) sono l'impulso genetico di ARPKD 2. Crescita delle cisti è un fenomeno complesso accompagnato da proliferazione disturbato 3,4, angiogenesi 5, dedifferenziazione e la perdita di polarilità di cellule tubulari 6-8.
Riassorbimento difettoso e la secrezione aumentata in cistico contribuiscono all'accumulo di liquidi nel lume e cisti espansione 9,10. Flusso-dipendente alterata [Ca 2+] i segnalazione è stata anche legata alla cystogenesis durante PKD 11-15.
Qui, si descrive un metodo adatto per misure patch-clamp di attività singolo canale e intracellulari di Ca 2+ livelli in monostrati epiteliali cistiche isolati da ratti PCK. Questo metodo è stato applicato con successo da noi per caratterizzare l'attività del canale epiteliale Na + (ENaC) e 10 [Ca 2+] i indotti da processi -dipendente Ca 2+ TRPV4 -permeable e purinergica cascata di segnalazione 13.
In questi studi abbiamo utilizzato topi PCK, un modello di ARPKD causata da una mutazione spontanea nel gene PKHD1. Il ceppo PCK era originally derivate da ratti 16 ratti così SD sono utilizzati come controllo appropriato per il confronto con il ceppo Sprague-Dawley PCK (SD). Di conseguenza, entrambi i ratti nefrone SD e condotti non dilatato raccolta isolati da ratti stesso PCK possono servire come due diversi gruppi di confronto per esperimenti su cistico.
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Protocol
Le procedure sperimentali descritte qui di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Animal Istituzionale presso il Medical College del Wisconsin e l'Università del Texas Health Science Center a Houston ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Figura 1 illustra le fasi principali di isolamento tessuti e procedura di lavorazione. In breve, reni da PCK o SD ratti sono utilizzati per l'isolamento manuale di monostrati epiteliali di collettori sia da tubuli o cisti non-composto in buona salute. Qui abbiamo studiato reni da 4-16 settimane di età ratti PCK 10,13.
1. Isolamento di renali Cisti e Tubules Collegamento (CNT) / dotti collettori (CD) Segmenti
- Anestetizzare animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato level dell'anestesia. Stabile respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
- Eseguire laparotomia e lavare i reni con tampone fosfato salino (PBS) attraverso l'aorta addominale 17.
- Preparare un catetere tubo di polietilene (PE50) e collegarlo ad una pompa siringa riempita con PBS. Tagliare la pelle e la parete addominale lungo la linea alba, poi fare una incisione addominale trasversale attraverso l'addome da un lato all'altro e spostare gli organi addominali con tamponi di cotone per ottenere l'accesso alla aorta discendente con ramificazione mesenterica e celiaci arterie. Inumidire gli organi interni con soluzione salina caldo durante ulteriori procedure per impedire la loro secchezza.
- Mettere una legatura (# 1) attorno ai mesenterica e celiaci arterie e un altro legature (# 2) intorno all'aorta sotto il diaframma (non tie). Separare delicatamente a. abdominalis da smussare sezionare tessuti connettivi intorno ad esso con una pinza sottile e mettere due legature ~ 3mm sotto l'arteria renale sinistra (# 3) e al di sopra della biforcazione iliaca (# 4).
- Legare la legatura # 4 e collegare un morsetto nave intorno all'aorta tra l'arteria renale sinistra e legature # 3. Fare un'incisione tra il morsetto e legature # 4 per cateterizzare l'aorta, utilizzare la legatura # 3 per fissare saldamente il catetere.
- Rilasciare il morsetto e fare in modo che l'impulso di sangue è visibile nel catetere per garantire una corretta installazione. Inizia perfusione ad una velocità di 6 ml / min, cravatta legature # 1 e # 2, e tagliare la vena renale sinistra. Continuare a lavare per 1-2 minuti fino a quando gli organi sono completamente scottati.
- Tagliare i vasi sanguigni renali, uretra e circostanti tessuti connettivi adiposi e con le forbici per raccogliere i reni. Poi fare un breve strappo in capsula renale e sbucciare le reni per decapsulate loro. Posizionare i reni in PBS ghiacciato. L'eutanasia è confermata da una toracotomia.
- Preparare 5 x 5 mm chip vetro coperchio rivestito con poli-L-lisina. Tagliare una gla copertinass con una matita diamante e posto circa 20 ml di 0,01% sterile soluzione filtrata Poly-L-lisina su ogni chip vetro. Preparare salina e due paia di pinze orologeria per la dissezione.
- Tagliare i reni con una lametta lungo il piano frontale in fette di ~ 1-2 mm di spessore. Mettere una delle fette sotto uno stereomicroscopio. Isolamento di tessuti dovrebbe essere fatto in soluzione salina ghiacciata.
- Individuare cisti allo stereomicroscopio come cavità rotondo-figura (Figura 2A); le loro pareti contengono spesso rete importante di vasi sanguigni proliferato. Uso pinze punta fine sezionano lo strato epiteliale interna di una cisti più sottile possibile per ottenere una zona monostrato. Attaccare ad un chip di vetro rivestito con poli-L-lisina. Appiccicoso superficie Poly-L-lisina permette al ricercatore di posizionare saldamente lo strato cisti interna su vetro. Esporre la cisti con il lato apicale per fornire l'accesso alle pipette (Figura 2B).
- Utilizzare PCK o ratto SD bambinofette centrali ney contenenti papilla per l'isolamento di non dilatate CNT / CCDsegments 18-21.
NOTA: i tessuti papillari sono più durevoli di corteccia e tenendo fasce tubolari papillari con una pinza e strappando lungo l'asse radiale fetta può essere scisso in settori sottili. Tubuli individuali sono visibili e possono essere estratte per essere immessi sul chip di vetro di copertura. - Identificare i segmenti CNT / CCD da biforcazioni, una maggiore trasparenza di tubuli prossimali e grandi cellule prominente visibili (Figura 2C). Posizionare il chip vetro di copertura con tubuli collegati al microscopio equipaggiato con micromanipolatori adatti per micropipette guida. Utilizzando micropipette taglienti tubuli split-aperti e fissare i bordi al vetro per rendere la superficie apicale accessibili (Figura 2D).
Elettrofisiologia 2. Single Channel Patch-clamp
- Riempire la camera del patch-clamp con soluzione del bagno e trasferire il chip vetro di coperturacon tessuti isolati alla camera. Assicurarsi che le micropipette patch-clamp hanno una resistenza di 7-10 MW per misurazioni affidabili (cella-attached) su celle.
- Per le misure di cella-attached, impostare il rapporto di guadagno dell'amplificatore a 20x e passa-basso le correnti a 300 Hz, da un filtro a otto poli Bessel. Per il monitoraggio canali ENaC, utilizzare una soluzione del bagno, in mm: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipetta: 140 LiCl, 2 MgCl 2 e 10 HEPES (pH 7,4).
- Condurre un esperimento di patch-clamp convenzionale in una modalità cella-attached 10. Selezionare una cella nel monostrato epiteliale e avvicinare la pipetta alla membrana apicale. Formare una guarnizione ad alta resistenza tra la pipetta e la membrana cellulare applicando aspirazione delicata. Una volta che un ad alta resistenza di tenuta gigaohm è formato, un protocollo senza gap ad un potenziale in possesso deve essere avviato un'attività di monitoraggio del canale di interesse.
- Dati del canale unico negozio gap-liberi corrente da gigaGuarnizioni Ohm per successive analisi. Analizzare gli eventi canale utilizzando un pacchetto software generalmente fornito con configurazioni di patch-clamp 18. Calcolare canale attività come NpO dove N indica il numero di canali attivi nella patch e P o è probabilità media aperta dei canali.
NOTA: Utilizzare le cisti isolate o tubuli in esperimenti di patch-clamp per non più di 30 min.
3. Raziometrico epifluorescenza misurazioni della concentrazione intracellulare di calcio nelle cellule epiteliali
- Utilizzare 5 mM Fura-02:00 sciolto in DMSO. Soluzione Aliquota magazzino in tubi conici singoli 500 microlitri (circa 10 ml). Proteggere dalla luce e conservare in freezer a -20 ° C per un massimo di sei mesi.
- Incubare le cisti isolate e tubuli spaccatura-aperto per 30-40 minuti a PSS (in mm: 145 NaCl, KCl 4.5, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 e 10 HEPES a pH 7,35) contenenti 5 mM Fura-02:00 colorante e 0.05% di acido Pluronic per aiutare disperdere le esteri acetossimetil. Per questo, posto tessuti del piatto 3.5 cm contenente loading cocktail, proteggere dalla luce e incubare su un agitatore lento a temperatura ambiente.
- Cambia Fura-02:00 contenenti supporti per pulire PSS dopo l'incubazione e posizionare il tessuto al microscopio per eseguire ulteriori immagini epifluorescenza.
- Accendere camera CCD e luce stabile (sistema monocromatore) dotata di ruota portafiltri (ogni posizione del filtro può essere associato ad un proprio livello di attenuazione, selezionato ogni volta che il filtro è chiamato).
- Trova il tessuto in campo chiaro. Passare il rilevamento del segnale di fluorescenza e regolare l'intensità della sorgente di luce utilizzando filtri a densità neutra e potenza della lampada per evitare la saturazione del segnale.
- Monitor Fura-2 AM fluorescenza nel campione di tessuto con eccitazione a 340/380 nm raziometrico con una frequenza di 0,125 Hz o superiore. Utilizzare un 40 × / NA 1.3 o simile lenti dell'obiettivo per una corretta risoluimmagine zione.
- Per l'elaborazione delle immagini e calcoli importare la sequenza di immagini. Assicurati di dividere i canali e utilizzare una modalità HyperStack scala di grigi. Seleziona più regioni di interesse (cellule singolo cisti o aree selezionate di tessuto cistica) e calcolare i valori di intensità per ciascun canale (340 e 380 nm) in preferito software di analisi dei dati; sottrazione di valori di intensità di fondo da ogni punto di dati.
- Per ogni punto di tempo calcolare il rapporto tra intensità delle 340 a 380 canali Fura-2 AM. Grafico a dispersione / linea point-tempo cambia di Ca 2+ transitoria per ogni regione e calcolare i valori medi / SE.
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Representative Results
Coinvolgimento potenziale ENaC in cystogenesis è stata dimostrata da diversi studi che osservano interrotto fattore di crescita epidermico (EGF) di segnalazione in PKD progressione 22-25 e riassorbimento di sodio anormale ARPKD modelli murini e colture di tessuti 26-28. Ad esempio, Veizis et al. Hanno dimostrato che amiloride-sensibile Na + assorbimento è diminuita nelle cellule CD dal non orthologous modello murino di BPK ARPKD 29. Abbiamo recentemente dimostrato che il sodio compromessa e il riassorbimento di acqua in cisti è un fattore importante per aggravare cystogenesis 10. In particolare, abbiamo impiegato analisi elettrofisiologiche e immunoistochimica e abbiamo scoperto che le cisti esercitano il riassorbimento di sodio smussati. Un approccio farmacologico dimostrato che selettivo ENaC blocco aggrava notevolmente la progressione cisti 10.
Abbiamo dimostrato ulteriormente l'effetto della somministrazione di benzamil, un bloccante ENaC, on attività dei canali nella parete cistica. 4-settimane ratti PCK sono stati forniti con veicolo o acqua contenente benzamil (15 mg / ml) ad libitum potabile. Dopo 12 settimane di trattamento gli animali sono stati trattati secondo il protocollo descritto sopra. Patch-clamp stata effettuata su monostrati cistiche isolati dal veicolo e benzamil gruppi trattati. La figura 3 mostra rappresentativi tracce attuali di attività ENaC registrata dalle membrane apicali. Il grafico di sintesi che dimostra attività media ENaC (NP o) era 0,91 ± 0,15 10 nelle cisti di gruppo di controllo, mentre la somministrazione benzamil diminuita l'attività del canale di 0,32 ± 0,05. Concludiamo che in ARPKD (caratterizzata da distensione estatica di CD a formare numerose cisti renali fusiformi 30) benzamil dato in acqua potabile raggiunge cisti renali con il flusso di urina 30. Questo effetto permette di diminuire benzamil ricaptazione di sodio dal liquido cisti, contr ibuting a cystogenesis 10.
Oltre al percorso EGF, adenosina trifosfato (ATP) e altre purine sono stati identificati come una componente di segnalazione paracrina critica che viene impropriamente modulata in modelli PKD e in pazienti affetti da questa malattia. E 'stato riferito che la segnalazione purinergico svolge un ruolo importante nel cystogenesis sia durante ADPKD e ARPKD 31,32. Cellule cisti di ratti PCK sono stati precedentemente dimostrato di esporre basso basale [Ca 2 +] i e la perdita di flusso-mediata [Ca 2 +] i segnalazione rispetto ai sani dotti collettori non dilatate dei ratti SD 13. Agonisti dei recettori P2 modulano lo sviluppo di cisti renali in un modello in vitro di formazione di cisti derivato dal mouse CPK / CPK 33. Alta concentrazione di ATP è stato trovato nel liquido cistico di pazienti ADPKD 34 e nei media condizionata da epiteli renali cistiche coltivate da topi cpk / CPK 35.
_content "> Abbiamo testato flusso di calcio in risposta alla somministrazione esogena di ATP. cisti PCK e normali condotti corticali di ratto SD sono stati isolati per le misurazioni di calcio prima e dopo l'applicazione di 10 mM ATP. I dati illustrati nella figura 4 rivelare l'effetto di 10 mM ATP nei tubuli cistiche di ratti PCK studiato con due diversi approcci: la figura 4A mostra misurazioni di Fura-02:00 intensità di fluorescenza a 340 e 380 Nm in un setup a epifluorescenza dotato di un monocromatore, e Figura 4B rappresenta registrazione di Fluo-8 colorante colorazione con confocale microscopia. Entrambe le tecniche dimostrano cinetiche simili di calcio risposta transitoria per l'applicazione ATP nell'epitelio cistico 10.
Figura 1:. Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale Dopol'animale sia adeguatamente anestetizzato e preparato per l'intervento chirurgico, i reni sono lavata con PBS per rimuovere il sangue. Poi, i reni vengono asportati, decapsulated, e monostrati cistica o tubuli non dilatato sono isolati manualmente con una pinza sotto uno stereomicroscopio. Tubuli non dilatate sono divise aperto con micropipette guidati da micromanipolatori mentre cistico come superficie interna delle cisti sarebbe aperta per avere accesso al lato apicale.
Figura 2: Isolamento e preparazione di monostrati dotto cistico e di raccolta (A) Una fetta rappresentante rene da 16 settimane di età PCK ratto.. (B) Un monostrato cistica su un chip vetrino coprioggetto trasferito ad un microscopio per l'analisi patch-clamp o calcium imaging (60X). Segmento / CCD (C) A CNT con biforcazione isolato da un topo SD. ( 
Figura 3: Effetto del trattamento benzamil sull'attività ENaC nell'epitelio cistico. (A) le tracce attuali Rappresentante per l'attività ENaC misurata in cellule allegato chiazze di cisti appena isolati da 16 settimane di età ratti PCK somministrato 12 settimane di benzamil nell'acqua potabile. Queste patch sono tenute ad un potenziale di prova di V h = -V p = -40 mV. Inward correnti Li + sono verso il basso. Le linee tratteggiate indicano il relativo stato attuale con una "c" e "o n" che indica gli stati aperti e chiusi. (B) il grafico Riepilogo delle attività osservata ENaC (NP o) (parzialmente riprodotto da 10 con permesso). * P <0.05 veveicolo RSU. 
Figura 4: Effetti della ATP per afflusso di calcio nelle cellule cistiche dei ratti PCK (A) Immagini rappresentative della monostrato cistica caricato con Fura-2:00, prima e dopo l'applicazione di 10 micron ATP.. Grafico che riassume l'effetto di ATP sui livelli di calcio nel monostrato cellulare di ratti PCK e SD collettori (N = 38 celle). (B) monostrato cistica caricato con Fluo-8 dye prima e dopo l'applicazione di 10 mM ATP e sintesi grafico risposta calcio intracellulare.
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Discussion
Abbiamo descritto qui applicazioni della tradizionale tecnica del patch-clamp e di imaging epifluorescenza calcio per monostrati epiteliali cistica derivate da un modello genetico murino di ARPKD. Il protocollo consiste di tre fasi, di cui la più attenzione deve essere rivolta alla l'isolamento delle cisti (passo 1.5 della sezione di protocolli) e per gli studi elettrofisiologici. Queste procedure chiave richiedono una formazione completa e la pazienza, e il lettore non deve essere frustrato in una volta.
Prima di tutto, la maggiore attenzione deve essere rivolta al processo dell'isolamento cisti monostrato. Questa parte della preparazione richiede manualità e significativamente impatti ulteriore lavoro, lo spessore del provino e il suo attacco anche per un chip di vetro è fondamentale per la visibilità delle cellule. Spessore pareti cistiche isolati varia nelle diverse parti del campione, e si consiglia di concentrarsi su grandi cisti con aree più grandi monostrato convenienti per worK. Per aiutare a pulire il campione e accedere alla monostrato, tessuti circostanti devono essere sbucciate con una pinza sotto uno stereomicroscopio. Va sottolineato che la tecnica implica l'utilizzazione di uno stereomicroscopio alta qualità caratterizzato da una profondità di campo e un notevole capacità di cambiare l'ingrandimento in una vasta gamma di ospitare varie dimensioni degli oggetti durante la dissezione. Un'altra limitazione del metodo è che tali tecniche sofisticate come patch-clamp e calcium imaging richiedono personale esperto questi metodi. Suggeriamo che esperienza iniziale può essere ottenuto sulla raccolta di colture cellulari dotto come disponibili in commercio cellule M1 e IMCD midollare corticale in quanto costituiscono monostrato epiteliale simile a cisti.
Il nostro approccio permette di misurare l'attività dei canali ionici e [Ca 2+] i livelli nell'ambiente nativo di tessuti isolati a fresco. Il principale vantaggio di questa procedura è che la preparazione dei campioni per singlanalisi e canali o tingere il carico non richiede trattamento enzimatico, danneggiando procedimenti meccanici o altri passaggi potenzialmente dannosi. Essa viene eseguita manualmente con una pinza in soluzione salina e fornisce grandi esemplari integri. Tali campioni possono essere utilizzati non solo per le tecniche descritte. In realtà, isolato cistico rappresenta sottile strato di cellule tubulari puri e mantiene le proprietà monostrato nativi, che lo rende un oggetto integro prezioso per gli esperimenti in tempo reale che produce fisiologicamente osservazioni pertinenti. Se l'isolamento di cisti sembra difficile una procedura per il ricercatore o una grande quantità di tessuto cistica è richiesto alla volta, trattamento enzimatico (ad esempio, con dispasi e collagenasi, come descritto qui 38 per il collettore corticale tubuli cassone) può essere utilizzato per semplificare il processo di isolamento. Tuttavia, il ricercatore dovrebbe essere molto attenti durante l'esecuzione di questo trattamento, come enzimi, soprattutto proteasi, possono influenzare in modo significativo channe ioneattività ls 'o danneggiare i recettori di membrana. Questo è, per esempio, molto importante per gli studi di segnalazione purinergico, come queste proteine di membrana sono ben noti a degradare rapidamente sotto trattamento enzimatico 39,40.
Inoltre, epitelio cistico può essere utilizzato per altri scopi, come ad esempio immunoistochimica o colorazione di un monostrato fissa con coloranti (es rodamina falloidina), o il caricamento del tessuto fresco con pennarelli sostanze intracellulari, come DAF-FM per NO rilevamento o varie tinture per monitorare produzione di specie reattive dell'ossigeno. Si consiglia di utilizzare la frazione di puro isolato cistico per blotting occidentale per eliminare l'impatto di fattori non specifici presenti nei lisati renali totali. Suggeriamo anche che cistico può essere allo stesso modo isolato da topi o altre specie che sono disponibili per gli studi di vari modelli di non solo ARPKD, ma anche ADPKD. Esemplari cisti appena isolate hanno innegabilevantaggi per la biologia molecolare approcci rispetto alle cellule in coltura cistica, come meglio sostenere le proprietà dei tessuti cistica all'interno dell'organo, e sicuramente fornire dati più giustificate riguardanti i processi di malattia in vivo.
Uno dei vantaggi significativi di questa tecnica è la possibilità di utilizzare (background genetico questi ratti condividono con ratti PCK) normale non dilatata collettori delle stesse reni o ratti SD tubuli, come tessuti di controllo. Simili patch-clamp e calcio misure in segmenti nefrone sono ampiamente utilizzati sui reni non cistica in molti laboratori 41-43. A seconda di tipo canali ionici, diverse modificazioni del metodo patch-clamp può essere utilizzato (a cellula intera, dentro-fuori, fuori-out); per esempio, ENAC e ROMK (renale esterno midollare potassio canale) attività possono essere valutate da cellula intera configurazione 44,45. La proposta di Fura-02:00 Imaging di calcio in epifluorescenza a grande campo con MONOChromator può essere anche eseguita con qualsiasi altro simile modifica calcium imaging come l'analisi con microscopia confocale o due fotoni con altri coloranti calcio. Questi sistemi microscopio sono meno accessibili, ma di fornire immagini di qualità superiore e sono più sensibili di microscopia a grande campo. Approccio simile è stato applicato anche per studiare l'attività canali TRPC e segnalazione di calcio in podocytes di appena isolato glomeruli 17,46,47. Altro calcium imaging che potrebbe essere applicato comprendere l'utilizzo di Fluo-8 come mostrato nella Figura 4B o misurazione confocale raziometrico con coloranti fluorescenti Fluo4 / FuraRed come descritto in Ilatovskaya et al. 46 Tecnicamente, è possibile effettuare sia patch-clamp e calcium imaging contemporaneamente sulla stessa cella se microscopio è dotato di entrambe le configurazioni. Pertanto, la tecnica descritta è un approccio fattibile per osservazioni di alta qualità nel campo della PKD, che può essere modificato in modo flessibile secondo the le esigenze della vostra ricerca e la disponibilità delle attrezzature specifiche. Inoltre, varie modifiche dell'imaging calcio possono essere usati qui, includendo la misurazione confocale raziometrico con coloranti fluorescenti Fluo4 / FuraRed (come descritto in Ilatovskaya et al. 46) o Fluo-8 come mostrato nella Figura 4B.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) per un'eccellente assistenza tecnica con esperimenti di microscopia. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (a OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (a OPO) e Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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