Summary
Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.
Abstract
Cyste initiatie en uitzetting gedurende polycystische nierziekte is een complex proces gekenmerkt door afwijkingen in buisvormige celproliferatie, luminale vochtophoping en extracellulaire matrixvorming. Activiteit van ionkanalen en intracellulaire calcium signalering zijn belangrijke fysiologische parameters welke functies van tubulaire epitheel te bepalen. We ontwikkelden een methode geschikt is voor real-time observatie van ionkanalen activiteit met patch-clamp techniek en de registratie van de intracellulaire Ca 2+ niveau epitheelmonolagen vers geïsoleerd van renale cysten. PCK ratten, een genetisch model van autosomaal recessieve polycystische nierziekte (ARPKD), hier werden gebruikt voor de ex vivo analyse van ionkanalen en calcium flux. Hier beschreven is een gedetailleerde stap-voor-stap procedure die tot cystic monolagen en de niet verwijde buisjes van PCK of normaal Sprague Dawley (SD) ratten isoleren en controleren enkel kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + dynamiek.Deze methode niet enzymatische verwerking vereisen en maakt analyse in een inheemse setting van vers geïsoleerde epitheliale monolaag. Bovendien is deze techniek zeer gevoelig is voor intracellulaire calcium veranderingen genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen. Tenslotte kunnen geïsoleerde blaas epitheel verder worden gebruikt voor kleuring met antilichamen of kleurstoffen, bereiden van primaire kweken en zuivering van verschillende biochemische assays.
Introduction
Ionenkanalen spelen een belangrijke rol in vele fysiologische functies, waaronder celgroei en differentiatie. Autosomaal dominante en recessieve polycystische nierziekten (ADPKD en ARPKD respectievelijk) genetische aandoeningen gekenmerkt door de ontwikkeling van renale vloeistof gevulde cysten van de buisvormige epitheelcel oorsprong. ADPKD wordt veroorzaakt door mutaties van PKD1 of PKD2 genen die polycystins 1 en 2, membraaneiwitten betrokken bij de regulering van celproliferatie en differentiatie. PKD2 op zichzelf of als een complex met PKD1 ook functioneren als een Ca2 + -doorlaatbare kationenkanaal 1. Mutaties van het gen dat codeert fibrocystin PKHD1 (a cilia-geassocieerde receptor-achtige eiwitten die betrokken zijn bij de tubulogenesis en / of onderhoud van polariteit van epitheel) de genetische impuls van ARPKD 2. Cyste groei is een complex fenomeen gepaard met verstoorde proliferatie 3,4, angiogenese 5, dedifferentiatie en het verlies van polaireteit van de tubulaire cellen 6-8.
Defecte reabsorptie en augmented secretie in cystic epitheel bijdragen aan vochtophoping in het lumen en cyste uitbreiding 9,10. Verminderde doorstroming afhankelijk [Ca 2+] i signalering is ook gekoppeld aan cystogenesis tijdens PKD 11-15.
Hier beschrijven we een werkwijze geschikt voor patch-clamp metingen van één kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + niveaus in cystic epitheliale monolagen geïsoleerd van PCK ratten. Deze methode werd met succes toegepast door ons te karakteriseren van activiteit van de epitheliale Na + kanaal (ENaC) 10 en [Ca 2+] i afhankelijke processen veroorzaakt door Ca 2+ -doorlaatbare TRPV4 en purinerge signalisatie cascade 13.
In deze studies gebruikten we PCK ratten, een model van ARPKD veroorzaakt door een spontane mutatie in het gen PKHD1. De PCK stam was originally afkomstig van Sprague-Dawley (SD) ratten 16 daardoor SD ratten gekozen als controle voor vergelijking met de PCK stam. Daardoor kan zowel SD rat nefron segmenten en niet-verwijde verzamelbuizen geïsoleerd uit dezelfde PCK ratten dienen als twee vergelijkingsgroepen voor experimenten op cystic epitheel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Medical College of Wisconsin en de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van de isolatie weefsel en veredeling. In het kort worden de nieren van PCK of SD-ratten gebruikt voor het handmatig isoleren van epitheliale monolagen van verzamelbuizen hetzij van gezonde niet-gekozen buisjes of cysten. Hier studeerde we nieren 4-16 weken oud PCK ratten 10,13.
1. Isolatie van Nier cysten en aansluiten Buisjes (CNT) / Verzamelen Goten (CD) Segmenten
- Verdoven proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. Dieren moeten voortdurend worden bewaakt om adequate le zorgenvel van de anesthesie. Stabiele ademhaling en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen.
- Voer laparotomie en spoel de nieren met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) via de abdominale aorta 17.
- Bereid een polyethyleen buis catheter (PE50) en sluit hem aan op een injectiepomp gevuld met PBS. Snijd de huid en de buikwand langs de linea alba, maak dan een dwarse incisie in de buik over de buik van links naar rechts en de verschuiving van de buikorganen met wattenstaafjes om de toegang tot de dalende aorta komen met vertakkende mesenterische en coeliakie slagaders. Bevochtig de inwendige organen met warme zoutoplossing tijdens de verdere procedures om hun droogte te voorkomen.
- Plaats een ligatuur (# 1) rond de mesenterische en coeliakie slagaders en andere ligatuur (# 2) rond de aorta onder het membraan (niet binden). Scheiden voorzichtig een. abdominalis door stomp ontleden bindweefsel rond het met dunne pincet en plaats twee ligaturen ~ 3mm onder de linker nierslagader (# 3) en boven de iliacale arteriën bifurcatie (# 4).
- Bind ligatuur # 4 en voeg een vat klem rond de aorta tussen de linker nierslagader en ligatuur # 3. Maak een incisie tussen de klem en ligatuur # 4 naar de aorta katheteriseren, gebruiken ligatuur # 3 om de catheter stevig vast te stellen.
- Laat de klem en zorg ervoor dat het bloed puls is zichtbaar in de katheter om de juiste installatie te verzekeren. Beginnen perfusie met een snelheid van 6 ml / min, das ligaturen # 1 en # 2, en snijd de linker nier ader. Verder spoelen gedurende 1-2 min tot de organen volledig geblancheerd.
- Renale bloedvaten, urethra en de omliggende bindweefsel en vetweefsel knippen met een schaar aan de nieren te verzamelen. Maak dan een korte scheur in de nier capsule en schil de nieren om ze decapsulate. Plaats de nieren in ijskoud PBS. Euthanasie wordt bevestigd door een thoracotomie.
- Bereid 5 x 5 mm dekglas chips bekleed met poly-L-lysine. Snijd een cover GLAss met een diamant potlood en plaats ongeveer 20 ui 0,01% steriel gefiltreerd Poly-L-lysine oplossing op elk glas chip. Bereid zoutoplossing en twee paar horlogemaker tang voor dissectie.
- Snijd de nieren met een scheermesje langs het frontale vlak in plakjes ~ 1-2 mm dik. Plaats een van de segmenten onder een stereomicroscoop. Isolatie van weefsels moet gebeuren in ijskoude zoutoplossing.
- Lokaliseren cysten onder een stereomicroscoop als round-shape holtes (Figuur 2A); hun muren bevatten vaak prominente netwerk van verspreid bloedvaten. Gebruik fijne punt tang ontleden de interne epitheliale laag van een cyste zo dun mogelijk om een monolaag gebied te verkrijgen. Maak het aan een glazen chip bedekt met poly-L-lysine. Kleverige Poly-L-Lysine oppervlak kan de onderzoeker stevig positioneren interne cyste laag op glas. Expose de cyste met de apicale kant naar boven om de toegang voor de pipetten (Figuur 2B) te verstrekken.
- Gebruik PCK of SD rat kindney centrale schijfjes bevatten papilla voor isolatie van niet-verwijde CNT / CCDsegments 18-21.
OPMERKING: Papillaire weefsels duurzamer dan cortex en houden papillaire buisvormige banden met een pincet en scheuren langs de radiale as van de plak kan worden gesplitst in dunne sectoren. Afzonderlijke buisjes zijn zichtbaar en kunnen worden getrokken op hoes glazen chips worden geplaatst. - Identificeren van de CNT / CCD segmenten van vertakkingen, grotere transparantie dan proximale buisjes en grote prominent zichtbare cellen (figuur 2C). Plaats het deksel glas chip met aangehechte buisjes onder een microscoop uitgerust met micromanipulators geschikt voor het rijden micropipetten. Met behulp van scherpe micropipetten split open buisjes en hechten hun randen aan het glas op het apicale oppervlak toegankelijk te maken (Figuur 2D).
2. Single Channel Patch-clamp elektrofysiologie
- Vul de patch-clamp kamer met bad oplossing en breng het deksel glas chipmet geïsoleerde weefsels naar de kamer. Zorg ervoor dat de patch-clamp micropipetten hebben weerstand van 10/07 MQ voor een betrouwbare on-cel (cel bevestigd) metingen.
- Voor de cel bevestigd metingen, zet de versterker winst verhouding tot 20x en low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter. Voor de bewaking ENaC kanalen, gebruikt een bad oplossing in mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipet: 140 LiCl, 2 MgCl2 en 10 HEPES (pH 7,4).
- Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel bevestigd modus 10. Selecteer een cel in de epitheliale monolaag en benaderen de pipet om het apicale membraan. Vormen een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en celmembraan door het toepassen van zachte zuigkracht. Zodra een hoog resistente gigaohm afdichting wordt gevormd, zou een spleetvrije protocol op een bedrijf potentieel worden gestart voor de monitoring activiteit van het kanaal van belang.
- Store gap-free enkel kanaal huidige gegevens van gigaOhm verbindingen voor daaropvolgende analyse. Analyseer het kanaal gebeurtenissen met behulp van een softwarepakket het algemeen geleverd met patch-clamp opstellingen 18. Bereken kanaalactiviteit als NPO waarbij N verwijst naar het aantal actieve kanalen in de pleister en P o gemiddeld geopend waarschijnlijkheid van de kanalen.
OPMERKING: Gebruik geïsoleerde cysten of buisjes in patch-clamp experimenten niet meer dan 30 min.
3. Ratiometrische epi-fluorescent Metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de epitheelcellen
- Gebruik 5 mM Fura-02:00 opgelost in DMSO. Aliquot voorraad oplossing in individuele 500 pi conische buizen (ongeveer 10 pl). Beschermen tegen licht en op te slaan in de vriezer bij -20 ° C voor maximaal zes maanden.
- Incubeer geïsoleerde cysten en split open buisjes voor 30-40 min in de PSS (in mm: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 en 10 HEPES bij pH 7,35) met 5 uM Fura-02:00 kleurstof en 0,05% pluronzuur om verspreiding van de acetoxymethylesters. Daarvoor in de plaats weefsels 3,5 cm schaaltje met laden cocktail, bescherming tegen licht en incubeer op een langzame shaker bij kamertemperatuur.
- Verander Fura-2 AM bevattende media te reinigen PSS na incubatie en plaats het weefsel onder een microscoop te epifluorescentie- beeldvorming verder voeren.
- Schakel CCD camera en stabiele lichtbron (monochromator systeem) voorzien filterwiel (elk filter positie kan worden door zijn eigen demping niveau telkens het filter wordt geselecteerd).
- Vind het weefsel in heldere gebied. Schakel om detectie van het fluorescentiesignaal en de intensiteit van de lichtbron via grijsfilters en lampvermogen verzadiging van het signaal te voorkomen.
- Monitor Fura-2 AM fluorescentie in het weefselmonster met ratiometrische excitatie bij 340/380 nm met een frequentie van 0.125 Hz of hoger. Gebruik een 40 × / NA 1.3 of soortgelijke objectief voor de juiste resolutiesimage tie.
- Voor beeldverwerking en berekeningen importeer de sequentie van beelden. Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus. Selecteer meerdere regio's van belang (single cyste cellen of geselecteerde gebieden van cystische weefsel) en het berekenen van de intensiteit waarden voor elk kanaal (340 en 380 nm) in de voorkeur data-analyse software; aftrekken achtergrond intensiteit waarden van elk gegevenspunt.
- Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fura-2 AM 340 om 380 kanalen. Perceel scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke regio en het berekenen van de gemiddelde / SE waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potentiële ENaC betrokkenheid bij cystogenesis is aangetoond door verscheidene studies die verstoorde epidermale groeifactor (EGF) waargenomen signalering in PKD progressie 22-25 en abnormale natrium reabsorptie in ARPKD muizenmodellen en weefselculturen 26-28. Zo Veizis et al. Toonde aan dat de amiloride gevoelige Na + absorptie verminderd bij CD cellen van de niet-orthologe BPK muismodel van ARPKD 29. We hebben onlangs aangetoond dat een verminderde natrium en water reabsorptie in cysten is een belangrijke factor in verzwarende cystogenesis 10. Specifiek, we werkzaam elektrofysiologische en immunohistochemische analyse en vond dat cysten uitoefenen afgestompte natrium reabsorptie. Een farmacologische aanpak aangetoond dat selectieve ENaC blokkade aanzienlijk verergert cyste progressie 10.
We verder aangetoond dat het effect van toediening van benzamil, een ENaC blocker, on activiteit van de kanalen in de cyste wand. 4-weken oude PCK ratten werden voorzien van het voertuig of het drinken van water met benzamil (15 mg / ml) ad libitum. Na 12 weken behandeling werden de dieren behandeld volgens de hierboven beschreven protocol. Patch-clamp werd uitgevoerd op cystic monolagen geïsoleerd van voertuig en benzamil behandelde groepen. Figuur 3 toont representatieve actuele sporen van ENaC activiteit geregistreerd van apicale membranen. De samenvatting grafiek toont aan dat de gemiddelde ENaC activiteit (NP o) was 0,91 ± 0,15 10 cysten van de controlegroep, terwijl benzamil toediening verlaagde de activiteit van het kanaal naar 0,32 ± 0,05. We concluderen dat in ARPKD (gekenmerkt door extatische uitzetting van cd's naar een groot aantal spoelvormige renale cysten 30 te vormen) benzamil gegeven in drinkwater bereikt nier cysten met urinestroom 30. Dit effect maakt benzamil natrium heropname afnemen van cystevloeistof, contr ibuting om cystogenesis 10.
Naast de EGF pathway werden adenosine trifosfaat (ATP) en andere purines geïdentificeerd als cruciaal paracrienen component die ten onrechte wordt gemoduleerd PKD modellen en patiënten met deze ziekte. Er werd gemeld dat purinerge signalering speelt een belangrijke rol in cystogenesis tijdens beide ADPKD en ARPKD 31,32. Cyste cellen van PCK ratten zijn eerder aangetoond lage basale vertonen [Ca 2+] i en verlies van flow-gemedieerde [Ca 2,] signalering vergeleken met gezonde niet-verwijde verzamelbuizen van SD-ratten 13. P2 receptor agonisten moduleren de ontwikkeling van renale cysten in een in vitro model van cysten afkomstig van de cpk / cpk muis 33. Hoge ATP concentratie werd gevonden in cystic vloeistof uit ADPKD patiënten 34 en in media geconditioneerd door cystic nieren epitheel gekweekt uit cpk / cpk muizen 35.
_content "> We testten calciumflux in reactie op exogene ATP toediening. PCK cysten en normale corticale kokers van SD-ratten werden geïsoleerd van de calcium metingen vóór en na toediening van 10 uM ATP. De gegevens in figuur 4 tonen het effect van 10 uM ATP in cystic tubuli van PCK ratten bestudeerd twee verschillende benaderingen: Figuur 4A toont metingen van Fura-02:00 fluorescentie-intensiteit bij 340 en 380 nM in een epifluorescentie opstelling uitgerust met een monochromator, en Figuur 4B geeft registratie van Fluo-8 kleurstof kleuring met confocale microscopie. Beide technieken tonen vergelijkbare kinetiek van calcium voorbijgaande reactie op ATP toepassing cystic 10 epitheel.
Na Schematische weergave van de experimentele protocol: Figuur 1.het dier goed verdoofd en voorbereid op de operatie worden de nieren gespoeld met PBS om bloed te verwijderen. Vervolgens worden de nieren uitgesneden, decapsulated en cystic monolagen of niet verwijde tubules worden handmatig met een tang die onder een stereomicroscoop. Niet-verwijde tubules opgesplitst openen met micropipetten aangedreven door micromanipulators dat cystic epitheel binnenoppervlak van de cysten zou worden geopend om toegang tot de apicale zijde.
Figuur 2: Isolatie en voorbereiding van cystic en het verzamelen kanaal monolagen (A) Een vertegenwoordiger nier stukje van 16 weken oude PCK rat.. (B) Een cystic monolaag op een cover glazen chip overgebracht naar een microscoop voor patch-clamp analyse of calcium imaging (60X). (C) A CNT / CCD segment vertakking geïsoleerd uit een SD rat. ( 
Figuur 3: Effect van benzamil behandeling op ENaC activiteit cystic epitheel. (A) Representatieve huidige sporen van ENaC activiteit gemeten in cellen bijgevoegde stukken cysten vers geïsoleerd uit 16 weken oude PCK ratten waaraan 12 weken benzamil in drinkwater. Deze patches werden gehouden in een test potentieel van V h = -V p = -40 mV. Innerlijke Li + stromen naar beneden. Gestippelde lijnen geven de respectievelijke huidige toestand met een "c" en "o n" aanduiding van de gesloten en open toestanden. (B) Samenvatting grafiek van waargenomen ENaC activiteit (NP o) (deels overgenomen uit 10 met toestemming). * P <0,05 versus voertuig. 
Figuur 4: Effecten van ATP op calcium influx in cystic cellen van de PCK ratten (A) Representatieve beelden van cystic monolaag beladen met Fura-2 AM voor en na toediening van 10 uM ATP.. Graph samenvatting van het effect van ATP op calciumniveau in de cel monolaag van PCK ratten en SD verzamelbuizen (N = 38 cellen). (B) Cystic monolayer geladen met Fluo-8 kleurstof voor en na toediening van 10 uM ATP en samenvatting grafiek van intracellulaire calcium respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hier beschreven toepassingen van conventionele patch-clamp techniek en epifluorescentie calcium beeldvorming om cystic epitheelmonolagen afgeleid van een muizen genetisch model van ARPKD. Het protocol bestaat uit drie stappen, waarbij de meeste aandacht moet worden besteed aan de isolatie van de cysten (stap 1.5 van de sectie protocollen) en de elektrofysiologische studies. Deze belangrijke procedures vereisen uitgebreide training en geduld, en de lezer mag niet worden gefrustreerd tegelijk.
Allereerst moet de aandacht voor de werkwijze volgens de cyste monolaag isolatie. Dit onderdeel van de voorbereiding vergt manuele vaardigheden en een aanzienlijke impact verdere werkzaamheden, als de dikte van het monster en zijn zelfs gehechtheid aan een glazen chip is van cruciaal belang voor de zichtbaarheid van de cellen. Dikte van geïsoleerde cyste muren varieert in verschillende delen van het monster, en het wordt aanbevolen om zich te concentreren op de grotere cysten met grotere monolaag gebieden handig voor work. Te helpen bij het schoonmaken van het model en de toegang tot de monolaag, moet de omliggende weefsels worden geschild met een pincet onder een stereomicroscoop. Benadrukt moet worden dat de techniek impliceert het gebruik van een hoge kwaliteit stereomicroscoop gekenmerkt door een aanzienlijke velddiepte en een vermogen om vergroting wijzigt in een breed scala aan verschillende afmetingen van objecten ontvangen tijdens dissectie. Een andere beperking van de methode is dat dergelijke geavanceerde technieken zoals patch-clamp en calcium beeldvorming vereisen personen vertrouwd met deze methoden. Wij stellen voor dat de eerste ervaringen kan worden verkregen op het verzamelen kanaal celculturen zoals in de handel verkrijgbaar corticale M1 en médullaire IMCD cellen als ze vormen epitheliale monolaag vergelijkbaar met cysten.
Onze aanpak maakt het meten van ionkanalen activiteit en [Ca 2+] i niveaus in de natuurlijke omgeving van vers geïsoleerde weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat de bereiding van specimens single-channel analyse of kleurstof laden niet enzymatische behandeling vereisen, mechanische beschadiging van procedures of andere potentieel schadelijke stappen. Het wordt handmatig uitgevoerd met een pincet in een zoutoplossing en biedt grote onbeschadigde exemplaren. Dergelijke preparaten kunnen worden gebruikt niet alleen voor de beschreven technieken. In feite, geïsoleerde blaas epitheel vertegenwoordigt dunne film van pure tubulaire cellen en onderhoudt natieve monolaag eigenschappen, waardoor het een waardevol intact object voor real-time experimenten die fysiologisch relevante waarnemingen produceert maakt. Als de isolatie van cysten lijkt moeilijk een procedure voor de onderzoeker of een grote hoeveelheid cystic weefsel eenmaal vereist op, enzymatische behandeling (bijvoorbeeld met dispase en collagenase, zoals hier 38 beschreven voor de corticale verzamelbuis tubuli) kan worden gebruikt de isolatie te vereenvoudigen. Toch moet de onderzoeker heel voorzichtig zijn bij het uitvoeren van deze behandeling, zoals enzymen, in het bijzonder proteasen, kunnen beïnvloeden ion channeactiviteit ls 'of schade aan het membraan receptoren. Dit is bijvoorbeeld belangrijk voor het onderzoek van purinerge signalering, zoals die membraaneiwitten zijn zeer bekend snel afgebroken onder enzymatische behandeling 39,40.
Bovendien kan cystische epitheel worden gebruikt voor andere doeleinden, zoals immunohistochemie of kleuring van een vaste monolaag met kleurstoffen (bijvoorbeeld rhodamine falloïdine) of laden van de verse weefsel intracellulaire stof markers, zoals DAF-FM voor NO detectie of verschillende kleurstoffen monitoren reactieve productie zuurstofradicalen. Er wordt voorgesteld om de zuivere fractie van geïsoleerde blaas epitheel gebruikt voor western blotting voor effecten van niet-specifieke factoren aanwezig in totale lysaten nieren elimineren. We stellen ook voor dat cystic epitheel soortgelijke wijze kunnen worden geïsoleerd uit muizen of andere soorten die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van verschillende modellen van niet alleen ARPKD zijn, maar ook ADPKD. Vers geïsoleerde cyste exemplaren hebben onmiskenbaarvoordelen voor moleculaire biologie benaderingen vergeleken met de gekweekte cystic cellen, omdat zij beter behouden de eigenschappen van het cystische weefsel in het orgaan, en ongetwijfeld zorgen gerechtvaardigder gegevens over de in vivo ziekteprocessen.
Een van de belangrijke voordelen van deze techniek is een mogelijkheid om normale niet-verwijde verzamelbuisjes van dezelfde nieren of SD-ratten buisjes (deze ratten delen genetische achtergrond met PCK ratten) gebruikt als controle weefsels. Vergelijkbare patch-clamp en calcium metingen in nefron segmenten worden veel gebruikt op niet-cystic nieren in veel laboratoria 41-43. Afhankelijk ionkanalen type verschillende modificaties van de patch-clamp-methode kan worden gebruikt (hele cel, inside-out, outside-out); bijvoorbeeld ENaC en ROMK (renale uitwendige medullaire kaliumkanaal) activiteit kan worden bepaald door whole-cell configuratie 44,45. De voorgestelde Fura-02:00 calcium beeldvorming in wide-field epifluorescentie met monochromator kan ook worden uitgevoerd met andere soortgelijke wijziging van calcium beeldvorming zoals analyse met confocale of twee-foton microscopie met andere calcium kleurstoffen. Deze microscoop systemen zijn minder betaalbaar, maar bieden een hogere beeldkwaliteit en zijn gevoeliger dan wide-field microscopie. Soortgelijke aanpak werd ook toegepast op TRPC kanalen activiteit en calcium signalering studeren in podocytes van vers geïsoleerde glomeruli 17,46,47. Andere calcium beeldvorming die kunnen worden toegepast onder gebruikmaking van Fluo-8 zoals getoond in figuur 4B of ratiometrische confocale meting met Fluo4 / FuraRed fluorescente kleurstoffen zoals beschreven in Ilatovskaya et al. 46 Technisch is het mogelijk om zowel patch-clamp en calcium imaging voeren gelijktijdig op dezelfde cel als microscoop uitgerust met zowel opstellingen. Aldus beschreven techniek bruikbaar zijn voor hoogwaardige waarnemingen in het gebied van PKD, die flexibel kan worden aangepast aan the behoeften van uw specifieke onderzoek en de beschikbaarheid van de apparatuur. Verder kunnen diverse modificaties van calcium imaging hier gebruikt, waaronder ratiometrische confocale metingen met Fluo4 / FuraRed fluorescente kleurstoffen (zoals beschreven in Ilatovskaya et al. 46) of Fluo-8 zoals getoond in Figuur 4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidies R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (naar OPO) en K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (naar OPO) en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
- Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
- Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
- Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
- Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
- Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
- Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
- Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
- Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
- Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
- Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
- Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
- Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
- Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
- Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
- Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
- Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
- Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
- Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
- Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
- Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
- Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
- Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
- Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
- Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
- Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
- Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
- Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
- Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
- Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
- Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
- Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
- Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
- Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
- Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
- Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
- Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
- Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
- Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
- Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
- Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).
