Summary
Ionkanaler udtrykt i tubulær epitel spiller en væsentlig rolle i patologien af polycystisk nyresygdom. Her beskriver vi forsøgsprotokoller bruges til at udføre patch-clamp analyse og intracellulært calcium niveau målinger i cystisk epitel frisk isoleret fra gnaver nyrerne.
Abstract
Cyst initiering og ekspansion i polycystisk nyresygdom er en kompleks proces kendetegnet ved abnormiteter i rørformede celleproliferation, luminal væskeophobning og ekstracellulær matrix formation. Aktivitet af ionkanaler og intracellulært calcium signalering er centrale fysiologiske parametre, som betinger funktioner af rørformet epitel. Vi udviklede en metode egnet til realtid observation af ionkanaler aktivitet med patch-clamp-teknik og registrering af intracellulær Ca2 + niveau epitel monolag frisk isolerede fra renale cyster. PCK rotter, en genetisk model for autosomal recessiv polycystisk nyresygdom (ARPKD), blev her anvendt til ex vivo analyse af ionkanaler og calcium flux. Beskrevet her er der en detaljeret trin-for-trin procedure designet til at isolere cystisk monolag og ikke-forstørrede tubuli fra PCK eller normale Sprague Dawley (SD) rotter, og overvåge enkelt kanal aktivitet og intracellulære Ca 2 + dynamik.Denne metode kræver ikke enzymatisk behandling og tillader analyse i en nativ indstilling af frisk isoleret epitelial monolag. Desuden er denne teknik er meget følsom over for intracellulære calcium ændringer og genererer høj opløsning billeder for nøjagtige målinger. Endelig kan isoleret cystisk epitel yderligere kan anvendes til farvning med antistoffer eller farvestoffer, fremstilling af primære kulturer og oprensning af forskellige biokemiske assays.
Introduction
Ionkanaler spiller en væsentlig rolle i mange fysiologiske funktioner, herunder cellevækst og differentiering. Autosomale dominante og recessive polycystiske nyresygdomme (ADPKD og ARPKD henholdsvis) er genetiske sygdomme karakteriseret ved udviklingen af renale væskefyldte cyster i den rørformede epitelcelle oprindelse. ADPKD er forårsaget af mutationer af pKD1 eller PKD2 gener, der koder polycystins 1 og 2, membranproteiner er involveret i reguleringen af celledeling og differentiering. PKD2 sig selv eller som et kompleks med pKD1 også fungere som en Ca2 + -permeable kationkanal 1. Mutationer af PKHD1 gen, der koder fibrocystin (a cilia-associeret receptor-lignende protein involveret i tubulogenesis og / eller vedligeholdelsen af polariteten af epitel) er den genetiske indflydelse af ARPKD 2. Cyste vækst er et komplekst fænomen ledsaget med forstyrret spredning 3,4, angiogenese 5, dedifferentiation og tab af polæreity af rørformede celler 6-8.
Defekt reabsorption og udvidet sekretion i cystisk epitel bidrage til væskeophobning i hulrummet og cyste ekspansion 9,10. Nedsat flow-afhængige [Ca2 +] i-signalering er også knyttet til cystogenesis under PKD 11-15.
Her beskriver vi en fremgangsmåde egnet til patch-clamp målinger af enkelt kanal aktivitet og intracellulære Ca2 + niveauer ved cystisk epiteliale monolag isoleret fra PCK rotter. Denne metode blev anvendt med succes af os at karakterisere aktivitet af epitel Na + kanal (ENaC) 10 og [Ca2 +] i -afhængige påført af Ca 2+ -permeable TRPV4 og purinergisk signaleringskaskade 13.
I disse undersøgelser anvendte vi PCK rotter, en model af ARPKD forårsaget af en spontan mutation i PKHD1 genet. Den PCK-stammen var originally afledt fra Sprague-Dawley (SD) rotter 16 derved SD rotter anvendes som en passende kontrol for sammenligning med PCK stamme. Som følge heraf kan både SD rotter nephron segmenter og ikke-dilateret samlekanalerne isoleret fra samme PCK rotter tjene som to forskellige sammenligningsgrupper for forsøg på cystisk epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle procedurer beskrevet nedenfor, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Medical College of Wisconsin og University of Texas Health Science Center på Houston og var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Figur 1 viser de vigtigste trin i vævet isolation og behandlingsprocedure. Kort fortalt nyrerne fra PCK eller SD-rotter anvendes til manuel isolering af epitelceller monolag af samlekanalerne enten fra raske ikke-ringet tubuli eller cyster. Her studerede vi nyrer fra 4-16 uger gamle rotter PCK 10,13.
1. Isolation af renal cyster og Tilslutning tubuli (CNT) / samlekanalerne (CD) Segmenter
- Bedøver forsøgsdyr med isofluran (5% induktion, 1,5 til 2,5% vedligeholdelse) / medicinsk kvalitet O 2 eller en anden godkendt metode. Dyrene skal løbende overvåges for at sikre tilstrækkelig leVel af anæstesi. Stabil respirationsfrekvens og tå knivspids reaktion anvendes til at bekræfte korrekt anæstesi.
- Udfør laparotomi og skyl nyrerne med phosphatbufret saltvand (PBS) gennem den abdominale aorta 17.
- Forbered en polyethylen slange kateter (PE50), og tilslut den til en sprøjtepumpe fyldt med PBS. Skær huden og bugvæggen langs linea alba, derefter foretage en tværgående abdominal incision på tværs af maven fra side til side og skift abdominale organer med vatpinde for at få adgang til faldende aorta med forgrening mesenteriske og cøliaki arterier. Fugt de indre organer med varmt saltvand under yderligere procedurer for at forhindre deres tørhed.
- Placer en ligatur (# 1) omkring mesenteriske arterier og cøliaki og en anden ligatur (# 2) omkring aorta under membranen (ikke binde). Adskille forsigtigt a. abdominalis ved stump dissekere bindevæv omkring det med tynde pincet og placere to ligaturer ~ 3mm under venstre nyrearterie (# 3) og over hoftearterierne bifurcation (# 4).
- Bind ligatur # 4 og vedhæfte et fartøj klemme omkring aorta mellem venstre renale arterie og ligatur # 3. Lav et snit mellem klemmen og ligatur # 4 ved selvkaterisation aorta, brug ligatur # 3 til fast løse kateteret.
- Slip klemmen og sørg for, at blodet puls er synlig i kateteret for at sikre korrekt installation. Start perfusion med en hastighed på 6 ml / min, binde ligaturer # 1 og # 2, og skære i venstre renale vene. Fortsæt skylning i 1-2 min, indtil organerne er fuldstændig blancheres.
- Skær renale blodkar, urinrøret og omgivende bindevæv og fedtvæv med en saks til at indsamle nyrerne. Så gør en kort tåre i nyre kapsel og skræl nyrerne til at decapsulate dem. Placer nyrerne i iskoldt PBS. Eutanasi bekræftes af en torakotomi.
- Forbered 5 x 5 mm cover glaschips overtrukket med poly-L-lysin. Skær et låg glass med en diamant blyant og sted ca. 20 pi 0,01% sterilfiltreret Poly-L-lysin opløsningen på hvert glas chip. Forbered saltvand og to par urmager pincet til dissektion.
- Skær nyrerne med et barberblad langs det frontale plan i skiver på ~ 1-2 mm tykkelse. Placer en af skiverne under et stereomikroskop. Isolering af væv skal ske i iskoldt saltvand.
- Find cyster under et stereomikroskop som round-shape hulrum (figur 2A); deres vægge indeholder ofte fremtrædende netværk af prolifererede blodkar. Ved hjælp af spids pincet dissekere det indre epitel lag af en cyste så tynd som muligt for at opnå et monolag område. Fastgøre den til et glas chip dækket med Poly-L-lysin. Sticky Poly-L-Lysin overflade tillader forskeren at fast positionere det indre cyste lag på glas. Udsætte cyste med apikale side op for at give adgang til pipetterne (figur 2B).
- Brug PCK eller SD rotte barnNey centrale skiver indeholdende papilla til isolering af ikke-udvidede CNT / CCDsegments 18-21.
BEMÆRK: Papillær væv er mere holdbare end cortex og ved at holde papillære rørformede bånd med pincet og rive langs radiale akse skiven kan spaltes i tynde sektorer. Individuelle tubuli er synlige og kan trækkes ud til at blive placeret på cover glaschips. - Identificer CNT / CCD-segmenter ved bifurkationer, højere transparens end proksimale tubuli og store fremtrædende synlige celler (Figur 2C). Placer dækglas chip med vedhæftede tubuli under et mikroskop udstyret med mikromanipulatorer egnede til kørsel mikropipetter. Brug skarpe mikropipetter split-åbne tubuli og vedhæft deres kanter til glasset for at gøre tilgængelige den apikale overflade (figur 2D).
2. Single Channel Patch-clamp Elektrofysiologi
- Fyld patch-clamp kammer med bad løsning og overføre låget glas chipmed isolerede væv til kammeret. Sørg for, at patch-clamp mikropipetter har modstand på 7-10 MOhm for pålidelige på celle (celle-vedhæftet) målinger.
- For celle- fastgjort målinger, indstille forstærkerens forstærkning forhold til 20x og lavpas strømmene ved 300 Hz ved en otte-polet Bessel-filter. Til overvågning ENAC kanaler, bruge en badopløsning, i mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipette: 140 LiCI, 2 MgCl2 og 10 HEPES (pH 7,4).
- Gennemføre en konventionel patch-clamp eksperiment i en celle-attached tilstand 10. Vælg en celle i epitel monolag og tilgang pipetten til den apikale membran. Form en høj modstand forsegling mellem en pipette og cellemembran ved at anvende blid sugning. Når en høj resistent gigaohm forsegling er dannet, bør et hul-fri protokol på en bedrift potentiale startes til overvågning aktivitet af kanalen af interesse.
- Store hul-fri enkelt kanal aktuelle data fra gigaOhm tætninger til efterfølgende analyse. Analyser kanal begivenheder ved hjælp af en software-pakke generelt leveres med patch-clamp opsætninger 18. Beregn kanal aktivitet som NPo hvor N betegner antallet af aktive kanaler i plastret og P o er gennemsnitlige åben sandsynlighed for kanalerne.
BEMÆRK: Brug isolerede cyster eller tubuli i patch-clamp-forsøg for ikke mere end 30 min.
3. Ratiometrisk epifluorescens Målinger af intracellulære calciumkoncentration i epithelcellerne
- Anvend 5 mM Fura-2:00 opløst i DMSO. Alikvot stamopløsning i individuelle 500 pi koniske rør (ca. 10 ul). Beskyt mod lys og opbevares i fryseren ved -20 C i op til seks måneder.
- Inkuber isolerede cyster og split-open tubuli 30-40 minutter i PSS (i mM: 145 NaCl, 4,5 KCI, 2 MgCl2, 2 CaCl2 og 10 HEPES ved pH 7,35) indeholdende 5 pM Fura-2 AM farvestof og 0,05% pluronsyre at hjælpe dispergere acetoxymethylestere. For at placere væv i 3,5 cm skål indeholdende loading cocktail, beskytte mod lys og inkuber på en langsom omryster ved stuetemperatur.
- Skift Fura-2 AM holdige medier til at rense PSS efter inkubering og placere vævet under et mikroskop for yderligere at udføre epifluorescens billeddannelse.
- Tænd CCD-kamera og stabil lyskilde (monochromator systemet) udstyret med filterhjulet (kan hvert filter position være forbundet med sin egen dæmpningsniveau, valgt hver gang filteret kaldes).
- Find vævet i lyse felt. Skift til påvisning af fluorescenssignalet og justere intensiteten af lyskilden ved hjælp neutralfiltre og lampeeffekt at undgå mætning af signalet.
- Monitor Fura-2 AM fluorescens i vævsprøven med ratiometrisk excitation ved 340/380 nm med frekvenser på 0,125 Hz eller højere. Brug en 40 × / NA 1.3 eller lignende objektiv for korrekt resolution billede.
- Til billedbehandling og beregninger importerer billedet sekvensen. Sørg for at opdele kanalerne og bruge en hyperstack gråtoner tilstand. Vælg flere regioner af interesse (enkelt cyste celler eller udvalgte områder af cystisk væv) og beregne intensitetsværdier for hver kanal (340 og 380 nm) i foretrukne dataanalyse software; Fratræk baggrund intensitetsværdier fra hvert datapunkt.
- For hvert tidspunkt at beregne forholdet mellem intensiteterne af Fura-2 AM 340 til 380 kanaler. Plot scatter / line point-time ændringer af Ca 2+ forbigående for hver region og beregne middelværdier / SE-værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potentiale ENaC involvering i cystogenesis er blevet påvist ved flere undersøgelser, der observerede forstyrret epidermal vækstfaktor (EGF), signalering i PKD progression 22-25 og unormal natrium reabsorption i ARPKD murine modeller og vævskulturer 26-28. For eksempel Veizis et al. Viste, at amilorid-følsomme Na + absorption er faldet i cd-celler fra den ikke-ortologe BPK musemodel for ARPKD 29. Vi har for nylig vist, at nedsat natrium og vand reabsorption i cyster er en vigtig faktor i skærpende cystogenesis 10. Specifikt anvendtes elektrofysiologiske og immunhistokemisk analyse og konstateret, at cyster udøver sløvet reabsorption af natrium. En farmakologisk tilgang påvist, at selektiv blokade ENaC forværrer markant cyste progression 10.
Vi yderligere demonstreret effekten af administration af benzamil, en ENaC blocker, on aktivitet af kanalerne i cyste væg. 4 uger gamle PCK rotter blev leveret med køretøjet eller drikkevand indeholdende benzamil (15 mg / ml) ad libitum. Efter 12 ugers behandling blev dyrene behandlet i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne protokol. Patch-clamp blev udført på de cystiske monolag isoleret fra køretøjet og benzamil behandlede grupper. Figur 3 viser repræsentative aktuelle spor af ENaC-aktivitet optaget fra apikale membraner. Resuméet Grafen viser, at gennemsnitlig ENaC aktivitet (NP o) var 0,91 ± 0,15 10 i cyster i kontrolgruppen, mens benzamil administration faldt aktiviteten af kanalen til 0,32 ± 0,05. Vi konkluderer, at i ARPKD (karakteriseret ved ekstatisk udspiling af cd'er til at danne en lang række spindel-formet nyre cyster 30) benzamil givet i drikkevand når renale cyster med urin flow 30. Denne effekt gør det muligt at mindske benzamil natrium reuptake fra cystevæske, contr ibuting at cystogenesis 10.
Ud over EGF pathway, blev adenosintriphosphat (ATP) og andre puriner også identificeret som en kritisk parakrin signalering komponent, der er uhensigtsmæssigt moduleret i PKD modeller og hos patienter med denne sygdom. Det blev rapporteret, at purinergisk signalering spiller en vigtig rolle i cystogenesis under både ADPKD og ARPKD 31,32. Cyste celler af PCK rotter har tidligere vist sig at udvise lav basal [Ca2 +] i og tab af flow-medieret [Ca2 +] i signalering sammenlignet med raske ikke-udvidede samlekanalerne SD-rotter 13. P2 receptoragonister modulere udviklingen af nyrecyster i en in vitro model af cystedannelse afledt af CPK / CPK musen 33. Høj ATP-koncentration blev fundet i cystisk væske fra ADPKD patienter 34 og i medier betinget af cystisk nyre epitel dyrket fra CPK / CPK mus 35.
_content "> Vi testede calciumflux som respons på exogen ATP administration. PCK cyster og normale kortikale kanaler fra SD-rotter blev isoleret for calcium målinger før og efter anvendelse af 10 pM ATP. data vist i figur 4 viser virkningen af 10 uM ATP i cystisk tubuli PCK rotter undersøgt med to forskellige fremgangsmåder: Figur 4A viser målinger af Fura-2:00 fluorescensintensitet ved 340 og 380 nm i en epifluorescens setup udstyret med en monochromator, og figur 4B repræsenterer registrering af Fluo-8 farvestof farvning med konfokal mikroskopi. Begge teknikker demonstrerer lignende kinetik for calcium transient respons på ATP ansøgning cystisk epitel 10.
Figur 1:. Skematisk fremstilling af forsøgsprotokollen Efterdyret er korrekt bedøvet og forberedt til kirurgi, er nyrerne skyllet med PBS for at fjerne blod. Derefter nyrerne udskæres, Decapsulated, og cystisk monolag eller ikke-forstørrede tubuli isoleres manuelt med pincet under et stereomikroskop. Ikke-dilaterede tubuli er opdelt åben med mikropipetter drives af mikromanipulatorer mens cystisk epitel som intern overflade af cyster ville være åben for at få adgang til den apikale side.
Figur 2: Isolering og udarbejdelse af cystiske og opsamlingskanal monolag (A) En repræsentant nyre skive fra 16 uger gamle PCK rotte.. (B) En cystisk monolag på et dækglas chip overført til et mikroskop for patch-clamp-analyse eller calcium imaging (60X). (C) A CNT / CCD segment med forgreningen isoleret fra en SD rotter. ( 
Figur 3: Effekt af benzamil behandling på ENaC aktivitet i cystisk epitel. (A) Repræsentative nuværende spor til ENaC aktivitet målt i celle vedhæftet pletter af cyster frisk isoleret fra 16 uger gamle PCK rotter administreret 12 ugers benzamil i drikkevand. Disse patches blev afholdt på en test potentiale V h = -V p = -40 mV. Aktiv Li + strømme nedad. Stiplede linjer angiver den respektive aktuelle tilstand med en "c" og "o n" angiver de lukkede og åbne tilstande. (B) Oversigt graf over observerede ENaC aktivitet (NP o) (delvis gengivet fra 10 med tilladelse). * P <0,05 veRSU'erne køretøj. 
Figur 4: Virkning af ATP på calciumindstrømning i cystisk celler af PCK rotter (A) Repræsentative billeder af cystisk monolag fyldt med Fura-2 AM før og efter anvendelse af 10 pM ATP.. Graph opsummerer virkningen af ATP calciumniveauer i cellemonolaget af PCK rotter og SD samlekanalerne (N = 38 celler). (B) Cystisk monolag fyldt med Fluo-8 farvestof før og efter anvendelse af 10 uM ATP og resumé graf over intracellulært calcium respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrev her anvendelser af konventionelle patch-clamp-teknik og epifluorescens calcium billeddannelse til cystisk epitel monolag afledt af en murin genetisk model af ARPKD. Protokollen består af tre trin, hvoraf skal betales mest opmærksomhed til isolering af cyster (trin 1.5 i protokoller sektionen) og til de elektrofysiologiske undersøgelser. Disse centrale procedurer kræver omfattende uddannelse og tålmodighed, og læseren bør ikke være frustreret på én gang.
Først og fremmest bør det mest opmærksomhed til processen af cyste monolag isolation. Denne del af forberedelsen kræver manuelle færdigheder og væsentligt påvirker det videre arbejde, som tykkelsen af prøven og dens endnu tilknytning til et glas chip er kritisk for synligheden af cellerne. Tykkelse af isolerede cyste vægge varierer i forskellige dele af prøven, og det anbefales at fokusere på større cyster med større monolag områder bekvemt for work. For at hjælpe med at rense prøven og få adgang til monolag bør omgivende væv skrælles med en pincet under et stereomikroskop. Det skal understreges, at teknikken indebærer anvendelse af en høj kvalitet stereomikroskop kendetegnet ved en betydelig felt dybde og en evne til at ændre forstørrelsen i en bred vifte at rumme varierende størrelser af objekter under dissektion. En anden begrænsning ved metoden er, at sådanne sofistikerede teknikker som patch-clamp og calcium imaging kræver personale med disse metoder. Vi foreslår, at de første erfaringer kan fås på opsamlingskanal cellekulturer, såsom kommercielt tilgængelig kortikale M1 og medullær IMCD celler som de danner epitelial monolag ligner cyster.
Vores tilgang tillader måling ionkanaler aktivitet og [Ca2 +] i-niveauer i det native miljø frisk isolerede væv. Den største fordel ved denne procedure er, at fremstilling af prøver til sie-kanals analyse eller farvestof lastning ikke kræver enzymatisk behandling, skade mekaniske procedurer eller andre potentielt skadelige trin. Den udføres manuelt med pincet i saltvand og giver store ubeskadigede prøver. Sådanne enheder kan anvendes ikke kun til de beskrevne teknikker. Faktisk isoleret cystisk epitel repræsenterer tynd film af rene rørformede celler og opretholder indfødte monolag egenskaber, hvilket gør det et værdifuldt intakt objekt for real-time eksperimenter, som producerer fysiologisk relevante observationer. Hvis isoleringen af cyster synes at hårdt en procedure for forskeren eller en stor mængde af cystisk væv er nødvendig på én gang, enzymatisk behandling (for eksempel med dispase og collagenase, som beskrevet her 38 for det kortikale samlerørene tubuli) kan anvendes at forenkle fremgangsmåden til isolering. Dog bør forskeren være meget forsigtig, mens de udfører denne behandling, som enzymer, især proteaser, kan have stor indflydelse ion Channels aktivitet eller beskadige membranreceptorer. Det er for eksempel meget vigtigt for studier af purinergisk signalering, da disse membranproteiner er meget velkendt for hurtigt nedbrydes under enzymatisk behandling 39,40.
Derudover kan cystisk epitel anvendes til andre formål, såsom immunhistokemi eller farvning af en fast monolag med farvestoffer (f.eks rhodamin phalloidin) eller indlæsning af friske væv med intracellulære stof markører, såsom DAF-FM for NO detektion eller forskellige farvestoffer til overvåge reaktive oxygenspecies produktion. Det foreslås at anvende rene fraktion af isolerede cystisk epitel for western blotting for at eliminere virkningen af ikke-specifikke faktorer i de samlede lysater nyre. Vi foreslår også, cystisk epitel kan tilsvarende isoleres fra mus eller andre arter, der er tilgængelige for de undersøgelser af forskellige modeller af ikke blot ARPKD, men også ADPKD. Frisk isolerede cyste prøver har ubestrideligefordele for molekylærbiologi tilgange i forhold til de dyrkede celler cystiske, da de bedre opretholde egenskaberne af cystisk væv i organet, og utvivlsomt give mere begrundede data om in vivo sygdomsprocesser.
En af de betydelige fordele ved denne teknik er en mulighed for at anvende almindelige ikke-udspilet samlekanalerne fra samme nyrer eller SD rotter tubuli (disse rotter deler genetiske baggrund med PCK rotter), som kontrol væv. Lignende patch-clamp og calcium målinger i nephron segmenter er meget udbredt på ikke-cystisk nyrer i mange laboratorier 41-43. Afhængigt ion kanaler type, forskellige modifikationer af patch-clamp-metoden kan anvendes (hel celle, inside-out, uden-out); for eksempel, ENaC og ROMK (ydre medulla renalis kaliumkanal) aktivitet kan vurderes ved helcelle-konfiguration 44,45. Den foreslåede Fura-02:00 calcium billeddannelse i bred marken epifluorescens med monochromator kan også udføres med enhver anden lignende ændring af calcium billeddannelse såsom analyse med konfokal eller to-foton mikroskopi med andre calcium farvestoffer. Disse mikroskop systemer er mindre overkommelige, men giver højere kvalitet og er mere følsomme end bredt felt mikroskopi. Lignende fremgangsmåde blev også anvendt til at studere trpC kanaler aktivitet og calcium signalering i podocytter frisk isoleret glomeruli 17,46,47. Andre calcium imaging, der kunne anvendes indbefatter anvendelse af Fluo-8 som demonstreret i figur 4B eller ratiometrisk konfokal måling med Fluo4 / FuraRed fluorescerende farvestoffer som beskrevet i Ilatovskaya et al. 46 Teknisk er det muligt at udføre både patch-clamp og calcium imaging samtidigt på den samme celle, hvis mikroskop er udstyret med både opsætninger. Således beskrevne teknik er en mulig fremgangsmåde for høj kvalitet bemærkninger inden for PKD, der kan fleksibelt ændres i henhold til the behovene i din specifikke forskning og tilgængeligheden af udstyr. Endvidere kan forskellige modifikationer af calcium billeddannelse anvendes her, herunder ratiometriske konfokale målinger med Fluo4 / FuraRed fluorescerende farvestoffer (som beskrevet i Ilatovskaya et al. 46) eller Fluo-8 som demonstreret i figur 4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) for fremragende teknisk bistand med mikroskopi eksperimenter. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health giver R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (til OPO) og K99 HL116603 (til TSP), National Kidney Foundation IG1724 (til TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (til OPO) og Ben J. Lipps Research Fellowship fra American Society of Nefrologisk (til DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
- Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
- Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
- Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
- Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
- Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
- Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
- Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
- Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
- Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
- Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
- Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
- Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
- Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
- Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
- Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
- Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
- Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
- Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
- Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
- Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
- Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
- Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
- Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
- Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
- Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
- Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
- Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
- Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
- Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
- Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
- Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
- Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
- Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
- Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
- Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
- Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
- Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
- Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
- Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
- Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
- Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).
