Summary
Los canales iónicos expresadas en el epitelio tubular renal desempeñan un papel importante en la patología de la enfermedad poliquística del riñón. Aquí se describen los protocolos experimentales utilizados para realizar mediciones de análisis y el nivel de calcio intracelular patch-clamp en el epitelio quística recién aisladas de los riñones de roedores.
Abstract
Iniciación quiste y expansión durante la enfermedad renal poliquística es un proceso complejo caracterizado por anormalidades en la proliferación celular tubular, acumulación de líquido luminal y la formación de matriz extracelular. La actividad de los canales iónicos y la señalización de calcio intracelular son parámetros fisiológicos clave que determinan las funciones de epitelio tubular. Hemos desarrollado un método adecuado para la observación en tiempo real de la actividad de los canales iónicos con la técnica de patch-clamp y el registro de nivel intracelular de Ca2 + en monocapas epiteliales recién aisladas de quistes renales. PCK ratas, un modelo genético de la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD), se utilizaron aquí para el análisis ex vivo de los canales iónicos y el flujo de calcio. Descrito aquí es un procedimiento detallado paso a paso diseñado para aislar monocapas quísticas y túbulos no dilatado de PCK o ratas normales Sprague Dawley (SD), y supervisar la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ dinámica.Este método no requiere procesamiento enzimático y permite el análisis en un entorno nativo de recién aisladas monocapa epitelial. Además, esta técnica es muy sensible a los cambios de calcio intracelular y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas. Por último, aislado epitelio quístico se puede utilizar más de tinción con anticuerpos o colorantes, preparación de cultivos primarios y purificación de diversos ensayos bioquímicos.
Introduction
Los canales iónicos juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular. Enfermedades renales autosómicos dominantes y recesivos poliquísticos (PQRAD y ARPKD, respectivamente) son trastornos genéticos caracterizados por el desarrollo de quistes llenos de líquido renales de origen de las células epiteliales tubulares. PQRAD está causada por mutaciones de los genes PKD1 o PKD2 codifican poliquistinas 1 y 2, las proteínas de membrana que participan en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. PKD2 por sí mismo o como un complejo con PKD1 también funcionan como un canal catiónico -permeable Ca 2 + 1. Las mutaciones del gen que codifica PKHD1 fibrocystin (una proteína similar al receptor de los cilios asociada a involucrados en el tubulogenesis y / o mantenimiento de la polaridad del epitelio) son el impulso genético de ARPKD 2. Crecimiento quiste es un fenómeno complejo acompañada con la proliferación perturbado 3,4, la angiogénesis 5, la desdiferenciación y pérdida de polardad de las células tubulares 6-8.
Reabsorción defectuosa y secreción aumentada en el epitelio quístico contribuyen a la acumulación de líquido en el lumen y el quiste de expansión 9,10. Flujo dependiente Deterioro [Ca 2 +] i de señalización también se ha vinculado a la quistogénesis durante PKD 11-15.
Aquí se describe un método adecuado para mediciones de patch-clamp de la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ niveles en monocapas epiteliales quísticas aisladas de ratas PCK. Este método fue aplicado con éxito por nosotros para caracterizar la actividad del canal epitelial de Na + (ENAC) 10 y la [Ca2 +] i dependiente de procesos inducidos por Ca2 + TRPV4 -permeable y la cascada de señalización purinérgico 13.
En estos estudios se utilizaron ratas PCK, un modelo de ARPKD causada por una mutación espontánea en el gen PKHD1. La cepa PCK fue originally derivados de las ratas 16 ratas de ese modo SD se utilizan como un control apropiado para la comparación con la cepa Sprague-Dawley PCK (SD). Como resultado, ambos segmentos de la nefrona de ratas SD y conductos no dilatado recogida aisladas de ratas PCK mismos pueden servir como dos grupos de comparación diferentes para experimentos en el epitelio quística.
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Protocol
Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Colegio Médico de Wisconsin y la Universidad de Texas Health Science Center en Houston y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La Figura 1 demuestra principales etapas del aislamiento de tejido y procedimiento de procesamiento. En pocas palabras, los riñones de ratas PCK o SD se utilizan para el aislamiento Manual de monocapas epiteliales de los conductos colectores, ya sea a partir de los túbulos o quistes no marcado saludables. Aquí estudiamos riñones de 4-16 semanas de edad ratas PCK 10,13.
1. Aislamiento del renales Quistes y Tubos de conexión (CNT) / conductos colectores (CD) Segmentos
- Anestesiar animal experimental con isoflurano (5% de inducción, 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / O de grado médico 2 u otro método aprobado. Los animales deben ser monitoreados continuamente para asegurar le adecuadavel de la anestesia. Reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada.
- Realizar laparotomía y lavar los riñones con tampón fosfato salino (PBS) a través de la aorta abdominal 17.
- Preparar un catéter tubo de polietileno (PE50) y conectarlo a una bomba de jeringa llena con PBS. Cortar la piel y la pared abdominal a lo largo de la línea alba, a continuación, hacer una incisión abdominal transversal a través del abdomen de lado a lado y cambiar los órganos abdominales con hisopos de algodón obtener acceso a la aorta descendente que con ramificación arterias mesentéricas y celíacos. Humedezca los órganos internos con solución salina caliente durante los procedimientos adicionales para evitar su sequedad.
- Coloque una ligadura (# 1) alrededor de las arterias mesentéricas y celíacos y otra ligadura (# 2) alrededor de la aorta por debajo del diafragma (no atar). Separar suavemente a. abdominalis por embotar la disección de los tejidos conectivos alrededor de ella con unas pinzas finas y colocar dos ligaduras ~ 3mm por debajo de la arteria renal izquierda (# 3) y por encima de la bifurcación arterias ilíacas (# 4).
- Ate ligadura # 4 y adjuntar una pinza recipiente alrededor de la aorta entre la arteria renal izquierda y ligadura # 3. Hacer una incisión entre la abrazadera y la ligadura # 4 de sondar la aorta, utilice ligadura # 3 para fijar firmemente el catéter.
- Suelte la abrazadera y asegurarse de que el pulso de la sangre es visible en el catéter para asegurar una correcta instalación. Iniciar la perfusión a una velocidad de 6 ml / min, atar ligaduras # 1 y # 2, y se cortó la vena renal izquierda. Continuar enjuagando durante 1-2 minutos hasta que los órganos están completamente blanqueadas.
- Cortar los vasos sanguíneos renales, la uretra y los tejidos conectivos circundantes y adiposo con unas tijeras para recoger los riñones. A continuación, hacer un corto desgarro en la cápsula renal y la cáscara de los riñones para decapsulate ellos. Coloca los riñones en helado de PBS. La eutanasia se confirma mediante una toracotomía.
- Preparar 5 x 5 mm chips de vidrio cubierta revestidas con poli-L-lisina. Corte un gla cubiertass con un lápiz de diamante y el lugar aproximadamente 20 l de solución de 0,01% esterilizada por filtración de poli-L-lisina en cada chip de vidrio. Preparar solución salina y dos pares de pinzas de relojero para la disección.
- Cortar los riñones con una hoja de afeitar a lo largo del plano frontal en rodajas de ~ 1-2 mm de espesor. Coloque una de las rebanadas bajo un microscopio estereoscópico. Aislamiento de tejidos debe hacerse en solución salina enfriada con hielo.
- Busque quistes bajo un microscopio estereoscópico como cavidades redondo (Figura 2); sus paredes contienen a menudo la red prominente de vasos sanguíneos proliferado. Utilizando unas pinzas de punta fina diseccionar la capa epitelial interna de un quiste tan delgada como sea posible para obtener una zona de monocapa. Adjuntar a un chip de vidrio cubierto con poli-L-lisina. Sticky superficie de poli-L-lisina permite al investigador para posicionar firmemente la capa interna del quiste en el vidrio. Exponer el quiste con la parte apical hasta facilitar el acceso de las pipetas (Figura 2B).
- Utilice PCK o rata SD niñorebanadas centrales ney contienen papila para el aislamiento de no dilatadas CNT / CCDsegments 18-21.
NOTA: los tejidos papilares son más duraderas que la corteza y mediante la celebración de bandas tubulares papilares con fórceps y desgarrando a lo largo de eje radial de la rebanada puede escindirse en sectores delgadas. Túbulos individuales son visibles y pueden ser sacados para ser colocados en los chips de vidrio cubierta. - Identificar los segmentos de CNT / CCD por bifurcaciones, una mayor transparencia de los túbulos proximales y grandes células prominentemente visibles (Figura 2C). Coloque el chip de vidrio cubierta con túbulos unidos bajo un microscopio equipado con micromanipuladores adecuados para micropipetas conducción. El uso de micropipetas afilados túbulos dividida abiertos y fije sus extremos a la copa para que la superficie apical accesible (Figura 2D).
Electrofisiología 2. Single Channel Patch-clamp
- Llenar la cámara de patch-clamp con solución de baño y transferir el chip de vidrio cubiertacon tejidos aislados a la cámara. Asegúrese de que las micropipetas patch-clamp tienen una resistencia de 7.10 mO para mediciones (células adjunta) fiables sobre las células.
- Para las mediciones de células adjunta, establecer la relación de ganancia del amplificador de 20x y de paso bajo las corrientes de 300 Hz por un filtro de ocho polos de Bessel. Para el monitoreo canales CENa, utilice una solución de baño, en mm: 150 NaCl, CaCl2 1, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 de MgCl 2 y 10 HEPES (pH 7,4).
- Llevar a cabo un experimento de patch-clamp convencional en un modo celular conectado a 10. Seleccione una celda en la monocapa epitelial y acercarse a la pipeta a la membrana apical. Forma un sello de alta resistencia entre una pipeta y la membrana celular mediante la aplicación de una suave succión. Una vez que se forma un sello de alta GigaOhm resistentes, un protocolo sin huecos en un potencial de mantenimiento se debe iniciar la actividad de seguimiento del canal de interés.
- Datos actuales tienda brecha gratis solo canal de gigaSellos ohmios para su posterior análisis. Analizar los eventos de canal utilizando un paquete de software en general, se suministra con configuraciones de patch-clamp 18. Calcular la actividad del canal como NPO donde N se refiere al número de canales activos en el parche y Po es probabilidad de apertura promedio de los canales.
NOTA: Utilice quistes o túbulos aislados en experimentos de patch-clamp para no más de 30 min.
3. Ratiometric epifluorescencia Las mediciones de concentración de calcio intracelular en las células epiteliales
- Utilice 5 mM Fura-2AM disuelto en DMSO. Solución Alícuota caldo en tubos cónicos de 500 l individuales (aproximadamente 10 l). Proteger de la luz y guardar en el congelador a -20 ° C durante un máximo de seis meses.
- Incubar quistes aislados y túbulos reventados por 30-40 min en PSS (en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl2 2, 2 CaCl2 y 10 HEPES a pH 7,35) que contiene 5 mM Fura-02 a.m. colorante y 0,05% de ácido plurónico para ayudar a dispersar los ésteres de acetoximetilo. Para eso, lugar tejidos en el plato de 3,5 cm que contenía cóctel de carga, protegerlo de la luz y se incuba en un agitador lento a temperatura ambiente.
- Cambie Fura-02 a.m. contiene medios para limpiar PSS después de la incubación y colocar el tejido bajo un microscopio para realizar más imágenes de epifluorescencia.
- A su vez en la cámara CCD y la fuente de luz estable (sistema monocromador) equipado con rueda de filtros (filtro de cada posición puede asociarse con su propio nivel de atenuación, seleccionado cada vez que el filtro se llama).
- Encuentra el tejido en campo claro. Cambie a la detección de la señal de fluorescencia y ajustar la intensidad de la fuente de luz utilizando filtros de densidad neutra y potencia de la lámpara para evitar la saturación de la señal.
- Monitorear Fura-2 AM fluorescencia en la muestra de tejido con excitación radiométrica a 340/380 nm con una frecuencia de 0.125 Hz o superior. Use un 40 × / NC 1.3 o similar lente objetivo para resolu adecuadala imagen.
- Para el procesamiento de imágenes y los cálculos importar la secuencia de imágenes. Asegúrese de dividir los canales y utilizar un modo de escala de grises HyperStack. Seleccione varias regiones de interés (células quiste único o áreas seleccionadas de tejido quística) y calcular valores de intensidad para cada canal (340 y 380 nm) en el software de análisis de datos preferido; valores de intensidad fondo restar de cada punto de datos.
- Para cada punto de tiempo de calcular la relación de intensidades de las Fura-2 AM 340 a 380 canales. Gráfico de dispersión / línea cambios en tiempo punto de Ca 2+ transitorio para cada región y calcular los valores medios / SE.
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Representative Results
Participación ENaC potencial en quistogénesis ha sido demostrado por varios estudios que observan factor de crecimiento epidérmico perturbado (FEAG) de señalización en PKD progresión de 22-25 y la reabsorción de sodio anormal en ARPKD modelos murinos y cultivos de tejidos 26-28. Por ejemplo, Veizis et al. Mostraron que la absorción sensible a amilorida Na + se reduce en las células de CD desde el modelo de ratón BPK no ortólogos de ARPKD 29. Recientemente hemos demostrado que la alteración de sodio y la reabsorción de agua en los quistes es un factor importante en el agravamiento de la quistogénesis 10. En concreto, se empleó el análisis electrofisiológico e inmunohistoquímico y encontramos que los quistes ejercen la reabsorción de sodio romo. Un enfoque farmacológico demostró que el bloqueo selectivo ENaC exacerba notablemente la progresión quiste 10.
Además, demostró el efecto de la administración de benzamilo, un bloqueador de ENaC, on la actividad de los canales en la pared del quiste. 4 semanas de edad ratas PCK fueron suministrados con vehículo o agua que contiene benzamilo (15 mg / ml) ad libitum potable. Después de 12 semanas de tratamiento los animales fueron procesados de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Patch-clamp se realizó en las monocapas quísticas aisladas de vehículo y benzamilo grupos tratados. La Figura 3 muestra las huellas actuales representativas de la actividad de ENAC grabado de las membranas apicales. El gráfico de resumen demuestra que la actividad promedio de ENaC (NP o) fue 0,91 ± 0,15 10 en los quistes de grupo de control, mientras que la administración benzamilo disminuyó la actividad del canal de 0,32 ± 0,05. Llegamos a la conclusión de que en ARPKD (caracterizada por la distensión extático de CDs para formar numerosos quistes renales en forma de huso 30) benzamilo dada en el agua potable llega quistes renales con el flujo de orina 30. Este efecto permite benzamilo para disminuir la recaptación de sodio del líquido del quiste, contr ibuting a quistogénesis 10.
Además de la vía EGF, trifosfato de adenosina (ATP) y otras purinas también fueron identificados como un componente de señalización paracrina crítico que se modula de forma inapropiada en los modelos de PKD y en pacientes con esta enfermedad. Se informó de que la señalización purinérgica juega un papel importante en la quistogénesis durante tanto PQRAD y ARPKD 31,32. Quiste células de ratas PCK han sido previamente demostrado que presentan baja basal [Ca 2 +] i y la pérdida de mediada por flujo [Ca 2 +] i señalización en comparación con conductos colectores no dilatadas sanos de ratas SD 13. Agonistas de los receptores P2 modulan el desarrollo de quistes renales en un modelo in vitro de la formación de quistes derivado del ratón CPK / CPK 33. Alta concentración de ATP se encuentra en el líquido quístico de pacientes con PQRAD 34 y en medio condicionado por los epitelios renales quísticas cultivadas de ratones cpk / CPK 35.
_content "> Hemos probado el flujo de calcio en respuesta a la administración ATP exógeno. Se aislaron los quistes PCK y conductos corticales normales de ratas SD para las mediciones de calcio antes y después de la aplicación de 10 mM ATP. Los datos se ilustra en la Figura 4 revelar el efecto de 10 mM ATP en los túbulos quísticas de ratas PCK estudió con dos enfoques diferentes: La Figura 4A muestra las mediciones de intensidad de fluorescencia Fura-2AM en 340 y 380 nM en una configuración de epifluorescencia equipado con un monocromador, y la Figura 4B representa el registro de Fluo-8 tinción de colorante con confocal microscopía. Ambas técnicas demostrar una cinética similar de calcio respuesta transitoria de la aplicación ATP en el epitelio quística 10.
Figura 1:. Representación esquemática del protocolo experimental Despuésel animal es anestesiado adecuadamente y preparado para la cirugía, los riñones se lavan con PBS para eliminar la sangre. Entonces, los riñones son extirpados, decapsulated y monocapas quísticas o túbulos no dilatado se aíslan manualmente con pinzas bajo un microscopio estereoscópico. Túbulos no dilatadas se dividen-abierto con micropipetas accionadas por micromanipuladores mientras que el epitelio quístico como la superficie interna de los quistes estaría abierto a tener acceso a la parte apical.
Figura 2: Aislamiento y preparación de monocapas conductos quística y la recolección (A) Una rebanada riñón representante de 16 semanas de edad ratas PCK.. (B) Una monocapa quística en un chip de vidrio de cubierta transferida a un microscopio para el análisis de patch-clamp o imágenes de calcio (60X). Segmento / CCD (C) A CNT con bifurcación aislado a partir de una rata SD. ( 
Figura 3: Efecto del tratamiento benzamilo sobre la actividad de ENAC en el epitelio quístico. (A) trazas actuales representativos para la actividad de ENAC medido en parches de células adjunta de quistes recién aisladas de 16 semanas de edad ratas PCK administrada 12 semanas de benzamilo en el agua potable. Estos parches se llevaron a cabo a un potencial prueba del V h = -V p = -40 mV. Corrientes hacia el interior Li + son a la baja. Las líneas discontinuas indican el respectivo estado actual con una "c" y "o n" denota los estados cerrado y abierto. (B) el gráfico Resumen de actividad observada ENAC (NP o) (parcialmente reproducido de 10 con permiso). * P <0,05 cincovehículo de RSU. 
Figura 4: Efectos de la ATP en la entrada de calcio en las células quísticas de las ratas PCK (A) Imágenes representativas de monocapa quística cargado con Fura-2 am antes y después de la aplicación de ATP 10 mM.. Gráfica que resume el efecto de la ATP en los niveles de calcio en la monocapa de células de ratas PCK y SD conductos colectores (N = 38 células). (B) monocapa quística cargado con Fluo-8 tinte antes y después de la aplicación de 10 mM ATP y resumen gráfico de respuesta de calcio intracelular.
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Discussion
Describimos aquí las aplicaciones de la técnica de patch-clamp convencional y imágenes de calcio epifluorescencia a monocapas epiteliales quísticas derivadas de un modelo genético murino de ARPKD. El protocolo consiste en tres pasos, de los cuales se debe prestar la mayor atención al aislamiento de los quistes (paso 1.5 de la sección de protocolos) y para los estudios electrofisiológicos. Estos procedimientos clave requieren una amplia formación y la paciencia, y el lector no debe ser frustrada a la vez.
En primer lugar, se debe prestar la mayor atención al proceso de aislamiento de la monocapa quiste. Esta parte de la preparación requiere de habilidades manuales y un impacto significativo en la labor futura, como el grosor de la muestra y su aún apego a un chip de vidrio es fundamental para la visibilidad de las células. Espesor de las paredes del quiste aislados varía en diferentes partes de la muestra, y se recomienda para centrarse en quistes más grandes con áreas más grandes monocapa convenientes para WORk. Para ayudar a limpiar la muestra y acceder a la monocapa, tejidos circundantes deben pelarse con pinzas bajo un microscopio estereoscópico. Cabe destacar que la técnica implica la utilización de un microscopio estereoscópico de alta calidad se caracteriza por una profundidad de campo significativa y una capacidad para cambiar la ampliación en una amplia gama para dar cabida a diferentes tamaños de los objetos durante la disección. Otra limitación del método es que tales técnicas sofisticadas como patch-clamp de imágenes de calcio y requieren personal familiarizado con estos métodos. Sugerimos que la experiencia inicial se puede obtener en la recolección de cultivos de células del conducto como disponibles comercialmente células M1 y IMCD medular corticales ya que forman monocapa epitelial similar a los quistes.
Nuestro enfoque permite medir los canales iónicos actividad y [Ca 2 +] i niveles en el entorno natural de los tejidos recién aisladas. La principal ventaja de este procedimiento es que la preparación de muestras para Singlanálisis e-canal o colorante de carga no requiere tratamiento enzimático, dañando procedimientos mecánicos u otros pasos potencialmente perjudiciales. Se realiza manualmente con fórceps en solución salina y ofrece grandes ejemplares en buen estado. Estos especímenes se pueden utilizar no sólo para las técnicas descritas. De hecho, aislado epitelio quística representa película delgada de células tubulares puros y mantiene propiedades monocapa nativas, lo que hace que sea un objeto intacta valiosa para los experimentos en tiempo real que produce fisiológicamente observaciones pertinentes. Si el aislamiento de los quistes parece duro se requiere un procedimiento para el investigador o una gran cantidad de tejido quística a la vez, tratamiento enzimático (por ejemplo, con dispasa y colagenasa, tal como se describe aquí 38 para la cortical túbulos colectores del conducto) se puede utilizar para simplificar el proceso de aislamiento. Sin embargo, el investigador debe tener mucho cuidado al realizar este tratamiento, como enzimas, especialmente proteasas, puede afectar significativamente Channe ionesactividad ls 'o dañar los receptores de membrana. Esto es, por ejemplo, muy importante para los estudios de la señalización purinérgica, ya que estas proteínas de membrana son muy bien conocidos para degradar rápidamente bajo tratamiento enzimático 39,40.
Además, el epitelio quística se puede utilizar para otros fines, tales como inmunohistoquímica o tinción de una monocapa fija con colorantes (por ejemplo, rodamina phalloidin), o cargar el tejido fresco con marcadores de sustancias intracelulares, tales como DAF-FM para el NO detección o varios colorantes a supervisar la producción de especies reactivas del oxígeno. Se sugiere utilizar la fracción pura de aislado epitelio quístico para el Western Blot para eliminar el impacto de los factores no específicos presentes en lisados totales renales. También sugerimos que el epitelio quístico puede igualmente aislado de ratones u otras especies que están disponibles para los estudios de diversos modelos de no sólo ARPKD, sino también PQRAD. Recién aisladas muestras de quistes tienen innegableventajas para la biología molecular enfoques comparación con las células cultivadas quística, ya que mejor mantener las propiedades del tejido quística dentro del órgano, y, sin duda, proporcionan datos más justificados con respecto a los procesos de la enfermedad in vivo.
Una de las ventajas importantes de esta técnica es la posibilidad de utilizar no dilatado conductos colectores de los mismos riñones, o ratas SD túbulos (estas ratas comparten antecedentes genéticos con las ratas PCK) normal, ya que los tejidos de control. Mediciones de patch-clamp y calcio similares en segmentos de la nefrona son ampliamente utilizados en los riñones no quísticas en muchos laboratorios 41-43. Dependiendo Tipo de canales de iones, diferentes modificaciones de método de patch-clamp se puede utilizar (de células enteras, de dentro a fuera, el exterior hacia fuera); por ejemplo, ENAC y ROMK (canal de potasio medular externa renal) la actividad se pueden evaluar por la configuración de célula completa 44,45. La imagen de calcio Fura-02 a.m. propuesto en epifluorescencia de campo amplio con Monochromator puede también realizarse con cualquier otra modificación similar de imágenes de calcio tales como el análisis con microscopía confocal o de dos fotones con otros colorantes de calcio. Estos sistemas de microscopio son menos asequibles, pero proporcionan imágenes de mayor calidad y son más sensibles que la microscopía de campo amplio. Enfoque similar se aplicó también para estudiar los canales TRPC actividad y la señalización de calcio en los podocitos de recién aisladas glomérulos 17,46,47. Otras imágenes de calcio que podría aplicarse incluyen la utilización de Fluo-8 como se demuestra en la Figura 4B o medición confocal divisor de tensión con Fluo4 / colorantes fluorescentes FuraRed como se describe en Ilatovskaya et al. 46 Técnicamente, es posible llevar a cabo tanto patch-clamp y de imágenes de calcio simultáneamente en la misma célula si microscopio está equipado con ambas configuraciones. Por lo tanto, la técnica descrita es un enfoque viable para las observaciones de alta calidad en el campo de la PKD, que puede ser modificado de manera flexible de acuerdo con THe necesidades de su investigación y disponibilidad de los equipos específicos. Por otra parte, diversas modificaciones de imágenes de calcio puede usar aquí, incluyendo mediciones confocal ratiometric con Fluo4 / tintes fluorescentes FuraRed (como se describe en Ilatovskaya et al. 46) o Fluo-8 como se demuestra en la Figura 4B.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (OPO) y K99 HL116603 (con TSP), la Fundación Nacional del Riñón IG1724 (con TSP), Asociación Americana del Corazón 13GRNT16220002 (OPO) y Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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