Summary
表现在肾小管上皮细胞离子通道在多囊肾病的病理一个显著的作用。这里，我们描述用于执行囊性上皮从啮齿动物肾脏新鲜分离的膜片钳分析和细胞内钙水平的测量的实验方案。
Abstract
期间多囊肾囊肿萌生和扩展是一个复杂的过程，其特征在肾小管细胞增殖，管腔流体积累和细胞外基质的形成异常。离子通道和细胞内钙信号的活动是决定的肾小管上皮细胞功能的关键生理参数。我们开发适合于实时观察离子通道的活性与在上皮单层从肾囊肿新鲜分离的细胞内Ca 2+水平膜片钳技术和登记的方法。 PCK大鼠的常染色体隐性遗传性多囊肾病（ARPKD）遗传模型，这里被用作离子通道和钙流的体外分析。这里描述的是详细的一步一步的步骤旨在隔离囊性单层和非扩张管从PCK或正常只SD（SD）大鼠，并监视单通道活性和细胞内Ca 2+动力学。此方法不需要酶加工，并允许在分析新鲜分离的上皮单层的天然环境。此外，这种技术是将细胞内钙的变化非常敏感，并生成高分辨率的图像进行精确的测量。最后，分离的囊性上皮可进一步用于与抗体或染料，制备原代培养物的纯化和关于各种生化分析染色。
Introduction
离子通道在许多生理功能，包括细胞生长和分化中发挥显著作用。常染色体显性和隐性多囊肾疾病（ADPKD和ARPKD，分别）是其特征在于，所述的肾小管上皮细胞起源的肾流体填充囊肿的发展遗传性疾病。多囊肾是由PKD1或PKD2编码polycystins 1和参与细胞增殖和分化的调节如图2所示，膜蛋白的突变引起的。 PKD2本身或作为与PKD1一个复杂也发挥作为钙 -permeable阳离子通道1。所述PKHD1基因编码fibrocystin（涉及小管和/或维持上皮极性的纤毛相关受体样蛋白）的突变是ARPKD 2的遗传动力。囊肿生长是一个复杂的现象，伴随着不安扩散3,4，5血管生成，分化和极性损失性肾小管细胞6-8。
有缺陷的再吸收和分泌增强囊性上皮有助于在管腔和囊肿膨胀9,10-流体积聚。受损的流量依赖性钙离子浓度我的信号也已PKD 11-15时挂cystogenesis。
这里，我们描述适用于单通道活性和细胞内Ca 2+水平的囊性上皮单层从PCK大鼠分离的膜片钳测量的方法。这种方法成功地被我们用于表征上皮细胞钠离子通道（ENaC的）10的活性和钙离子浓度依赖我引起的钙 -permeable TRPV4和嘌呤信号级联13处理 。
在这些研究中，我们使用的PCK大鼠，模型ARPKD引起的在PKHD1基因的自发突变。该PCK应变originallÿ从的Sprague-Dawley（SD）大鼠16从而SD大鼠被用作适当的控制用于 与PCK应变比较而得。其结果是，既大鼠肾段和非扩张集合管从同一PCK大鼠分离可以作为两个不同的比较组对囊性上皮实验。
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Protocol
下面描述的实验程序，在威斯康星州和德克萨斯大学健康科学中心休斯敦大学医学院获得批准的机构动物护理和使用委员会，并分别按照卫生指南实验动物的护理和使用国家研究院。 图1显示的组织分离和处理过程的主要步骤。简要地说，从PCK或SD大鼠的肾脏用于收集无论是从健康非拨小管或囊肿导管上皮单层的手动隔离。在这里，我们从4-16周龄PCK大鼠10,13研究肾脏。
1.肾囊肿和连接小管（CNT）/隔离集合管（CD）段
- 麻醉实验动物异氟醚（5％的诱导，1.5〜2.5％的维护）/医用级O 2或其他经批准的方法。动物必须不断监控，以确保有足够的文件韦尔麻醉。稳定的呼吸频率和脚趾捏的反应是用来确定适当的麻醉。
- 执行剖腹并通过腹主动脉17冲洗用磷酸缓冲盐水（PBS）的肾脏。
- 准备一个聚乙烯管导管（PE50），并把它连接到注射泵填充有PBS。切开皮肤和腹壁沿白线，然后使整个腹部横向腹部切口，从一边到另一边倒腾腹部器官用棉签以访问降主动脉与肠系膜分支和腹腔动脉。在进一步的过程滋润五脏六腑用温生理盐水，以防止其干燥。
- 将一个连字（＃1）周围的肠系膜和腹腔动脉，另一结扎（＃2）周围的隔膜下主动脉（不打领带）。轻轻分开一个。腹钝性解剖结缔组织周围薄镊子把两个连写〜3左肾动脉下方毫米（＃3）和上述髂动脉分叉（＃4）。
- 领带结扎＃4和附加周围左肾动脉结扎和＃3之间的主动脉的容器夹具。使钳和结扎＃4导尿主动脉之间的切口，用绷带＃3牢固地固定导管。
- 释放夹紧并确保该脉是在导管可见以确保正确安装。开始灌流以6ml / min的速率，领带连字＃1和＃2，和切断左肾静脉。继续冲洗1-2分钟，直到脏器完全变白。
- 切肾血管，尿道口及其周围结缔组织和脂肪组织用剪刀来收集肾脏。然后作一个简短的撕裂肾囊和剥离肾脏解封他们。将肾脏入冰 - 冷PBS。安乐死是通过开胸手术证实。
- 制备涂覆有聚-L-赖氨酸的5×5毫米玻璃盖片。切盖GLA分类用金刚石铅笔和地点大约20微升的0.01％无菌过滤聚-L-赖氨酸溶液到每玻璃芯片。准备生理盐水和两对制表师镊子解剖。
- 切断与沿冠状面刀片肾脏进入1-2毫米厚度的〜切片。放置在立体显微镜下的片段之一。组织的分离应在冰冷盐水来完成。
- 定位在立体显微镜下为圆形状的空腔（图2A）囊肿;他们的墙壁通常含有增生的血管突出的网络。使用细尖镊子解剖囊肿尽可能地薄，得到的单层面积的内部上皮细胞层。它附加到覆盖有聚L-赖氨酸的玻璃片。粘聚-L-赖氨酸表面允许研究者牢牢定位在玻璃内部囊肿层。暴露与顶侧上的囊肿，以提供接入。移液器（图2B）。
- 使用PCK或SD大鼠的孩子内伊中央片含有乳头的非扩张的CNT / CCDsegments 18-21隔离。
注：乳头状组织比皮质和保持乳头管带用钳子和沿径向轴撕裂片可切割为薄部门更持久。个别小管是可见的，并可以拉出到被放置在盖玻璃芯片。 - 识别将CNT / CCD段由分岔，比近端小管和大显着可见的细胞（图2C）更高的透明度。放置附有小管的玻璃盖片上配备有适合驱动微量显微在显微镜下。使用锋利的微量分割开管和连接它们的边缘到玻璃使顶端表面可访问（图2D）。
2.单通道膜片钳电
- 填充膜片钳室浴溶液和传送护罩玻璃芯片与离体组织到腔室。确保膜片钳微量具有7-10兆欧电阻为可靠的细胞（细胞连接的）测量。
- 对于细胞贴附测量，将放大器的增益比20倍，并通过一个八极贝塞尔滤波器低通的电流，在300赫兹。对于ENaC的频道监测，使用一个浴溶液，以mM：150的NaCl，1的CaCl 2，2的MgCl 2，10 HEPES（pH 7.4）中;吸移管：140的LiCl，2的MgCl 2和10的HEPES（pH 7.4）中。
- 进行常规的膜片钳实验中一个细胞贴附模式10。选择在上皮单层的细胞并接近吸管顶膜。形成通过施加轻柔抽吸吸管和细胞膜之间的高电阻密封。一旦高耐千兆欧姆密封形成，在保持电位的间隙 - 自由协议应启动针对感兴趣的信道的监视活动。
- 从千兆存储的无间隙的单通道电流数据欧姆密封件进行后续分析。分析使用一般用膜片钳设置18提供的软件包的渠道活动。计算信道活性NPO其中N是指在贴片和P 2 O的活性通道的数量是信道的平均开放概率。
注：使用孤立囊肿或小管在膜片钳实验中不超过30分钟。
细胞内钙离子浓度的上皮细胞3成比例落射荧光测量
- 使用5mM的的Fura-2AM溶解在DMSO中。等分试样原液成单独的500μl的锥形管中（约10微升）。从光线并存储在冰箱在-20℃下长达半年的保护。
- 在PSS孵育孤立囊肿和分裂开管30-40分钟（毫米：145氯化钠，氯化钾4.5，2 氯化镁 ，氯化钙2 2和 10 HEPES pH值为7.35），含5微 米的Fura-2 AM染料和0.05％聚醚酸有助于驱散乙酰氧基甲基酯。为此，含有装载鸡尾酒地方的组织在3.5厘米培养皿，避光孵育一个缓慢摇动器上在室温下进行。
- 改变的Fura-2 AM含有媒体孵育后清洗PSS和放置组织，在显微镜下以进一步执行萤光成像。
- 打开CCD相机和稳定的光源（单色系统）配备了滤光轮（每个过滤器的位置可以有自己的衰减水平，选择每一个过滤器被调用时，相关联）。
- 查找在明视场组织。切换到检测荧光信号和调整用中性密度过滤器和灯功率，以避免信号的饱和度的光源的强度。
- 监视与比率激励的组织样品中的Fura-2 AM荧光在三百八十○分之三百四十○纳米，具有0.125 Hz或更高的频率。使用40×/ NA 1.3或类似的物镜正确的解像度化形象。
- 用于图像处理和计算导入图像序列。确保分裂渠道和使用hyperstack灰度模式。选择几个感兴趣的区域（单囊细胞或囊状组织选定的区域），并计算强度值每通道（340和380纳米）转换成首选数据分析软件;减法背景的强度值从每个数据点。
- 对于每个时间点计算出的Fura-2 AM 340〜380信道的强度的比率。地块分散/的钙瞬变每个地区的线路点时间的变化，并计算平均值/ SE值。
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Representative Results
潜在的ENaC参与cystogenesis已经证明了几项研究观察到了破坏表皮生长因子（EGF）在PKD进展22-25和异常钠重吸收在ARPKD鼠模型和组织培养26-28信令。例如，Veizis 等人表明，阿米洛利敏感的 Na +吸收在光盘细胞ARPKD 29的非直系同源BPK小鼠模型下降。我们最近证明，受损的钠和水的重吸收的孢囊是在加重cystogenesis 10的一个重要因素。具体来说，我们采用电生理和免疫组化分析，发现囊肿发挥迟钝钠的重吸收。药理学方法证明了选择性的ENaC阻断明显加剧囊肿进展10。
我们进一步表明benzamil，一个ENaC的阻断剂，给药的效果Ø在囊肿壁的通道的n个活性。 4周龄PCK大鼠供给车辆或饮用含有benzamil（15毫克/毫升）的水随意。治疗12周后的动物都根据上述的协议处理。膜片钳被上囊性单层从车辆分离和benzamil处理组进行的。 图3示出了从顶膜记录的ENaC活性的代表当前痕迹。摘要图显示，平均ENaC的活性（NP O）为0.91±0.15 10对照组的囊肿，而benzamil管理通道的活性下降至0.32±0.05。我们得出结论，在ARPKD（特征的CD狂喜腹胀以形成众多纺锤形肾囊肿30）benzamil饮用水中给定的到达肾囊肿与尿流30。这种效应使benzamil从囊液，对照减少钠的重吸收 ibuting到cystogenesis 10。
除EGF途径中，三磷酸腺苷（ATP）和其它嘌呤也被确定为是不适当调制PKD模型和患者患有这种疾病的关键旁分泌信号分量。据报道，嘌呤信令期间都多囊肾和ARPKD 31,32起着cystogenesis重要的作用。 PCK大鼠囊肿细胞先前已被证明表现出低的基础的[Ca 2+] i和丧失血流介导的[Ca 2+] i的信令相比SD大鼠13的健康非扩张集合管。的P2受体激动剂调节在从CPK / CPK鼠标33来自囊肿形成的体外模型肾囊肿的发展。高ATP浓度从多囊肾患者34和媒体囊性肾脏上皮细胞由肌酸磷酸激酶/肌酸磷酸激酶的小鼠35培养空调发现囊性液。
_content“>我们响应外源性ATP给药测试钙通量。PCK囊肿和正常皮质导管从SD大鼠中分离得到钙测量应用之前和10μM的ATP。数据的图 4所示后揭示为10μMATP的效果在PCK大鼠囊性肾小管研究了两种不同的方法： 图4A示出在表面荧光设置配备有单色器的Fura-2AM荧光强度在340和380纳米的测量， 而图4B表示的Fluo-8染料染色登记共焦显微镜。这两种技术都表现出相似的胆囊上皮细胞10 ATP应用钙瞬态响应动力学。
图1：实验方案的示意图后该动物被适当麻醉并为手术准备，肾脏被刷新用PBS以除去血液。然后，将肾脏切除，解封装，并且囊性单层或非扩张管与在立体显微镜下镊子手动隔离。非扩张管被分割开与微量通过显微操作而囊性上皮驱动作为孢囊的内表面将开放访问顶侧。
图2：隔离和准备的胆囊和集合管单层（A）16周龄PCK大鼠代表肾脏切片。 （B）上转移到显微镜膜片钳分析或钙成像（60X）玻璃盖片囊性单层。 （三）在CNT / CCD段与分叉从SD大鼠离体。 （ 
图3：在胆囊上皮细胞的ENaC活动benzamil治疗效果 。 （ 一）代表当前的痕迹在囊肿16周龄PCK大鼠新鲜分离的细胞贴附式膜片测量ENaC的活动给予12周benzamil的饮用水。这些补丁是在第V H = - V P = -40 mV的测试电位上。向内锂离子电流下降。虚线表示为“C”和“O N”表示在关闭和打开状态各自的当前状态。观察ENaC的活性（NP O）（由10部分经授权转载）（二）摘要图。 * P <0.05已经持有限制股的车辆。 
图4：对在PCK大鼠囊性细胞钙内流的影响ATP的载带fura-2 AM应用之前和10μM的ATP后囊性单层的（A）的代表性的图像。图表总结了PCK大鼠的细胞单层的ATP对钙水平的作用和SD集合管（n = 38个细胞）。（B）的前和加载的Fluo-8染料囊性单层应用为10μMATP和摘要图后细胞内钙离子反应。
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Discussion
我们在这里描述的传统膜片钳技术和表面荧光钙成像的应用程序从ARPKD的鼠的遗传模型导出囊性上皮单层。该协议包括三个步骤，其中最应引起重视的囊肿（协议节的步骤1.5）的隔离和电生理研究。这些关键步骤需要大量的训练和耐心，读者不应该立刻感到沮丧。
首先，最要注意的囊肿单层隔离的过程。制备的这一部分需要手工技巧和显著影响进一步的工作，作为检体和其连附到玻璃芯片的厚度为细胞的能见度非常重要。孤立囊壁厚度在试样的不同部位各不相同，并建议把重点放在大囊肿更大单层领域方便窝ķ。为了帮助清洁试样和访问单层，周围组织应去皮用在立体显微镜下用镊子。应当强调的是，该技术指利用高品质的立体特征在于显著场深度和能力来改变倍率在宽范围，以容纳不同大小的物体的夹层中。该方法的另一个限制是，由于膜片钳和钙成像这样复杂的技术人员需要熟悉这些方法。我们建议，可以在集合管的细胞培养物获得，例如市售皮质M1和髓质IMCD细胞的初步经验，因为它们形成类似囊肿上皮单层。
我们的方法允许测量离子通道活性的[Ca 2+] i的水平在新鲜分离的组织本地环境。这个过程的主要优点是，制备的试样的SINGL电子渠道分析或染料加载不需要酶处理，破坏机械程序或其他可能有害的步骤。它是在生理盐水钳手工完成，并提供了大量完好的标本。这样的标本可不仅用于所描述的技术。事实上，分离的囊性上皮表示纯肾小管细胞的薄膜，并保持原生单层特性，这使得它成为产生生理学相关观察的实时实验一种有价值完好对象。如果孢囊的分离似乎很难研究者或大量囊性组织的过程是必需的一次，酶处理（例如，用分散酶和胶原酶，如所描述这里38为皮质集合管小管）可以用于简化隔离过程。然而，研究人员应该非常小心，而执行此处理，酶，特别是蛋白酶，可显著影响信道均衡和离子ls'的活动或损坏膜受体。这是，例如，为嘌呤信令的研究非常重要，因为这些膜蛋白非常公知的下酶处理39,40快速降解。
此外，囊性上皮可用于其他目的，例如免疫组织化学的固定单层用染料或染色（如若丹明鬼笔环肽），或加载新鲜组织与细胞内物质的标记，诸如DAF-FM对NO的检测或各种染料监测活性氧的生产。它建议使用的分离的囊性上皮的纯馏分为Western印迹，以消除存在于总肾裂解物非特异的因素的影响。我们还建议，囊性上皮可以类似地从小鼠或可用于不仅ARPKD各种型号的研究其他物种中分离，也多囊肾。新鲜分离的囊肿标本不可否认优势为分子生物学办法相比，培养的囊性细胞，因为它们更好地维持器官内的囊性组织的性质，并无疑提供关于体内疾病过程更合理的数据。
一个这种技术的优点显著是一个可能使用正常的非扩张收集从同一肾脏，或SD大鼠小管管道（这些大鼠共享的遗传背景具有PCK只），作为对照组织。在肾单位的段相似膜片钳和钙测量被广泛使用在非囊性肾脏在许多实验室41-43。根据离子通道的类型，膜片钳法不同的修改都可以使用（全细胞，由内向外，外面向外）;例如，ENaC的和ROMK（肾外髓钾通道）活性可以通过全细胞构型44,45评估。在宽视场落射荧光与monoc建议的Fura-2 AM钙成像也可以按照与钙成像的任何其它类似的修改hromator如分析共焦或双光子显微镜与其它钙染料。这些显微系统都难以负担，但提供更高质量的影像，而且比宽视场显微镜更敏感。也适用类似的方法来研究TRPC通道活性，钙信号在新鲜分离的肾小球17,46,47的足。可以应用于其他钙成像包括利用率的Fluo-8如Ilatovskaya 等人 46技术上描述为证实图4B或比例共焦测量与Fluo4 / FuraRed荧光染料上，有可能同时执行膜片钳和钙成像同时在同一细胞如果显微镜配备有两个设置。因此，所描述的技术是一种可行的方法为在PKD的领域中对高品质的观测，可根据第进行灵活地调整您的具体研究和设备的可用性电子商务的需求。此外，这里可以使用钙成像的各种改进，其中包括比例共聚焦测量，Fluo4 / FuraRed荧光染料或荧光- 8（如在Ilatovskaya 等人 46所述 ），为表明图4B上。
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Acknowledgments
作者想感谢格伦·斯洛克姆（威斯康星医学院）和科琳A.拉文（尼康仪器公司）与显微镜实验优秀的技术援助。这项研究是支持由美国国立卫生研究院授予R01 HL108880（以AS），R01 DK095029（以OPO）和K99 HL116603（以TSP），全国肾脏基金会IG1724（以TSP），美国心脏协会13GRNT16220002（以OPO）和本·J.里普斯研究奖学金由美国肾脏病学会（至DVI）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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