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Biology

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Abstract

Zysten Initiierung und Ausdehnung während polyzystische Nierenerkrankung ist ein komplexer Prozess, gekennzeichnet durch Abnormalitäten in Rohrzellproliferation, luminale Flüssigkeitsansammlung und die extrazelluläre Matrixbildung. Aktivität von Ionenkanälen und der intrazellulären Calcium-Signalgebung sind wichtige physiologische Parameter die Funktionen der Tubulusepithel bestimmen. Wir entwickelten ein für Echtzeit-Beobachtung von Ionenkanälen Aktivität mit Patch-Clamp-Technik, und die Registrierung der intrazellulären Ca 2+ Pegel in epithelialen Mono frisch aus Nierenzysten isoliert Methode. PCK-Ratten, ein genetisches Modell der autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), wurden für die ex vivo Analyse der Ionenkanäle und Calciumfluss verwendet. Beschrieben wird hier eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren entwickelt, um zystische Monoschichten und nicht-dilatierten Tubuli von PCK oder normaler Sprague Dawley (SD) Ratten, zu isolieren und zu überwachen Einzelkanalaktivität und intrazelluläre Ca 2+ Dynamik.Dieses Verfahren erfordert keine enzymatische Verarbeitung und ermöglicht die Analyse in einer nativen Einstellung der frisch isolierten Epithelzellen-Monoschicht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calciumänderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen. Schließlich kann isoliert Zystenepithel weiter zum Anfärben mit Antikörpern oder Farbstoffe, wurden primäre Kulturen und Reinigung für verschiedene biochemische Assays verwendet werden.

Introduction

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, einschließlich Zellwachstum und Differenzierung. Autosomal dominante und rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD und ARPKD bezeichnet) sind genetische Störungen, die durch die Entwicklung von Nierenflüssigkeitsgefüllten Zysten des Rohr Epithelzelltumoren. ADPKD Mutationen von PKD1 oder PKD2 Gene Polyzystinen 1 und 2, Membranproteine ​​in der Regulation der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt kodiert verursacht. PKD2 allein oder als Komplex mit PKD1 fungieren auch als Ca 2+ durchlässige Kationenkanals 1. Mutationen des PKHD1 kodierende Gen Fibrocystin (a Zilien-assoziierten Rezeptor-ähnlichen Proteins in der Tubulogenese und / oder Wartung Polarität Epithel beteiligt sind) sind die genetischen Anstoß ARPKD 2. Zystenwachstum ist ein komplexes Phänomen mit gestörter Proliferation 3,4, Angiogenese 5, Dedifferenzierung und Verlust der polaren begleitetkeit von röhrenförmigen Zellen 6-8.

Defekten Reabsorption und Sekretion in Augmented Zystenepithel tragen zu einer Flüssigkeitsansammlung in dem Lumen und Zystenexpansions 9,10. Impaired strömungsabhängige [Ca 2+] i-Signalisierung wurde auch cystogenesis während PKD 11-15 verbunden.

Hier beschreiben wir eine für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Aktivität und der intrazellulären Ca 2+ -Spiegel bei zystischer epithelialen Monoschichten von PCK Ratten isoliert Methode. Dieses Verfahren wurde von uns erfolgreich angewendet, um der Aktivität des epithelialen Na + -Kanal (ENaC) 10 charakterisieren und [Ca 2+] i -abhängigen Prozesse durch Ca 2+ durchlässige TRPV4 und purinergen Signalkaskade 13 induziert.

In diesen Studien verwendeten wir PCK Ratten ein Modell ARPKD durch eine spontane Mutation in dem PKHD1 Gen verursacht. Die PCK-Stamm war originally von Sprague-Dawley (SD) Ratten 16 dadurch SD-Ratten werden als eine geeignete Kontrolle zum Vergleich mit dem PCK verwendete Stamm abgeleitet ist. Als Ergebnis können beide SD-Ratte nephron Segmenten und nicht-erweiterten Sammelkanäle vom selben PCK Ratten isoliert, wie zwei unterschiedliche Vergleichsgruppen für Versuche zur Zystenepithel dienen.

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Protocol

Die nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee am Medical College of Wisconsin und der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Figur 1 zeigt wesentliche Schritte des Gewebes Isolierung und Verarbeitungsverfahren. Kurz gesagt, werden Nieren von PCK oder SD-Ratten für die manuelle Isolierung von Epithelzellen Monoschichten von Sammelkanäle entweder von gesunden nicht-gewählten Tubuli oder Zysten verwendet. Hier untersuchten wir die Nieren 4-16 Wochen alt PCK Ratten 10,13.

1. Isolierung von Nierenzysten und Anschließen Röhrchen (CNT) / Sammelrohr (CD) Segmente

  1. Anesthetize Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. Die Tiere müssen ständig überwacht, um eine angemessene le zu gewährleistenvel der Anästhesie. Stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen.
  2. Zuführen Laparotomie und bündig die Nieren mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch die abdominale Aorta 17.
    1. Bereiten Sie einen Polyethylenschlauch Katheter (PE50) und verbinden Sie es mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt. Schneiden Sie die Haut und Bauchwand entlang der Linea alba, dann machen Sie einen transversalen Bauchschnitt über den Bauch von Seite zu Seite und verschieben Sie die Bauchorgane mit Wattestäbchen, um Zugang zu der absteigenden Aorta mit Verzweigungen mesenterialen und Zöliakie Arterien zu erhalten. Befeuchten Sie die inneren Organe mit warmer Kochsalzlösung während der weiteren Verfahren auf ihre Trockenheit zu verhindern.
    2. Legen Sie eine Ligatur (# 1) um die mesenterialen und Zöliakie Arterien und andere Blattschraube (# 2) um die Aorta unter der Membran (nicht binden). Vorsichtig trennen ein. abdominalis von stumpf sezieren Bindegewebe um ihn herum mit dünnen Pinzette und legen Sie zwei Ligaturen ~ 3mm unterhalb der linken Nierenarterie (# 3) und oberhalb der Darmbeinarterien Bifurkation (# 4).
    3. Binden Sie Ligatur # 4 und fügen Sie eine Gefäßklemme um die Aorta zwischen dem linken Nierenarterie und Unterbindung # 3. Einen Einschnitt zwischen der Klemme und Unterbindung # 4, um die Aorta katheterisieren, verwenden Sie Unterbindung # 3 in die fest zu fixieren, den Katheter.
    4. Lösen Sie die Klemme und stellen Sie sicher, dass das Blut Puls ist in dem Katheter sichtbar, um eine ordnungsgemäße Installation sicherzustellen. Starten Perfusion mit einer Rate von 6 ml / min, binden Ligaturen # 1 und # 2, und schneiden Sie die linke Nierenvene. Weiter spülen 1-2 Minuten, bis die Organe vollständig blanchiert.
    5. Schneiden Sie renalen Blutgefäße, der Harnröhre und der umgebenden Binde- und Fettgewebe mit einer Schere, um die Nieren zu sammeln. Dann machen Sie eine kurze Riss in Nierenkapsel und ziehen die Nieren, um sie decapsulate. Legen Sie die Nieren in eiskaltem PBS. Sterbehilfe wird durch eine Thorakotomie bestätigt.
  3. Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips mit Poly-L-Lysin beschichtet. Schneiden Sie ein Deckgläsernss mit einem Diamantstift und Ort etwa 20 & mgr; l 0,01% steril filtriert Poly-L-Lysin-Lösung auf jedes Glas-Chip. Bereiten Kochsalzlösung und zwei Paare von Uhrmacher Zangen für die Präparation.
  4. Schneiden die Nieren mit einer Rasierklinge entlang der Frontalebene in Scheiben von ~ 1-2 mm Dicke. Legen Sie eine der Scheiben unter einem Stereomikroskop. Isolierung von Gewebe sind in eiskalter Kochsalzlösung durchgeführt werden.
  5. Finde Zysten unter einem Stereomikroskop als Rundform Hohlräume (2A); ihre Wände enthalten oft prominente Netzwerk von vermehrten Blutgefäße. Verwenden von spitzen Pinzette sezieren die interne Epithelschicht einer Zyste so dünn wie möglich, um eine Monoschicht-Bereich zu erhalten. Verbinden Sie es mit einem Glas-Chip mit Poly-L-Lysin bedeckt. Sticky Poly-L-Lysin-Oberfläche ermöglicht dem Forscher fest positionieren Sie den internen Zyste Schicht auf Glas. Setzen Sie die Zyste mit der apikalen Seite nach oben, um den Zugang für die Pipetten (2B) bereitzustellen.
  6. Verwenden PCK oder SD-Ratten kidney zentralen Scheiben Papille zur Isolierung von nicht-dilatierten CNT / CCDsegments 18-21 enthalten.
    HINWEIS: Papillary Geweben sind haltbarer als Kortex und durch Halten papillären Rohrbänder mit einer Pinzette und Reißen entlang radialen Achse der Scheibe zu dünnen Bereichen abgespalten werden. Einzelne Tubuli sind sichtbar und können herausgezogen, um auf Deckglas-Chips platziert werden kann.
  7. Identifizieren Sie die CNT / CCD-Segmente durch Gabelungen, höhere Transparenz als proximalen Tubuli und große deutlich sichtbare Zellen (2C). Legen Sie die Abdeckung Glas-Chip mit angeschlossenem Tubuli unter einem Mikroskop mit Mikromanipulatoren für den Antrieb von Mikropipetten ausgestattet. Mit scharfen Mikropipetten Split offenen Tubuli und befestigen ihre Ränder auf das Glas der apikalen Oberfläche zugänglich zu machen (2D).

2. Einzelkanal-Patch-Clamp-Elektrophysiologie

  1. Füllen Sie den Patch-Clamp-Kammer mit Bad-Lösung und übertragen Sie das Deckglas-Chipmit isolierten Geweben in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Patch-Clamp-Mikropipetten haben Widerstand von 7-10 MOhm für die zuverlässige On-Zelle (Cell-Attached) Messungen.
  2. Für die Cell-Attached-Messungen, stellen Sie den Verstärkungsfaktor-Verhältnis auf 20-fach und Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter. ENaC-Kanäle für die Überwachung, mit einem Badlösung in mM: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); Pipette 140 LiCl, MgCl 2 2 und 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 10. Eine Zelle in der Monoschicht epithelialer und nähern sich der Pipette in der apikalen Membran. Bilden einen hochohmigen Abdichtung zwischen einer Pipette und Zellmembran durch leichten Sog. Sobald eine high resistant Gigaohm Dichtung gebildet wird, sollte eine lückenlose Protokoll bei einem Haltepotential für die Überwachung der Aktivität des interessierenden Kanal gestartet werden.
  4. Shop spaltfreie Einzelkanal aktuellen Daten von gigaOhm-Dichtungen für die spätere Analyse. Analysieren Sie die Kanal-Ereignisse mit Hilfe eines Software-Paket in der Regel mit Patch-Clamp-Setups 18 zugeführt. Berechnung der Kanalaktivität als NPO, wo N die Anzahl der aktiven Kanäle in der Patch und P o ist durchschnittlich Öffnungswahrscheinlichkeit der Kanäle.
    HINWEIS: Verwenden Sie isolierte Zysten oder Tubuli in Patch-Clamp-Experimenten für nicht mehr als 30 Minuten.

3. Ratiometrisch Epifluoreszenz Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration in den Epithelzellen

  1. Verwenden 5 mM Fura-2AM in DMSO gelöst. Aliquot Stammlösung in einzelne 500 ul konische Röhrchen (etwa 10 & mgr; l). Vor Licht und lagern in der Tiefkühltruhe bei -20 ° C für bis zu sechs Monate.
  2. Inkubieren isolierten Zysten und Split-offenen Tubuli 30-40 min in PSS (in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 und 10 HEPES bei pH 7,35), das 5 uM Fura-2 AM Farbstoff und 0,05% Pluronsäure um die Dispersion der Acetoxymethylester. Dafür Ort Gewebe in der 3,5 cm Schale mit Ladecocktail, vor Licht schützen und Inkubation auf einem langsamen Schüttler bei Raumtemperatur.
  3. Ändern Fura-2 AM haltigen Medien, um nach der Inkubation reinigen PSS und legen Sie das Gewebe unter dem Mikroskop zu Epifluoreszenz-Bildgebung weiter durchzuführen.
  4. Schalten Sie CCD-Kamera und stabile Lichtquelle (Monochromator-System) mit Filterscheibe ausgestattet (jede Filterposition kann mit einer eigenen Dämpfungspegel, jedes Mal, wenn der Filter aufgerufen wird ausgewählt in Verbindung gebracht werden).
  5. Finden Sie das Gewebe im Hellfeld. Wechseln Sie zur Detektion des Fluoreszenzsignals und stellen Sie die Intensität der Lichtquelle mit Neutralfilter und Lampenleistung, um die Sättigung des Signals zu vermeiden.
  6. Überwachen Fura-2 AM-Fluoreszenz in der Gewebeprobe mit ratiometrische Anregung bei 340/380 nm mit einer Frequenz von 0.125 Hz oder höher. Verwenden Sie eine 40 × / NA 1.3 oder ähnliche Objektivlinse zum richtigen Resolution Bild.
  7. Für die Bildverarbeitung und Berechnungen importieren Sie die Bildfolge. Stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Einzelzystenzellen oder ausgewählte Bereiche der zystischen Gewebe) und berechnen Sie Intensitätswerte für jeden Kanal (340 und 380 nm) in die bevorzugten Datenanalyse-Software; subtrahieren Hintergrund Intensitätswerte von jedem Datenpunkt.
  8. Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten der Fura-2 AM 340-380 Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede Region und berechnen Mittelwert / SE-Werte.

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Representative Results

Potential ENaC Beteiligung cystogenesis durch mehrere Studien, die gestört epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) beobachtet Signalisierung in PKD Progression 22-25 und abnorme Natriumreabsorption in ARPKD Mausmodellen und Gewebekulturen 26-28 nachgewiesen. B. Veizis et al. Zeigten, dass Amilorid-sensitive Na + -Absorption in CD-Zellen aus dem nicht-ortho BPK Mausmodell ARPKD 29 verringert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass beeinträchtigte Natrium und Wasser Rückresorption in Zysten ist ein wichtiger Faktor in erschwerenden cystogenesis 10. Insbesondere beschäftigten wir elektrophysiologische und immunhistochemische Analyse und festgestellt, dass Zysten ausüben abgestumpften Natriumresorption. Ein pharmakologischer Ansatz gezeigt, dass selektive ENaC Blockade deutlich verschärft Zyste Progression 10.

Wir die Wirkung der Verabreichung von Benzamil, einer ENaC-Blocker, weiter gezeigt, on Aktivität der Kanäle in der Zystenwand. 4-Wochen alt PCK-Ratten wurden mit Fahrzeug oder Trinkwasser mit Benzamil (15 mg / ml) ad libitum versorgt. Nach 12 Behandlungswochen wurden die Tiere nach dem oben beschriebenen Protokoll verarbeitet. Patch-Clamp wurde auf die zystische Monoschichten aus dem Fahrzeug isoliert und Benzamil behandelten Gruppen durchgeführt. Abbildung 3 zeigt repräsentative aktuelle Spuren der ENaC-Aktivität aus apikalen Membranen aufgezeichnet. Die Zusammenfassung Grafik zeigt, dass die durchschnittlichen ENaC-Aktivität (NP o) betrug 0,91 ± 0,15 10 in den Zysten der Kontrollgruppe, wohingegen Benzamil Verwaltung sank die Aktivität des Kanals auf 0,32 ± 0,05. Wir schließen, dass in ARPKD (gekennzeichnet durch ekstatischer Ausdehnung der CDs zu zahlreichen spindelförmige Nierenzysten 30 bilden) Benzamil im Trinkwasser gegeben Nierenzysten mit Harnfluss 30 erreicht. Dieser Effekt ermöglicht Benzamil zu Natrium-Wiederaufnahme von Zystenflüssigkeit, contr verringern ibuting zu cystogenesis 10.

Neben der EGF-Weg wurden Adenosintriphosphat (ATP) und andere Purine auch als kritischer parakrine Signalkomponente, die fälschlicherweise in PKD Modellen und in Patienten mit dieser Krankheit moduliert wird identifiziert. Es wurde berichtet, dass Adenosin-Signalisierung spielt eine wichtige Rolle in cystogenesis sowohl während ADPKD und ARPKD 31,32. Zystenzellen des PCK Ratten haben bisher gezeigt, dass niedrige basale aufweisen [Ca 2+] i und der Verlust der flussvermittelte [Ca 2+] i-Signalisierung im Vergleich zu gesunden nicht-erweiterten Sammelkanäle der SD-Ratten 13. P2-Rezeptor-Agonisten modulieren die Entwicklung von Nierenzysten in einem in vitro Modell der Zystenbildung vom cpk / cpk Maus 33 abgeleitet. Hohe ATP-Konzentration wurde bei zystischer Flüssigkeit von ADPKD Patienten 34 und in den Medien von Zystennieren Epithelien von cpk / cpk Mäusen 35 kultivierten Anlage gefunden.

_content "> Wir testeten Calciumflusses in Reaktion auf exogenes ATP Verabreichung. PCK Zysten und normalen kortikalen Kanäle von SD-Ratten wurden für die Calciummessungen getrennt vor und nach dem Auftragen von 10 & mgr; M ATP. Die Daten in 4 dargestellt zeigen die Wirkung von 10 & mgr; M ATP in den zystischen Tubuli der PCK Ratten untersucht mit zwei verschiedene Ansätze: 4A zeigt Messungen der Fura-2AM Fluoreszenzintensität bei 340 und 380 nm in einem Epifluoreszenz-Setup mit einem Monochromator ausgestattet und 4B stellt Registrierung von Fluo-8-Farbstoff Färbung mit konfokalen Mikroskopie. Beide Techniken zeigen ähnliche Kinetik des Calcium Einschwingverhalten, um ATP-Anwendung in Zystenepithel 10.

Abbildung 1
Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsprotokoll Nachdas Tier richtig betäubt und bereit für die Operation werden die Nieren mit PBS gespült, um Blut zu entfernen. Dann werden die Nieren herausgeschnitten, entkapselt und zystischer Schichten oder nicht erweiterten Tubuli werden manuell mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop isoliert. Nicht dilatative Tubuli sind gespalten offen mit Mikropipetten von Mikromanipulatoren wohin Zystenepithel angetrieben, wie innere Oberfläche der Zysten würde offen sein, den Zugang zu der apikalen Seite zu haben.

Figur 2
Abbildung 2: Isolierung und Herstellung von zystischer und Sammelkanal-Monoschichten (A) Ein Vertreter Nieren Scheibe von 16 Wochen alten PCK Ratte.. (B) eine Monoschicht auf zystische einem Deckglas Chip an ein Mikroskop für Patch-Clamp-Analyse oder Calcium imaging (60X) überführt. (C) Ein CNT / CCD-Segment mit Bifurkation von einer SD-Ratten isoliert. (

Figur 3
Abbildung 3: Wirkung von Benzamil Behandlung auf ENaC-Aktivität bei zystischer Epithel. (A) Repräsentative Stromspuren für ENaC-Aktivität in der Zelle angebracht Patches von Zysten frisch aus 16 Wochen alt PCK Ratten isoliert gemessen verabreicht 12 Wochen Benzamil im Trinkwasser. Diese Patches wurden zu einem Testpotential von V H = V p = -40 mV gehalten. Inward Li + Ströme nach unten. Eine gestrichelte Linien zeigen den jeweiligen aktuellen Stand mit einem "c" und "o n" bezeichnet den geschlossenen und offenen Zuständen. (B) Übersichtsdiagramm der beobachteten ENaC-Aktivität (NP o) (mit Genehmigung teilweise aus 10 wiedergegeben). * P <0,05 veRSUs Fahrzeugs.

Figur 4
Abbildung 4: Wirkungen von ATP auf Calcium-Einstrom in den zystischen Zellen der PCK-Ratten (A) Repräsentative Bilder von zystischer Monoschicht mit Fura-2 AM beladen vor und nach der Anwendung von 10 & mgr; M ATP.. Diagramm mit einer Zusammenfassung der Wirkung von ATP auf Kalziumspiegel im Zellmonolayer von PCK Ratten und SD Sammelkanäle (N = 38 Zellen). (B) Cystic Monoschicht vor und mit Fluo-8 Farbstoff beladen nach dem Auftragen von 10 & mgr; M ATP und zusammenfassende graphische Darstellung der intrazellulären Calcium-Reaktion.

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Discussion

Wir hier beschriebenen Anwendungen von herkömmlichen Patch-Clamp-Technik und Epifluoreszenz Calcium Imaging, um zystische Epithelzellen-Monoschichten aus einem Maus-Modell der genetischen ARPKD abgeleitet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten, von denen die meisten Aufmerksamkeit ist auf die Isolierung der Zysten (Schritt 1.5 der Protokolle Abschnitt) und an die elektrophysiologische Studien bezahlt werden. Diese Schlüssel Verfahren erfordern umfangreiche Schulungen und Geduld, und der Leser sollte nicht enttäuscht werden auf einmal.

Zunächst einmal sollte die Aufmerksamkeit auf den Prozess der Zyste einschichtigen Isolierung gezahlt. Dieser Teil der Vorbereitung erfordert handwerkliches Geschick und wirkt sich deutlich auf die weiteren Arbeiten, wie Dicke der Probe und ihrer selbst Befestigung an einem Glas-Chip ist von entscheidender Bedeutung für die Sichtbarkeit der Zellen. Dicke getrennt Zyste Wände variiert in verschiedenen Teilen der Probe, und es wird empfohlen, auf größeren Zysten mit größeren Monoschicht Bereiche praktisch für wor konzentrierenk. Zu helfen, reinigen Sie die Probe und Zugriff auf die Monolage sollte das umgebende Gewebe mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop abgezogen werden. Es sollte betont werden, dass die Technik impliziert Verwendung eines hochwertigen Stereomikroskop, gekennzeichnet durch eine deutliche Tiefenschärfe und eine Fähigkeit, um die Vergrößerung in einem weiten Bereich verändern unterschiedlichen Größen von Objekten bei der Präparation zubringen. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens ist, dass eine solche ausgefeilten Techniken wie patch-clamp und Calcium Bildgebung erfordern Personal mit diesen Verfahren vertraut. Wir schlagen vor, dass die ersten Erfahrungen auf Sammelkanal-Zellkulturen, wie beispielsweise im Handel erhältlich kortikalen M1 und Mark IMCD-Zellen erhalten werden, wie sie epithelialen Monoschicht ähnlich wie Zysten bilden.

Unser Ansatz erlaubt die Messung von Ionenkanälen Aktivität und [Ca 2+] i-Spiegel im nativen Umgebung von frisch isolierten Geweben. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist, dass die Vorbereitung von Proben für singlE-Kanal-Analyse oder Farbstoffbeladung erfordert keine enzymatische Behandlung, Beschädigung mechanische Verfahren oder andere potenziell schädlichen Schritte. Es wird manuell mit einer Pinzette in Kochsalzlösung durchgeführt und bietet große unbeschädigten Proben. Solche Proben können nicht nur für die beschriebenen Techniken verwendet werden. In der Tat, isoliert Zystenepithel stellt dünner Film aus reinem Rohrzellen und pflegt einheimische Mono Eigenschaften, die es zu einem wertvollen intakten Objekt zur Echtzeit-Experimenten, die physiologisch relevanten Beobachtungen produziert macht. Wenn die Isolierung von Zysten scheint schwer ein Verfahren für den Forscher oder eine große Menge von zystischer Gewebe wird auf einmal erforderlich ist, eine enzymatische Behandlung (zum Beispiel mit Dispase und Kollagenase, wie 38 für die kortikalen Sammelkanal Tubuli beschrieben) kann verwendet werden, um den Isolationsprozess zu vereinfachen. Jedoch sollte der Forscher sehr vorsichtig sein, während der Durchführung dieser Behandlung, wie Enzyme, insbesondere Proteasen, können Ionen channe signifikant beeinflussenls 'Aktivitäten oder Beschädigung der Membranrezeptoren. Dies ist zum Beispiel für die Untersuchungen purinerger Signalisierung sehr wichtig, da diese Membranproteine ​​sind sehr gut bekannt, schnell unter enzymatische Behandlung 39,40 verschlechtern.

Zusätzlich können Zystenepithel für andere Zwecke, wie Immunhistochemie oder Färbung von einem festen Monoschicht mit Farbstoffen (zB Rhodamin-Phalloidin) oder Laden des frischen Gewebes mit intrazellulären Substanz Marker, wie DAF-FM für die NO-Nachweis oder verschiedene Farbstoffe verwendet werden überwachen Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Es wird vorgeschlagen, um die reine Fraktion von isolierten Zystenepithel verwenden für Western-Blotting, um Auswirkungen von insgesamt Nieren Lysate vorliegende unspezifische Faktoren zu beseitigen. Wir schlagen vor, daß Zystenepithel können in ähnlicher Weise von Mäusen oder anderen Spezies, die für das Studium der verschiedenen Modelle der nicht nur ARPKD verfügbar sind, isoliert werden, sondern auch ADPKD. Frisch isolierte Zyste Exemplare haben unbestreitbareVorteile für die Molekularbiologie Ansätze, um die kultivierten Zellen im Vergleich zystischer, da sie eine bessere Kontinuität der Eigenschaften des zystische Gewebe im Organ, und zweifellos bieten mehr gerechtfertigt, Daten über die in vivo-Krankheitsprozessen.

Einer der wesentlichen Vorteile dieses Verfahrens besteht die Möglichkeit, normale nicht erweiterten Sammelkanäle von den gleichen Nieren oder SD-Ratten Tubuli (diese Ratten teilen genetischen Hintergrund mit PCK Ratten) zu verwenden, da Kontrollgeweben. Ähnliche Patch-Clamp-und Calcium-Messungen in nephron Segmente sind weit verbreitet auf Nicht-Zystennieren in vielen Labors 41-43 verwendet. Je Ionenkanäle Typ, verschiedene Modifikationen der Patch-Clamp-Verfahren verwendet werden (ganze Zelle, ein inside-out, Outside-out); zum Beispiel ENaC und ROMK (renalen äußeren medullären Kaliumkanal) Aktivität kann durch Gesamtzellkonfiguration 44,45 beurteilt werden. Die vorgeschlagene Fura-2 AM Kalzium-Imaging in Weitfeld-Epifluoreszenz mit Mono-Chromator kann auch mit jedem anderen ähnlichen Modifizierung Calcium Imaging wie Analyse mit konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie mit anderen Calcium Farbstoffe durchgeführt werden. Diese Mikroskopsysteme sind weniger erschwinglich, sondern bieten eine höhere Bildqualität und sind empfindlicher als Weitfeldmikroskopie. Ähnlicher Ansatz wurde auch angewendet, um TRPC Kanäle Aktivität und Calcium-Signalgebung in Podozyten von frisch isolierten Glomeruli 17,46,47 studieren. Andere Calcium Bildgebung, die angewendet werden könnten, umfassen Ausnutzung der Fluo-8, wie in Figur 4B oder ratiometrischen konfokalen Messung mit Fluo4 / FuraRed Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen wie in Ilatovskaya et al. 46 Technisch beschrieben, ist es möglich, sowohl die Patch-Clamp und Calcium Bildgebung auszuführen gleichzeitig auf derselben Zelle, wenn Mikroskop ist mit beiden Konfigurationen ausgestattet. Somit ist die beschriebene Technik ein gangbarer Ansatz für hochwertige Beobachtungen im Bereich der PKD, die flexibel nach th verändert werden könnenE Anforderungen Ihrer spezifischen Forschungs- und Verfügbarkeit der Geräte. Ferner können verschiedene Modifikationen der Calcium Imaging hier verwendet werden, einschließlich ratiometrische Messungen mit konfokaler Fluo4 / FuraRed Fluoreszenzfarbstoffen oder Fluo-8 (wie in Ilatovskaya et al. 46 beschrieben), wie in Abbildung 4B gezeigt.

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Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopieexperimente bedanken. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health gewährt R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (nach OPO) und K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (nach OPO) und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medizin Ausgabe 103 Patch-Clamp polyzystische Nierenerkrankung ARPKD ADPKD Niere intrazellulären Calcium Fura-2 AM Nephron Zyste Entwicklung Polyzystin
Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,… More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

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