Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Implementering Patch Clamp og Live Fluorescensmikroskopi til Monitor funksjonelle egenskaper nyisolerte PKD Epitel

Published: September 1, 2015 doi: 10.3791/53035

Summary

Ionekanaler uttrykt i nyretubuli epitel spille en betydelig rolle i patologi polycystisk nyresykdom. Her beskriver vi eksperimentelle protokollene som brukes til å utføre patch-clamp analyse og intracellulær kalsium nivå målinger ved cystisk epitel fersk isolert fra gnager nyrer.

Abstract

Cyste initiering og ekspansjon i løpet av polycystisk nyresykdom er en kompleks prosess som kjennetegnes ved unormaliteter i rørformet celleproliferasjon, luminal væskeopphopning og ekstracellulær matrisedannelse. Aktivitet av ionekanaler og intracellulær kalsium signalisering er sentrale fysiologiske parametere som bestemmer funksjonene rørformet epitel. Vi utviklet en metode som passer for sanntids observasjon av ionekanaler aktivitet med patch-clamp teknikken og registrering av intracellulær Ca 2+ nivå i epitelmonolag nyisolerte fra nyrecyster. PCK rotter, en genetisk modell av autosomal recessiv polycystisk nyresykdom (ARPKD), ble brukt her for ex vivo analyse av ionekanaler og kalsium flux. Beskrevet her er en detaljert trinn-for-trinn fremgangsmåte er utformet for å isolere cystisk monolagene og ikke-utvidede rørelementer fra PCK eller normale Sprague Dawley (SD) rotter, og overvåke enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + dynamikk.Denne metoden krever ikke enzymatisk behandling og lar analyse i en innfødt innstilling av nystekte isolert epitel enkeltlag. Dessuten er denne teknikk meget følsom for endringer i den intracellulære kalsium og genererer bilder med høy oppløsning for nøyaktige målinger. Endelig kan isoleres cystisk epitel videre brukes for farging med antistoffer eller fargestoffer, fremstillingen av primærkulturer og rensing av forskjellige biokjemiske analyser.

Introduction

Ionekanaler spille en betydelig rolle i mange fysiologiske funksjoner, inkludert cellevekst og differensiering. Autosomal dominant og recessive Polycystisk nyre sykdommer (ADPKD og ARPKD, henholdsvis) er genetiske lidelser preget av utviklingen av nyrevæskefylte cyster av røret epitelcelle opprinnelse. ADPKD er forårsaket av mutasjoner av PKD1 eller PKD2 gener som koder polycystins 1 og 2, membranproteiner som er involvert i regulering av celleproliferasjon og differensiering. PKD2 av seg selv eller som et kompleks med PKD1 også fungere som en Ca2 + -permeable kation kanal en. Mutasjoner i genet som koder for fibrocystin PKHD1 (a cilia-assosiert reseptor-lignende protein som er involvert i tubulogenesis og / eller vedlikehold av polariteten til epitel) er genetisk drivkraften i ARPKD 2. Cyste veksten er et komplekst fenomen akkompagnert med forstyrret spredning 3,4, angiogenese 5, dedifferentiation og tap av polarligheten av rørformede celler 6-8.

Defekt reabsorpsjon og utvidet sekresjon ved cystisk epitel bidra til væskeansamling i lumen og cyste utvidelse 9,10. Nedsatt strømningsavhengige [Ca2 +] signalering er også knyttet til cystogenesis under PKD 11-15.

Her beskriver vi en fremgangsmåte egnet for patch-clamp målinger av enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + nivåer i pasienter med cystisk epitelmonolag isolert fra PCK rotter. Denne metoden ble anvendt med hell ved oss å karakterisere aktiviteten av epiteliale Na + kanal (ENaC) 10 og [Ca2 +] -avhengige prosesser som induseres av Ca 2 + -permeable TRPV4 og purinergiske signalkaskade 13.

I disse studiene har vi brukt PCK rotter, en modell av ARPKD forårsaket av en spontan mutasjon i PKHD1 genet. Den PCK stammen var originally avledet fra Sprague-Dawley (SD) rotter som 16 derved SD-rotter blir anvendt som en egnet kontroll for sammenligning med PCK belastning. Som et resultat kan både SD rotte nevronet segmenter og ikke-utvidede oppsamlingskanaler isolert fra samme PCK rotter tjener som to forskjellige sammenligningsgrupper for eksperimenter med cystisk epitel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Medical College of Wisconsin og University of Texas Health Science Center på Houston og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Figur 1 viser hovedtrinnene i vev isolasjon og prosesseringsprosedyre. Kort fortalt er nyrer fra PCK eller SD-rotter brukes til manuell isolering av epitelmonolag for innsamling kanaler enten fra friske ikke-slåtte tubuli eller cyster. Her studerte vi nyrer fra 4-16 uker gamle PCK rotter 10,13.

1. Isolering av nyre cyster og kobler Drikkerør (CNT) / Samle kanaler (CD) Segments

  1. Bedøve forsøksdyr med isofluran (5% induksjon, 1,5 til 2,5% vedlikehold) / medisinsk karakter O 2 eller en annen godkjent metode. Dyr må kontinuerlig overvåkes for å sikre tilstrekkelig leVEL av anestesi. Stabil respirasjonsfrekvens og tå klype reaksjon blir brukt til å bekrefte riktig anestesi.
  2. Utfør laparotomi og skylle nyrene med fosfat saltvann (PBS) gjennom abdominal aorta 17.
    1. Forbered en polyetylenrør kateter (PE50) og koble den til en sprøytepumpe fylt med PBS. Kutt i huden og bukveggen langs linea alba, deretter lage en tverrgående mage snitt over magen fra side til side og skifte abdominal organer med bomullspinner for å få tilgang til den synkende aorta med forgrening mesenteriske og cøliaki arterier. Fukt indre organer med varmt saltvann under ytterligere prosedyrer for å hindre deres tørrhet.
    2. Plasser en ligatur (# 1) rundt mesenteriske og cøliaki arterier og en annen ligatur (# 2) rundt aorta under mellomgulvet (ikke tie). Forsiktig skille en. abdominalis av sløv dissekere bindevev rundt det med tynne pinsett og plassere to ligaturer ~ 3mm under venstre nyrearterien (# 3) og over bekkenarterier delinger (# 4).
    3. Knyt ligatur # 4 og legge et fartøy klemme rundt aorta mellom venstre nyrearterien og ligatur # 3. Lag et snitt mellom klemmen og ligatur # 4 for å kateterisere aorta, bruker ligatur # 3 til fast feste kateteret.
    4. Slipp klemmen og sørge for at blodet pulsen er synlig i kateteret for å sikre riktig installasjon. Begynn perfusjon med en hastighet på 6 ml / min, tie ligaturer # 1 og # 2, og kuttet venstre nyrevene. Fortsett å skylle i 1-2 min før organene er helt forvellet.
    5. Skjær nyreblodårer, urinrøret og omkringliggende bindevev og fettvev med saks for å samle nyrene. Deretter lage en kort rift i nyren og skrelle nyrene til decapsulate dem. Plasser nyrene i iskald PBS. Dødshjelp er bekreftet av en Thoracotomi.
  3. Forbered 5 x 5 mm dekkglass chips belagt med Poly-L-lysin. Skjær et lokk glass med en diamant blyant og sted omtrent 20 ul av 0,01% sterilfiltrert Poly-L-lysin løsning på hvert glass chip. Forbered saltvann og to par urmaker tang for disseksjon.
  4. Skjær nyrene med et barberblad langs frontal plan i skiver av ~ 1-2 mm tykkelse. Plasser en av skivene under ett stereomikroskop. Isolering av vev bør gjøres i iskaldt saltvann.
  5. Finn cyster under en stereomikroskop som round-form hulrom (Figur 2A); sine vegger inneholder ofte fremtredende nettverk av prolifererte blodkar. Ved hjelp av fine pinsetter tippet dissekere indre epitellaget av en cyste så tynn som mulig for å oppnå et monolag område. Fest den til et glass chip dekket med Poly-L-lysin. Sticky Poly-L-lysin overflaten gjør at forskeren fast posisjonere interne cyste lag på glass. Utsett cyste med den apikale siden opp for å gi tilgang for pipetter (figur 2B).
  6. Bruk PCK eller SD rotte kidNey sentrale skiver inneholder papilla for isolering av ikke-utvidede CNT / CCDsegments 18-21.
    MERK: papillær vev er mer holdbare enn cortex og ved å holde papillær rørformede band med pinsett og rive langs radial aksen stykket kan spaltes i tynne sektorer. Individuelle tubuli er synlige, og kan trekkes ut for å bli plassert på dekselet glassbitene.
  7. Identifiser CNT / CCD-segmenter ved bifurcations, høyere åpenhet enn proksimale tubuli og store fremtredende synlige celler (Figur 2C). Plasser dekkglass chip med vedlagt tubuli under et mikroskop utstyrt med micromanipulators egnet for kjøring mikropipetter. Ved hjelp av skarpe mikropipetter split-åpne tubuli og fest kantene til glasset for å gjøre den apikale overflaten tilgjengelig (figur 2D).

2. Enkeltkanal Patch-clamp Elektro

  1. Fyll patch-clamp kammer med badoppløsningen og overføre dekkglasset chipmed isolerte vev til kammeret. Kontroller at patch-clamp mikropipetter ha motstand på 7-10 Megohm for pålitelig on-celle (celle-attached) målinger.
  2. For celle-festet målinger velges forsterkereffekten forholdet til 20x og low-pass strømmene ved 300 Hz ved en åtte-pol Bessel filter. For ENaC kanaler overvåkning ved å bruke et bad løsning, i mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2 og 10 HEPES (pH 7,4); pipette: 140 LiCl, 2 MgCl2 og 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Gjennomføre en konvensjonell patch-clamp eksperiment i et celle-tilknyttet-modus 10. Velg en celle i epiteliale monolaget og nærmer pipetten til den apikale membranen. Danner en høy motstand forsegling mellom en pipette og cellemembranen ved å bruke et lett sug. Når en høy resistent gigaOhm tetning er dannet, bør en gap-fri protokoll på et holdepotensial startes for å overvåke aktiviteten av kanalen er av interesse.
  4. Butikk gap-frie enkeltkanal aktuelle data fra gigaOhm sel for nærmere analyse. Analyser kanal hendelser ved hjelp av en programvarepakke som regel levert med patch-clamp oppsett 18. Beregn kanal aktivitet som NPO der N refererer til antall aktive kanaler i oppdateringen og P o er gjennomsnittlig åpen sannsynligheten av kanalene.
    MERK: Bruk isolerte cyster eller tubuli i patch-clamp eksperimenter for ikke mer enn 30 min.

3. Proporsjonellekspansjon epifluorescens Målinger av intracellulære kalsiumkonsentrasjonen i epitelceller

  1. Bruk 5 mM Fura-2 AM løst i DMSO. Delmengde stamløsning i individuelle 500 ul koniske rør (ca. 10 mL). Beskytt mot lys og lagre i fryseren ved -20 C i inntil seks måneder.
  2. Inkuber isolerte cyster og split-open tubuli for 30-40 min i PSS (i mm: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCI2, 2 CaCl 2 og 10 HEPES ved pH 7,35) som inneholder fem mikrometer Fura-2 AM fargestoff og 0,05% pluronic syre for å hjelpe spre acetoksymetyl estere. For det, sted vev i 3,5 cm skål inneholdende lasting cocktail, beskytte mot lys og inkuber på en langsom rister ved romtemperatur.
  3. Endre Fura-2 AM som inneholder media å rydde PSS etter inkubasjon og plassere vevet under et mikroskop for å ytterligere utføre epifluorescence bildebehandling.
  4. Slå på CCD-kamera og stabil lyskilde (monokromator system) er utstyrt med filterhjul (hvert filter stillingen kan være forbundet med en egen dempning nivå, velges hver gang filteret heter).
  5. Finn vevet i lyse felt. Bytt til deteksjon av fluorescens-signalet og justere intensiteten av lyskilden ved hjelp av nøytral tetthet filter og lampeeffekt for å unngå metning av signalet.
  6. Overvåke Fura-2 AM fluorescens i vevsprøve med proporsjonal eksitasjon ved 340/380 nm med frekvens på 0,125 Hz eller høyere. Bruk en 40 × / NA 1.3 eller lignende objektiv for riktig vedtaketsjon bilde.
  7. For bildebehandling og beregninger importere bildesekvensen. Sørg for å splitte kanalene og bruke en hyperstack gråtoner modus. Velg flere regioner av interesse (enkelt cyste celler eller utvalgte områder av cystisk vev) og beregne intensitetsverdiene for hver kanal (340 og 380 nm) til foretrukne dataanalyse programvare; Trekk fra bakgrunnsintensitetsverdier fra hvert datapunkt.
  8. For hvert tidspunkt å beregne forholdet mellom intensitetene for Fura-2 AM 340 til 380 kanaler. Plot scatter / linje point-tiden endringer av Ca 2+ transient for hver region og beregner gjennomsnitts / SE verdier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Potensialet ENaC engasjement i cystogenesis har blitt demonstrert av flere studier som observerte forstyrret epidermal vekstfaktor (EGF) signale i PKD progresjon 22-25 og unormal natrium reabsorpsjon i ARPKD murine modeller og vevkulturer 26-28. For eksempel, Veizis et al., Viste at amilorid-sensitive Na + absorpsjon er nedsatt i CD-celler fra ikke-ortologe BPK musemodell for ARPKD 29. Vi har nylig vist at nedsatt natrium og vann reabsorpsjon i cyster er en viktig faktor i skjerpende cystogenesis 10. Spesielt ansatt vi elektrofysiologisk og immunhistokjemisk analyse og fant at cyster utøve avstumpet natrium reabsorpsjon. En farmakologisk tilnærming viste at selektiv ENaC blokade markant forverret cyste progresjon 10.

Vi har videre demonstrert at virkningen av administrering av benzamil, en ENaC blokkering, on aktivitet av kanalene i cyste veggen. 4-uker gammel PCK rotter ble levert med bærer eller drikkevann inneholdende benzamil (15 mg / ml) ad libitum. Etter 12 ukers behandling ble dyrene behandlet i henhold til den protokoll som er beskrevet ovenfor. Patch-clamp ble utført på cystisk monosjiktene isolert fra kjøretøyet og benzamil behandlede gruppene. Figur 3 viser representative nåværende spor av ENaC aktivitet registreres fra apikal membraner. Oppsummeringen Grafen viser at gjennomsnittlig ENaC aktivitet (NP o) var 0,91 ± 0,15 10 i cyster i kontrollgruppen, mens benzamil administrasjon reduserte aktiviteten av kanalen til 0,32 ± 0,05. Vi konkluderer med at i ARPKD (preget av ekstatisk utspiling av CDer for å danne en rekke spindel-formet nyrecyster 30) benzamil gitt i drikkevann når nyrecyster med urin flow 30. Denne effekten kan benzamil å redusere natrium reuptake fra cyste væske, kontr ibuting å cystogenesis 10.

I tillegg til EGF vei, ble adenosin trifosfat (ATP) og andre puriner også identifisert som et viktig parakrin signalkomponent som er feilaktig modulert i PKD modeller og hos pasienter med denne sykdommen. Det ble rapportert at purinergiske signale spiller en viktig rolle i cystogenesis under både ADPKD og ARPKD 31,32. Cyst celler av PCK rotter har tidligere blitt vist å utvise lav basal [Ca2 +] i og tap av flow-mediert [Ca2 +] signalering sammenlignet med friske, ikke-utvidede samlekanaler av SD-rotter 13. P2-reseptor-agonister modulere utvikling av nyre cyster i en in vitro modell av formasjonen cyste avledet fra CPK / CK 33 mus. Høy ATP konsentrasjon ble funnet i cystisk væske fra ADPKD pasienter 34 og i media betinget av cystisk nyre epithelia dyrkede fra CK / CK mus 35.

_content "> Vi testet kalsium-fluks som respons på eksogen ATP administrering. PCK cyster og normale kortikale kanalene fra SD-rotter ble isolert for kalsiummålinger før og etter påføring av 10 uM ATP. data illustrert i figur 4 viser virkningen av 10 uM ATP i cystisk tubuli av PCK rotter studert med to ulike tilnærminger: 4A viser målinger av Fura-2AM fluorescens intensitet på 340 og 380 nM i en epifluorescence oppsett utstyrt med en monokromator, og 4B representerer registrering av Fluo-8 fargestoff flekker med konfokalt mikroskopi. Begge teknikkene demonstrere lignende kinetikk av kalsium transient respons på ATP-programmet i cystisk epitel 10.

Figur 1
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle protokollen etterdyret er bedøvet, og riktig forberedt for kirurgi, nyrene spylt med PBS for å fjerne blodet. Deretter blir nyrene skåret, Decapsulated, og cystisk monolagene eller ikke-dilatert tubuli isoleres manuelt med tang under ett stereomikroskop. Non-utvidede tubuli er delt-åpen med mikropipetter drevet av micromanipulators mens cystisk epitel som indre overflaten av cyster ville være åpen for å ha tilgang til den apikale siden.

Figur 2
Figur 2: Isolering og utarbeidelse av cystisk og samlekanal monolayers (A) En representant nyre skive fra 16 uker gamle PCK rotte.. (B) En cystisk monolag på et dekkglass chip overført til et mikroskop for patch-clamp-analyse eller kalsium-imaging (60X). (C) A CNT / CCD-segmentet med forgreningen isolert fra en SD-rotte. (

Figur 3
Figur 3: Effekt av behandling på benzamil ENaC-aktivitet ved cystisk epitel. (A) Representative løpende spor for ENaC-aktivitet målt i celle festet lapper av cyster nylig isolerte fra 16 uker gamle rotter administrert PCK 12 ukers benzamil i drikkevann. Disse oppdateringene ble holdt på en test potensialet V h = -V p = -40 mV. Innover Li + strøm er nedadgående. Stiplede linjene indikerer den respektive nåværende tilstand med en "c" og "o n" betegner de lukkede og åpne stater. (B) Oppsummering graf over observerte ENaC aktivitet (NP o) (delvis gjengitt fra 10 med tillatelse). * P <0,05 versus kjøretøy.

Figur 4
Figur 4: Effekt av ATP på kalsiuminnstrømning i celler av cystisk PCK rotter (A) Representative bilder av cystisk monolag lastet med Fura-2 AM før og etter påføring av 10 uM ATP.. Graf oppsummerer effekten av ATP på kalsiumnivå i cellen monolag av PCK rotter og SD oppsamlingskanaler (N = 38 celler). (B) Cystisk monolag lastet med Fluo-8 fargestoff før og etter påføring av 10 uM ATP og sammendrag graf av intracellulær kalsium respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskrev her anvendelser av konvensjonell patch-clamp teknikken og epifluorescence kalsium bildebehandling til cystisk epitelmonolag avledet fra en murine genetisk modell av ARPKD. Protokollen består av tre trinn, hvorav den mest oppmerksomhet bør rettes mot isolering av cyster (trinn 1.5 av protokoller delen) og til de elektrofysiologiske studier. Disse nøkkel prosedyrer krever omfattende opplæring og tålmodighet, og leseren bør ikke være frustrert på en gang.

Først av alt, bør den mest oppmerksomhet rettes til prosessen med cyste monolayer isolasjon. Denne delen av forberedelsen krever manuelle ferdigheter og betydelig påvirker videre arbeid, som tykkelsen på prøven og sine enda vedlegg til et glass chip er kritisk for synligheten av cellene. Tykkelse av isolerte cyste vegger varierer i ulike deler av prøven, og det anbefales å fokusere på større cyster med større monolags områder praktiske for work. For å bidra til å rense prøven og få tilgang til den monolaget, bør omliggende vev skrelles med tang under ett stereomikroskop. Det bør understrekes at den teknikk som innebærer anvendelse av et stereomikroskop høy kvalitet karakteriseres ved en betydelig dybde felt, og en evne til å endre forstørrelsen i et bredt område for å tilpasse varierende størrelser av gjenstander under dissekering. En annen begrensning av fremgangsmåten er at slike avanserte teknikker som patch-clamp og kalsium avbildning krever personale som er kjent med disse metoder. Vi foreslår at første opplevelsen kan fås ved samlekanal cellekulturer som er kommersielt tilgjengelig kortikale M1 og medullar IMCD celler som de danner epithelial enkeltlag ligner cyster.

Vår tilnærming tillater måling ionekanaler aktivitet og [Ca 2+] i nivåer i opprinnelige miljø av nyisolerte vev. Den største fordelen med denne fremgangsmåten er at utarbeidelse av prøver for single-kanal analyse eller fargestoff lasting krever ikke enzymatisk behandling, skade mekaniske prosedyrer eller andre potensielt skadelige trinn. Det er utført manuelt med tang i saltvann og gir store uskadde prøver. Slike prøver kan brukes ikke bare for de beskrevne teknikker. Faktisk utgjør isolert cystisk epitel tynn film av rene rørformede celler, og opprettholder opprinnelige monolags egenskaper, noe som gjør det til et verdifullt intakt gjenstand for sanntids eksperimenter som produserer fysiologisk relevante observasjoner. Ved isolering av cyster synes å vanskelig en fremgangsmåte for forskeren eller en stor mengde av cystisk vev er nødvendig med en gang, enzymatisk behandling (for eksempel med dispase og kollagenase, slik det er beskrevet her 38 for kortikale samlekanal tubuli) kan benyttes for å forenkle isolasjonsprosess. Imidlertid bør forskeren være svært forsiktig mens du utfører denne behandlingen, som enzymer, spesielt proteaser, kan påvirke ion channels 'aktivitet eller skade membranreseptorer. Dette er for eksempel viktig for studier av purinergiske signalering, da disse membranproteiner er svært godt kjent for raskt nedbrytes i henhold til enzymatisk behandling 39,40.

I tillegg kan cystisk epitel brukes til andre formål, for eksempel immunhistokjemi eller farging av en fast enkeltlag med fargestoffer (f.eks rhodamin phalloidin), eller laste den friske vevet med intracellulære stoff markører, for eksempel DAF-FM for NO påvisning eller ulike fargestoffer til overvåke reaktive oksygenforbindelser produksjon. Det er foreslått å bruke den rene brøkdel av isolert cystisk epitel for western blotting å eliminere effekten av ikke-spesifikke faktorer tilstede i totale nyrelysatene. Vi foreslår også at cystisk epitel kan være like isolert fra mus eller andre arter som er tilgjengelige for studier av ulike modeller for ikke bare ARPKD, men også ADPKD. Nyisolerte cyste eksemplarer har unekteligfordeler for molekylær biologi tilnærminger i forhold til de dyrkede cystisk celler, som de bedre opprettholde egenskapene til cystisk vev i organet, og utvilsomt gi mer berettiget data angående in vivo sykdomsprosesser.

En av de viktigste fordelene med denne teknikken er en mulighet for å bruke vanlig ikke-utvidet oppsamling kanalene fra de samme nyrer, eller SD-rotter tubuli (disse rottene dele genetisk bakgrunn med PCK rotter), som kontroll vev. Lignende patch-clamp og kalsium målinger i nevronet segmenter er mye brukt på ikke-cystisk nyrer i mange laboratorier 41-43. Avhengig av ionekanaler typen, forskjellige modifikasjoner av patch-clamp-metoden kan brukes (hele cellen, innsiden ut, utenfor-out); for eksempel, ENaC og ROMK (renal ytre medullær kaliumkanal) aktivitet kan bedømmes ved hel-cellekonfigurasjon 44,45. Den foreslåtte Fura-2 AM kalsium bildebehandling i vidvinkel epifluorescens med monochromator kan også utføres med noen andre lignende modifisering av kalsium bildebehandling som for eksempel analyse med confocal eller to-foton mikroskopi med andre kalsium fargestoffer. Disse mikroskop systemer er mindre rimelig, men gir høyere bildekvalitet og er mer følsomme enn bredt felt mikroskopi. Lignende tilnærming ble også brukt til å studere TRPC kanaler aktivitet og kalsium signalisering i podocytes fersk isolert glomeruli 17,46,47. Andre kalsium avbildning som kan anvendes omfatte utnyttelse av Fluo-8 som vist på figur 4B eller ratiometrisk konfokal måling med Fluo4 / FuraRed fluorescerende fargestoffer som beskrevet i Ilatovskaya et al. 46 Teknisk sett er det mulig å utføre både patch-clamp og kalsium avbildning samtidig på den samme cellen hvis mikroskop er utstyrt med begge oppsett. Således er den beskrevne teknikk en mulig tilnærming for høykvalitets observasjoner i feltet av PKD, som fleksibelt kan modifiseres i henhold til the behovene til spesifikke forskning og tilgjengeligheten av utstyr. Dessuten kan anvendes forskjellige modifikasjoner av kalsium avbildning her, inkludert ratiometrisk konfokale målinger med Fluo4 / FuraRed fluorescerende fargestoffer (som beskrevet i Ilatovskaya et al. 46) eller Fluo-8 som vist på figur 4B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) for utmerket teknisk assistanse med mikroskopi eksperimenter. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health gir R01 HL108880 (til AS), R01 DK095029 (til OPO) og K99 HL116603 (til TSP), National Kidney Foundation IG1724 (til TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (til OPO) og Ben J. Lipps Stipendiat fra American Society of Nefrologi (til DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Fluo-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

Medisin Patch-klemme polycystisk nyresykdom ARPKD ADPKD nyre intracellulær kalsium Fura-2 AM nephron cyste utvikling polycystin
Implementering Patch Clamp og Live Fluorescensmikroskopi til Monitor funksjonelle egenskaper nyisolerte PKD Epitel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V.,More

Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter