Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي ( Published: January 29, 2016 doi: 10.3791/53036
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Life and Environmental Sciences, Faculty of Science and Technology, Bournemouth University

Summary

السكان الميكروبية تحتوي على التجانس الخلية كبيرا، وهو ما يمكن أن تملي السلوك العام. تحليل المسبار الجزيئي من خلال التدفق الخلوي يمكن تحديد الدول الفسيولوجية للخلايا، ولكن تطبيقه يختلف بين الأنواع. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول لتحديد بدقة وفيات خلية ضمن مجموعة من السكان cyanobacterium، دون التقليل أو تسجيل نتائج إيجابية كاذبة.

Abstract

وقد ثبت القطعان الميكروبية في الدراسات الميدانية والمختبرية لعرض التجانس عالية في المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية. تحديد الدولة في الوقت الحقيقي من خلية الميكروبية تتجاوز فئات حية أو ميتة، والميكروبات يمكن أن توجد في حالة سبات، حيث يتم تخفيض انقسام الخلايا والأنشطة الأيضية. نظرا للحاجة إلى الكشف وتقدير من الميكروبات، التدفق الخلوي (FCM) مع تحقيقات الجزيئية يوفر طريقة سريعة ودقيقة للمساعدة في تحديد قابلية السكان عموما. باستخدام SYTOX الأخضر والبرتقالي SYTOX في البكتيريا الزرقاء نموذج Microcystis الزنجارية للكشف عن سلامة الغشاء، ونحن نطور طريقة تحويل للدلالة السريع وفيات خلية واحدة. سيتم إحالة تحقيقات الجزيئية المستخدمة في هذه المجلة لتحقيقات الحمض النووي الخضراء كما أو البرتقال على التوالي (على الرغم من أن هناك منتجات أخرى مماثلة مع الإثارة وانبعاث موجات التي لديها وسائط قابلة للمقارنة من التدبير العمومين، ونحن على وجه التحديد الرجوع إلى ذكر في المقدمة تحقيقات). البروتوكولات باستخدام المجسات الجزيئية تختلف بين الأنواع، واختلاف أساسي في التركيز وحضانة مرات. بعد هذا البروتوكول المبينة على M.aeruginosa وكان محسن الأخضر التحقيق الحمض النووي بتركيزات من 0.5 ميكرومتر بعد 30 دقيقة من الحضانة والتحقيق الحمض النووي البرتقال في 1 ميكرومتر بعد 10 دقيقة. في كل تحقيقات تركيزات أقل من المستوى الأمثل ذكرت أدى إلى تحت الإبلاغ عن الخلايا مع الضرر الغشاء. على العكس، 5 ميكرومتر تركيزات وأعلى في كل من التحقيقات أظهرت نوع من تلطيخ غير محددة، حيث الخلايا الحية 'أنتجت مضان المستهدفة، مما يؤدي إلى تمثيل أكثر من الأرقام "غير قابلة للحياة" الخلية. قدمت الضوابط الإيجابية (قتل الحرارة) الكتلة الحيوية الميتة قابلة للاختبار، على الرغم من ملاءمة الجيل السيطرة لا تزال تخضع للمناقشة. من خلال إظهار تسلسل منطقي من الخطوات لتحسين الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي دي نحنmonstrate كيفية إنشاء بروتوكول التي يمكن استخدامها لتحليل الحالة الفسيولوجية السيانوبكتيريا على نحو فعال.

Introduction

الخلية هي نظام معقد، الذي يستجيب باستمرار على البيئة عن طريق تعديل المعلمات الفسيولوجية وتغيير وظيفتها. تتأثر ديناميات السكان السكان الميكروبية إسوي سواء في طبيعة والمختبر من خلال تطوير القطعان، والتي تحدث حتى في ظل الظروف البيئية ثابتة نسبيا 1-3. تباين المجتمعات الميكروبية الطبيعية ينشأ بسبب الطبيعة المتغيرة للغاية من الظروف البيئية. هذه العمليات العشوائية وأحيانا ما تنتج في وقت لاحق القطعان التي هي مختلفة جدا إلى متوسط ​​عدد السكان. وكشفت أدلة حديثة أن هذه القطعان الفسيولوجية تستجيب بشكل مختلف للظروف البيئية، ويمكن أن تنتج مركبات إشارة أو مثبطات التي تؤثر بشكل كبير والتأثير على 3،4 إجمالي عدد السكان.

إنشاء وسيلة لتحديد عدم التجانس بين السكان هو المفتاح لبرنامج الأمم المتحدةderstanding البيئة الميكروبات في بيئات مختلفة وضروري عند بناء المعرفة من البكتيريا الزرقاء إزعاج، مثل Microcystis السامة، مما يؤثر بشكل كبير على الأمن المائي البشري. الأنواع مثل أنابينا عرض التجانس الشكلي في استجابة لتقلبات البيئة، وتطوير خلايا متخصصة مثل heterocysts وakinetes 2. في المقابل، خلايا Microcystis لا تعرض التجانس الشكلي واضحا خلال الاستجابة للضغط النفسي. التمييز بين خلايا قابلة للحياة وغير قابلة للحياة هو الجانب الأكثر أهمية التمايز الفسيولوجية ويسمح فهم أفضل للديناميات السكانية الميكروبية. ومع ذلك، تبقى المشكلة المفاهيمية للبقاء البكتيرية نفسها صعبة وسيئة تتميز 1،5،6.

التدفق الخلوي (FCM) هي طريقة موثوقة وسريعة لتحليل الخلايا الفردية. لزيادة فهم طبيب خلية واحدةبليد الحركة من خلال FCM، وقد استخدمت تحقيقات الجزيئية للتمييز عدد من الأيض والعمليات الحيوية (7). وقد أدى ذلك إلى زيادة المعرفة الأنواع على المستوى الخلوي والسكان، وهذا بدوره ساعد في إدارة الموارد المائية 8،9. ومع ذلك، الكائنات الحية تختلف من حيث الجزيئي امتصاص التحقيق وهروب رأس المال بسبب المسام ومضخات في الجدران الخلوية والأغشية، والتي أدت إلى عدد من الجزيئية تصميم التحقيق وتنفيذ بروتوكول 6،10،11. وغالبا ما زودت الاختبارات الجزيئية المتاحة لأغراض تجارية والبحوث مع بروتوكول عام والتي يمكن أن تنطبق على نوع من الخلايا مختلفة جدا. يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في نقل البروتوكولات وضعت لنوع خلية واحدة إلى 6 آخر، وبالتالي هو المهمة الأساسية لتحسين تحقيقات الجزيئية فعال قبل الاستخدام.

تحقيقات الحمض النووي الأخضر والبرتقالي ربط إلى كل من الأحماض النووية مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل مع الحد الأدنى من قاعدة حددتستخدم ivity وتقييم سلامة الغشاء البلازمي للخلايا. التحقيق الحمض النووي الأخضر يحتوي على طرأ تحسن ملحوظ على وضع العلامات الخلية إشارة مضان مقارنة تحقيقات الجزيئية الأخرى، مثل مركبات القائم على يوديد propidium 12، والتي يمكن أيضا بمثابة مؤشر على بقاء الخلية. مصطلح "بقاء الخلية" هنا يفترض أن تدهور الحمض النووي يحدث بعد فقدان النزاهة غشاء البلازما. تحقيقات الحمض النووي هي cyanine الأصباغ غير متماثل مع ثلاثة الشحنات الموجبة، ولا يمكن دخول الخلايا مع أغشية سالمة تحت تركيزات تتميز، في كل من حقيقيات النوى 11،13 و 14،15 بدائية النواة الكائنات الحية. يمكن ربط مسبار الحمض النووي للأحماض النووية يؤدي إلى ما يصل إلى> 500 أضعاف من انبعاثات مضان من الإشارات المحلية في الخلايا التي تحتوي سلامة غشاء للخطر. على الرغم من أن تحقيقات الجزيئية مثل الأخضر التحقيق الحمض النووي يمكن أن يكون مؤشرا جيدا لعلم وظائف الأعضاء خلية واحدة، هناك حاجة رس تحسين كل التحقيق مع كائن الهدف المقصود، كما اختلفت الأوقات الحضانة من 7 دقيقة - 30 دقيقة، وتركيز يتراوح من 0.1 ميكرومتر - 0.5 ميكرومتر في التجارب Microcystis وحده 15-19.

هنا نقدم بروتوكول لتعظيم المقايسات cytometric من اللون الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي جديدة نسبيا (والتي حتى الآن لم يتم اختباره على أنواع السيانوبكتيريا M.aeruginosa). ويمكن بعد ذلك نقل المنهجية المتقدمة التالية إلى الأنواع الأخرى، وتستخدم كمنصة لتحسين البروتوكولات في تحقيقات الجزيئية الأخرى، وبالتالي زيادة فهم الميكروبات والسلوك البيئي الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المسبار الجزيئي وقياس التدفق الخلوي

  1. تمييع الحلول الأسهم من تحقيقات الحمض النووي، والتي يتم توفيرها كحل 5 ملم في dimethylsulfoxide (DMSO) إلى aliquots من التركيزات المطلوبة في عالى النقاء H 2 O. تصفيتها
  2. تخزين تحقيقات الحمض النووي في الظروف المظلمة بين -5 درجة مئوية و- 25 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. بدوره على تدفق عداد الكريات وحزمة برامج تحميل (انظر جدول المواد / معدات لمواصفات FCM).
  4. وضع أنبوب انحلال الدم الخالي (12 × 75 ملم) على التحقيق حقن العينة (SIP)، انقر فوق تنشيط ثم تدفق مرة أخرى لبدء عملية التنظيف FCM.
    ملاحظة: يمكن لبعض المراحل عينة لSIP استيعاب عدة أنواع من الأنابيب بما في ذلك أنابيب microcentrifuge. والجزيئي مخفف التحقيق وغمد السائل المستخدمة في أجهزة FCM هو من الصف التحليلي "نوع 1" 0.22 ميكرومتر غشاء مصدر تصفيتها.
  5. مكانأنبوب انحلال الدم الطازج مع 2 مل من عالى النقاء تصفيتها H 2 O على SIP، تحدد سقفا زمنيا لمدة 10 - 15 دقيقة وسرعة الموائعية الصيام (أو معدل تدفق> 66 ميكرولتر / دقيقة).
  6. حدد خلية البيانات الجديدة، وطرح على عتبات ذات الصلة لمضان وقنوات مبعثر الخفيفة للحد من الضوضاء الخلفية، وانقر فوق "تشغيل".
  7. إذا كان مجموع الأحداث في الثانية ليست أقل من توصية الصانعين، ثم قم بتشغيل عينة 2 مل من محلول تطهير لمدة 2 دقيقة على السريع ثم كرر الخطوات 1.4 و 1.5.
    ملاحظة: يرجى مراجعة توصيات الصانعين لFCM بدء تنظيف البروتوكولات، كما أنها يمكن أن تختلف بين النماذج. اختبار للعتبات محددة يحتاج أيضا ليكون في خط مع النموذج FCM عن بعض المعدات التي تسمح للمستخدم لتطبيق الفولتية مكاسب للأنابيب مضخم (هذه الفرق) تعزيز أو تقليل إشارة كهربائية المسجلة من أجهزة الكشف الضوئية. نموذج FCM المستخدمة في هذا من experiمنة وحددت هذه الفرق الجهد واستخدام عتبة 80،000 الضوء المبعثر إلى الأمام (FSC-H) لاستبعاد جسيمات أصغر من 2.0 ميكرومتر والضوضاء الإلكترونية.

2. التحضير للثقافات وعدد الخلايا الأولية

  1. الأوتوكلاف 98 مل من عالى النقاء تصفيتها H 2 O و 2 مل من وسائل الإعلام الطحالب (تركيز X50) في كوب 250 مل لمدة 20 دقيقة في 120 درجة مئوية.
  2. من الأحادية الأولي من M.aeruginosa (PCC 7806) في ارتفاع مطرد الدولة مكان الكثافة 2 مل من العينة إلى أنبوب تحت SIP. تفصيل أي تشكيل مستعمرة من قبل vortexing أو صوتنة 20 و تأكيد خلايا فرقت بالتساوي من خلال المجهر الضوئي.
    ملاحظة: التعرض المفرط للموجات فوق الصوتية يمكن أن يؤدي إلى تحلل الخلايا ويجب استخدامها بحذر. منذ صوتنة يمكن أن ينهار الحويصلات الغاز (كما هو موجود في بعض الأنواع مثل M.aeruginosa) المخرجات مثل ضوء الجانب مبعثر (SSC-H) كثافة يمكن أن تصبح أكثر ذاتهاnsitive.
  3. في داخل البرنامج FCM، حدد مؤامرة الرسم البياني لتسجيل البيانات من الأمام ضوء مبعثر (FSC-H) وتكوين المواصفات مؤامرة بالنقر على "تسجيل" لعرض في نطاق سجل على المحور.
  4. في الناتج منفصل، حدد الرسم البياني آخر (تسجيل محور) لتسجيل مضان الطبيعية مثل الإكسسوارات فيكوسيانين الضوئي الصباغ (FL4-H، 675 ± 12.5 نانومتر)، وجدت في M.aeruginosa.
  5. استخدام مصدر الضوء الذي يمكن أن تثير فيكوسيانين وكاشف التي يمكن أن تصنف الانبعاثات من مضان الناتجة عن ذلك.
    ملاحظة: الضوئي الصباغ مثل الكلوروفيل يمكن أن يكون سعيدا مع يشيع استخدامها 488 نانومتر الليزر الأزرق، في حين فيكوسيانين هو متحمس أكثر من 600 نانومتر، وسوف يتم الكشف فقط مع مصدر الضوء الأحمر 21. تحقق مع الشركة المصنعة للأجهزة قياس التدفق الخلوي لمصادر الضوء الإثارة والأطياف للكشف عن الانبعاثات، هنا كل من 488 نانومتر و 640 نانومتر ليزر تم استخدامها جنبا إلى جنب معمن 675 ± 12.5 مرشح بصري نانومتر.
  6. لتسجيل أعلى دقة حدد الإعدادات الأقرب إلى حجم الأساسية للكائن الحي الهدف (10 ميكرون)، ومعدل التدفق البطيء نسبيا (14 ميكرولتر / دقيقة).
    يجب تشغيل للحصول على أفضل العينات وفقا لقرار بتصنيع توصية من الأحداث في الثانية: ملاحظة.
  7. قبل صدور بيانات اكتساب تستخدم عتبة إلى بوابة الخروج ضوء مبعثر و / أو إشارات مضان التي تنتج عن ضجيج الخلفية الإلكتروني أو الحطام عينة الخلية.
  8. حدد خلية بيانات جديدة، وخلق مؤامرة الكثافة مع FSC-H وSSC-H المعلمات على نطاق وسجل ثم انقر فوق تشغيل.
  9. إذا كثافة العينة يؤدي إلى معدل الحدث المفرط، يمكن اتخاذ خطوات تخفيف لزيادة الدقة والإحكام.
  10. على مؤامرة كثافة تطبيق البوابات البرنامج من الرسم البياني السابق لاستبعاد انخفاض مستوى الإشارات مبعثر، التي تنتجها الضوضاء في الخلفية أو الحطام (FSC <320،000). وعلى العكس من بوابة مضان النسبي العاليوتشمل إشارات فيكوسيانين من الخلايا وفقط هذه الأحداث (FL4، 56000 - 1950000).
  11. استخدام عدد الخلايا المسجلة في المناطق المعزولة ونقسمه على الحجم الكلي للعينة التي مرت من خلال FCM، للعمل على كيفية العديد من الخلايا لكل مل.
    ملاحظة: النموذج FCM المستخدمة هنا ديها المعالجات الدقيقة التي تسيطر عليها نظام مضخة تحوي يسمح حجم العينة يحدد لاحقا. قد تتطلب معدات أخرى FCM تعليق حبة معايرة أو حساب H 2 O الخلافات الوزن / الحجم للتحقق من إجمالي حجم العينة.
  12. إضافة حجم المطلوب من الخلايا إلى وسائل الإعلام طازجة من أجل البدء في دورة نمو دفعة (250،000 خلية / مل) من M.aeruginosa.
    ملاحظة: سوف الأنواع تختلف في معدلات النمو اعتمادا على من المعلمات بيئة في الموقع وتوافر المواد الغذائية، لذلك دورة دفعة وينبغي قبل تسجيله لتحديد مراحل دورة الحياة.

3. OPTIMسعودة الجزيئية التحقيق امتصاص الخلية

  1. حصاد نصف ثقافة M.aeruginosa أعدت في الخطوة 2 من المرحلة الأسية واستخدام كعنصر تحكم 'الحية'.
    ملاحظة: عينات المخفف من ثقافة عالية الكثافة مباشرة إلى مرحلة الأسي قد تؤثر على النتائج الأمثل من خلال دوران خلية ميتة، مقارنة بما كان عليه من الثقافات تلقيح من مرحلة متخلفة / الاستقراء الأولي.
  2. إعداد النصف الآخر كوسيلة لمراقبة 'الميت' باستخدام أساليب مثل الايثانول 70٪، وعينات التدفئة في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لامتصاص العرق أو 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة 6،11،22. تحقق اختلافات في عينات المكروية (على سبيل المثال، ودرجة الحموضة).
    ملاحظة:، قتلت الحرارة، 'الميت' مراقبة إيجابية في M.aeruginosa هي متميزة من عينة 'الحية' من خلال انخفاضه في إشارات فيكوسيانين. حمل فيات بواسطة طرق أخرى قد لا يؤدي إلى نفس المخرج، وسوف VARذ في الأنواع.
  3. إعداد عينات مختلطة استخدام نسب مختلفة من 'يعيش' وعينات 'الميت' (على سبيل المثال، 0٪، 25٪، 50٪، 100٪).
  4. تفصيل تشكيل مستعمرة من قبل vortexing أو صوتنة وتحقق من الرقم الهيدروجيني.
  5. حدد ليزر 488 نانومتر إلى جانب الكشف عن التي يمكن أن تسجل مضان من الأخضر (FL1، 530 ± 15 نانومتر) والبرتقالي (FL2، 585 ± 20 نانومتر) تحقيقات الحمض النووي والليزر 640 نانومتر لتسجيل إشارات فيكوسيانين من خلال كشف الخاصة به.
    ملاحظة: عندما يرتبط الحمض النووي، والأخضر التحقيق الحمض النووي لديه تقريبي الطول الموجي مضان الإثارة من 504 نانومتر، والحدود القصوى للانبعاثات من 523 نانومتر، في حين أن البرتقال التحقيق الحمض النووي له طول موجة الإثارة من 547 نانومتر، والانبعاثات قصوى تبلغ 570 نانومتر. ويمكن استخدام 488 نانومتر الأرجون ليزر الحالة الصلبة ايون لإثارة كلا تحقيقات الجزيئية، ومع ذلك، فإن الليزر الأخضر (إلى 547 نانومتر) تنتج مضان البرتقال العالي.
  6. كنقطة انطلاق، ويعرضالمسبار الجزيئي مع الشركات المصنعة وأوصى التركيز على الثقافة 'الميت' 50٪ 'حية' و 50٪ واحتضان في الظلام.
  7. حدد خلية البيانات الجديدة، ضع العينة تحت SIP مع العتبات ومشغلات من شأنها أن تقلل من الضوضاء في الخلفية (FSC-H 80000).
  8. خلق مؤامرة الكثافة مع FSC-H وSSC-H المعلمات، وثلاثة رسوم بيانية. واحد الرسم البياني باستخدام المسبار الجزيئي قناة كشف بصري منها (FL1 أو 2)، واحدة للكشف عن انبعاث فيكوسيانين (FL4-H) وغيرها من FSC-H، كل على نطاق السجل.
  9. احتضان عينات من M.aeruginosa مع تحقيقات الحمض النووي في الظلام لمدة تصل إلى 60 دقيقة، تسجيل في الخلايا بيانات منفصلة، ​​في عدد من النقاط الزمنية (1، 5، 10، 15، 30 و 60 دقيقة).
    ملاحظة: عند ضبط المعلمات مثل الاختيار درجة الحموضة مع المصنوعات لردود الفعل المحتملة من بعض المواد الكيميائية (للحمض النووي اختبار تحقيقات لا يمكن أن تحتوي منطقة عازلة الفوسفات أو مستويات عالية من التكافؤ أو مغنيةالكاتيونات قدم، كما سيتم تخفيض الربط مع DNA).
  10. تطبيق بوابة البرامج لتشمل فقط FSC-H الرسم البياني (320،000 - 1،500،000) للهدف من الكائنات حجم الخلية، في كل منها التحقيق مضان قناة الرسم البياني.
    ملاحظة: التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت 0.05، 0.1، 0.5، 1، 5، 10، 50 و 100 ميكرومتر، والتي يمكن أن تتغير من زيادة أو تقليل حجم العينة M.aeruginosa أو محلول المخزون الأولي للتحقيقات النووية.
  11. في القناة التحقيق مضان، وتطبيق بوابة أخرى برنامج شامل لأعلى قمة في الرسم البياني (الأخضر FL1-H، 240،000 - 1،650،000 والبرتقالي FL2-H، 30000 - 165000)، وبعد ذلك البوابة التي مسبار إيجابي مضان في المؤامرة الكثافة.
  12. تشغيل الخطوات 3،1-3،11 مع 100٪ "الحية"، و 100٪ 'الميت' وجميع العينات ثقافة مختلطة، وتعديل تركيزات التحقيق الجزيئية (مثل X 0.1 إلى x 10) و / أو درجة الحرارة ومستويات الحموضة إذا لزم الأمر.
    13. <لى> قارن بين عدد من الإشارات الإيجابية الجزيئي التحقيق مضان لكثافة الخلايا الأصلية من الخلايا الميتة (مأخوذة من نصف مجموع FSC-H أو 100٪ ثقافة 'الميت') للعثور على النسبة الإجمالية للخلايا ملطخة الحمض النووي تحقيقات.
  13. هل كل هذا لفترة زمنية في كل تركيز للعثور على بروتوكول الأمثل لتحقيق أعلى نسبة من نوكليك خلية التحقيق امتصاص دون إنتاج تلطيخ غير محدد (استخدام الوسائل في اتجاه واحد أنوفا أو كروسكال واليس تحليل التباين الأحادي، إذا كانت البيانات غير حدودي).

4. الجزيئية التحقيق الإسفار التمييز

  1. لاختبار تدخل مضان / التداخل من جوهري أو غير محددة تلطيخ الخلايا حدد 50٪ 'حية' و 50٪ 'الميت' بيانات ثقافة مختلطة وخلع جميع البوابات.
  2. تطبيق بوابة البرامج لتشمل فقط FSC-H الرسم البياني (320،000 - 1،500،000) للهدف من الكائنات حجم الخلية، في فيكوسيانينقناة الرسم البياني.
  3. بوابة أعلى قمة فيكوسيانين والتسمية باسم 'يعيش'، مع إضافة أدنى الذروة وصفت بانها "القتلى".
  4. أداء خطوة بوابة أخرى في الجزيئية التحقيق مضان قناة الرسم البياني منها، وذلك باستخدام واحد في وقت واحد، و'يعيش' ثم فيكوسيانين 'الميت' (FL4) إشارات، وتسجيل كل من الأطوال الموجية المتوسطة.
    وقد تم وضع لإحداث وفيات في هذه التجربة من خلال المعالجة الحرارية، والتي بموجب هذا البروتوكول يقلل بشكل واضح إشارات فيكوسيانين: ملاحظة. طرق أخرى للسكان المنتجة من الخلايا الميتة قد تنتج مخرجات مختلفة في أشواط المكتسبة.
  5. نسبة موجات متوسط ​​الإيجابية في مضان الجزيئية التحقيق ('ميت') والجوهرية / إشارة غير محددة ('الحية') لتحديد حساسية البروتوكول.
    ملاحظة: تحسين التمييز مضان من "حي" وبوبول 'الميت'بالجمع، وزيادة مصدر الكربون لامتصاص وصمة عار نشط في المغذيات المنضب الخلايا أو ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لتحسين نفاذية جدار الخلية وما ينتج عنها من إشارات مضان 6. تعويض محدود في بعض النماذج FCM عن التداخل الطيفي يمكن أن يؤديها تصحيح البشرى الذي يتلاعب به المستخدم أثناء اكتساب عينة (التغييرات PMT الجهد) أو من البرمجيات المتخصصة بعد التحليلي.
  6. حدد البروتوكول الأمثل حيث تم ملطخة أكبر قدر من الخلايا الميتة دون وقوع غير محددة تلطيخ. إذا كان عدد من اختبار لها نتائج مماثلة تقبل بروتوكول مع أقل تركيز والحضانة الوقت، جنبا إلى جنب مع حسن التمييز إشارة مضان. متابعة بتصنيع تعليمات لإجراء اغلاق الكريات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الضوء المبعثر إلى الأمام (FSC) وضوء الجانب مبعثر (SSC) المخرجات من ثقافة دفعة M.aeruginosa في المرحلة الأسي يقدم معلومات عن حجم الخلية (قطر) وتحبب الداخلية على التوالي (الشكل 1A). FSC يمكن أن تميز الخلايا التي تكون كبيرة جدا و / أو صغيرة أن تكون M.aeruginosa. ويمكن أن يتم هذا التمييز أو النابضة ببيانات تكرير بين نقاط معينة من الانتاج FSC (الشكل 1C). فيكوسيانين، دستور كبيرا من M.aeruginosa جهاز التمثيل الضوئي تنتج إشارة قوية عند استجوابه من قبل مصدر الضوء الأحمر (مثلا: 640؛ م: 675 ± 12.5 نانومتر)، والتي يمكن استخدامها لمزيد من السكان البوابة، مماثلة لتلك التي أجريت في FSC المعزولة ولكن مع مضان (الشكل 1D). من إشارات FSC ومضان، البيانات يمكن بوابات من إخراج الأصلي (الشكل 1A) إلى بيانات محددة عن M.aeruginosa لوعدد الخلايا إينال (الشكل 1B).

تألق ذاتي لكل خلية في السكان البكتيريا الزرقاء يختلف بوصفها وظيفة من الحالة الفسيولوجية. هنا كانت تحصد الخلايا من ثقافة مرحلة الأسي تظهر مرتفعة نسبيا مضان أحمر بعيدا عن "حي" السكان السيطرة وتعرضت لسيطرة 'الميت' إلى 60 درجة مئوية الحرارة لمدة 1 ساعة. عندما "العيش" ضوابط المصطبغة أقل المصطبغة و'الميت' أعلى مختلطة التحول خفض في تألق ذاتي واضح (أرقام 2A & B). و'الميت' مضان الخلية والمعلمات FSC يمكن استخدامها للتمييز على مجموع الخلايا التي تناولها التحقيق الجزيئي. في غشاء خطر أو الخلايا الميتة تحقيقات الحمض النووي سوف تنتج إشارة إضافية إما على؛ قناة FL1 (530 ± 15 نانومتر) لتحقيق الحمض النووي الأخضر أو ​​قناة FL2 (585 ± 20 نانومتر) لميلان النووي البرتقالالتحقيق معرف (أرقام 3A & B)، بالمقارنة مع الأم 'العيش' إشارة مضان. ويمكن رؤية تأكيد كلا تحقيقات الحمض النووي في الخلايا مع أغشية الضرر من خلال المجهر epifluorescence (أرقام 4A & D).

تم الحصول على النسبة الإجمالية من الخلايا التي تم ملطخة الأخضر التحقيق الحمض النووي من عينات مختلطة، والتي كانت قبل بوابات لتشمل فقط M.aeruginosa الحجم خلايا من FSC-H الرسم البياني (320،000 - 1،500،000). في "الحي: الميتة 50:50 عينة، وخلايا مضان الخضراء بوابات من أعلى قمة في FL1 (530 ± 15 نانومتر) الرسم البياني وبالمقارنة مع الكثافة الأصلية في 'الميت' السكان الخلية (إما عن طريق خفض إجمالي FSC- H أو تشغيل عدد خلايا منفصلة فقط على 100٪ 'الميت' عينات من الخلايا). فوق 100٪ تشير إلى أن يحدث تلطيخ غير محددة. نسبة متوسط ​​من الخلايا التي كانت قد تناولت nucle الخضراءجيم تراوحت التحقيق الحمضية من؛ 15 ± 0.3٪ في 0.05 ميكرومتر بعد 1 دقيقة إلى 177.1 ± 5.1٪ في 100 ميكرومتر خلال 10 دقيقة من الحضانة (الجدول 1). وأظهرت تركيزات أكثر من 1 ميكرومتر (لا تشمل) تلطيخ غير محددة (أي، الخلايا الحية "التي بدأت لتولي التحقيق الجزيئي). A اتجاهين ANOVA بين التركيزات التي لم تظهر تلطيخ غير محددة (،05-1 ميكرومتر) وأظهرت فارقا كبيرا العام في التفاعل بين تركيز الأخضر التحقيق الحمض النووي وفترة حضانة في M.aeruginosa، F (12 ، 40) = 6.48، p <0.001. كان هناك تأثير الرئيسي في تركيزات الأخضر التحقيق النووي حمض المستخدمة F (3، 40) = 836.92، ف <0.001 والأوقات حضانة F (4،40) = 347.98، ف <0.001. وأشار اختبار توكي بعد المخصص فرق كبير بين جميع التركيزات باستثناء 0،5 و 1 ميكرومتر (P <0.001) وفرق كبير بين جميع الأوقات الحضانة من 1 - 60 دقيقة (P <0.001). ومع ذلك، توكي الاختبار البعدي المخصص من طريقة واحدة ANOVA كشف امتصاص يعني الخضراء التحقيق الحمض النووي لا تختلف ما بين 30 و 60 دقيقة ل0.05 ميكرومتر (P> 0.05) و 1 ميكرومتر (P> 0.05) (الشكل 5A). وتراوحت نسبة متوسط ​​'حية' و 'الميت' إشارات مضان النسبية في FL1 للتمييز من السكان (تقاس من خلال FL4) في التحقيق الحمض النووي الأخضر من أعلى المعدلات في 0.1 ميكرومتر بعد 60 دقيقة من 714 ± 14.8 (RFU) ل أدنى من 0.8 ± 0.0 (RFU) في 100 ميكرومتر بعد 30 دقيقة (الجدول 2). مقارنة النسب وحدات مضان النسبي (RFU) للتمييز كثافة في "حي" و "ميت" FL1 يشير إلى اتجاهين ANOVA تقارير فرق كبير الشامل في التفاعل بين تركيزات والأوقات حضانة F P <0.001 مع الأخضر التحقيق الحمض النووي. كان هناك أيضا اختلاف كبير في التأثير الرئيسي في جميع تركيزات F (7،80) = 475.41، ف <0.001 والأوقات حضانة F (4،80) = 78.28، P <0.001. نسب التمييز إشارات مضان بين 'حية' والحرارة قتل الخلايا الميتة وزادت مع مرور الوقت بين تركيزات 0.05 ميكرومتر و1 ميكرومتر ولكنها انخفضت بين 5 ميكرومتر و 100 ميكرومتر (الشكل 5B).

النسبة المئوية للخلايا التي كانت ملطخة مع البرتقال التحقيق الحمض النووي شهدت متوسط ​​النسبة المئوية المنخفضة من 4 ± 0.3٪، في تركيز 0.05 ميكرومتر بعد 1 دقيقة، وترتفع إلى 166 ± 3.5٪ في 100 ميكرومتر بعد 10 دقيقة من الحضانة (الجدول 3). تركيزات مرة أخرى قدم أكثر من 1 ميكرومتر أيضا تلطيخ غير محدد من الخلايا الحية. A اتجاهين ANOVA betwالتابعين التركيزات التي لم تظهر أي تلطيخ غير محددة (،05-1 ميكرومتر) ذكرت فرق كبير الشامل في التفاعل بين جميع التركيزات من البرتقال التحقيق الحمض النووي وحضانة مرات في M.aeruginosa، F (12، 40) = 133.55، p <0.001. كان هناك تأثير الرئيسي ذات دلالة إحصائية في تركيزات F (3، 40) = 6919.67، ف <0.001 والأوقات حضانة F (3، 40) = 1161.45، ف <0.001. ومع ذلك اختبارا آخر المخصص توكي من خلال طريقة واحدة فقط ANOVA على 1 ميكرومتر أشارت إلى أن الأوقات الحضانة ما بين 10 و 30 و 60 دقيقة وكان لا فرق إحصائي في امتصاص البرتقال التحقيق الحمض النووي (جميع P> 0.05) (الشكل 6A). تراوحت مضان إشارة التمييز بين السكان 'يعيش' و 'الميت' الملون في FL2 في البرتقال التحقيق الحمض النووي من أدنى 0.3 ± 0.0 (RFU) بعد 60 دقيقة في 50 ميكرومتر و 30 مفي في 100 ميكرومتر إلى أعلى من 158.3 ± 0.4 (RFU) بعد 60 دقيقة بتركيز 0.1 ميكرومتر (جدول 4). أبلغ عن اتجاهين ANOVA دلالة إحصائية شاملة في التفاعلات بين تركيزات وفترة حضانة F (28، 80) = 28.12، P <0.001. تم العثور على آثار الرئيسية للتركيز F (7، 80) = 607.9، p <0.001 والأوقات حضانة F (4، 80) = 31.24، P <0.001 أيضا أن يكون كل تختلف اختلافا كبيرا. زاد التمييز مضان بين الإشارات من الخلايا الحية 'والحرارة قتل' الميت 'في FL2 مع مرور الوقت بين تركيزات 0.05 ميكرومتر ميكرومتر و 0.5 ولكنها انخفضت بين 1 ميكرومتر و 100 ميكرومتر (الشكل 6B). وبالتالي فإن تركيز الأمثل للأخضر التحقيق الحمض النووي هو 0.5 ميكرومتر مع فترة حضانة لمدة 30 دقيقة وللالبرتقال التحقيق الحمض النووي للتركيز الأمثل هو 1 ميكرومتر incu هدأ لمدة 10 دقيقة.

الشكل 1
الشكل 1. FCM مخرجات M.aeruginosa خلال FSC، SSC والأقصى الأحمر الإسفار (675 ± 12.5 نانومتر). (A) FSC وSSC من M.aeruginosa PCC 7806. (ب) تقريبا انتاج الشكل 1A مع FSC بوابات و مضان أحمر بعيد (مثلا: 640؛ م: 675 ± 12.5 نانومتر). (C) FSC تمثل أحجام الخلية. السهم اصطف أحمر يدل على المنطقة التي يتم بوابات للحد من الضوضاء الخلفية أو حجم الجسيمات الأخرى. (D) إشارات فيكوسيانين عالية تنتج من M.aeruginosa في ثقافة المرحلة دفعة هائلة مع الأحمر arrowed المناطق بوابات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

FO: المحافظة على together.within صفحة = "1"> الرقم 2
الرقم التحول 2. فيكوسيانين الإشارة في M.aeruginosa عندما المعالجة حراريا. تغيير M.aeruginosa تألق ذاتي في الخلايا الحية 'و' الميت 'تستخدم للتحقق من صحة النووي امتصاص حمض التحقيق. (A) الإشارات الحمراء الأقصى التحول من أعلى المصطبغة 'يعيش' السكان (الأخضر) إلى السكان أقل المصطبغة 'الميت' (الحمراء). (B) FSC ومضان أحمر مخرجات بكثير جنبا إلى جنب مع تحول ما يقرب من اثنين من حيث الحجم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. البرتقال مضان التحول في M.aeruginosa من 'مباشر' Unstaineد إلى خلايا 'الميت' الملون. M.aeruginosa 'حية' و 'الميت' الضوابط مختلطة حضنت مع البرتقال التحقيق الحمض النووي عند تركيز 1.0 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. (A) FL2 (585 ± 20 نانومتر) تقارير قناة تحولا زيادة من "حي" السكان غير ملوثين (الأخضر) إلى 'الميت' السكان الملون (البرتقالي) من خلال اثنين من حيث الحجم. (B) A 'الميت' السكان الملون (البرتقالي) الذي انخفض الإشارات الحمراء بعيدة ولكن زيادة إشارات FL2 من سكان "حي" (الخضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. المجهر epifluorescence من M.aeruginosa مع المسابر الجزيئية. مايكروفونroscope الصور من M.aeruginosa 50:50 الحية: السكان ميت المحتضنة مع تحقيقات الحمض النووي، جميع الصور x1،000 التكبير. (A) صورة epifluorescence الخضراء التحقيق الحمض النووي تناولها من قبل الخلايا الميتة. الخلايا الحية "تظهر حمراء بسبب تألق ذاتي من الكلوروفيل. (B) عرض المجهر ضوء الشكل 4A تظهر الخلايا الحية الخضراء الصباغية والخلايا الصباغية أقل 'الميت'، مع تلف الغشاء. (C) يعيش: ميت 50:50 مختلطة السكان M.aeruginosa. (D) أورانج النووية حضانة التحقيق الحمض من الشكل 4C، مع الخلايا الميتة والكشف عن اللون البرتقالي من خلال المجهر epifluorescence. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5 الشكل 5. النسبة المئوية للخلايا وصفتها مع الأخضر نوكليك حمض التحقيق ونسبة من 'مباشر' لإشارات FL1 'الميت'. يعني النسبة المئوية للخلايا M.aeruginosa ملطخة التحقيق الحمض النووي الأخضر في أوقات التركيز والحضانة المختلفة. لم (A) 0.1 ميكرومتر ليس وصمة عار ما يكفي من الخلايا، و 5 ميكرومتر عرض تلطيخ غير محددة وتركيزات 0.5 ميكرومتر و1 ميكرومتر الملون ما يقرب من 100٪ من السكان، والتي تبين حضانة مرات الأمثل بعد 30 دقيقة (أ). (B) "لايف: قتلى" نسب إشارات FL1 من مرحلة النمو الأسي والعينات المعالجة حراريا. تركيزات من 0.5 ميكرومتر و1 ميكرومتر تظهر تمييز الجيد من إشارات FL1 زيادة مع مرور الوقت الحضانة (نسب RFU اثنين من حيث الحجم). تركيزات من 10 ميكرومتر وأكثر من (غير الممثلة في الرسم البياني) تظهر ضعف التمييز إشارة مضان وتداخل 'يعيش' ل'الميت' السكان د. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. النسبة المئوية للخلايا وصفتها مع أورانج نوكليك حمض التحقيق ونسبة من 'مباشر' لإشارات 'الميت'. نتائج من التركيز وفترة حضانة التغيرات في السكان من M.aeruginosa. (A) متوسط ​​النسبة المئوية للخلايا التي سجلت إشارة مضان البرتقال في FL2 مع تركيزات؛ 0.1 ميكرومتر و0.5 ميكرومتر لا تلطيخ ما يكفي من الخلايا، و 5 ميكرومتر تلطيخ الخلايا الحية (تلطيخ غير محددة)، جنبا إلى جنب مع تركيز الأمثل من 1 ميكرومتر بعد 10 دقيقة (أ). (B) والبرتقال التحقيق الحمض النووي 'يعيش: الميتة النسب في FL2 تظهر التمييز جيد وليس أكثر من اللفإشارات مضان في تركيز 1 ميكرومتر أو أقل وإشارات الفقيرة متداخلة FL2 (نسب النظام أقل من واحد من حيث الحجم) التي يزيد فيها تركيز 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اضرب. فترة حضانة (دقيقة)
(ميكرومتر) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 15 44.1 1.8 54.7 1.6 70.5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98.8 0.1
1 58.5 1.6 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
5 91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153.9 13.0
100 165.8 3.1 174.4 5.7 177.1 5.1 161.5 2.5 159.7 6.6

الجدول 1. نسبة امتصاص حمض الأخضر نوكليك التحقيق في الخلايا. بيانات الجدول تبين من التجربة الأمثل باستخدام الأخضر التحقيق الحمض النووي و'حية' و 50٪ 'الميت' (المعالجة حراريا) عينة السكان 50٪. النسب المئوية يعني من الخلايا التي سجلتحسبت الأخضر النووي التحقيق حمض مضان (FL1) مقابل العدد الإجمالي من الخلايا الميتة التي تم الحصول عليها من FSC-H العد. قيم أعلى من 100٪ عرض تلطيخ غير محددة (SE أكد).

اضرب. فترة حضانة (دقيقة)
(ميكرومتر) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 385.5 15.0 481.9 17.7
0.1 178.3 18.1 343.0 19.5 437.0 20.6 619.1 12.1 714.1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365.8 33.5 426.8 67.2 480.4 73.2
1 205.8 12.1 225.9 13.7 237.3 15.6 241.5 5.8 263.1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

الجدول 2. نسبة من إشارات مضان أخضر في "لايف" و "الميت" خلايا ملون M.aeruginosa. التمييز FL1 إشارة بين الخلايا ملطخة الأخضر التحقيق الحمض النووي والتسجيلات الجوهرية غير محددة. وتضمنت العينة 50٪ 'يعيش' و 50٪ 'ميت' (المعالجة حراريا) M.aeruginosaمن نفس سكان يقاس على مدى جميع الأوقات التركيز وحضانة (SE تحتها خط).

اضرب. فترة حضانة (دقيقة)
(ميكرومتر) 1 5 10 30 60
0.05 4.0 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 15
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91.4 15 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132.9 6.0 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

الجدول 3. نسبة امتصاص أورانج نوكليك حمض التحقيق في خلايا الجدول مع البيانات الأمثل باستخدام البرتقال التحقيق الحمض النووي و'الميت' (المعالجة حراريا) عينة السكان 50٪ 'حية' و 50٪. تم احتساب متوسط ​​النسبة المئوية للخلايا التي سجلت البرتقال النووي التحقيق حمض مضان (FL2) مقابل العدد الإجمالي من الخلايا الميتة من FSC-H عدد (SE تحتها خط).

اضرب. فترة حضانة (دقيقة)
(ميكرومتر) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ td> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 6.5
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 15 0.1
10 7.0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 1.6 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 1.6 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

الجدول 4. نسبة من الأحماض النووية أورانج في "لايف" و "الميت" خلايا ملون M.aeruginosa. التمييز FL2 الإشارات بين الخلايا الملون من البرتقال التحقيق الحمض النووي (FL2) والتسجيلات الجوهرية غير محددة. وتضمنت العينة 50٪ 'حية' و 50٪ 'الميت' (المعالجة حراريا) M.aeruginosa من نفس سكان يقاس على مدى جميع الأوقات التركيز وحضانة (SE تحتها خط).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأعداد المتزايدة من المنشورات باستخدام المجسات الجزيئية تشير إلى أن بيانات موثوق بها وغنية بالمعلومات ويمكن الحصول على 5،6،8 - 15،19،22،23. اعتبارا من بعد ليس هناك وصمة عار مثالية لبقاء الخلية التي يمكن أن تكون فعالة في جميع الأنواع مع نفس التركيز وحضانة الساعة 6،10. حتى نفس النوع من التحقيق مع انبعاثات مضان المعدلة يظهر الحاجة إلى إنشاء التركيز وحضانة الصحيح الوقت (الجدولين 1 و 3). كما رأينا عند استخدام هذا البروتوكول، وتركيز والحضانة الوقت الأمثل لالبرتقال التحقيق الحمض النووي هو 10 دقيقة في 1 ميكرومتر، في حين أن الأخضر التحقيق الحمض النووي يحتاج نصف التركيز فحسب، بل يأخذ ثلاث مرات طالما (الأرقام 5 و 6). كل من هذه مونومرات cyanine خلايا impermeant مع تركيزات أعلى 1.0 ميكرومتر بدأ إنتاج تداخل في الانبعاثات أطياف مع الخلايا المصابة غير الغشاء. هذا التداخل سيgnals تقدم دليلا على أن يحدث تلطيخ غير محددة حيث الخلايا الحية 'يتخذون التحقيق الجزيئي. نتج عن ذلك من خلال مضان من تلطيخ غير محددة ولدت ايجابيات كاذبة، مما يؤكد الحاجة إلى تطوير بروتوكول المزمع إنشاؤها بعناية لكل التحقيق الجزيئية والكائن المستهدف. فإن الخطوات الأكثر أهمية في تحسين التحقيق الجزيئية على النحو التالي: 1) فهم كيفية تفاعل التحقيق الجزيئي مع الصك FCM. 2) اعتماد يعيش مناسبة والضوابط الميتة. 3) تطوير المعرفة من النابضة المعلمات من مخرجات FCM و 4) تعديل البروتوكول من خلال فهم البيئات في الموقع.

مصدر الضوء، والمرشحات الضوئية، والقدرة على تغيير PMT الجهد وكشف خلال أجهزة قياس التدفق الخلوي تختلف من مصنع لآخر، لذلك فإن الوعي بما الطول الموجي الإثارة من الليزر وأين يكمن أطياف الانبعاثات بالنسبة لقنوات مضان حاسمة. مع الاستحواذ على البيانات،عتبات يمكن فرض زيادة القرار الذي ستضيع لولا ذلك لربما من الضوضاء في الخلفية، والحطام أو المجاميع خلية ميتة. تحقيقات الجزيئية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على بقاء الأنواع دون زراعة، من خلال المعلمات واحدة مثل غشاء المحتملة، محتوى الحمض النووي ونشاط انزيم. ومع ذلك، في عينات بيئية يمكن أن يكون هناك العديد من الكائنات الحية من حجم الخلية مماثل ومضان. وبالإضافة إلى ذلك داخل الثقافات uniagal، والسكان الخلايا من المحتم أن تكون درجة دول الفسيولوجية 3، والتي قد تؤثر على امتصاص الجزيئي التحقيق. واحدة من المزايا الرئيسية لFCM هو قدرته على التمييز وتميز الدول الفسيولوجية على مستوى الخلية الفردية في الوقت الحقيقي، وهو أمر ضروري عند دراسة الكائنات الحية الدقيقة الجدوى في الموقع، وغالبا ما يتعرضون لظروف سريعة وديناميكية. على الرغم من استخدامه المتكرر، ومفهوم بقاء الخلية لا يزال من الصعب تحديد. تطبق عادة على انتشار الخليوي،وسجل الجدوى كثيرا على النهج القائم على النمو. هذا الافتراض الأساس قد تقصر، والظروف قد لا تتناسب مع الخلايا الفردية لإنتاج ولكنها قد تكون لا تزال مقبولة. الخلايا في الحالة الفسيولوجية nonproliferating التي دخلت السكون أو G (0) مرحلة دورة الخلية 27 قد لا تتفاعل مع لجنة التحقيق الجزيئي إعطاء السلبيات كاذبة في دورة DNA أو التمثيل الغذائي تحقيقات القائمة.

وذلك باستخدام خلايا مختبر نمت أو المعزولة حديثا لتحسين تحقيقات الجزيئية مساعدة التكرير البيانات المستخدمة في الدراسات البيئية. تؤخذ الخلايا المستخدمة في التحسين من ثقافات دفعة عادة في مراحل ثابتة الأسي أو في وقت مبكر ويفترض أن يكون أعلى جدوى. ومع ذلك، يجب أن تؤخذ بحذر شديد عند استخدام كثافات عالية الخلية، وتلك في مرحلة ثابتة في وقت متأخر أو الميكروبات المنتجة للمصفوفات خارج الخلية. في هذا البروتوكول تعرضت لها السيطرة على السكان القتلى من الخلايا إلى 60 درجة مئوية الحرارة لمدة 1 ساعة،مع تأكيد الضرر الغشاء وتدهور الصباغ ينظر من خلال المجهر (الشكل 4) والمخرجات مضان FCM (أرقام 2 و 3). محاكاة أسباب موت الخلايا الطبيعية من الصعب للغاية الحال؛ الابتلاع من قبل رعاة، تحلل الفيروسي، أو موت الخلية المبرمج احتمال التقسيم غير المتماثلة 24 ليست مجدية دائما أو يمكن ملاحظتها تحت ظروف المختبر. وكثيرا ما شكك سائط التجريبية من الأخلاق لأنها قد لا يكون معادلا للضغوط الناجمة عن البيئة (على سبيل المثال، قتل حرارة)، ويمكن أن يكون هناك رد غير المتجانسة، التي بعض الأفراد يتعرضون للقتل وتظهر الخلايا الأخرى أي تدهور الخلايا يمكن ملاحظتها أو وفاة 3 25. لتجنب مثل هذا التناقض التعريف العملي الذي التجارب قياس يجب أن يحدد بوضوح حتى لا يؤدي إلى الارتباك 6،23، وتخفيف تطبيع العلاقات بين الدراسات.

الطرق البديلة المختلفة هفاستخدمت البريد لبقاء الخلية تحليل في الثقافات بالتزامن مع تحقيقات الجزيئية. المجهر epifluorescence هو أسلوب التقليدية المستخدمة، على الرغم من photobleaching من أو إدخال إشارات الحرفية من الخلايا المجاورة قد يعطي تحت أو فوق تقدير الحالة الفسيولوجية إذا لم تسجل بسرعة كافية لسكان. وهذا يجعل الأمثل من خلال التصوير صعبة للغاية، مع دقة يحتمل أن تكون منخفضة. تقييم الجيني الجدوى الخلوية باستخدام كل من DNA و RNA أساليب التضخيم مثل: تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، عكس الناسخ (RT-PCR) والتضخيم النووي على أساس تسلسل حمض (NASBA) قد استخدمت أيضا. ومع ذلك، يخدم التقييم الجيني فقط كطريقة غير مباشرة من التحقق من صحة جدوى عن استمرار الحمض النووي يعتمد بشكل كبير على الظروف البيئية، مع ارتباط بقاء الخلية الفعلية قد تكون متفاوتة بشكل كبير 28. باستخدام مزيج من الضوء المبعثر و / أو مضان من خلال الصور الطبيعيةأصباغ ynthetic (الشكل 1) المحاصرة من السكان يمكن: زيادة دقة البيانات، وتحديد استجابات السكان نادرة والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة. FCM على طول تحقيقات الجزيئية تبرز من التقنيات المذكورة السابقة في اختبار الفسيولوجية للخلية واحدة في السرعة والدقة وتسجيل معلمات متعددة.

FCM هو أداة تحليلية قوية في علم الأحياء المجهرية المائية ومع إضافة تحقيقات الجزيئية لديها إمكانات واسعة في عدد من المجالات بما في ذلك، وحيدة الخلية وتحليل المجتمع للقطاعات الصناعية (على سبيل المثال، ورصد إمدادات مياه الشرب). التقدم في المستقبل يمكن أن نرى FCM دمج مضان التهجين في الموقع (FISH)، والتي يمكن الكشف عن وتوطين سلاسل جينية معينة في الخلايا الفردية داخل عينات غير متجانسة كثيفة في. تطوير FCM والجزيئية التحقيق قابلية للفي الموقع التسجيلات يمكن أن توفر بيانات حيوية عن مصادر المياه لتنفيذ الصورة الأولىtrategies لإدارة الموارد. بعد بروتوكول الأمثل وضعت هنا، FCM وتحقيقات الجزيئية يمكن أن تلعب دورا حاسما في توفير بيانات قيمة عن علم وظائف الأعضاء الميكروبية في البيئات المائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف طالب دكتوراه ديف هارتنل وجامعة بورنموث للحصول على الدعم والتمويل للبحوث والمرافق.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).

Tags

الطب، العدد 107، التدفق الخلوي، التحقيق الجزيئي، البكتيريا الزرقاء،
الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي (<em&gt; Microcystis الزنجارية</em&gt;) باستخدام التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chapman, I. J., Esteban, G. F.,… More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter