Summary
Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.
Abstract
Microbiële subpopulaties in veld en laboratoriumstudies bleek een hoge heterogeniteit in morfologische en fysiologische parameters weergegeven. Het bepalen van de actuele toestand van een microbiële cel overstijgt levende of dode categorieën, zoals microben kan voorkomen in een slapende toestand, waarbij celdeling en metabolische activiteiten verminderd. Gezien de noodzaak voor detectie en kwantificering van microben flowcytometrie (FCM) met moleculaire probes verschaft een snelle en nauwkeurige methode om te bepalen algemene levensvatbaarheid populatie. Door het gebruik van SYTOX Groen en SYTOX Oranje in het model cyanobacterie Microcystis aeruginosa te membraanintegriteit ontdekken, ontwikkelen we een overdraagbare methode voor een snelle indicatie van enkele cel sterfte. De moleculaire probes die in dit tijdschrift worden genoemd groen of oranje nucleïnezuur probes respectievelijk (hoewel er andere producten met gelijke excitatie en emissie golflengten die vergelijkbare functies hebben action, we specifiek naar de voorgrond genoemde sondes). Protocollen met behulp van moleculaire probes verschillen tussen soorten verschillen voornamelijk in concentratie en incubatietijd. Na dit protocol beschreven op M.aeruginosa de groene nucleïnezuurprobe geoptimaliseerd in concentraties van 0,5 uM na 30 min incuberen en de oranje nucleïnezuurprobe bij 1 uM na 10 min. In beide sondes concentraties lager dan hier vermeld geleid tot onder rapportage van cellen met membraanschade. Omgekeerd 5 uM concentraties en hoger in beide probes vertoonden een type niet-specifieke kleuring, waarbij 'levende' cellen die een doel fluorescentie, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van "niet-levensvatbaar" celaantallen. De positieve controles (warmte gedode) die toetsbaar dode biomassa, hoewel de geschiktheid van controle generatie blijft onderwerp van discussie. Door het aantonen van een logische opeenvolging van stappen voor het optimaliseren van de groene en oranje nucleïnezuurprobes we demonstrate hoe een protocol dat kan worden gebruikt voor cyanobacteriën fysiologische toestand effectief te analyseren creëren.
Introduction
De cel is een complex systeem dat continu reageert op het milieu door beïnvloeding van de fysiologische parameters en de functie ervan te veranderen. De populatie dynamica van isogene microbiële populaties zowel qua aard als het laboratorium worden beïnvloed door de ontwikkeling van subpopulaties, optredende zelfs onder betrekkelijk constante milieuomstandigheden 1 - 3. De variabiliteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ontstaat als gevolg van de sterk variabele aard van omgevingsomstandigheden. Deze soms stochastische processen vervolgens produceren subpopulaties die zijn heel anders dan de gemiddelde bevolking. Recent bewijs is gebleken dat deze fysiologische subpopulaties verschillend reageren op milieu-omstandigheden en kan het signaal verbindingen of remmers die drastisch beïnvloeden en invloed hebben op de totale 3,4 bevolking te produceren.
De oprichting van een methode om heterogeniteit binnen een populatie te definiëren is de sleutel tot understanding de ecologie van microben in verschillende omgevingen en is essentieel bij het bouwen kennis overlast cyanobacteriën, zoals toxische Microcystis, die grote gevolgen hebben voor de menselijke waterzekerheid. Soorten zoals Anabaena morfologische heterogeniteit weergegeven in reactie op omgevingschommelingen ontwikkelen gespecialiseerde cellen zoals heterocysten en akinetes 2. In tegenstelling, doe Microcystis cellen niet duidelijk morfologische heterogeniteit tonen tijdens een reactie op stress. Het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen is het belangrijkste fysiologische differentiatie en maakt een beter begrip van microbiële populatie. Echter, de conceptuele probleem van de bacteriële levensvatbaarheid zelf blijft moeilijk en slecht gekenmerkt 1,5,6.
Flowcytometrie (FCM) is een betrouwbare en snelle werkwijze voor het analyseren van afzonderlijke cellen. Om het begrip van enkele cel fysio verhogenlogie met FCM, zijn moleculaire probes werden gebruikt voor een aantal metabolische en biochemische processen 7 onderscheiden. Dit heeft geleid tot een grotere kennis van de soorten op cellulair en populatieniveau en op zijn beurt hielp waterbeheer 8,9. Echter organismen verschillen in moleculaire opname en efflux probe vanwege de poriën en pompen in celwanden en membranen, die hebben geleid tot een aantal moleculaire ontwerp probe en protocolimplementatie 6,10,11. Moleculaire probes beschikbaar voor commerciële en onderzoeksdoeleinden worden vaak voorzien van een generiek protocol die van toepassing kunnen zijn voor een heel ander celtype. Men moet zeer voorzichtig overdracht protocollen ontwikkeld één celtype tot een ander 6, is het daarom een essentiële taak moleculaire probes optimaal effectief voor gebruik.
De groene en oranje nucleïnezuur probes binden aan zowel dubbel- en enkelstrengs nucleïnezuren met minimale base selecterentiviteit en worden gebruikt om de plasma membraan integriteit van de cellen te beoordelen. De groene nucleïnezuur probe een duidelijk verbeterde cel labeling fluorescentiesignaal vergeleken met andere moleculaire probes, zoals propidium-jodide gebaseerde verbindingen 12, die ook kan fungeren als een indicator van de levensvatbaarheid van de cellen. De term "cell rentabiliteit" Hier neemt aan dat DNA degradatie optreedt na het verlies van plasmamembraan integriteit. De nucleïnezuurprobes zijn asymmetrisch cyaninekleurstoffen met drie positieve ladingen en kan niet cellen met intacte membranen te voeren onder gekenmerkt concentraties in zowel eukaryotische 11,13 en 14,15 prokaryotische organismen. De binding van een nucleïnezuur probe nucleïnezuren kunnen leiden tot een> 500-voudige toename van fluorescentie-emissie van endogene signalen in cellen die hun membraan integriteit aangetast. Hoewel moleculaire probes zoals de groene nucleïnezuurprobe een goede indicator van de enkelvoudige celfysiologie kan zijn, is er behoefte to optimaliseren elke sonde met het beoogde doel organisme, zoals incubatietijd hebben varieerden van 7 min - 30 min en concentratie varieert van 0,1 uM - 0,5 micrometer in Microcystis experimenten alleen 15-19.
Hier presenteren we een protocol om de cytometrische analyses van groen en de relatief nieuwe oranje nucleïnezuurprobes (die tot op heden niet getest op de cyanobacteriën soort M.aeruginosa) te optimaliseren. De volgende ontwikkelde methodologie kan worden overgedragen naar andere soorten en gebruikt als een platform voor het optimaliseren van protocollen in andere moleculaire probes, waardoor het begrip van microben en ecologische gedrag verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van de Molecular Probe en Flow Cytometer
- Verdunde voorraadoplossingen van de nucleïnezuur probes, die worden geleverd als een 5 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) tot hoeveelheden van gewenste concentraties in ultrazuiver gefiltreerd H 2 O.
- Bewaar de nucleïnezuur probes in het donker tussen -5 ° C en - 25 ° C tot gebruik.
- Schakel de flowcytometer en de belasting softwarepakket (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor FCM specificaties).
- Plaats een lege hemolyse buis (12 x 75 mm) op het monster injectiesonde (SIP), klik ontstoppen en dan terug spoelen naar de FCM reinigingsproces te starten.
OPMERKING: Sommige monster podia voor het SIP is geschikt voor verschillende soorten slangen, waaronder microcentrifugebuisjes. De moleculaire sonde verdunner en schede vloeistof gebruikt in de FCM apparaat is van een analytische kwaliteit "type 1" 0,22 pm membraan gefilterd bron. - Plaatseen frisse hemolyse buis met 2 ml ultrapuur gefilterd H 2 O op het SIP, een tijdslimiet voor 10 - 15 min en een fluïde snelheid te snel (of een debiet van> 66 pl / min).
- Selecteer een nieuwe data cel, op relevante drempels voor fluorescentie en lichtverstrooiing kanalen om ruis te verminderen en klik op 'run'.
- Als de totale gebeurtenissen per seconde, zijn niet onder de aanbeveling van de fabrikant, vervolgens een 2 ml monster van decontaminatie-oplossing gedurende 2 minuten op een snelle en herhaal de stappen 1.4 en 1.5.
LET OP: Controleer aanbevelingen van de fabrikant voor FCM start-up reiniging protocollen, omdat ze kunnen variëren tussen de modellen. Testen op specifieke drempels moet ook in overeenstemming met de FCM model zoals bepaalde apparatuur kan de gebruiker spanningen krijgt de fotomultiplier buizen (PMT's) verhogen of verlagen van het elektrische signaal geregistreerd vanaf de optische detectors toepassen. De FCM-model gebruikt in deze ervament heeft PMT voltage vast en gebruikt een drempel van 80.000 naar voren lichtverstrooiing (FSC-H) tot deeltjes kleiner dan 2,0 micrometer en elektronische ruis uit te sluiten.
2. Voorbereiding van Culturen en Initial celtellingen
- Autoclaaf 98 ml ultrazuiver gefilterde H2O en 2 ml algen media (x50 concentratie) in een bekerglas van 250 ml gedurende 20 minuten bij 120 oC
- Uit een eerste monocultuur van M.aeruginosa (PCC 7806) in een hoge steady state dichtheid plaats 2 ml van het monster in een buis onder de SIP. Disaggregeren elke kolonievorming door vortexen of sonificatie 20 en bevestig gelijkmatig verspreid cellen door lichtmicroscopie.
OPMERKING: Overmatige blootstelling aan ultrasone golven kunnen leiden tot cellysis en moet met voorzichtigheid worden gebruikt. Sinds ultrasoonapparaat gasblaasjes kan instorten (zoals gevonden in soorten zoals M.aeruginosa) uitgangen, zoals kant lichtverstrooiing (SSC-H) intensiteit kan meer se gewordennsitive. - Binnen de FCM-software, selecteer een histogram plot gegevens van voorwaartse lichtverstrooiing (FSC-H) registreren en configureren van de plot specificaties door te klikken op "log" te bekijken in een log-schaal op de as.
- In een aparte uitgang, selecteer een ander histogram (log-as) naar natuurlijke fluorescentie op te nemen, zoals de accessoire fotosynthetische pigment fycocyanine (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), gevonden in M.aeruginosa.
- Gebruik een lichtbron die phycocyanine en een detector die de emissies van de resulterende fluorescentie kunt een filter kunnen prikkelen.
OPMERKING: Fotosynthetische pigment zoals chlorofyl kan enthousiast met de meest gebruikte 488 nm blauwe laser, terwijl phycocyanine is enthousiast meer dan 600 nm en zal alleen worden gedetecteerd met een rode lichtbron 21. Neem contact op met de flowcytometers fabrikant voor excitatie lichtbronnen en de spectra van de emissie detectoren, hier zowel een 488 nm en 640 nm laser werden gebruikt samen meteen 675 ± 12,5 nm optische filter. - Voor het opnemen van de hoogste resolutie instellingen selecteren die het dichtst bij de kern grootte van het doelorganisme (10 pm) en een relatief lage stroomsnelheid (14 pl / min).
OPMERKING: Voor de beste resolutie monsters moet worden uitgevoerd volgens de fabrikanten aanbeveling van de gebeurtenissen per seconde. - Alvorens gegevens te gebruiken een drempel naar gate uit lichtverstrooiing en / of fluorescentie signalen die worden veroorzaakt door elektronische ruis of celmonster puin.
- Selecteer een nieuwe data cel, maken een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters op een log schaal en op Uitvoeren.
- Als monster dichtheid leidt tot een overmatige incidentie, kan verdunning maatregelen worden genomen om de nauwkeurigheid en precisie te verhogen.
- Van de dichtheid perceel van toepassing software poorten van de vorige histogram te laag niveau scatter signalen, geproduceerd door achtergrondgeluiden of vuil (FSC <320.000) sluiten. Omgekeerd is de poort van de hogere relatieve fluorescentiephycocyanine signalen van cellen en alleen onder deze gebeurtenissen (FL4, 56.000 - 1.950.000).
- Met het aantal cellen die in de afgesloten ruimtes delen door het totale volume van het monster dat is gepasseerd door de FCM te werken hoeveel cellen per ml.
Opmerking: De FCM model hier gebruikt heeft een microprocessor gestuurde peristaltische pompsysteem waardoor monstervolume te bepalen. Andere FCM apparatuur kan een gekalibreerde kralensuspensie of een berekening van H 2 O gewicht / volume verschillen totale monstervolume vereist verifiëren. - Voeg de vereiste hoeveelheid cellen aan de vers bereide media om een batch groeicyclus (250.000 cellen / ml) van M.aeruginosa starten.
OPMERKING: Species verschillen in groei, afhankelijk van hun in-situ omgeving parameters en de beschikbaarheid van voedingsstoffen, zodat een batch cyclus moet vooraf opgenomen op life cycle fasen vast te stellen.
3. Optimordening der Molecular Probe Cel Opname
- Oogst de helft van de M.aeruginosa kweek bereid in stap 2 van een exponentiële fase en als een 'live' control.
Opmerking: De monsters verdund uit een hoge dichtheid kweek rechtstreeks naar een exponentiële fase kan beïnvloeden optimalisatie resultaten door dode celvernieuwing, vergeleken met die van culturen geïnoculeerd vanuit een aanvankelijke vertraging / inductiefase. - Bereid de andere helft als een "dode" controle door gebruik van werkwijzen zoals 70% ethanol, verwarming monsters bij 60 ° C gedurende 1 uur, of paraformaldehyde 4% formaldehyde gedurende 30 min 6,11,22. Controleer variaties in de micro monsters (bijv., PH).
LET OP: De positieve, warmte-gedood 'dode' controle M.aeruginosa wordt onderscheiden van een 'live' monster door de daling van de phycocyanine signalen. Inducerende sterfte door andere methoden kunnen veroorzaken dezelfde output en zal vary in soorten. - Instellen gemengde monsters met verschillende verhoudingen van 'levende' en 'dode' samples (bijvoorbeeld 0%, 25%, 50%, 100%).
- Disaggregeren kolonievorming door vortexen of sonificatie en controleer de pH.
- Selecteer een 488 nm laser naast detectoren fluorescentie kunt opnemen van de groene (FL1, 530 ± 15 nm) en oranje (VT2, 585 ± 20 nm) nucleïnezuurprobes en de 640 nm laser om fycocyanine signalen op te nemen via haar respectieve detector.
OPMERKING: Bij gebonden aan DNA, de groene nucleïnezuur probe heeft een geschatte fluorescentie excitatie golflengte van 504 nm en emissie maxima van 523 nm, terwijl de oranje nucleïnezuur probe heeft een excitatiegolflengte van 547 nm en emissie maxima van 570 nm. Een 488 nm argon ion solid state laser kan worden gebruikt voor zowel moleculaire probes wekken echter een groene laser (tot 547 nm) een hogere fluorescentie te produceren. - Als uitgangspunt, de invoering van demoleculaire sonde met fabrikanten aanbevolen concentratie tot de 50% 'live' en 50% 'dode' cultuur en incubeer in het donker.
- Selecteer een nieuwe data cel, plaatst het monster onder het SIP met drempels en triggers die achtergrondgeluiden (FSC-H 80.000) zal verminderen.
- Maak een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters, en drie histogrammen. Een histogram met de desbetreffende moleculaire probe optische detector kanaal (FL1 of 2), een om fycocyanine emissies (FL4-H) en de andere FSC-H, allemaal op een logaritmische schaal detecteren.
- Incubeer de monsters van M.aeruginosa met het nucleïnezuur probes in het donker voor 60 min, opnemen in afzonderlijke datacellen op verschillende tijdstippen (1, 5, 10, 15, 30 en 60 min).
OPMERKING: Bij het aanpassen van parameters zoals pH controle met produceert voor potentiële reacties van bepaalde chemische stoffen (voor de geteste nucleïnezuursondes een buffer kan niet fosfaten of hoge niveaus van monovalente of diva bevattengeleend kationen, zoals de binding met DNA wordt gereduceerd). - Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de respectievelijke fluorescentie sonde kanaal histogram.
Opmerking: De concentraties die in dit protocol waren 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 uM, die kan worden veranderd door ofwel verhogen of verlagen van het volume van M.aeruginosa monster of initiële voorraadoplossing van nucleïnezuur probes. - In de fluorescentie sonde kanaal gelden andere inclusief software poort naar de hoogste piek in het histogram (groen FL1-H, 240.000 - 1.650.000, oranje FL2-H, 30.000 - 165.000) en vervolgens de poort die positieve probe fluorescentie in de dichtheid plot.
- Run stappen 3,1 - 3,11 bij 100% "live", 100% 'dode' en al mengcultuur monsters, het aanpassen van de concentraties moleculaire probe (bijvoorbeeld x 0,1 tot x 10) en / of de temperatuur en pH indien nodig. <li> Vergelijk het aantal positieve moleculaire probe fluorescentiesignalen de oorspronkelijke celdichtheid van "dode" cellen (uit half totale FSC-H of 100% 'dode' cultuur) om het totale percentage cellen gekleurd met het nucleïnezuur vinden probes.
- Doe dit voor elke periode in elke concentratie om de optimale protocol voor het hoogste percentage van de cel nu- sonde opname vinden zonder dat niet-specifieke kleuring (gebruik van de middelen in een One-Way ANOVA of Kruskal-Wallis one-way variantie-analyse, als de gegevens niet-parametrische).
4. Molecular Probe Fluorescentie Discriminatie
- Voor het testen van de fluorescentie interferentie / overlap van intrinsieke of niet-specifieke cel kleuring selecteer de 50% 'live' en 50% 'dode' gemengde cultuur data en verwijder alle poorten.
- Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de phycocyaninekanaal histogram.
- Poort de hoogste piek en phycocyanine label 'live', met toevoeging van de laagste piek aangeduid als "dood".
- Voer een verdere poort stap in de respectieve moleculaire probe fluorescentie histogram kanaal, via een op een moment, het 'live' en vervolgens 'dode' phycocyanine (FL4) signalen, waarop zowel de gemiddelde golflengtes.
OPMERKING: De modus voor het induceren van sterfte in dit experiment werd gedaan door een warmtebehandeling, die op grond van dit protocol duidelijk afneemt phycocyanine signalen. Andere methoden voor het produceren van populaties van 'dode' cellen kunnen verschillende uitgangen op in de verworven runs. - Verhouding van de gemiddelde golflengte van de positieve moleculaire probe fluorescentie ("dode") en de intrinsieke / niet-specifiek signaal ("levende") protocol gevoeligheid te bepalen.
OPMERKING: Om de fluorescentie van discriminatie van 'live' en 'dood' Popul verbeterenaties, verhoging van de koolstofbron actieve vlek opname van nutriënten uitgeputte cellen of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aan celwand permeabiliteit en verkregen fluorescentiesignalen 6 verbeteren. Limited compensatie bepaalde FCM modellen spectrale overlap kan worden uitgevoerd door de gebruiker gemanipuleerd paarsgewijze correctie tijdens monsterverzameling (PMT voltage verandert) of uit post-analytische gespecialiseerde software. - Selecteer de geoptimaliseerde protocol, waar het hoogste bedrag van de 'dode' cellen is gekleurd zonder het optreden van niet-specifieke kleuring. Als een aantal test vergelijkbare resultaten te aanvaarden van het protocol met de laagste concentratie en de incubatietijd, samen met een goede discriminatie fluorescentie signaal. Volg de instructies van de fabrikant voor de cytometer shutdown procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) en kant lichtverstrooiing (SSC) uitgangen van een M.aeruginosa batch cultuur in exponentiële fase geeft informatie over de grootte cel (diameter) en de interne granulariteit respectievelijk (Figuur 1A). FSC kunnen cellen die te groot en / of klein M.aeruginosa te onderscheiden zijn. Deze discriminatie of gating kan door raffinage van gegevens tussen bepaalde punten van FSC uitgang (figuur 1C). Phycocyanin, grote samenstelling van M.aeruginosa fotosynthetisch apparaat produceert een sterk signaal ondervraagd door een rode lichtbron (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), die kan worden gebruikt om verder gate populaties, vergelijkbaar met die gedaan FSC gating maar met fluorescentie (figuur 1D). Van FSC en fluorescentiesignalen kunnen gegevens worden afgesloten van de oorspronkelijke uitgang (figuur 1A) specifieke gegevens M.aeruginosa voor final cel tellingen (Figuur 1B).
Autofluorescentie per cel in cyanobacteriën populaties verschillen in functie van fysiologische toestand. Hier werden de cellen geoogst van een exponentiële fase cultuur tonen relatief hoge ver rode fluorescentie voor een 'live' control bevolking en de 'dode' controle werd blootgesteld aan 60 o C warmte gedurende 1 uur. Toen 'live' hogere gepigmenteerde en 'dode' lagere gepigmenteerde controles worden gemengd de dalende verschuiving in autofluorescentie is duidelijk (Figuren 2A en B). Het "dead" cell fluorescentie en FSC parameters kunnen worden gebruikt om het totale cellen die de moleculaire probe hebben opgenomen discrimineren. In membraan gecompromitteerd of 'dode' cellen zal de nucleïnezuurprobes een extra signaal te produceren, hetzij op; FL1 kanaal (530 ± 15 nm) voor de groene nucleïnezuurprobe of FL2 kanaal (585 ± 20 nm) voor de oranje nu- acid probe (Figuur 3A en B), vergeleken met het natieve 'live' fluorescentiesignaal. Bevestiging van beide nucleïnezuur probes in cellen met schade membranen kan worden gezien door epifluorescentie microscopie (Figuren 4A & D).
Het totale percentage cellen die waren gekleurd met groene nucleïnezuurprobe werd verkregen van gemengde monsters die werden pre-gated daarvan alleen M.aeruginosa afmetingen cellen van een FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000). In een 50:50 'live: dead' monster, groene fluorescentie cellen afgesloten van de hoogste piek in een FL1 (530 ± 15 nm) histogram werd vergeleken met originele dichtheid in de 'dode' cel populatie (hetzij door het totale FSC- halveren H of het runnen van een aparte cel rekenen op alleen de 100% 'dode' cel monsters). Boven 100% zou blijken dat niet-specifieke kleuring optreedt. Het gemiddelde percentage van cellen die waren gemaakt van de groene nucleofiele exocyclische aminefunctiesic acid probe varieerde; 15 ± 0,3% in 0,05 uM na 1 min tot 177,1 ± 5,1% bij 100 uM gedurende 10 min incubatie (Tabel 1). Concentraties van meer dan 1 uM (niet inbegrepen) toonde niet-specifieke kleuring (bijv., 'Live' cellen die begonnen met het nemen van de moleculaire sonde). A Two-Way ANOVA tussen de concentraties die geen niet-specifieke kleuring vertonen leverde (0,05 - 1 uM) en gaven een algemeen significant verschil in interactie tussen de concentratie van groene nucleïnezuurprobe en incubatietijd in M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Er was een hoofdeffect over de concentraties van groene nucleïnezuurprobe gebruikt F (3, 40) = 836,92, p <0,001 en incubatietijden F (4,40) = 347,98, p <0,001. Een post-hoc Tukey-test gaf een significant verschil tussen alle concentraties, behalve 0,5 en 1 uM (p <0,001) en eensignificant verschil tussen alle incubatietijden van 1 - 60 min (p <0,001). Echter, een post hoc Tukey test van een One Way ANOVA bleek de gemiddelde opname van groene nucleïnezuurprobe verschilt niet tussen 30 en 60 min bij 0,05 uM (p> 0,05) en 1 uM (p> 0,05) (Figuur 5A). De gemiddelde verhouding van 'live' en 'dood' relatieve fluorescentie signalen in FL1 voor discriminatie van de bevolking (gemeten door middel van FL4) varieerden in de groene nucleïnezuurprobe van de hoogste in 0,1 pm na 60 min van 714 ± 14,8 (RFU) naar de laagste van 0,8 ± 0,0 (RFU) bij 100 uM na 30 min (Tabel 2). Vergelijking van de verhoudingen van relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) discriminatie intensiteit 'live' en 'dode' FL1 signaleert een Two Way ANOVA meldt een algemene significante verschillen in de interactie tussen concentraties en incubatietijden F p <0,001 met de groene nucleïnezuurprobe. Er was ook een significant verschil in het hoofdeffect voor alle concentraties F (7,80) = 475,41, p <0,001 en incubatietijden F (4,80) = 78,28, p <0,001. De discriminatie verhoudingen van fluorescentie-signalen tussen de 'live' en warmte gedood 'dode' cellen verhoogd met de tijd tussen de concentraties van 0,05 pm en 1 uM, maar daalde tussen 5 urn en 100 micrometer (Figuur 5B).
Het percentage cellen die werden gekleurd met oranje nucleïnezuurprobe zag gemiddeld lage percentage van 4 ± 0,3%, in een concentratie van 0,05 uM na 1 minuut toe tot 166 ± 3,5% bij 100 uM na 10 min incubatie (Tabel 3). Opnieuw concentraties dan 1 uM presenteerde ook niet-specifieke kleuring van levende cellen. A Two-Way ANOVA betwEen concentraties die geen niet-specifieke kleuring vertoonde (0,05 - 1 uM) rapporteerde een algemene significante verschillen in de interactie tussen alle concentraties van de oranje nucleïnezuurprobe en incubatietijden in M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Er was een statistisch significant hoofdeffect over concentraties F (3, 40) = 6919,67, p <0,001 en incubatietijden F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Maar een post hoc Tukey-test door een One Way ANOVA op slechts 1 uM aangegeven dat incubatietijden tussen 10, 30 en 60 min had geen statistisch verschil in de opname van oranje nucleïnezuurprobe (alle p> 0,05) (figuur 6A). Discriminatie fluorescentie-signaal tussen 'live' en 'dood' gekleurd bevolkingsgroepen in FL2 varieerden in oranje nucleïnezuurprobe van de laagste van 0,3 ± 0,0 (RFU) na 60 min in 50 uM en 30 min 100 uM in de hoogste 158,3 ± 0,4 (RFU) na 60 min bij een concentratie van 0,1 pM (Tabel 4). Een Two Way ANOVA meldde een algehele statistische significantie in de interacties tussen de concentratie en de incubatietijd F (28, 80) = 28.12, p <0,001. De belangrijkste effecten van concentratie F (7, 80) = 607,9, p <0,001 en incubatietijden F (4, 80) = 31,24, p <0,001 bleken ook alle significant verschillend zijn. Discriminatie fluorescentie tussen de signalen van 'live' en warmte gedood 'dode' cellen in VT2 verhoogd met de tijd tussen de concentraties van 0,05 uM en 0,5 uM, maar daalde tussen 1 urn en 100 micrometer (Figuur 6B). Daarom is de optimale concentratie voor de groene nucleïnezuurprobe 0,5 pM met een incubatietijd van 30 min en het oranje nucleïnezuurprobe de optimale concentratie 1 uM Incuingehouden gedurende 10 min.
Figuur 1. FCM uitgangen van M.aeruginosa Door FSC, SSC & Verre rode fluorescentie (675 ± 12,5 nm). (A) FSC en SSC van M.aeruginosa PCC 7806. (B) dezelfde output als figuur 1A met gated FSC en ver rode fluorescentie (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC die de afmetingen van de cel. De rode gevoerde pijl geeft het gebied dat wordt afgesloten op de achtergrond ruis of andere grootte deeltjes te verminderen. (D) Hoge phycocyanine signalen geproduceerd uit M.aeruginosa in een exponentiële fase batch cultuur met rode pijlen gated gebieden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Phycocyanin Signal Shift in M.aeruginosa wanneer warmte behandeld. Verandering van M.aeruginosa autofluorescentie in 'live' en 'dood' cellen gebruikt om nu- opname zuurprobe valideren. (A) Far rode signalen verschuiven van een hoger gepigmenteerde 'live' populatie (groen) om een lagere gepigmenteerde 'dode' populatie (rood). (B) FSC en ver rode fluorescentie in combinatie uitgangen met een verschuiving van bijna twee ordes van grootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Oranje Fluorescentie Verschuiving in M.aeruginosa Van 'Live' Unstained om 'dode' gekleurde cellen. M.aeruginosa 'live' en 'dode' gemengd controles geïncubeerd met oranje nucleïnezuurprobe in een concentratie van 1,0 urn voor 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) kanaal meldt een toegenomen verschuiving van een 'live' onbesmet bevolking (groen) om een 'dode' gekleurd bevolking (oranje) via twee ordes van grootte. (B) A 'dode' gekleurd bevolking (oranje), die is afgenomen ver rode signalen maar steeg FL2 signalen van een 'live' populatie (groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. epifluorescentiemicroscopie van M.aeruginosa met Molecular Probes. Microscope beelden van een M.aeruginosa 50:50 live-: dode bevolking geïncubeerd met nucleïnezuurprobes, alle afbeeldingen x1000 vergroting. (A) Een epifluorescentie beeld van groene nucleïnezuursonde door 'dood' cellen genomen. 'Live' cellen blijken rood als gevolg van de autofluorescentie van chlorofyl. (B) licht microscoop van figuur 4A toont 'live' groene gepigmenteerde cellen en minder gepigmenteerde 'dode' cellen, met membraan schade. (C) leven: dood 50:50 gemengde M.aeruginosa bevolking. (D) Oranje nucleïnezuurprobe incubatie uit figuur 4C, met 'dode' cellen onthullen een oranje kleur door middel van epifluorescentie microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. percentage cellen Gelabeld met Groene nucleïnezuurprobe en de verhouding van de "live" in "Dead" FL1 Signals. Gemiddelde percentage M.aeruginosa cellen gekleurd met de groene nucleïnezuurprobe in verschillende concentraties en incubatietijden. (A) 0,1 uM kleurden weinig cellen, 5 pM tonen aspecifieke kleuring en concentraties van 0,5 uM en 1 uM gekleurd bijna 100% van de bevolking, met optimale incubatietijd na 30 min (a). (B) 'Live: dead' verhoudingen van FL1 signalen van een exponentiële groeifase en warmte behandelde monsters. Concentraties van 0,5 pM en 1 uM vertonen een goede discriminatie van FL1 signalen met toenemende incubatietijd (RFU verhoudingen twee orden van grootte). Concentraties van 10 uM en dan (niet vertegenwoordigd op de grafiek) discriminatie slechte fluorescentiesignaal en overlapping van 'live' een tonend 'dode' populatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Percentage van cellen Gelabeld met Oranje nucleïnezuurprobe en de verhouding van de "live" in "Dead 'signalen. De resultaten van concentratie en incubatietijd veranderingen in populaties van M.aeruginosa. (A) Gemiddeld percentage cellen dat een was opgenomen oranje fluorescentiesignaal in VT2 met concentraties; 0,1 pM en 0,5 pM geen kleuring genoeg cellen, 5 pM kleuring levende cellen (niet-specifieke kleuring), samen met de optimale concentratie van 1 uM na 10 min (a). (B) De oranje nucleïnezuursonde 'live: dead' verhoudingen in VT2 tonen goede discriminatie en geen over het omwikkelenvan de fluorescentie signalen in concentraties van 1 uM of minder en slechte overlappende FL2 signalen (ratio lager dan een orde van grootte) met concentraties van meer dan 1 uM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Conc. | Incubatietijd (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 15.0 | 0.3 | 22.1 | 0.9 | 28.1 | 1.9 | 41.0 | 1.9 | 50.2 | 2.1 |
| 0.1 | 23.5 | 1.5 | 44.1 | 1.8 | 54.7 | 1.6 | 70.5 | 0.8 | 78.3 | 1.0 |
| 0.5 | 49.0 | 3.4 | 74.8 | 4.8 | 87.6 | 3.6 | 97.3 | 0.8 | 98,8 | 0.1 |
| 1 | 58.5 | 1.6 | 77.4 | 0.7 | 88.4 | 0.4 | 98.0 | 0.1 | 99.2 | 0.1 |
| 5 | 91.4 | 0.9 | 98.7 | 0.5 | 99.3 | 0.7 | 102.2 | 1.3 | 106,3 | 0.8 |
| 10 | 96.1 | 0.5 | 97.7 | 0.1 | 97.9 | 0.1 | 102,0 | 0.5 | 113.4 | 5.1 |
| 50 | 94.6 | 0.6 | 99.5 | 2.3 | 112,7 | 3.8 | 148,7 | 2.4 | 153,9 | 13.0 |
| 100 | 165,8 | 3.1 | 174,4 | 5.7 | 177,1 | 5.1 | 161,5 | 2.5 | 159,7 | 6.6 |
Tabel 1. Percentage Opname van Green nucleïnezuurprobe cellen. Tabel met gegevens uit de optimalisering experiment met de groene nucleïnezuurprobe en een (hittebehandeld) bevolkingssteekproef 50% 'live' en 50% 'dode'. De gemiddelde percentages van cellen die zijn opgenomengroene nucleïnezuurprobe fluorescentie (FL1) werden berekend met het totaal aantal "dode" cellen verkregen uit een FSC-H count. Waarden boven 100% laten zien niet-specifieke kleuring (SE onderstreept).
| Conc. | Incubatietijd (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 92.9 | 5.4 | 170,0 | 10.9 | 237,2 | 14.9 | 385,5 | 15.0 | 481,9 | 17.7 |
| 0.1 | 178,3 | 18.1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20.6 | 619,1 | 12.1 | 714,1 | 14.8 |
| 0.5 | 202,5 | 5.9 | 308,3 | 13.1 | 365,8 | 33.5 | 426,8 | 67.2 | 480,4 | 73.2 |
| 1 | 205,8 | 12.1 | 225,9 | 13.7 | 237,3 | 15.6 | 241,5 | 5.8 | 263,1 | 8.1 |
| 5 | 69.9 | 2.6 | 53.0 | 0.6 | 40.2 | 1.7 | 27.1 | 3.7 | 21.1 | 3.4 |
| 10 | 44.3 | 2.9 | 28.7 | 5.6 | 23.6 | 4.9 | 11.6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0.1 | 3.9 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.2 | 0.1 | 1.1 | 0.1 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.8 | 0.1 | 0.8 | 0.1 |
Tabel 2. Verhouding Green fluorescentiesignalen in 'live' en 'dode' Gekleurd M.aeruginosa cellen. Onderscheid FL1 signaal tussen cellen gekleurd met de groene nucleïnezuurprobe en aspecifieke intrinsieke opnamen. De steekproef bevatte een 50% 'live' en 50% 'dode' (met warmte behandeld) M.aeruginosavan dezelfde populatie gemeten over alle concentratie en incubatietijd (SE onderstreept).
| Conc. | Incubatietijd (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 4.0 | 0.3 | 14.9 | 0.2 | 23.5 | 0.8 | 39.1 | 2.4 | 37.6 | 1.5 |
| 0.1 | 14.6 | 0.4 | 42.2 | 0.5 | 55.0 | 1.1 | 72.8 | 0.9 | 80.2 | 0.1 |
| 0.5 | 54.5 | 0.4 | 79.8 | 1.2 | 86.4 | 0.4 | 91.2 | 0.1 | 93.2 | 0.1 |
| 1 | 92.0 | 0.8 | 94.8 | 0.1 | 96.9 | 0.6 | 98.4 | 0.6 | 98.4 | 0.3 |
| 5 | 91.4 | 1.5 | 93.5 | 1.8 | 102,9 | 5.4 | 118,9 | 0.1 | 124,8 | 0.1 |
| 10 | 95.9 | 1.0 | 102.4 | 1.8 | 132,9 | 6.0 | 148,9 | 4.8 | 132,8 | 5.1 |
| 50 | 107,5 | 3.7 130,6 | 16.6 | 145,2 | 0.2 | 135,4 | 16.2 | 114,6 | 6.6 | |
| 100 | 97.1 | 0.1 | 130,7 | 7.8 | 166,1 | 3.5 | 144,7 | 6.8 | 115,1 | 6.2 |
Tabel 3. Percentage Opname van Orange nucleïnezuurprobe cellen. Lijst met optimalisatie data via de oranje nucleïnezuurprobe en een 50% 'live' en 50% 'dode' (warmtebehandeling) bevolkingssteekproef. Het gemiddelde percentage van cellen die orange nucleïnezuurprobe fluorescentie (FL2) zijn opgenomen zijn berekend met het totaal aantal "dode" cellen van een FSC-H count (SE onderstreept).
| Conc. | Incubatietijd (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 20.4 | 0.9 | 41.3 | 1.3 | 56.1 | 2.4 | 80.4 | 3.6 | 83.3 | 1.8 |
| 0.1 | 31.2 | 1.4 | 76.1 | 2.4 | 100,9 | 3.1 | 146,2 | 0.6 | 158,3 | 0.4 |
| 0.5 | 80.6 | 0.4 | 124,9 | 2.4 | 137,3 | 1.1 | 138,7 </ td> | 2.1 | 132,8 | 3.9 |
| 1 | 89.7 | 16.0 | 80.9 | 16.9 | 69.1 | 10.7 | 43.0 | 5.7 | 35.9 | 6.5 |
| 5 | 10.4 | 0.6 | 7.5 | 0.1 | 5.0 | 1.0 | 2.7 | 0.5 | 1.5 | 0.1 |
| 10 | 7.0 | 0.1 | 3.6 | 0.3 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.1 | 1.2 | 0.1 |
| 50 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.3 | 1.3 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 0.3 | 0.0 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 0.5 | 0.2 |
Tabel 4. Verhouding Orange nucleïnezuur in 'live' en 'dode' Gekleurd M.aeruginosa cellen. Onderscheid FL2 signaal tussen de cellen gekleurd oranje nucleïnezuurprobe (FL2) en aspecifieke intrinsieke opnamen. De steekproef bevatte een 50% 'live' en 50% 'dode' (met warmte behandeld) M.aeruginosa van dezelfde bevolking gemeten over alle concentratie en incubatietijd (SE onderstreept).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het toegenomen aantal publicaties behulp van moleculaire probes aangeeft dat betrouwbare en informatieve gegevens kunnen worden verkregen 5,6,8 - 15,19,22,23. Tot nu toe is er geen perfecte vlek voor de levensvatbaarheid van de cellen die effectief kan zijn in alle soorten met dezelfde concentratie en incubatietijd 6,10. Zelfs hetzelfde type probe met gewijzigde fluorescentie-emissie blijkt het nodig de juiste concentratie en incubatietijd (tabellen 1 en 3) vast. Wanneer men met dit protocol, de optimale concentratie en incubatietijd voor orange nucleïnezuurprobe 10 min bij 1 uM, terwijl de groene nucleïnezuurprobe slechts de helft van de concentratie nodig maar duurt drie keer zo lang (Figuren 5 en 6). Beide mobiele impermeant cyanine monomeren bij concentraties boven 1,0 uM begonnen overlapping van emissie spectra met niet-membraan gewonde cellen. Deze overlap van signals levert het bewijs dat niet-specifieke kleuring optreedt, waar 'live' cellen zijn toegang tot de moleculaire probe. De resulterende dan fluorescentie van niet-specifieke kleuring gegenereerde valse positieven, onderstreept de noodzaak van een protocol ontwikkeling zorgvuldig worden vastgesteld voor elke moleculaire probe en target organisme. De meest kritische stappen in het optimaliseren van een moleculaire probe zou zijn: 1) begrijpen hoe de moleculaire sonde interageert met FCM instrument; 2) de vaststelling van geschikte levende en dode controles; 3) het ontwikkelen van kennis van gating parameters van FCM uitgangen en 4) tot wijziging van het protocol door middel van begrip van de in-situ omgevingen.
De lichtbron, optische filters, vermogen om PMT voltage en detectors verandering binnen flowcytometers verschilt van fabrikant tot fabrikant, zodat een besef van wat excitatie golflengte van de laser en waar de emissiespectra ligt ten opzichte van de fluorescentie kanalen zijn cruciaal. Met de overnames van de gegevens,drempelwaarden kunnen worden ingesteld toenemende resolutie die anders verloren zou gaan misschien achtergrondruis, vuil of dode cel aggregaten. Moleculaire probes kunnen inzicht bieden in de levensvatbaarheid van soorten zonder de teelt, door middel van enkele parameters zoals, membraanpotentiaal, DNA-gehalte en enzymactiviteit. Echter, binnen milieumonsters kunnen er vele organismen van dezelfde celgrootte en fluorescentie. Verder binnen uniagal kweken, zal celpopulaties onvermijdelijk een zekere fysiologische toestanden 3, welke moleculaire opname probe kan beïnvloeden. Een van de belangrijkste voordelen van FCM is zijn vermogen om te onderscheiden en te karakteriseren fysiologische toestanden op individueel celniveau in real time, wat essentieel bij het bestuderen micro levensvatbaarheid in-situ, zoals ze vaak worden blootgesteld aan snelle en dynamische omstandigheden. Ondanks het veelvuldige gebruik het begrip cellevensvatbaarheid nog steeds moeilijk te definiëren. Gewoonlijk toegepast om cellulaire proliferatie,levensvatbaarheid wordt zeer gescoord op een groei gebaseerde aanpak. Deze onderbouwing aanname kunnen vallen korte, als de omstandigheden niet individuele cellen te reproduceren kunnen passen, maar ze kunnen nog steeds aanvaardbaar zijn. Cellen in een prolifererende fysiologische toestand waarin een rust of een G (0) celcyclus fase 27 kan niet communiceren met een moleculaire sonde geeft valse negatieven in de DNA-cyclus of metabole gebaseerd sondes hebt ingevoerd.
Met behulp van laboratorium gekweekt of vers geïsoleerde cellen om moleculaire probes te optimaliseren zal de raffinage van gegevens die worden gebruikt in ecologische studies te helpen. Cellen die de optimalisering van batch cultures worden gewoonlijk genomen op exponentiële en vroege stationaire fase en aangenomen dat de hoogste levensvatbaarheid. Echter, moeten extra voorzichtig zijn bij het gebruik van hoge celdichtheden, die in een laat stationaire fase of microben produceren extracellulaire matrix. In dit protocol de controle voor de dode populatie van cellen werden blootgesteld aan 60 o C warmte gedurende 1 uur,met bevestiging van membraan schade en pigment afbraak gezien door microscopie (figuur 4) en FCM fluorescentie uitgangen (figuren 2 en 3). Simuleren oorzaken van natuurlijke celdood uiterst moeilijk; inname door grazers, virale lysis, geprogrammeerde celdood of de mogelijkheid van asymmetrische verdeling 24 zijn niet altijd haalbaar of onder laboratorium omstandigheden in acht worden genomen. Experimentele vormen van moraal vaak gehoord als ze niet gelijk aan spanningen opgewekt uit het milieu (bijvoorbeeld, warmte doden) en er kan een heterogene reactie, waarbij bepaalde individuen gedood en andere cellen vertonen geen waarneembare cel degradatie of overlijden 3 zijn , 25. Om zo'n paradox voorkomen dat de operationele definitie waarmee de experimenten gemeten duidelijk moeten worden vastgesteld om niet te leiden tot verwarring 6,23, verlichten normalisering tussen studies.
Verschillende alternatieve methoden have analyse toegepast om cellevensvatbaarheid in cultures in combinatie met moleculaire probes. Epifluorescentie microscopie is een traditionele techniek, hoewel fotobleken of de introductie van artefact signalen van nabijgelegen cellen onder of over een schatting van een populatie fysiologische toestand indien niet snel genoeg opgenomen kunnen leiden. Dit maakt optimalisatie door middel van beeldvorming zeer moeilijk, met potentieel lage nauwkeurigheid. Genomische evaluatie van cellulaire levensvatbaarheid gebruikt zowel DNA als RNA amplificatiewerkwijzen zoals; polymerase-kettingreactie (PCR), reverse transcriptase (RT-PCR) en nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatie (NASBA) zijn ook gebruikt. Echter, genomische evaluatie dient slechts als een indirecte methode levensvatbaarheid validering het voortduren van nucleïnezuur sterk afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, de correlatie van werkelijke cellevensvatbaarheid enorm potentieel 28 variëren. Door het gebruik van een combinatie van lichtverstrooiing en / of fluorescentie door middel van natuurlijke foto'synthetic pigmenten (figuur 1) gating van populaties: toename resolutie van gegevens identificeren zeldzame reacties bevolking en vermindering vals positieve resultaten. FCM samen moleculaire probes zich van de eerder genoemde technieken voor het testen van één celfysiologische om zijn snelheid, nauwkeurigheid en registratie van meerdere parameters.
FCM is een krachtig analytisch hulpmiddel in aquatische microbiologie en met de toevoeging van moleculaire probes heeft een breed potentieel in een aantal gebieden, waaronder enkele cel en de gemeenschap analyse industriële sectoren (bv., Monitoring drinkwatervoorziening). Toekomstige vooruitgang zag FCM nemen fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), die kan detecteren en lokaliseren van specifieke genetische sequenties in afzonderlijke cellen in dichte heterogene monsters. De ontwikkeling van FCM en moleculaire sonde draagbaarheid voor in-situ opnamen kon vitale gegevens over waterbronnen te vroeg en te implementerentrategies voor resource management. Na de optimalisatie protocol hier ontwikkeld, kan FCM en moleculaire probes potentieel spelen een cruciale rol in het leveren van waardevolle gegevens over de microbiële fysiologie in het aquatisch milieu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag promovendus Dave Hartnell en Bournemouth University erkennen voor steun en financiering voor onderzoek en faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
References
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
