Summary
Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.
Abstract
Mikrobielle Subpopulationen in Feld- und Laborstudien haben gezeigt, dass hohe Heterogenität in der morphologischen und physiologischen Parametern. Bestimmen der Echtzeitzustand einer mikrobiellen Zelle geht über lebenden oder toten Kategorien, wie Mikroben in einem Ruhezustand, wobei die Zellteilung und metabolische Aktivität vermindert existieren. Da es notwendig ist für die Detektion und Quantifizierung von Mikroorganismen, Durchflusszytometrie (FCM) mit molekularer Sonden stellt ein schnelles und genaues Verfahren, um festzustellen Gesamtpopulation Lebensfähigkeit. Durch die Verwendung von SYTOX Grüne und orange SYTOX im Modell Cyanobakterien Microcystis aeruginosa, um die Integrität der Membran zu erkennen, entwickeln wir eine übertragbare Methode für die schnelle Anzeige der einzelnen Zelle Sterblichkeit. Die molekulare Sonden in dieser Zeitschrift verwendet wird als grün oder orange Nukleinsäure-Sonden bezeichnet werden (obwohl es auch andere Produkte mit ähnlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, die eine vergleichbare Formen der actio habenn, die wir ausdrücklich auf die vorderen erwähnten Sonden). Protokolle mit molekularen Sonden variieren zwischen den Arten, die sich hauptsächlich in der Konzentration und Inkubationszeiten. Nach diesem Protokoll auf Microcystis aeruginosa setzen die grüne Nucleinsäuresonde wurde bei Konzentrationen von 0,5 & mgr; M nach 30-minütiger Inkubation und die orange Nucleinsäuresonde bei 1 uM nach 10 min optimiert. In beiden Sonden Konzentrationen von weniger als der angegebenen optimalen Rahmen Berichterstattung von Zellen mit Membranschäden führten zu einem. Umgekehrt, 5 uM Konzentrationen und höher in beiden Proben zeigte eine Art von nicht-spezifischer Färbung, wobei "live" Zellen erzeugt einen Ziel Fluoreszenz, was zu einer überproportionalen Anteil "abgetötet" Zellzahlen. Die positiven Kontrollen (durch Hitze abgetöteten) vorgesehen testbare tote Biomasse, auch wenn die Angemessenheit der Steuerungsgeneration bleibt umstritten. Durch den Nachweis einer logischen Sequenz von Schritten für die Optimierung der grün und orange Nucleinsäuresonden wir demonstrate, wie ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Cyanobakterien physiologischen Zustand effektiv zu analysieren erstellen.
Introduction
Die Zelle ist ein komplexes System, das ständig reagiert auf die Umwelt durch die Beeinflussung der physiologischen Parameter und ihre Funktion zu verändern. Die Populationsdynamik von isogenen mikrobiellen Populationen sowohl in der Natur und das Labor werden durch die Entwicklung von Unterpopulationen betroffen sind, auftreten, auch unter relativ konstanten Umgebungsbedingungen 1-3. Die Variabilität der natürlichen mikrobiellen entsteht durch die hohe Variabilität der Umweltbedingungen. Diese manchmal stochastische Prozesse anschließend produzieren Subpopulationen, die sehr unterschiedlich zu dem Bevölkerungsdurchschnitt liegen. Neuere Erkenntnisse haben ergeben, dass diese physiologischen Subpopulationen reagieren unterschiedlich auf Umweltbedingungen und können Signalverbindungen oder Inhibitoren, die dramatisch beeinflussen und beeinflussen die Gesamtbevölkerung 3,4 herzustellen.
Die Schaffung eines Verfahrens zur Heterogenität innerhalb einer Population zu definieren ist der Schlüssel zu unständnis der Ökologie von Mikroben in verschiedenen Umgebungen und ist von wesentlicher Bedeutung bei der Erstellung Kenntnisse Ärgernis Cyanobakterien, wie die giftigen Microcystis, die Auswirkungen stark auf menschliche Sicherheit der Wasserversorgung. Arten wie Anabaena morphologische Heterogenität als Reaktion auf Umweltveränderungen angezeigt, die Entwicklung von spezialisierten Zellen wie Heterocysten und Akineten 2. Im Gegensatz dazu Microcystis Zellen nicht klar, morphologische Heterogenität während einer Stressreaktion anzuzeigen. Die Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen ist der wichtigste Aspekt der physiologischen Differenzierung und ermöglicht ein besseres Verständnis der mikrobiellen Populationsdynamik. Die konzeptionelle Problem der bakteriellen Lebensfähigkeit selbst bleibt jedoch schwierig und schlecht gekennzeichnet 1,5,6.
Durchflusszytometrie (FCM) ist ein sicheres und schnelles Verfahren zur Analyse von Einzelzellen. Um das Verständnis der einzelnen Zelle physio erhöhenlogy durch FCM, molekularen Sonden sind verwendet worden, um eine Anzahl von metabolischen und biochemischen Prozessen 7 unterscheiden. Dies hat zu mehr Wissen von Arten auf zellulärer und Bevölkerungsebene geführt und im Gegenzug geholfen Wasserressourcenmanagement 8,9. Jedoch unterscheiden sich Organismen hinsichtlich der molekularen Sonde Aufnahme und Ausströmen durch die Poren und die Pumpen in Zellwänden und Membranen, die zu einer Reihe von molekularen Sonde Design und Protokollimplementierung 6,10,11 geführt. Molekularsonden für kommerzielle und Forschungszwecke verfügbar sind oft mit einer generisches Protokoll, die zu einem ganz anderen Zelltyp anwendbar sein kann, geliefert. Man muss sehr vorsichtig beim Übertragen von Protokollen für einen Zelltyp entwickelt, um weitere 6 sein kann, ist es daher eine wesentliche Aufgabe der molekularen Sonden effektiv vor der Verwendung zu optimieren.
Die grüne und orange Nukleinsäuresonden sowohl Doppel-und Einzel Nukleinsäuren mit minimalen Basis binden wählenivität und werden verwendet, um die Plasmamembranintegrität von Zellen zu beurteilen. Die grüne Nukleinsäuresonde eine deutlich verbesserte Zellmarkierung Fluoreszenzsignal im Vergleich zu anderen molekularen Sonden wie Propidiumiodid basierenden Verbindungen 12, die auch als ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen wirken kann. Der Ausdruck "die Lebensfähigkeit der Zellen" hier davon aus, dass DNA-Abbau nach dem Verlust der Plasmamembranintegrität auftritt. Die Nucleinsäuresonden sind unsymmetrische Cyaninfarbstoffe mit drei positive Ladungen und können nicht in Zellen mit intakten Membranen unter gekennzeichnet Konzentrationen sowohl eukaryotische als auch prokaryotische 14,15 11,13 Organismen. Der Bindung einer Nukleinsäure-Sonde an Nukleinsäuren in der bis zu einer> 500 fachen Zunahme der Fluoreszenz-Emissionen von endogenen Signalen in Zellen, die ihre Membranintegrität beeinträchtigt haben ergeben. Obwohl molekulare Sonden wie das grün Nucleinsäuresonde kann ein guter Indikator für die einzelne Zellphysiologie zu sein, gibt es einen Bedarf to optimieren jede Sonde mit der beabsichtigten Zielorganismus, wie Inkubationszeiten wurden von 7 min variiert - 30 Minuten und die Konzentration im Bereich von 0,1 & mgr; M - 0,5 & mgr; M in Microcystis Experimente allein 15-19.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die zytometrische Assays von Grün und die relativ neu orange Nukleinsäuresonden (die bisher nicht von den Cyanobakterien Spezies Microcystis aeruginosa getestet) zu optimieren. Folgendes entwickelten Methodik kann dann auf andere Spezies übertragen und als eine Plattform für die Optimierung der Protokolle in anderen molekularen Sonden, wodurch das Verständnis der Mikroben und deren ökologische Verhalten Erhöhung verwendet werden.
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Protocol
1. Vorbereitung der Molecular Probe und Durchflusszytometer
- Verdünnte Lösungen der Nukleinsäure-Sonden, die als eine 5 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) geliefert werden Aliquots der erforderlichen Konzentrationen in ultrareinem H 2 O. gefilterten
- Bewahren Sie die Nukleinsäuresonden in dunkler Umgebung zwischen -5 ° C und - 25 ° C bis zur Verwendung.
- Schalten Sie das Durchflusszytometer und Last-Software-Paket (siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für die FCM-Spezifikationen).
- Stellen Sie eine leere Hämolyse Rohr (12 x 75 mm) an der Probeninjektionssonde (SIP), klicken Sie auf Sprünge zu helfen und dann wieder bündig mit der FCM Reinigungsprozess zu starten.
ANMERKUNG: Manche Probe Stufen für die SIP können verschiedene Arten von Rohren einschließlich Mikrozentrifugenröhrchen unterzubringen. Die in der FCM Vorrichtung verwendet molekulare Sonde Verdünnungsmittel und Mantelflüssigkeit ist von einer Qualität zur Analyse der "Typ 1" 0,22 um Membran filtriert Quelle. - Ortein frischer Hämolyse Rohr mit 2 ml Reinstwasser gefiltert H 2 O auf dem SIP, eine Frist für 10-15 min und einem fluidischen Geschwindigkeit zu schnell (oder einer Flussrate von> 66 & mgr; l / min).
- Wählen Sie eine neue Datenzelle, zu relevanten Schwellenwerte für Fluoreszenz und Lichtstreuung Kanäle, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren, und klicken Sie auf "Ausführen" setzen.
- Wenn die Gesamt Ereignisse pro Sekunde sind nicht unter Empfehlung der Hersteller, dann eine 2 ml Probe des Dekontaminationslösung für 2 Minuten auf schnelle und wiederholen Sie die Schritte 1.4 und 1.5.
HINWEIS: Überprüfen Sie bitte die Herstellerempfehlungen für die FCM-Start-up-Reinigungsprotokolle, wie sie zwischen den Modellen variieren. Tests für bestimmte Grenzwerte muss auch im Einklang mit der FCM-Modell sein, da einige Geräte ermöglicht es dem Benutzer, Spannungen gewinnt den Photomultipliern (PMTs) die Verstärkung oder Verringerung des elektrischen Signals von den optischen Detektoren verbucht worden sind. Die in dieser Erfah verwendet FCM Modellment hat Spannung PMTs fixiert und verwendet einen Schwellenwert von 80.000 Vorwärtslichtstreuung (FSC-H), um Teilchen, die kleiner als 2,0 um und elektronisches Rauschen aus.
2. Herstellung von Kulturen und erste Zellzahlen
- Autoklav 98 ml Reinstwasser filtriert H 2 O und 2 ml Algenmedium (x50-Konzentration) in einem 250 ml Becherglas während 20 Minuten bei 120 o C.
- Von einer anfänglichen Monokultur von Microcystis aeruginosa (PCC 7806) in einer hohen stabilen Zustand Dichte Platz 2 ml der Probe in ein Rohr unter dem SIP. Disaggregieren keine Koloniebildung durch Vortexen oder Ultraschallbehandlung 20 und bestätigen gleichmäßig verteilt Zellen durch Lichtmikroskopie.
HINWEIS: Übermäßige Exposition gegenüber Ultraschallwellen, um Zelllyse führen und sollte mit Vorsicht angewendet werden. Da Ultraschallbehandlung können Gasbläschen kollabieren Ausgänge wie Seitenlichtstreuung (wie in Arten wie Microcystis aeruginosa gefunden) (SSC-H) Intensität mehr an sich gewordennsitive. - Innerhalb der FCM-Software, wählen Sie ein Histogramm, um Daten von Vorwärtslichtstreuung (FSC-H) aufzeichnen und die Handlung Spezifikationen konfigurieren, indem Sie "log", um in einer logarithmischen Skala auf der Achse anzuzeigen.
- In einem separaten Ausgang, wählen Sie ein anderes Histogramm (Log-Achse), um natürliche Fluoreszenz aufzunehmen, wie die Zubehörphotosynthetischen Pigment Phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), in Microcystis aeruginosa gefunden.
- Verwenden einer Lichtquelle, Phycocyanin und einen Detektor, der die Emissionen aus dem erhaltenen Fluoreszenzfilter kann anregen kann.
HINWEIS: Photosynthesepigment wie Chlorophyll angeregt mit dem häufig verwendeten 488 nm blauen Laser sein, während Phycocyanin ist mehr als 600 nm angeregt und wird nur mit einer roten Lichtquelle 21 festgestellt werden. Überprüfung mit dem Durchflusszytometer Hersteller für Anregungslichtquellen und den Spektren der Emissionsdetektoren, hier sowohl einer 488 nm und 640 nm-Laser verwendet wurden zusammen mitein 675 ± 12,5 nm optischer Filter. - Für die Aufnahme der Einstellungen in der Nähe des Kerngröße des Zielorganismus (10 & mgr; m) und einer relativ geringen Durchflussrate (14 & mgr; l / min) höchste Auflösung wählen.
HINWEIS: Für die beste Auflösung Proben sollten nach fertigt Empfehlung von Ereignissen pro Sekunde ausgeführt werden. - Vor der Datenerfassung mit einem Schwellenwert zu Tor aus Lichtstreuung und / oder Fluoreszenz-Signale, die durch die elektronische Hintergrundrauschen oder Zellprobe Schmutz verursacht werden.
- Wählen Sie eine neue Datenzelle, erstellen eine Dichte Grundstück mit FSC-H und SSC-H-Parameter auf einer logarithmischen Skala und auf Ausführen.
- Wenn Probendichte führt zu einer übermäßigen Ereignisrate, kann Verdünnungsschritte unternommen, um Genauigkeit und Präzision zu erhöhen.
- Von der Dichte Grundstück gelten Software-Toren aus dem vorherigen Histogramm auf den niedrigen Pegel Streusignale, die von Hintergrundrauschen oder Schmutz (FSC <320.000) hergestellt auszuschließen. Umgekehrt Gate die höhere relative FluoreszenzPhycocyanin Signale von Zellen und enthalten nur diese Ereignisse (FL4, 56.000 - 1.950.000).
- Verwenden Sie die Zahl der Zellen in den gated Bereichen erfasst und teilen sie durch das Gesamtvolumen der Probe, die durch die FCM durchlaufen hat, um herauszufinden, wie viele Zellen pro ml.
HINWEIS: Der FCM Modell verwendet hat hier eine Mikroprozessor gesteuerte Schlauchpumpe System, das Probenvolumen zu bestimmen. Andere FCM Geräte erfordern einen kalibrierten Partikelsuspension oder eine Berechnung von H 2 O Gewicht / Volumen Unterschiede zum gesamten Probenvolumen zu überprüfen. - Hinzufügen der erforderlichen Menge von Zellen, die frisch hergestellt Medien, um eine Batch-Wachstumszyklus (250.000 Zellen / ml) von Microcystis aeruginosa starten.
HINWEIS: Arten werden in den Wachstumsraten je nach ihrem In-situ-Umgebungsparameter und die Verfügbarkeit von Nährstoffen, so dass ein Batch-Zyklus sollte vorher aufgezeichnet, um Lebenszyklusphasen zu bestimmen abweichen.
3. Optimsierung von Molecular Probe Zellaufnahme
- Ernte Hälfte des Microcystis aeruginosa Kultur in Schritt 2 aus einer exponentiellen Phase vorbereitet und verwenden als "live" Kontrolle.
HINWEIS: Die Proben aus einer hohen Dichte Kultur direkt zu einer exponentiellen Phase verdünnt kann Optimierungsergebnisse durch tote Zelle Umsatz auswirken, im Vergleich zu der Kulturen von einem Anfangsverzögerung / Induktionsphase beimpft. - Bereiten Sie die andere Hälfte als "tot" Steuerung durch Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise 70% Ethanol, Erhitzen von Proben bei 60 ° C für 1 Stunde, Paraformaldehyd oder 4% Formaldehyd für 30 Minuten 6,11,22. Überprüfen Variationen in der Proben-Mikroumgebung (z. B. pH).
HINWEIS: Die positive, durch Hitze abgetöteten, "tot" Kontrolle in Microcystis aeruginosa unterscheidet sich von einer "Live" Probe durch seine Abnahme Phycocyanin Signale. Induziert Mortalität durch andere Verfahren nicht dazu führen, die gleiche Leistung und wird vary in Arten. - Up Mischproben mit unterschiedlichen Verhältnissen von Set "Live" und "tot" Proben (zB 0%, 25%, 50%, 100%).
- Disaggregieren Koloniebildung durch Vortexen oder Ultraschallbehandlung und pH-Wert prüfen.
- Wählen Sie einen 488-nm-Laser zusammen mit Detektoren, die Fluoreszenz von der grünen aufzeichnen kann (FL1, 530 ± 15 nm) und orange (FL2, 585 ± 20 nm) Nukleinsäuresonden und die 640-nm-Laser, um Phycocyanin Signale durch ihre jeweiligen Detektor aufzeichnen.
HINWEIS: Wenn an DNA gebunden ist, hat der grüne Nucleinsäuresonde eine ungefähre Fluoreszenzanregungswellenlänge von 504 nm und Emissionsmaxima von 523 nm, während die orange Nukleinsäuresonde weist eine Anregungswellenlänge von 547 nm und Emissionsmaxima von 570 nm. A 488 nm Argonionen-Festkörperlaser eingesetzt werden, um beide Molekülsonden erregt werden jedoch ein grüner Laser (bis 547 nm) eine höhere Orangefluoreszenz zu produzieren. - Als Ausgangspunkt, stellen diemolekulare Sonde mit den Herstellern empfohlenen Konzentration auf die 50% "live" und 50% "tot" Kultur und Inkubation im Dunkeln.
- Wählen Sie eine neue Datenzelle, legen Sie die Probe unter dem SIP mit Schwellen und Trigger, die Hintergrundgeräusche (FSC-H 80.000) reduzieren wird.
- Erstellen Sie eine Dichte Grundstück mit FSC-H und SSC-H-Parameter, und drei Histogramme. Ein Histogramm unter Verwendung der jeweiligen molekularen Sonde optischen Detektorkanal (FL1 oder 2), eine zur Erkennung Phycocyanin Emissionen (FL4-H) und das andere FSC-H, die alle auf einer logarithmischen Skala.
- Die Proben der Microcystis aeruginosa mit Nukleinsäuresonden im Dunkeln inkubieren für bis zu 60 min, Aufzeichnung in getrennten Datenzellen bei einer Anzahl von Zeitpunkten (1, 5, 10, 15, 30 und 60 min).
HINWEIS: Bei der Einstellung von Parametern wie pH-Check mit fertigt für mögliche Reaktionen von bestimmten Chemikalien (für die getesteten Nukleinsäure-Sonden ein Puffer kann nicht Phosphate oder hohen ein- oder diva enthaltenlieh Kationen, da die Bindung an DNA wird reduziert). - Tragen Sie eine Software-Tor, nur sind die FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000) für die Zielorganismen Zellgröße, in die jeweilige Fluoreszenzsonde Kanal-Histogramm.
ANMERKUNG: Die in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen waren 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 um, was entweder durch Erhöhen oder Verringern des Volumens Microcystis aeruginosa Probe oder anfängliche Stammlösung von Nukleinsäure-Sonden geändert werden können. - In der Fluoreszenzsonde Kanal, gelten andere inclusive Software-Tor auf den höchsten Gipfel im Histogramm (grüne FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30.000 - 165.000) und in der Folge, dass positive Gate-Sonde Fluoreszenz in den Density-Plot.
- Lauf Schritte 3,1-3,11 bei 100% "live" 100% "tot" und alle Mischkulturproben, Einstellung des Molekularsondenkonzentrationen (zB x 0,1 x 10) und / oder der Temperatur und pH-Werte, falls notwendig. <li> Vergleichen Sie die Anzahl der positiven molekularen Sonde Fluoreszenzsignale in die ursprüngliche Zelldichte von "toten" Zellen (von einem halben Gesamt FSC-H oder einer 100% "tot" Kultur genommen), um den Gesamtanteil der Zellen mit der Nukleinsäure befleckt finden Sonden.
- Tun Sie dies für jeden Zeitraum innerhalb jeder Konzentration, um die optimale Protokoll für den höchsten Prozentsatz der Zell Nukleinsonde Aufnahme, ohne nicht-spezifische Färbung (verwenden Sie die Mittel in einem One-Way ANOVA oder Kruskal-Wallis-Test zu finden, wenn die Daten nicht-para).
4. Molecular Probe Fluoreszenz Diskriminierung
- Für die Prüfung von Fluoreszenzinterferenz / Überlappung von intrinsischen oder nicht-spezifische Zellfärbung wählen Sie die 50% "live" und 50% "tot" Mischkultur Daten und nehmen Sie alle Tore.
- Tragen Sie eine Software-Tor, nur sind die FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000) für die Zielorganismen Zellgröße, in die PhycocyaninKanal-Histogramm.
- Tor der höchste Gipfel Phycocyanin und Label als "live", mit dem Zusatz von der untersten Spitze als "tot" bezeichnet.
- Führen Sie eine weitere Gate-Schritt in die jeweilige molekulare Sonde Fluoreszenzhistogramm-Kanal, mit ein zu einer Zeit, die "live" und dann "tot" Phycocyanin (FL4) Signale, die Aufnahme sowohl mittlere Wellenlängen.
HINWEIS: Der Modus zur Induktion der Mortalität in diesem Experiment wurde durch Wärmebehandlung, die sich aus diesem Protokoll Phycocyanin Signale deutlich verringert wurde. Andere Verfahren zur Herstellung von Populationen von "toten" Zellen können verschiedene Ausgänge in den erworbenen Läufe ergeben. - Verhältnis die mittleren Wellenlängen der positiven molekularen Sonde Fluoreszenz ("tot") und die Eigen / nicht-spezifische Signal ("Live"), um Protokoll Empfindlichkeit zu bestimmen.
HINWEIS: Um die Fluoreszenz Diskriminierung "live" und "tot" popul verbesserntionen, erhöhen Sie die Kohlenstoffquelle zur aktiven Fleck-Aufnahme in Nährstoff erschöpft Zellen oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellwanddurchlässigkeit und resultierenden Fluoreszenzsignale 6 zu verbessern. Begrenzte Entschädigung in einigen FCM Modelle für spektrale Überlappung kann durch benutzer manipuliert paarweisen Korrektur während der Probennahme (PMT Spannungsänderungen) oder von post-analytische Spezialsoftware durchgeführt werden. - Wählen Sie das optimiertes Protokoll, wo die höchste Menge an "toten" Zellen hat, ohne dass es eine unspezifische Färbung gefärbt worden. Wenn eine Anzahl von Tests haben ähnliche Ergebnisse zu akzeptieren das Protokoll mit der niedrigsten Konzentration und Inkubationszeit, zusammen mit guten Fluoreszenzsignal Diskriminierung. Folgen produziert Anweisungen für die Zytometer Herunterfahren.
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Representative Results
Vorwärtslichtstreuung (FSC) und Seitenlichtstreuung (SSC) Ausgänge von einer Microcystis aeruginosa Batch-Kultur in exponentiellen Phase liefert Informationen über Zellgröße (Durchmesser) und interne Granularität bzw. (Abbildung 1A). FSC können Zellen, die zu groß und / oder klein sein Microcystis aeruginosa sind, diskriminieren. Diese Diskriminierung oder Gating durch Raffination von Daten zwischen bestimmten Punkten eines FSC-Ausgang (1C) durchgeführt werden. Phycocyanin, ein Haupt Verfassung Microcystis aeruginosa Photosyntheseapparat erzeugt ein starkes Signal, wenn durch eine rote Lichtquelle abgefragt (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), was zu einer weiteren Gate-Populationen verwendet werden kann, ähnlich wie in FSC getan Gating aber mit Fluoreszenz (Figur 1D). Aus FSC und Fluoreszenzsignale können Daten von dem ursprünglichen Ausgangs (1A), um bestimmte Daten auf Microcystis aeruginosa für f gatedinal Zellzählungen (1B).
Autofluoreszenz pro Zelle in Cyanobakterien Populationen unterscheidet in Abhängigkeit von physiologischen Zustand. Hier wurden die Zellen von einer exponentiellen Phase-Kultur, die relativ hohe weit rote Fluoreszenz für eine "Live" Kontrollpopulation und der "tote" Kontrolle wurde 1 Stunde auf 60 ° C Hitze ausgesetzt geerntet. Wenn 'live' höher pigmentiert und "tot" untere pigmentierte Kontrollen gemischt die abnehmende Verschiebung in der Autofluoreszenz ist klar (2A & B). Der "tote" Zellfluoreszenz und FSC-Parameter können verwendet werden, um die gesamten Zellen, aus denen die molekulare Sonde genommen haben zu unterscheiden. In Membran beeinträchtigt oder "toten" Zellen, die Nukleinsäuresonden wird ein zusätzliches Signal entweder zu erzeugen; FL1-Kanal (530 ± 15 nm) für die grüne Nukleinsäuresonde oder FL2-Kanal (585 ± 20 nm) für die Orangen Nukleinsäuren acid Sonde (3A & B), im Vergleich zur nativen "live" Fluoreszenzsignal. Bestätigung beider Nukleinsäuresonden in Zellen, die mit Schäden Membranen können durch Epifluoreszenzmikroskopie gesehen werden (4A & D).
Der Gesamtanteil der Zellen, die durch das grüne Nucleinsäuresonde gebeizt worden war, wurde aus gemischten Proben wurden, und die erhaltenen vorge gated einschließen nur Microcystis aeruginosa bemessen Zellen aus einem FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000). In einem 50:50 "live: dead 'Probe, grüne Fluoreszenz-Zellen von der höchsten Spitze in einem FL1 (530 ± 15 nm) Histogramm gated wurde auf Originaldichte in der" toten "Zellpopulation (im Vergleich entweder durch Halbierung der Gesamt FSC- H oder das Ausführen eines getrennten Zellzahl nur auf den 100% "tot" Zellproben). Über 100% anzeigen, dass nicht-spezifische Färbung auftritt. Der mittlere Prozentsatz der Zellen, aus denen die grüne nucle genommen hatteic-Sonde reichten von; 15 ± 0,3% bei 0,05 & mgr; M nach 1 min auf 177,1 ± 5,1% bei 100 & mgr; M während 10 min Inkubation (Tabelle 1). Konzentrationen über 1 uM (nicht einschließlich) zeigte unspezifische Färbung (dh., "Live" Zellen, die für die Aufnahme der molekularen Sonde gestartet). Ein Zwei-Wege ANOVA zwischen den Konzentrationen, die nicht aufwiesen unspezifische Färbung (0,05-1 uM) und zeigte insgesamt ein deutlicher Unterschied in der Wechselwirkung zwischen der Konzentration der grünen Nucleinsäuresonde und Inkubationszeit in Microcystis aeruginosa, F (12 , 40) = 6.48, p <0,001. Es gibt ein Haupteffekt für die Konzentrationen von grünen Nukleinsäuresonde verwendet, F (3, 40) = 836,92, p <0,001 und Inkubationszeiten F (4,40) = 347,98, p <0,001. Eine Post-hoc Tukey Test zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Konzentrationen, außer 0,5 und 1 & mgr; M (p <0,001) und einesignifikanter Unterschied zwischen allen Inkubationszeiten von 1 bis 60 min (p <0,001). Allerdings ist eine Post-Hoc-Tukey-Test von einem One Way ANOVA zeigte die mittlere Aufnahme von grünen Nukleinsäuresonde nicht zwischen 30 und 60 min unterscheiden sich für 0,05 um (p> 0,05) und 1 & mgr; M (p> 0,05) (5A). Das mittlere Verhältnis von "Live" und "tote" relative Fluoreszenzsignale FL1 zur Unterscheidung von Populationen (über FL4 gemessen) lag im grünen Nucleinsäuresonde vom höchsten in 0,1 uM nach 60 min von 714 ± 14,8 (RFU), um das niedrigste von 0,8 ± 0,0 (RFU) in 100 & mgr; M nach 30 min (Tabelle 2). Vergleicht man die Verhältnisse der relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) für die Intensität der Diskriminierung in "live" und "tot" FL1 Signale a Two Way ANOVA meldet einen Gesamt signifikanten Unterschied in der Interaktion zwischen den Konzentrationen und Inkubationszeiten F p <0,001 mit dem grünen Nukleinsäuresonde. Es gab auch einen signifikanten Unterschied in der Hauptwirkung in allen Konzentrationen F (7,80) = 475,41, p <0,001 und Inkubationszeiten F (4,80) = 78,28, p <0,001. Die Diskriminierung Verhältnisse von Fluoreszenzsignalen zwischen dem 'live' und Wärme "toten" Zellen getötet mit der Zeit zwischen den Konzentrationen von 0,05 um und 1 & mgr; M erhöht, sondern verringert zwischen 5 um und 100 um (5B).
Der Prozentsatz von Zellen, die mit dem orangen Nucleinsäuresonde färbt wurden gesehen einen mittleren niedrigen Prozentsatz von 4 ± 0,3%, in einer Konzentration von 0,05 & mgr; M nach 1 min, steigend auf 166 ± 3,5% bei 100 & mgr; M nach 10 min Inkubation (Tabelle 3). Wieder Konzentrationen über 1 & mgr; M dargestellt auch nicht-spezifische Färbung von lebenden Zellen. A Two-Way ANOVA zween die Konzentrationen, die keine unspezifische Färbung zeigten (0,05-1 uM) berichteten insgesamt ein deutlicher Unterschied in der Wechselwirkung zwischen allen Konzentrationen des orangen Nucleinsäuresonde und Inkubationszeiten in Microcystis aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Es gab einen statistisch signifikanten Haupteffekt in Konzentrationen F (3, 40) = 6919,67; p <0,001 und Inkubationszeiten F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Doch ein Post-Hoc-Tukey-Test durch einen One Way ANOVA auf nur 1 & mgr; M zeigten, dass Inkubationszeiten zwischen 10, 30 und 60 min hatte keinen statistischen Unterschied in der Aufnahme von Orangennukleinsäuresonde (alle p> 0,05) (6A). Fluoreszenzsignal Unterscheidung zwischen "Live" und "tot" gefärbten Populationen in FL2 reichten in orange Nukleinsäure-Sonde von der niedrigsten von 0,3 ± 0,0 (RFU) nach 60 min in 50 & mgr; M und 30 min 100 & mgr; M auf den höchsten von 158,3 ± 0,4 (RFU) nach 60 Minuten bei einer Konzentration von 0,1 & mgr; M (Tabelle 4). A Two Way ANOVA berichteten über eine statistische Gesamt Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen Konzentration und Inkubationszeit F (28, 80) = 28.12, p <0,001. Die Hauptwirkungen der Konzentration F (7, 80) = 607,9, p <0,001 und Inkubationszeiten F (4, 80) = 31,24, p <0.001 ergab, dass auch alle signifikant unterschiedlich. Fluoreszenz Diskriminierung zwischen den Signalen von "live" und Hitze getötet "toten" Zellen in FL2 nahm mit der Zeit zwischen den Konzentrationen von 0,05 uM und 0,5 uM verringerte sich jedoch zwischen 1 um und 100 um (6B). Deshalb ist die optimale Konzentration für die grüne Nucleinsäuresonde 0,5 um mit einer Inkubationszeit von 30 min und für die Orangen Nucleinsäuresonde die optimale Konzentration beträgt 1 um incufür 10 min inkubiert.
Abbildung 1. FCM Ausgänge von Microcystis aeruginosa Durch FSC, SSC & Far rote Fluoreszenz (675 ± 12,5 nm). (A) FSC und SSC von Microcystis aeruginosa PCC 7806. (B) die gleiche Ausgabe wie 1A mit gated FSC und weit rote Fluoreszenz (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC repräsentieren die Größen der Zelle. Der rote Pfeil zeigt ausgekleidet den Bereich, der gated an Hintergrundrauschen oder andere Größe Partikel zu reduzieren. (D) Hoch Phycocyanin aus Microcystis aeruginosa in einer exponentiellen Phase Batch-Kultur mit rotem erzeugten Signale Pfeil gated Bereichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Phycocyanin Signalverschiebung in Microcystis aeruginosa Als wärmebehandelt. Änderung Microcystis aeruginosa Autofluoreszenz in "live" und "toten" Zellen verwendet werden, um Nukleinsäure-Sonde Aufnahme zu überprüfen. (A) Far rote Signale Schalten von einem höheren pigmentierte 'live' Bevölkerung (grün) auf einen niedrigeren pigmentierte "tot" Bevölkerung (rot). (B) und FSC weit rote Fluoreszenz kombinierten Ausgänge mit einer Verschiebung von fast zwei Größenordnungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. orange Fluoreszenzverschiebung in Microcystis aeruginosa von "Live" Unstained, um "tote" gefärbten Zellen. Microcystis aeruginosa "live" und "tot" gemischt Kontrollen mit orange Nukleinsäuresonde in einer Konzentration von 1,0 & mgr; m für 30 min inkubiert. (A) FL2 (585 ± 20 nm) Kanal meldet eine erhöhte Verschiebung von einer 'live' ungefärbt Bevölkerung (grün) zu einem "toten" befleckt Bevölkerung (orange) durch zwei Größenordnungen. (B) eine "tote" befleckt Bevölkerung (orange), die weit rote Signale abgenommen hat, sondern erhöht FL2 Signale von einem "live" Bevölkerung (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Epifluoreszenzmikroskopie von Microcystis aeruginosa mit Molecular Probes. MicROSCOPE Bildern von einer Microcystis aeruginosa 50:50 Live: dead Bevölkerung mit Nukleinsäure-Sonden inkubiert, alle Bilder x 1000 Vergrößerung. (A) einem Epifluoreszenz-Bild der grünen Nukleinsäuresonde durch "toten" Zellen aufgenommen. "Live" Zellen erscheinen aufgrund der Autofluoreszenz des Chlorophylls rot. (B) Lichtmikroskopische Ansicht der 4A, die 'live' grün pigmentierten Zellen und weniger pigmentiert "toten" Zellen mit Membranschäden. (C) leben: dead 50:50 gemischten Microcystis aeruginosa Bevölkerung. (D) Orange Nukleinsäuresonde Inkubation von 4C, mit "toten" Zellen enthüllt eine orange Farbe durch Epifluoreszenzmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5 Anteil der Zellen mit Grün Nucleinsäuresonde Beschriftete und das Verhältnis von "Live" zu "Dead 'FL1 Signale. Die mittlere Prozentsatz von Microcystis aeruginosa-Zellen mit dem Grün Nukleinsäuresonde in unterschiedlicher Konzentration und Inkubationszeiten gefärbt. (A) 0,1 uM nicht beflecken genügend Zellen, 5 uM zeigen unspezifische Färbung und Konzentrationen von 0,5 um und 1 uM befleckt fast 100% der Bevölkerung, nach 30 Minuten, die optimale Inkubationszeiten (a). (B), Live: dead 'Verhältnisse von FL1 Signale von einer exponentiellen Wachstumsphase und wärmebehandelten Proben. Konzentrationen von 0,5 & mgr; M und 1 & mgr; M zeigen gute Diskriminierung von FL1 Signale mit zunehmender Inkubationszeit (RFU Verhältnisse zwei Größenordnungen). Konzentrationen von 10 & mgr; M und über (nicht auf Graphen dargestellt) zeigen schlechte Fluoreszenzsignal Diskriminierung und Überlagerung von "live" eind "tot" Populationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Anteil der Zellen mit orange Nucleinsäuresonde Labelled und das Verhältnis von "Live" um "toten" Signale. Die Ergebnisse von Konzentration und Inkubationszeit Veränderungen der Populationen von Microcystis aeruginosa. (A) Mittlerer Prozentsatz an Zellen, die ein aufgenommen hatten orangen Fluoreszenzsignal in FL2 mit Konzentrationen; 0,1 uM und 0,5 uM nach 10 min keine Verfärbung genügend Zellen, 5 & mgr; M Färbung lebender Zellen (nicht-spezifische Färbung), zusammen mit der optimalen Konzentration von 1 uM (a). (B) Die orange Nukleinsäuresonde "live: dead 'Verhältnisse in FL2 zeigen gute Diskriminierung und keine überlappendenvon Fluoreszenzsignalen in Konzentrationen von 1 um oder weniger und schlechter Überlappungs FL2 Signale (Verhältnisse niedriger als eine Größenordnung) mit Konzentrationen über 1 uM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Konz. | Inkubationszeit (min) | |||||||||
| (um) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 15,0 | 0,3 | 22.1 | 0.9 | 28,1 | 1.9 | 41,0 | 1.9 | 50,2 | 2.1 |
| 0.1 | 23,5 | 15 | 44,1 | 1.8 | 54,7 | 1.6 | 70,5 | 0.8 | 78,3 | 1.0 |
| 0,5 | 49,0 | 3.4 | 74,8 | 4.8 | 87,6 | 3.6 | 97,3 | 0.8 | 98,8 | 0.1 |
| 1 | 58,5 | 1.6 | 77,4 | 0.7 | 88,4 | 0,4 | 98,0 | 0.1 | 99,2 | 0.1 |
| 5 | 91,4 | 0.9 | 98,7 | 0,5 | 99,3 | 0.7 | 102,2 | 1.3 | 106,3 | 0.8 |
| 10 | 96,1 | 0,5 | 97,7 | 0.1 | 97,9 | 0.1 | 102,0 | 0,5 | 113,4 | 5.1 |
| 50 | 94,6 | 0.6 | 99,5 | 2.3 | 112,7 | 3.8 | 148,7 | 2.4 | 153,9 | 13,0 |
| 100 | 165,8 | 3.1 | 174,4 | 5.7 | 177,1 | 5.1 | 161,5 | 2.5 | 159,7 | 6.6 |
Tabelle 1. Anteil Aufnahme von Grün Nukleinsäure-Sonde in Zellen. Tabelle, die Daten aus der Optimierung Experiment unter Verwendung des grünen Nukleinsäuresonde und eine "live" und 50% "tot" (wärmebehandelt) Bevölkerungsstichprobe 50%. Die mittleren Prozentsätze der Zellen, die aufgezeichnetengrüne Nukleinsäuresonde Fluoreszenz (FL1) haben gegen die Gesamtzahl der "toten" Zellen aus einem FSC-H Zahl erhalten berechnet. Werte über 100% zeigen unspezifische Färbung (SE unterstrichen).
| Konz. | Inkubationszeit (min) | |||||||||
| (um) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 92,9 | 5.4 | 170,0 | 10.9 | 237,2 | 14,9 | 385,5 | 15,0 | 481,9 | 17,7 |
| 0.1 | 178,3 | 18.1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20,6 | 619,1 | 12.1 | 714,1 | 14,8 |
| 0,5 | 202,5 | 5.9 | 308,3 | 13.1 | 365,8 | 33,5 | 426,8 | 67,2 | 480,4 | 73,2 |
| 1 | 205,8 | 12.1 | 225,9 | 13,7 | 237,3 | 15,6 | 241,5 | 5.8 | 263,1 | 8.1 |
| 5 | 69,9 | 2.6 | 53,0 | 0.6 | 40,2 | 1.7 | 27,1 | 3.7 | 21.1 | 3.4 |
| 10 | 44,3 | 2.9 | 28,7 | 5.6 | 23,6 | 4.9 | 11,6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0.1 | 3.9 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.2 | 0.1 | 1.1 | 0.1 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.8 | 0.1 | 0.8 | 0.1 |
Tabelle 2. Verhältnis von grüner Fluoreszenz-Signale in "Live" und "Dead 'Stained Microcystis aeruginosa Zellen. FL1 Signalunterscheidung zwischen den Zellen mit dem Grün Nukleinsäuresonde und nicht-spezifische Eigenaufnahmen gefärbt. Die Probe enthielt 50% "live" und 50% "tot" (wärmebehandelt) Microcystis aeruginosader gleichen Bevölkerung über alle Konzentration und Inkubationszeiten gemessen (SE unterstrichen).
| Konz. | Inkubationszeit (min) | |||||||||
| (um) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 4.0 | 0,3 | 14,9 | 0,2 | 23,5 | 0.8 | 39,1 | 2.4 | 37,6 | 15 |
| 0.1 | 14,6 | 0,4 | 42,2 | 0,5 | 55,0 | 1.1 | 72,8 | 0.9 | 80,2 | 0.1 |
| 0,5 | 54,5 | 0,4 | 79,8 | 1.2 | 86,4 | 0,4 | 91,2 | 0.1 | 93,2 | 0.1 |
| 1 | 92,0 | 0.8 | 94,8 | 0.1 | 96,9 | 0.6 | 98,4 | 0.6 | 98,4 | 0,3 |
| 5 | 91,4 | 15 | 93,5 | 1.8 | 102,9 | 5.4 | 118,9 | 0.1 | 124,8 | 0.1 |
| 10 | 95,9 | 1.0 | 102,4 | 1.8 | 132,9 | 6.0 | 148,9 | 4.8 | 132,8 | 5.1 |
| 50 | 107,5 | 3.7 130,6 | 16,6 | 145,2 | 0,2 | 135,4 | 16.2 | 114,6 | 6.6 | |
| 100 | 97,1 | 0.1 | 130,7 | 7.8 | 166,1 | 3.5 | 144,7 | 6.8 | 115,1 | 6.2 |
Tabelle 3. Prozentuale Uptake of Orange Nukleinsäure-Sonde in Zellen. Tabelle mit Optimierungsdaten unter Verwendung der Orange Nukleinsäuresonde und eine 50% ige "live" und 50% "tot" (wärmebehandelt) Bevölkerungsstichprobe. Der mittlere Prozentsatz der Zellen, die Orangennukleinsäuresondenfluoreszenz (FL2) aufgenommen haben, haben gegen die Gesamtzahl der "toten" Zellen aus einem FSC-H Zahl berechnet worden (SE unterstrichen).
| Konz. | Inkubationszeit (min) | |||||||||
| (um) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 20,4 | 0.9 | 41,3 | 1.3 | 56,1 | 2.4 | 80,4 | 3.6 | 83,3 | 1.8 |
| 0.1 | 31,2 | 1.4 | 76,1 | 2.4 | 100,9 | 3.1 | 146,2 | 0.6 | 158,3 | 0,4 |
| 0,5 | 80,6 | 0,4 | 124,9 | 2.4 | 137,3 | 1.1 | 138,7 </ td> | 2.1 | 132,8 | 3.9 |
| 1 | 89,7 | 16.0 | 80,9 | 16,9 | 69,1 | 10,7 | 43,0 | 5.7 | 35,9 | 6.5 |
| 5 | 10.4 | 0.6 | 7.5 | 0.1 | 5.0 | 1.0 | 2.7 | 0,5 | 15 | 0.1 |
| 10 | 7.0 | 0.1 | 3.6 | 0,3 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0.1 | 1.2 | 0.1 |
| 50 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0,3 | 1.3 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 0,3 | 0.0 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 0,3 | 0.0 | 0,5 | 0,2 |
Tabelle 4. Verhältnis von Oranien Nukleinsäure in "Live" und "Dead 'Stained Microcystis aeruginosa Zellen. FL2 Signalunterscheidung zwischen den Zellen aus der Orangennukleinsäuresonde (FL2) und nicht-spezifische Eigenaufnahmen gefärbt. Die Probe mit 50% "live" und 50% "tot" (wärmebehandelt) Microcystis aeruginosa der gleichen Bevölkerung über alle Konzentration und Inkubationszeiten gemessen enthalten (SE unterstrichen).
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Discussion
Die erhöhte Anzahl von Publikationen mit molekularen Sonden zeigt an, dass verlässliche und aussagekräftige Daten erhalten 5,6,8 werden - 15,19,22,23. Als der noch gibt es keine perfekte Färbung für die Lebensfähigkeit der Zellen, die wirksam sein kann für alle Arten mit der gleichen Konzentration und Inkubationszeit 6,10. Sogar die gleiche Art von Sonden mit veränderten Fluoreszenzemissionen zeigt die Notwendigkeit, die richtige Konzentration und Inkubationszeit (Tabellen 1 und 3) festzulegen. Wie bei der Verwendung dieses Protokoll zu sehen ist, die optimale Konzentration und Inkubationszeit für orange Nukleinsäuresonde 10 min bei 1 uM, während die grüne Nucleinsäuresonde würde nur noch die Hälfte der Konzentration nimmt aber dreimal so lang ist (Figuren 5 und 6). Beide Zell impermeante Cyanin-Monomeren mit einer Konzentration über 1,0 uM begonnen, um eine Überlappung in den Emissionsspektren mit nicht-Membran verletzten Zellen zu produzieren. Diese Überlappung der signale liefert den Beweis, dass nicht-spezifische Färbung auftritt, wo 'live' Zellen Aufnahme der molekularen Sonde. Der resultierende Über Fluoreszenz von nicht-spezifische Färbung erzeugt falsche Positive, was die Notwendigkeit für die Protokollentwicklung sorgfältig für jede molekulare Sonde und Zielorganismus hergestellt werden. Die wichtigsten Schritte bei der Optimierung einer molekularen Sonde wäre: 1) das Verständnis, wie die molekulare Sonde interagiert mit dem FCM Instruments; 2) die Annahme geeigneter lebenden und toten Kontrollen; 3) Entwicklung von Kenntnis von Gating-Parameter von FCM Ausgänge und 4) Modifizieren des Protokolls durch das Verständnis der in-situ-Umgebungen.
Die Lichtquelle, optische Filter, die Fähigkeit, PMT-Spannung und den Detektoren im Durchflusszytometer verändern variieren von Hersteller zu Hersteller unterschiedlich, so dass ein Bewusstsein, was Anregungswellenlänge aus dem Laser und in dem sich die Emissionsspektren liegt in Bezug auf die Fluoreszenzkanäle sind von entscheidender Bedeutung. Mit Übernahmen von Daten,Schwellenwerte können zunehmender Auflösung, die sonst verloren gehen würde, um vielleicht Hintergrundrauschen, Schmutz oder toten Zellaggregate verhängt werden. Molekularsonden können Einblicke in die Lebensfähigkeit der Spezies bieten ohne Kultivierung durch einzelne Parameter, wie Membranpotential, DNA-Gehalt und der Enzymaktivität. Doch innerhalb Umweltproben kann es viele Organismen eines ähnlichen Zellgröße und Fluoreszenz sein. Darüber hinaus innerhalb uniagal Kulturen, werden Populationen von Zellen zwangsläufig eine gewisse physiologische Zustände 3, die molekulare Sonde Aufnahme beeinträchtigen können. Einer der Hauptvorteile der FCM ist seine Fähigkeit, zu unterscheiden und zu charakterisieren, physiologische Zustände auf Einzelzellebene in Echtzeit, die notwendig ist, wenn das Studium Mikroorganismen Lebensfähigkeit in-situ, da sie häufig eine rasche und dynamische Bedingungen unterworfen. Trotz der häufigen Verwendung der Begriff der Lebensfähigkeit der Zellen nach wie vor schwer zu definieren. In der Regel, um die zelluläre Proliferation angewendet,Rentabilität ist sehr stark auf Wachstumsansatz erzielt. Dieser Unterbau Annahme kann zu kurz, als Bedingungen möglicherweise nicht einzelne Zellen zu reproduzieren zu entsprechen, aber sie können immer noch tolerierbar sein. Zellen in einer nicht proliferierenden physiologischen Zustand, der eine Ruhe oder ein G (0) Zellzyklusphase 27 kann nicht mit einer molekularen Sonde geben falsche Negative in DNA-Zyklus oder Stoffwechsel basierte Sonden interagieren eingegeben haben.
Verwenden Labor gezüchtet oder frisch isolierte Zellen molekulare Sonden zu optimieren die Raffination von Daten in ökologischen Studien verwendet zu unterstützen. Die Zellen in der Optimierung von Batch-Kulturen verwendet werden gewöhnlich am exponentiellen oder frühen stationären Phasen genommen und angenommen, dass die höchste Rentabilität haben. Allerdings müssen Sie besonders vorsichtig bei der Verwendung von hohen Zelldichten, die in einem späten stationären Phase oder Mikroben produzieren extrazelluläre Matrizen entnommen werden. In diesem Protokoll werden die Steuerung für die tote Population von Zellen wurden für 1 h auf 60 ° C Hitze ausgesetzt,mit der Bestätigung der Membranschäden und Pigmentabbau durch Mikroskopie beobachtet (Abbildung 4) und FCM Fluoreszenz Ausgänge (Figuren 2 und 3). Simulation der Ursachen der natürlichen Zelltod ist äußerst schwierig, wie; Aufnahme durch Weidetiere, virale Lyse, den programmierten Zelltod oder die Möglichkeit der asymmetrischen Teilung 24 sind nicht immer machbar oder unter Laborbedingungen beobachtet werden. Versuchsmoden Moral werden häufig in Frage gestellt, da sie nicht äquivalent Beanspruchungen aus der Umgebung induziert werden (zB Wärme Tötung) und es kann eine heterogene Reaktion, durch die bestimmte Exemplare getötet und anderen Zellen zeigen keine beobachtbare Zelldegradation oder Tod 3 sein kann , 25. Um solch ein Paradox zu vermeiden, der Arbeitsdefinition, mit dem die Experimente gemessen muss klar festgelegt werden, um nicht zu Verwirrung 6,23 führen, erleichtern die Normalisierung zwischen den Studien.
Verschiedene alternative Methoden have Analyse Zell-Lebensfähigkeit in Kulturen, die in Verbindung mit molekularen Sonden verwendet worden. Epifluoreszenzmikroskopie ist eine traditionelle Technik verwendet, obwohl Ausbleichung oder die Einführung Artefaktsignale von umliegenden Zellen eine unter oder über-Schätzung von Populationen physiologischen Zustand, wenn nicht schnell genug erfasst ergeben. Dies macht Optimierung durch Abbilden sehr schwierig, mit potenziell geringen Genauigkeit. Genomische Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zelle mit den beiden DNA-und RNA-Amplifikationsverfahren wie; Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Reverse Transkriptase (RT-PCR) und Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) wurden ebenfalls verwendet. Dient jedoch genomische Beurteilung nur als indirekte Methode der Lebensfähigkeit Validierung als die Persistenz von Nukleinsäure hängt stark von Umweltbedingungen, mit der Korrelation der tatsächlichen Zelllebensfähigkeit potentiell unterschiedlichen immens 28. Durch die Verwendung einer Kombination von Lichtstreuung und / oder Fluoreszenz durch natürliche Bilderynthetic Pigmente (Abbildung 1) Gating von Populationen kann: Erhöhung Auflösung von Daten, zu identifizieren Reaktionen selten Bevölkerung und zur Verringerung falsch positiven Ergebnissen. FCM entlang molekularen Sonden hebt sich von den vorherigen erwähnten Techniken bei der Prüfung einzelne Zelle physiologischen für seine Geschwindigkeit, Genauigkeit und Aufzeichnung von mehreren Parametern.
FCM ist ein leistungsstarkes analytisches Werkzeug in der aquatischen Mikrobiologie und mit der Zugabe von Molekularsonden verfügt über ein breites Potenzial in einer Reihe von Bereichen, einschließlich Einzelzelle und Community-Analyse, um Industriezweige (z. B. die Überwachung der Trinkwasserversorgung). Künftige Fortschritte konnte sehen FCM nehmen Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), das zu erkennen und zu lokalisieren spezifischen genetischen Sequenzen, die in einzelnen Zellen in dichten heterogenen Proben können. Die Entwicklung von FCM und molekulare Sonde Portabilität zur in-situ-Aufnahmen konnten wichtige Daten auf Wasserquellen bieten, früh s implementierenTRATEGIEN für das Ressourcenmanagement. Im Anschluss an die hier entwickelten Optimierungsprotokoll kann FCM und molekulare Sonden möglicherweise spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von wertvollen Daten zu den mikrobiellen Physiologie in der aquatischen Umwelt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Doktorand Dave Hartnell und Bournemouth University für die Unterstützung und Finanzierung für die Forschung und Einrichtungen anzuerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
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