Summary
Mikrobepopulasjoner inneholde betydelig celle heterogenitet, som kan diktere generelle atferd. Molekylær sonde analyse gjennom flowcytometri kan avgjøre fysiologiske tilstander av celler, men sin søknad varierer mellom artene. Denne studien gir en protokoll for å fastslå nøyaktig celle død innen et cyanobacterium befolkning, uten å undervurdere eller opptak falske positive resultater.
Abstract
Mikrobielle subpopulasjoner i felt- og laboratoriestudier har vist seg å vise høy heterogenitet i morfologiske og fysiologiske parametre. Bestemme sanntid tilstand av en mikrobiell celle går utover levende eller døde kategorier, som mikrober kan eksistere i en sovende tilstand, der celledeling og metabolske aktiviteter er redusert. Gitt behovet for deteksjon og kvantifisering av mikrober, strømningscytometri (FCM) med molekylære prober gir en hurtig og nøyaktig metode for å bestemme totalpopulasjonen levedyktighet. Ved å bruke SYTOX Grønn og SYTOX Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa å påvise membran integritet, utvikler vi en overførbar metode for rask indikasjon på enkelt dødelighet celle. De molekylære prober som brukes i dette tidsskriftet vil bli referert til som en grønn eller orange nukleinsyre-prober som henholdsvis (selv om det er andre produkter med lignende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder som har en sammenlignbar måter aktion, vi henviser spesielt i forgrunnen nevnt prober). Protokoller ved hjelp av molekylære prober varierer mellom arter, ulik hovedsakelig i konsentrasjons og inkuberingstider. Etter denne protokollen satt ut på M.aeruginosa den grønne nukleinsyre-probe ble optimalisert ved konsentrasjoner på 0,5 um etter 30 min inkubering, og den oransje nukleinsyre-probe på en pM etter 10 min. I begge probes konsentrasjoner mindre enn oppgitt optimal ført til en underrapportering av celler med membranskade. Omvendt, 5 uM konsentrasjoner og høyere i begge probene viste en type ikke-spesifikk farging, hvorved førende celler produsert et mål fluorescens, som fører til en overrepresentasjon av "ikke-levedyktig" celleantall. De positive kontroller (varmedrepte) forut testbar død biomasse, selv om hensiktsmessigheten av kontroll generasjon er fortsatt gjenstand for debatt. Ved å demonstrere en logisk sekvens av trinn for å optimalisere de grønne og oransje nukleinsyreprober vi demonstrate hvordan å lage en protokoll som kan brukes til å analysere cyanobacterial fysiologisk tilstand effektivt.
Introduction
Cellen er et komplekst system, som stadig svarer til omgivelsene ved å modifisere fysiologiske parametere, og å endre dets funksjon. Populasjonsdynamikk isogene mikrobielle populasjoner både i naturen og laboratorie påvirkes av utviklingen av subpopulasjoner, som forekommer selv under relativt konstant miljøforhold 1 - 3. Variabiliteten av naturlige mikrobielle samfunn oppstår på grunn av den sterkt varierende natur av miljøforhold. Disse noen ganger stokastiske prosesser senere produsere subpopulasjoner som er svært annerledes enn gjennomsnittsbefolkningen. Nyere bevis har avdekket at disse fysiologiske subpopulasjonene reagerer forskjellig på miljøforhold og kan produsere signal forbindelser eller hemmere som dramatisk påvirker og påvirker den generelle befolkningen 3,4.
Etablering av en metode for å definere heterogenitet innen en populasjon er nøkkelen til unståelse økologi av mikrober i ulike miljøer, og er viktig når bygger kjennskap til plage cyanobakterier, slik som giftig Microcystis, som påvirker sterkt på human vannsikkerhet. art som Anabaena viser morfologisk heterogenitet i respons til svingninger miljø, utvikle spesialiserte celler som heterocysts og akinetes 2. I motsetning til dette har Microcystis celler ikke viser tydelig morfologisk heterogenitet i løpet av en stressrespons. Diskrimineringen mellom levedyktige og ikke-levedyktige celler, er det viktigste aspektet av fysiologisk differensiering og tillater en bedre forståelse av mikrobielle populasjonsdynamikk. Men den konseptuelle problemet med bakteriell levedyktighet seg fortsatt vanskelig og dårlig preget 1,5,6.
Strømningscytometri (FCM) er en pålitelig og rask metode for å analysere individuelle celler. For å øke forståelsen for enkelt celle fysiology gjennom FCM, har molekylære prober blitt brukt til å skille mellom en rekke metabolske og biokjemiske prosesser 7. Dette har ført til økt kunnskap om arter på celle og befolkningsnivå og i sin tur bidro til vannressursforvaltning 8,9. Imidlertid organismer forskjellig når det gjelder molekylær probe opptak og utstrømming på grunn av porer og pumper i cellevegger og membraner, som har ført til en rekke molekylær probe utforming og protokoll implementering 6,10,11. Molekylære prober tilgjengelig for kommersielle og forskningsformål er ofte leveres med et generisk protokoll som kan være aktuelt for en helt annen celletype. Man må være meget forsiktig med å overføre protokoller er utviklet for en celletype til en annen 6, er det derfor en viktig oppgave å optimalisere molekylære prober effektivt før bruk.
De grønne og oransje nukleinsyreprober binde seg til både doble og enkle nukleinsyrer med minimal basen velgeivity og blir brukt til å vurdere den plasmamembranintegritet av celler. Den grønne nukleinsyreprobe har en markert forbedret cellemerking fluorescens signal sammenlignet med andre molekylære prober, slik som propidiumjodid-baserte forbindelser 12, som også kan fungere som en indikator på cellelevedyktigheten. Begrepet "cellelevedyktigheten" her forutsetter at DNA degradering oppstår etter tapet av plasmamembranintegritet. De nukleinsyreprober er usymmetriske cyaninfargestoffer med tre positive ladninger og kan ikke gå inn celler med intakt membraner henhold preget konsentrasjoner, både eukaryote 11,13 og prokaryote 14,15 organismer. Bindingen av en nukleinsyre-probe nukleinsyrer som kan føre opp til en> 500 gangers økning av fluorescensemisjoner fra endogene signaler i celler som har sitt membranintegritet kompromittert. Selv om molekylære prober som for eksempel grønne nukleinsyreprobe kan være en god indikator på enkeltcellefysiologi, er det et behov to optimalisere hver sonde med den tiltenkte målorganismen, som inkubasjonstider har variert fra 7 min - 30 min og konsentrasjonsområder fra 0,1 pM - 0,5 pM i Microcystis eksperimenter alene 15 - 19.
Her presenterer vi en protokoll for å optimalisere cytometriske analyser av grønt og de relativt nye oransje nukleinsyreprober (som til dags dato ikke blitt testet på cyanobakterielle arter M.aeruginosa). Følgende utviklet metode kan deretter overføres til andre arter, og brukt som en plattform for å optimalisere protokoller i andre molekylære prober, for derved å øke forståelsen av mikrober og deres økologiske oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av Molecular Probe og Flowcytometer
- Fortynne stamløsninger av nukleinsyre-prober, som leveres som en 5 mM løsning i dimetylsulfoksyd (DMSO) til aliquoter av ønskede konsentrasjoner i ultrarent filtrert H 2 O.
- Oppbevar nukleinsyreprober i mørke forhold mellom -5 o C og - 25 ° C til bruk.
- Slå på flowcytometeret og last programvarepakke (se tabell over Materiale / Utstyr for FCM spesifikasjoner).
- Plasser en tom hemolyse rør (12 x 75 mm) på prøven injeksjon probe (SIP), klikk rense og deretter tilbake flush å starte FCM renseprosessen.
MERK: Noen eksempler på scener for SIP kan romme flere typer rør inkludert mikrosentrifugerør. Den molekylære proben fortynningsmiddel og skjermfluid anvendes i FCM apparatet fra en analytisk kvalitet "type 1" 0,22 um membran filtrert kilde. - Plassen frisk hemolyse tube med 2 ml av ultrarent filtrert H 2 O på SIP, sette en frist for 10 - 15 min og en fluidhastighet for å spole (eller en strømningshastighet på> 66 mL / min).
- Velg en ny datacelle, sette på relevante terskler for fluorescens og lysspredning kanaler for å redusere bakgrunnsstøy og klikk "Kjør".
- Dersom de totale hendelser per sekund er ikke under produsentens anbefaling, og deretter kjøre en 2 ml prøve av dekontaminering løsning for 2 min på rask og deretter gjenta trinn 1,4 og 1,5.
MERK: Vennligst sjekk produsentenes anbefalinger for FCM oppstart rengjøring protokoller, som de kan variere fra modell til modell. Testing for bestemte terskler må også være i tråd med FCM-modellen som noe utstyr tillater brukeren å søke spenninger gevinster til fotomultiplikatorrør (PMTs) styrke eller redusere elektriske signalet registrert fra de optiske detektorer. FCM modellen som brukes i denne experiment har fast spenning PMTs og brukt en terskel på 80 000 frem lysspredning (FSC-H) for å utelukke partikler mindre enn 2,0 mikrometer og elektronisk støy.
2. Utarbeidelse av kulturer og Innledende legemer
- Autoclave 98 ml ultrarent filtrert H 2 O og 2 ml av algemateriale (x50 konsentrasjon) i et 250 ml begerglass i 20 min ved 120 o C.
- Fra en innledende monokultur av M.aeruginosa (PCC 7806) i en stabil tilstand med høy tetthet sted 2 ml av prøven inn i et rør i henhold til SIP. Disaggregert noen kolonidannelse ved virvling eller ultralyd 20 og bekreft jevnt spredt cellene gjennom lysmikroskopi.
MERK: Overdreven eksponering for ultrasoniske bølger kan føre til cellelyse og bør brukes med forsiktighet. Siden lydbehandling kan kollapse gass vesikler (som finnes i arter som M.aeruginosa) utganger for eksempel side lysspredning (SSC-H) intensitet kan bli mer sensitive. - Innenfor FCM programvaren, velger du et histogram komplott for å registrere data fra frem lysspredning (FSC-H) og konfigurere tomten spesifikasjoner ved å klikke på "logg inn" for å se på en logg skala på aksen.
- I en separat utgang, velger du en annen histogram (log-aksen) for å spille inn naturlig fluorescens som tilbehør fotosyntese pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), som finnes i M.aeruginosa.
- Bruk en lyskilde som kan opphisse phycocyanin og en detektor som kan filtrere utslippene fra den resulterende fluorescens.
MERK: Photosynthetic pigment som klorofyll kan være spent med brukte 488 nm blå laser, mens phycocyanin er begeistret over 600 nm, og vil bare bli oppdaget med en rød lyskilde 21. Sjekk med flowcytometere produsenten for eksitasjon lyskilder og spektra av utslipps detektorer, her både en 488 nm og en 640 nm laser ble brukt sammen meden 675 ± 12,5 nm optisk filter. - For opptak av de høyest oppløsning velge innstillinger nærmest kjernen størrelsen av målorganismen (10 um) og en relativt lav strømningshastighet (14 mL / min).
MERK: For den beste oppløsningen prøver skal kjøres i henhold til produserer anbefaling av hendelser per sekund. - Før anskaffe data bruker en terskel for å separere ut lysspredning og / eller fluorescenssignaler som er forårsaket av elektronisk bakgrunnsstøy eller celleprøve rusk.
- Velg en ny datacelle, opprette en tetthet tomt med FSC-H og SSC-H parametere på en logg skala og klikk løp.
- Hvis prøvetetthet fører til en overdreven hendelsesrate, kan utvannings skritt tas for å øke nøyaktighet og presisjon.
- På tetthet tomten gjelder programvare porter fra forrige histogrammet for å utelukke lave nivå scatter signaler, produsert av bakgrunnsstøy eller rusk (FSC <320000). Motsatt gate høyere relative fluorescensphycocyanin signaler fra celler og bare inneholde disse hendelsene (FL4, 56000 - 1.950.000).
- Bruk antall celler registrert i gated områder og dele det med det totale volumet av prøven som har passert gjennom FCM, for å regne ut hvor mange celler per ml.
MERK: FCM-modellen som er brukt her har et mikroprosessorstyrt system som tillater peristaltisk pumpe prøvevolum som skal bestemmes. FCM annet utstyr kan kreve en kalibrert perlesuspensjon eller en beregning av H 2 O vekt / volumforskjeller for å bekrefte total prøvevolum. - Legg det nødvendige volumet av cellene til de nylagde media for å starte en batch vekst syklus (250.000 celler / ml) av M.aeruginosa.
MERK: Arter vil variere i vekstrater avhengig av deres in-situ miljøparametere og næringsstoffer, så en batch syklus bør være forhåndsinnspilte å bestemme livsfaser.
3. Optimization Molekylær Probe Cell Opptak
- Høste halvparten av M.aeruginosa kultur utarbeidet i trinn 2 fra en eksponensiell fase og bruke som en "live" kontroll.
MERK: Prøver fortynnes fra en høy tetthet kultur direkte til en eksponensiell fase kan påvirke optimalisering resultater gjennom død celle omsetning, sammenlignet med kulturer inokulert fra en første lag / induksjonsfasen. - Klargjør den andre halvparten som en "død" kontroll ved hjelp av fremgangsmåter så som 70% etanol, varme-prøver ved 60 ° C i 1 time, paraformaldehyd eller 4% formaldehyd i 30 minutter 6,11,22. Kontroller variasjoner i prøvene mikromiljøet (f.eks., PH).
MERK: positive, varme drept, 'død' kontroll i M.aeruginosa skiller seg fra en "live" prøven gjennom sin nedgang i phycocyanin signaler. Indusere dødelighet av andre metoder kan ikke føre til det samme utgang og vil VaRy i arter. - Sett opp blandede prøver ved hjelp av ulike prosenter av "live" og "døde" prøver (f.eks, 0%, 25%, 50%, 100%).
- Disaggregert kolonidannelse ved virvling eller ultralydbehandling og sjekke pH.
- Velg en 488 nm laser sammen med detektorer som kan ta opp fluorescens fra den grønne (FL1, 530 ± 15 nm) og orange (FL2, 585 ± 20 nm) nukleinsyreprober og 640 nm laser for å spille inn phycocyanin signaler gjennom sin respektive detektor.
MERK: Når bundet til DNA, har de grønne nukleinsyreprobe en omtrentlig fluorescens eksitasjonsbølgelengde på 504 nm og emisjon på 523 nm maxima, mens den oransje nukleinsyre probe har en eksitasjonsbølgelengde på 547 nm og utslipp maksima på 570 nm. En 488 nm argon-ion solid state laser kan anvendes for å eksitere begge molekylære prober, vil imidlertid en grønn laser (opp til 547 nm) produsere en høyere orange fluorescens. - Som et utgangspunkt, innføremolekylær probe med produsentens anbefalte konsentrasjon til 50% "live" og 50% "døde" kultur og inkuberes i mørket.
- Velg en ny datacelle, plasser prøven under SIP med terskler og triggere som vil redusere bakgrunnsstøy (FSC-H 80000).
- Lag en tetthet tomt med FSC-H og SSC-H parametre, og tre histogrammer. En histogram ved å bruke den respektive molekylære proben optisk detektor kanal (FL1 eller 2), en for å detektere utslipp av fycocyanin (FL4-H) og den andre FSC-H, alt på en log skala.
- Inkuber prøver av M.aeruginosa med nukleinsyreprober i mørke i opptil 60 min, opptak i separate dataceller, ved et antall tidspunkter (1, 5, 10, 15, 30 og 60 min).
MERK: Ved justering av parametre slik som pH sjekk med produserer for potensielle reaksjoner fra visse kjemikalier (for de testede nukleinsyreprober en buffer kan ikke inneholde fosfater eller høye nivåer av monovalente eller divalånes kationer, som den binding med DNA vil bli redusert). - Påfør en programvare gate å bare inkludere FSC-H histogram (320 000 - 1.500.000) for målorganismer cellestørrelse, i den respektive fluorescens probe kanal histogram.
MERK: Konsentrasjonene anvendt i denne protokollen var 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 uM, som kan endres ved enten å øke eller minske volumet av M.aeruginosa prøve eller initial stamløsning av nukleinsyre-prober. - I fluorescens probe kanal, gjelder en annen komplett programvare gate til den høyeste toppen i histogrammet (grønn FL1-H, 240000 - 1650000, oransje FL2-H, 30 000 - 165 000) og deretter porten som positive sonde fluorescens i tettheten tomten.
- Kjør trinn 03.01 til 03.11 med 100% "levende", 100% 'døde' og alle blandede prøvene kultur, justere de molekylære probe konsentrasjoner (f.eks x 0,1 x 10) og / eller temperatur og pH-verdier hvis nødvendig. <li> sammenligne antallet positive molekylær probe fluorescenssignaler til den opprinnelige celletetthet av "døde" celler (tatt fra en halv total FSC-H eller en 100% "død" kultur) for å finne den totale prosentandel av celler farget med nukleinsyren prober.
- Gjør dette for hver tidsperiode innenfor hver konsentrasjon for å finne den optimale protokollen for den høyeste andelen av cellen nukleinsyre probe opptak uten å produsere ikke-spesifikk farging (bruk de midler i en One-Way ANOVA eller Kruskal-Wallis enveis variansanalyse, hvis dataene er ikke-parametrisk).
4. Molecular Probe Fluorescens Diskriminering
- For testing av fluorescens interferens / overlapp fra egenverdi eller uspesifikke cellefarging velge 50% "live" og 50% over oppbrukte blandet kultur data og ta av alle porter.
- Påfør en programvare gate å bare inkludere FSC-H histogram (320 000 - 1.500.000) for målorganismer cellestørrelse, inn i phycocyaninkanal histogram.
- Gate høyeste phycocyanin topp og etikett som "live", med tillegg av den laveste peak merket som "død".
- Utfør en ytterligere gate skritt inn i respektive molekylær probe fluorescens histogram-kanalen med en av gangen, den "live" og deretter "døde" phycocyanin (FL4) signaler, innspilling både middelbølgelengder.
MERK: mode for å indusere mortalitet i dette eksperimentet ble utført ved varmebehandling, noe som i henhold til denne protokoll tydelig avtar Fykocyanin signaler. Andre metoder for å produsere populasjoner av 'døde' celler kan gi forskjellige utganger i de oppkjøpte går. - Ratio de midlere bølgelengder av positive molekylær probe fluorescens ("døde") og den indre / ikke-spesifikt signal ("levende") for å bestemme protokoll følsomhet.
MERK: For å forbedre fluorescens diskriminering av "live" og "døde" populsjoner, øker karbonkilden til aktiv flekk opptak i næringsfattige celler eller etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) for å forbedre celleveggen permeabilitet og resulterer fluorescenssignaler 6. Begrenset kompensasjon i noen FCM modeller for spektral overlapp kan utføres av bruker-manipulert parvise korreksjon under prøve oppkjøp (PMT spenningsendringer) eller fra post-analytiske spesialisert programvare. - Velg optimalisert protokoll hvor det høyeste beløpet av 'døde' celler har blitt farget uten forekomst uspesifikk farging. Hvis en rekke test har lignende resultater godta protokollen med lavest konsentrasjon og inkubasjonstid, sammen med god fluorescenssignal diskriminering. Følg produsentens anvisninger for cytometeret avslutningsprosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forward lysspredning (FSC) og side lysspredning (SSC) utganger fra en M.aeruginosa batch kultur i eksponentiell fase gir informasjon om celle størrelse (diameter) og intern detaljnivå henholdsvis (figur 1A). FSC kan diskriminere celler som er for store og / eller små til å være M.aeruginosa. Denne diskriminering eller gating kan gjøres ved raffinering av data mellom visse punkter i en FSC utgang (figur 1C). Phycocyanin, en stor konstitueringen av M.aeruginosa fotoapparat gir et sterkt signal når avhørt av en rød lyskilde (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), som kan brukes til ytterligere gate bestander, lik den som gjøres i FSC gating men med fluorescens (figur 1D). Fra FSC og fluorescens-signaler, kan data bli styrt fra det opprinnelige utgang (figur 1A) til bestemte data på M.aeruginosa for fINAL celler (Figur 1b).
Autofluorescens per celle i cyanobakterier populasjoner forskjellig som en funksjon av fysiologisk tilstand. Her cellene ble høstet fra en eksponentiell fase kultur viser relativt høye langt rød fluorescens for en "live" befolkningskontroll og 'død' kontroll ble utsatt til 60 o C varme i 1 time. Når 'leve' høyere pigmentert og 'døde' lavere pigmenterte kontroller blandes den synkende skifte i autofluorescence er klart (2A & B). Den "døde" celle fluorescens og FSC parametre kan brukes for å diskriminere de totale celler som har tatt opp den molekylære proben. I membran kompromittert eller "døde" celler fra nukleinsyre-prober som vil frembringe et ytterligere signal enten på; FL1 kanal (530 ± 15 nm) for den grønne nukleinsyreprobe eller FL2 kanal (585 ± 20 nm) for den oransje nucleic acid probe (figur 3A og B), sammenlignet med det native "live" fluorescens-signal. Bekreftelse på begge nukleinsyreprober i celler med skade membranene kan sees gjennom epifluorescens mikroskopi (figurene 4A-D).
Den totale prosentandel av celler som var blitt farget med grønt nukleinsyre probe ble erholdt fra blandede prøvene, som var pre-gated å omfatte bare M.aeruginosa størrelse celler fra en FSC-H histogram (320 000 - 1.500.000). I en 50:50 "live: dead 'prøven, grønn fluorescens celler gated fra den høyeste toppen i en FL1 (530 ± 15 nm) histogram ble sammenlignet med opprinnelige tetthet i' død 'cellepopulasjon (enten ved å halvere den totale FSC- H eller kjører en egen celletall på bare 100% 'døde' celleprøver). Over 100% vil indikere at ikke-spesifikk farging inntreffer. Den midlere prosentandelen av celler som har tatt opp det grønne nucleic syre probe varierte fra; 15 ± 0,3% i 0,05 um etter 1 min til 177,1 ± 5,1% i 100 mM i løpet av 10 min inkubering (tabell 1). Konsentrasjoner over 1 mikrometer (ikke inkludert) viste ikke-spesifikk farging (ie., "Live" celler som begynte å ta opp den molekylære sonde). En to-veis ANOVA mellom konsentrasjonene som ikke utviser ikke-spesifikk farging (0,05 til 1 uM), og viste et samlet signifikant forskjell i samspillet mellom konsentrasjonen av grønne nukleinsyre probe og inkubasjonstid i M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Det var en viktig effekt på tvers av konsentrasjonene av grønn nukleinsyre-sonde som ble brukt F (3, 40) = 836,92, p <0,001, og inkubasjonstidene F (4,40) = 347,98, p <0,001. En post-hoc Tukey test indikerte en signifikant forskjell mellom alle konsentrasjoner unntatt 0,5 og 1 mM (p <0,001) og ensignifikant forskjell mellom alle inkubasjonstider av 1 - 60 minutter (p <0,001). Men en post hoc Tukey Test fra en enveis ANOVA viste den midlere opptak av grønt nukleinsyresonde skiller ikke mellom 30 og 60 min for 0,05 pM (p> 0,05) og 1 mM (p> 0,05) (Figur 5A). Det gjennomsnittlige forholdet mellom "levende" og "døde" relative fluorescenssignaler i FL1 for diskriminering av populasjoner (målt gjennom FL4) varierte i den grønne nukleinsyreprobe fra det høyeste i 0,1 mikrometer etter 60 min av 714 ± 14.8 (RFU) til laveste på 0,8 ± 0,0 (RFU) i 100 uM etter 30 min (Tabell 2). Sammenligning prosenter av relative fluorescens enheter (RFU) for intensitet diskriminering i "live" og "døde" FL1 signaliserer en Two Way ANOVA rapporterer en samlet signifikant forskjell i samspillet mellom konsentrasjoner og inkuberingstider F 23,9, p <0,001 med den grønne nukleinsyreprobe. Det var også en signifikant forskjell i hovedeffekten på tvers av alle konsentrasjoner F (7,80) = 475,41, p <0,001, og inkubasjonstidene F (4,80) = 78,28, p <0,001. Diskrimineringen prosenter av fluorescens-signaler mellom "live" og varme drept "døde" celler økte med tiden mellom konsentrasjoner på 0,05 uM og 1 pM, men redusert mellom 5 og 100 um (figur 5B).
Prosentandelen av celler som ble farget med orange nukleinsyreprobe så en midlere lav prosentandel av 4 ± 0,3%, i en konsentrasjon på 0,05 uM etter 1 min, økende til 166 ± 3,5% på 100 uM etter 10 min inkubering (tabell 3). Igjen konsentrasjoner over 1 mikrometer presenteres også ikke-spesifikk farging av levende celler. En to-veis ANOVA between konsentrasjonene som viste ingen ikke-spesifikk farging (0,05 til 1 uM) rapporterte en generell signifikant forskjell i samspillet mellom alle konsentrasjoner av den oransje nukleinsyreprobe og inkubasjonstider i M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Det var en statistisk signifikant hovedeffekt på tvers av konsentrasjoner F (3, 40) = 6919,67, p <0,001, og inkubasjonstidene F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Men en Post Hoc Tukey test gjennom en One Way ANOVA på bare 1 mikrometer indikerte at inkuberingstider mellom 10, 30 og 60 min hadde ingen statistisk forskjell i opptak av appelsin nukleinsyresonde (alle p> 0,05) (figur 6A). Fluorescens signal diskriminering mellom "levende" og "døde" farget populasjoner i FL2 varierte i oransje nukleinsyreprobe fra det laveste på 0,3 ± 0,0 (RFU) etter 60 min i 50 mikrometer og 30 mi i 100 uM til den høyeste av 158,3 ± 0,4 (RFU) etter 60 minutter ved en konsentrasjon på 0,1 pM (tabell 4). En Two Way ANOVA rapportert en samlet statistisk betydning i samspillet mellom konsentrasjoner og inkubasjonstid F (28, 80) = 28,12, p <0,001. Hovedeffektene av konsentrasjonen F (7, 80) = 607,9, p <0,001, og inkubasjonstidene F (4, 80) = 31,24, p <0,001 ble også funnet å være alt vesentlig forskjellige. Fluorescens diskriminering mellom signalene fra "levende" og varme drept "døde" celler i FL2 øket med tiden mellom konsentrasjoner av 0,05 uM og 0,5 uM, men avtok mellom 1 og 100 um (figur 6B). Derfor er den optimale konsentrasjon for det grønne nukleinsyreprobe er 0,5 um med en inkubasjonstid på 30 min, og til den oransje nukleinsyreprobe den optimale konsentrasjonen er 1 uM incuinkubert i 10 min.
Figur 1. FCM ut av produksjonen M.aeruginosa Gjennom FSC, SSC & Far Red fluorescens (675 ± 12,5 nm). (A) FSC og SSC av M.aeruginosa PCC 7806. (B) Den samme utgang som figur 1A med gated FSC og langt rød fluorescens (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC som representerer størrelsen på cellen. Den røde foret pil betegner området som er inngjerdet for å redusere bakgrunnsstøy eller andre størrelses partikler. (D) Høye phycocyanin signaler produsert fra M.aeruginosa i en eksponentiell fase batch kultur med rød arrowed gated områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fykocyanin Signal Skiftet M.aeruginosa Når varmebehandlet. Endring av M.aeruginosa autofluorescence i "levende" og "døde" celler som brukes til å validere nukleinsyreprobe opptak. (A) Far røde signaler skiftende fra en høyere pigmentert "live" befolkningen (grønn) til en lavere pigmentert 'død' befolkning (rød). (B) FSC og langt rød fluorescens kombinert utganger med en forskyvning av nesten to størrelsesordener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Orange Fluorescens Skiftet M.aeruginosa Fra 'live' Unstained til 'død' fargede cellene. M.aeruginosa "live" og "døde" blandet kontroller inkuberes med oransje nukleinsyreprobe i en konsentrasjon på 1,0 mikrometer i 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) kanal rapporterer økt overgang fra en "live" unstained befolkningen (grønn) til en "død" farget befolkning (oransje) gjennom to størrelsesordener. (B) A 'død' farget befolkning (oransje) som har sunket langt røde signaler, men økt FL2 signaler fra en "live" befolkningen (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. epifluorescens Mikroskopi av M.aeruginosa med molekylære prober. Microscope bilder fra en M.aeruginosa 50:50 levende: dead befolkningen inkuberes med nukleinsyreprober, alle bildene x1,000 forstørrelse. (A) En epifluorescens bilde på grønn nukleinsyre-probe som opptas av "døde" celler. "Live" celler blir røde på grunn av autofluorescence av klorofyll. (B) lysmikroskop utsikt over 4A viser "live" grønne pigmenterte celler og mindre pigmenterte 'døde' celler, med membranskade. (C) Live: dead 50:50 blandet M.aeruginosa befolkningen. (D) Orange nukleinsyreprobe inkubasjon av figur 4C, med 'døde' celler avslører en oransje farge gjennom epifluorescence mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Prosentandel celler Merkede med grønn nukleinsyreprobe og forholdet av "live" til "døde" FL1 signaler. Gjennomsnittlig prosentdel av M.aeruginosa celler farget med grønt nukleinsyreprobe i forskjellige konsentrasjons og inkubasjonstider. (A) 0,1 mM ikke flekken nok celler, 5 uM viser ikke-spesifikk farging og konsentrasjoner på 0,5 uM og 1 uM farget nesten 100% av befolkningen, som viser optimale inkubasjonstider etter 30 min (a). (B) 'Levende: dead' prosenter av FL1 signaler fra en eksponentiell vekstfase og varmebehandlede prøver. Konsentrasjoner av 0,5 mikrometer og 1 mikrometer viser god diskriminering av FL1 signaler øker med inkubasjonstid (RFU forholdstall to størrelsesordener). Konsentrasjoner av 10 mikrometer og over (som ikke er representert på grafen) viser dårlig fluorescenssignal diskriminering og overlapping av "live" end 'døde' populasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Andel Cells Merkede med Orange nukleinsyreprobe og forholdet mellom "live" til "død" Signaler. Resultater fra konsentrasjons og inkubasjon gang endringer i populasjoner av M.aeruginosa. (A) Mean prosentandel av celler som hadde spilt en orange fluorescens signal i FL2 med konsentrasjoner av; 0,1 uM og 0,5 uM ikke farging nok celler, 5 uM flekker levende celler (ikke-spesifikk farging), sammen med den optimale konsentrasjon på 1 uM etter 10 min (a). (B) Den oransje nukleinsyreprobe "live: dead 'forholdstall i FL2 viser god diskriminering og ingen over lappingav fluorescenssignaler i konsentrasjoner på 1 mikrometer eller mindre og dårlige overlapp FL2 signaler (forholdstall lavere enn en størrelsesorden) med konsentrasjoner over 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kons. | Inkubasjonstid (min) | |||||||||
| (mm) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 15.0 | 0.3 | 22.1 | 0.9 | 28.1 | 1.9 | 41.0 | 1.9 | 50.2 | 2.1 |
| 0.1 | 23.5 | 1.5 | 44.1 | 1.8 | 54.7 | 1.6 | 70.5 | 0.8 | 78.3 | 1.0 |
| 0.5 | 49,0 | 3.4 | 74,8 | 4.8 | 87.6 | 3.6 | 97.3 | 0.8 | 98,8 | 0.1 |
| 1 | 58.5 | 1.6 | 77.4 | 0.7 | 88.4 | 0.4 | 98.0 | 0.1 | 99,2 | 0.1 |
| 5 | 91.4 | 0.9 | 98.7 | 0.5 | 99.3 | 0.7 | 102,2 | 1. 3 | 106,3 | 0.8 |
| 10 | 96.1 | 0.5 | 97.7 | 0.1 | 97.9 | 0.1 | 102,0 | 0.5 | 113.4 | 5.1 |
| 50 | 94.6 | 0.6 | 99.5 | 2.3 | 112,7 | 3.8 | 148,7 | 2.4 | 153,9 | 13.0 |
| 100 | 165,8 | 3.1 | 174,4 | 5.7 | 177,1 | 5.1 | 161,5 | 2.5 | 159,7 | 6.6 |
Tabell 1. Prosent Opptak av grønn nukleinsyresonde i celler. Tabell som viser data fra optimalisering eksperiment ved hjelp av grønne nukleinsyre probe og en 50% "live" og 50% "døde" (varmebehandlet) populasjonen prøven. De gjennomsnittlige prosentandeler av celler som har tattgrønn nukleinsyreprobe fluorescens (FL1) er beregnet for det totale antall "døde" celler oppnådd fra en FSC-H teller. Verdier over 100% viser ikke-spesifikk farging (SE understreket).
| Kons. | Inkubasjonstid (min) | |||||||||
| (mm) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 92.9 | 5.4 | 170,0 | 10.9 | 237,2 | 14.9 | 385,5 | 15.0 | 481,9 | 17.7 |
| 0.1 | 178,3 | 18.1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20.6 | 619,1 | 12.1 | 714,1 | 14.8 |
| 0.5 | 202,5 | 5.9 | 308.3 | 13.1 | 365,8 | 33.5 | 426,8 | 67.2 | 480,4 | 73.2 |
| 1 | 205,8 | 12.1 | 225,9 | 13.7 | 237,3 | 15.6 | 241,5 | 5.8 | 263,1 | 8.1 |
| 5 | 69.9 | 2.6 | 53,0 | 0.6 | 40.2 | 1.7 | 27.1 | 3.7 | 21.1 | 3.4 |
| 10 | 44.3 | 2.9 | 28.7 | 5.6 | 23.6 | 4.9 | 11.6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0.1 | 3.9 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.2 | 0.1 | 1.1 | 0.1 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1. 3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.8 | 0.1 | 0.8 | 0.1 |
Tabell 2. Forhold av grønn fluorescens Signaler i "live" og "døde" Stained M.aeruginosa Cells. FL1 signal diskriminering mellom celler farget med grønn nukleinsyreprobe og uspesifikke iboende innspillinger. Prøven inneholdt en 50% "live" og 50% "døde" (varmebehandlet) M.aeruginosaav den samme populasjonen målt over alle konsentrasjon og inkubasjonstider (SE understreket).
| Kons. | Inkubasjonstid (min) | |||||||||
| (mm) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 4.0 | 0.3 | 14.9 | 0.2 | 23.5 | 0.8 | 39.1 | 2.4 | 37.6 | 1.5 |
| 0.1 | 14.6 | 0.4 | 42.2 | 0.5 | 55,0 | 1.1 | 72.8 | 0.9 | 80.2 | 0.1 |
| 0.5 | 54.5 | 0.4 | 79.8 | 1.2 | 86.4 | 0.4 | 91.2 | 0.1 | 93.2 | 0.1 |
| 1 | 92.0 | 0.8 | 94.8 | 0.1 | 96,9 | 0.6 | 98,4 | 0.6 | 98,4 | 0.3 |
| 5 | 91.4 | 1.5 | 93,5 | 1.8 | 102,9 | 5.4 | 118,9 | 0.1 | 124,8 | 0.1 |
| 10 | 95.9 | 1.0 | 102,4 | 1.8 | 132,9 | 6.0 | 148,9 | 4.8 | 132,8 | 5.1 |
| 50 | 107.5 | 3.7 130,6 | 16.6 | 145,2 | 0.2 | 135,4 | 16.2 | 114,6 | 6.6 | |
| 100 | 97,1 | 0.1 | 130,7 | 7.8 | 166,1 | 3.5 | 144,7 | 6.8 | 115,1 | 6.2 |
Tabell 3. Prosent opptak av Orange nukleinsyresonde i celler. Tabell med optimalisering av data ved hjelp av den oransje nukleinsyre probe og en 50% "live" og 50% "døde" (varmebehandlet) populasjonen prøven. Den midlere prosentandel av celler som har tatt opp orange nukleinsyreprobe fluorescens (FL2) er beregnet for det totale antall "døde" celler fra en FSC-H count (SE understreket).
| Kons. | Inkubasjonstid (min) | |||||||||
| (mm) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 20.4 | 0.9 | 41.3 | 1. 3 | 56.1 | 2.4 | 80.4 | 3.6 | 83.3 | 1.8 |
| 0.1 | 31.2 | 1.4 | 76.1 | 2.4 | 100,9 | 3.1 | 146,2 | 0.6 | 158.3 | 0.4 |
| 0.5 | 80.6 | 0.4 | 124,9 | 2.4 | 137,3 | 1.1 | 138,7 </ td> | 2.1 | 132,8 | 3.9 |
| 1 | 89,7 | 16.0 | 80.9 | 16.9 | 69.1 | 10.7 | 43.0 | 5.7 | 35.9 | 6.5 |
| 5 | 10.4 | 0.6 | 7.5 | 0.1 | 5.0 | 1.0 | 2.7 | 0.5 | 1.5 | 0.1 |
| 10 | 7.0 | 0.1 | 3.6 | 0.3 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.1 | 1.2 | 0.1 |
| 50 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.3 | 1. 3 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 0.3 | 0.0 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 0.5 | 0.2 |
Tabell 4. Forhold av Orange nukleinsyre i 'live' og 'død' Stained M.aeruginosa Cells. FL2 signal diskriminering mellom celler farget fra den oransje nukleinsyreprobe (FL2) og uspesifikke iboende innspillinger. Prøven inneholdt en 50% "live" og 50% "døde" (varmebehandlet) M.aeruginosa av den samme populasjonen målt over alle konsentrasjon og inkubasjonstider (SE understreket).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De økte antall publikasjoner bruke molekylære prober indikerer at pålitelige og informative data kan hentes 5,6,8 - 15,19,22,23. Som foreløpig er det ingen perfekt flekken for celle levedyktighet som kan være effektivt på tvers av alle arter med samme konsentrasjon og inkubasjonstid 6,10. Selv den samme type sonde med endrede fluorescensemisjoner viser et behov for å etablere den riktige konsentrasjon og inkubasjonstiden (tabellene 1 og 3). Som det sees ved bruk av denne protokollen, den optimale konsentrasjonen og inkubasjonstiden for orange nukleinsyreprobe er 10 minutter ved 1 pM, mens den grønne nukleinsyreprobe ville bare trenger halvparten av konsentrasjonen men tre ganger lenger (figurene 5 og 6). Begge disse celle impermeant cyanine monomerer med konsentrasjoner høyere enn 1,0 uM begynte å frembringe en overlapping i utslipp spektra med ikke-membran skadde celler. Dette overlapping av signals gir bevis for at ikke-spesifikk farging oppstår der "live" celler tar opp den molekylære probe. Den resulterende løpet fluorescens fra ikke-spesifikk farging generert falske positiver, som understreker behovet for protokollen utviklingen nøye etablert for hver molekylær probe og target organisme. De mest kritiske trinn i å optimalisere en molekylær probe ville være: 1) for å forstå hvordan den molekylære proben samvirker med FCM-instrument; 2) vedta egnet levende og døde kontroller; 3) å utvikle kunnskap om gating parametere fra FCM utganger og 4) å endre protokollen gjennom forståelse av in-situ miljøer.
Lyskilden, optiske filtre, evnen til å endre PMT spenning og detektorer innenfor flowcytometere varierer fra produsent til produsent, slik at en forståelse av hva eksitasjonsbølgelengde fra laseren og hvor emisjonsspektra ligger i forhold til fluorescens kanaler er avgjørende. Med oppkjøp av data,terskler kan pålegges økende oppløsning som ellers ville være tapt for kanskje bakgrunnsstøy, rusk eller døde celleaggregater. Molekylære prober kan gi innsikt i levedyktigheten av arter uten dyrking, ved engangs parametre som, membranpotensialet, DNA-innhold og enzymaktivitet. Men innenfor miljøprøver kan det være mange organismer av samme cellestørrelse og fluorescens. I tillegg innenfor uniagal kulturer, vil populasjoner av celler uunngåelig ha en grad av fysiologiske tilstander 3, som kan påvirke molekylær probe opptak. En av de viktigste fordelene med FCM er dens evne til å skille og karakterisere fysiologiske tilstander hos den enkelte celle-nivået i sann tid, noe som er viktig når man studerer mikroorganismer levedyktighet in-situ, slik de er ofte utsatt for raske og dynamiske betingelser. Til tross for sin hyppig bruk, begrepet cellenes levedyktighet fremdeles vanskelig å definere. Vanligvis brukt til celleproliferasjonstest,levedyktighet er veldig mye scoret på en vekstbasert tilnærming. Dette underbygger antakelsen kan falle kort, ettersom forholdene ikke kan passe individuelle celler til å reprodusere, men de kan likevel være tålelig. Celler i en nonproliferating fysiologisk tilstand som har inngått en quiescence eller en G (0) cellesyklus fase 27 kan ikke kommunisere med en molekylær probe gi falske negative i DNA sykle eller metabolsk basert sonder.
Ved hjelp av laboratorie dyrket eller nylig isolerte celler for å optimalisere molekylære prober vil hjelpe raffinering av data som brukes i økologiske studier. Celler som brukes i optimalisering fra batch kulturer blir ofte tatt på eksponentiell eller tidlig stasjonærfaser og antas å ha høyest levedyktighet. Imidlertid må ekstra forsiktighet ved bruk av høy celletetthet, de som er i en sen stasjonær fase eller mikrober produserer ekstracellulære matriser. I denne protokollen kontroll for de døde populasjon av celler ble utsatt for 60 ° C varme i 1 time,med bekreftelse av membranskade og pigment degradering sett gjennom mikroskop (figur 4) og FCM fluorescens utganger (figurene 2 og 3). Simulere årsakene til naturlig celledød er ekstremt vanskelig som; Inntak av beitedyr, viral lysering, programmert celledød eller muligheten for asymmetrisk fordeling 24 er ikke alltid mulig eller holdes under laboratorieforhold. Eksperimentelle måter moral blir ofte stilt spørsmål som de ikke kan være tilsvarende spenninger indusert fra omgivelsen (f.eks, varme killing) og det kan være en heterogen reaksjon, ved hvilken visse individer blir drept og andre celler viser ingen observerbar celle nedbrytning eller død 3 , 25. For å unngå en slik paradoks operativ definisjon av hvilke forsøkene målte må avklares for ikke å føre til forvirring 6,23, lettelser normalisering mellom studier.
Hav ulike alternative metodere blitt anvendt for analyse av cellenes levedyktighet i kulturer i forbindelse med molekylære prober. Epifluorescens mikroskopi er en tradisjonell teknikk som brukes, selv om fotobleking eller innføring av funn signaler fra nærliggende celler kan gi en under eller over estimat av en populasjoner fysiologisk tilstand hvis det ikke registreres raskt nok. Dette gjør optimalisering gjennom bildebehandling svært vanskelig, med potensielt lav nøyaktighet. Genomisk vurdering av cellelevedyktigheten ved hjelp av både DNA- og RNA-amplifiseringsmetoder som; polymerase-kjedereaksjon (PCR), revers transkriptase (RT-PCR) og nukleinsyresekvensen basert amplifikasjon (NASBA) har også vært anvendt. Men serverer genomisk evaluering kun som en indirekte metode for levedyktighet validering som utholdenhet av nukleinsyre tungt avhengig av miljøforhold, med korrelasjonen av selve cellen levedyktighet potensielt varierende umåtelig 28. Ved å bruke en kombinasjon av lysspredning og / eller fluorescens gjennom naturlige bilderynthetic pigmenter (figur 1) gating av populasjoner kan: økning oppløsning på data, identifisere sjeldne befolknings svar og redusere falske positive resultater. FCM langs molekylære prober skiller seg ut fra de tidligere nevnte teknikker å teste fysiologisk enkelt celle for sin hastighet, nøyaktighet og registrering av flere parametere.
FCM er et kraftig analyseverktøy i akvatisk mikrobiologi og med tillegg av molekylære prober har et bredt potensial på en rekke områder, inkludert, encellede og samfunnsanalyse til industrisektorer (f.eks., Overvåking drikkevannsforsyninger). Fremtidige fremskritt kunne se FCM innlemme fluorescens in situ hybridisering (FISH), som kan oppdage og lokalisere spesifikke genetiske sekvenser i individuelle celler i tette heterogene prøver. Utviklingen av FCM og molekylær probe portabilitet for in-situ-opptak kan gi viktige data på vannkilder å gjennomføre tidlig strategies for ressursforvaltning. Etter optimalisering protokoll utviklet her, kan FCM og molekylære prober potensielt spille en avgjørende rolle i å gi verdifulle data om mikrobiell fysiologi i akvatiske miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke PhD student Dave Hartnell og Bournemouth University for støtte og finansiering til forskning og fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
References
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
