Summary
Populações microbianas contêm heterogeneidade celular substancial, que pode ditar o comportamento geral. Análise sonda molecular através de citometria de fluxo pode determinar estados fisiológicos de células, no entanto a sua aplicação varia entre as espécies. Este estudo fornece um protocolo para determinar com precisão a mortalidade de células dentro de uma população cianobactéria, sem subestimar ou gravar resultados falsos positivos.
Abstract
Subpopulações microbianas em estudos de campo e de laboratório foram mostrados para exibir elevada heterogeneidade em parâmetros morfológicos e fisiológicos. A determinação do estado de uma célula microbiana tempo real ultrapassa categorias vivas ou mortas, tal como micróbios podem existir num estado dormente, pelo qual a divisão celular e actividades metabólicas são reduzidos. Dada a necessidade de detecção e quantificação de micróbios, a citometria de fluxo (FCM) com sondas moleculares proporciona um método rápido e preciso para ajudar a determinar a viabilidade da população em geral. Usando SYTOX Verde e Laranja SYTOX no modelo de cianobactérias Microcystis aeruginosa para detectar a integridade da membrana, desenvolvemos um método transferível para indicação rápida de mortalidade única célula. As sondas moleculares utilizados nesta revista serão referidas sondas de ácidos nucleicos como verdes ou laranja, respectivamente (embora existam outros produtos com comprimentos de onda de excitação e emissão semelhantes que têm uma modos comparáveis de action, que se referem especificamente à tona mencionado sondas). Protocolos que utilizam sondas moleculares variam entre espécies, diferindo principalmente na concentração e de incubação vezes. Seguindo este protocolo descrito em M.aeruginosa a sonda de ácido nucleico verde foi optimizada em concentrações de 0,5 uM, após 30 min de incubação e a sonda de ácido nucleico de laranja a 1 uM, após 10 min. Em ambas as concentrações sondas menos do que o ideal afirmou levou a uma subnotificação de células com danos na membrana. Por outro lado, as concentrações de 5 | iM e mais elevada em ambas as sondas exibiu um tipo de coloração não específica, por meio de que as células "ao vivo" produziu uma fluorescência alvo, levando a uma representação através do número de células não viáveis ''. Os controlos positivos (mortos pelo calor), desde biomassa morta testável, embora a adequação da geração controlo mantém-se sujeita a debate. Ao demonstrar uma seqüência lógica de etapas para otimizar as sondas de ácidos nucleicos verde e laranja de nós,monstrate como criar um protocolo que pode ser utilizado para analisar o estado fisiológico de cianobactérias eficaz.
Introduction
A célula é um sistema complexo, que responde constantemente para o meio ambiente, modificando parâmetros fisiológicos e alterar a sua função. A dinâmica populacional das populações microbianas isog�nicas tanto na natureza eo laboratório são afectados pelo desenvolvimento de subpopulações, ocorrendo mesmo em condições ambientais relativamente constantes 1 - 3. A variabilidade das comunidades microbianas naturais surge devido à natureza altamente variável de condições ambientais. Estes processos estocásticos, por vezes, posteriormente produzir subpopulações que são muito diferentes para a média da população. Evidências recentes têm revelado que estes subpopulações fisiológicas respondem diferentemente a condições ambientais e pode produzir compostos inibidores do sinal ou que afectam dramaticamente e influenciam a 3,4 população geral.
O estabelecimento de um método para definir a heterogeneidade dentro de uma população é fundamental para untendimento a ecologia dos micróbios em diversos ambientes e é essencial na construção de conhecimento de cianobactérias incômodo, como a Microcystis tóxica, que tem um forte impacto sobre segurança hídrica humana. Espécies como Anabaena exibir heterogeneidade morfológica em resposta a flutuações ambientais, desenvolvendo células especializadas, como heterocistos e akinetes 2. Em contraste, as células de Microcystis não apresentam heterogeneidade morfológica óbvia durante uma resposta ao estresse. A discriminação entre as células viáveis e não viáveis é o aspecto mais importante de diferenciação fisiológica e permite uma melhor compreensão da dinâmica das populações microbianas. No entanto, o problema conceitual da viabilidade bacteriana em si continua a ser difícil e pouco caracterizada 1,5,6.
A citometria de fluxo (FCM) é um método fiável e rápido de análise de células individuais. Para aumentar a compreensão do fisioterapeuta única célulalogia através FCM, sondas moleculares têm sido utilizados para distinguir uma série de processos metabólicos e bioquímicos 7. Isto levou a um maior conhecimento das espécies em um nível celular e da população e, por sua vez ajudou a gestão dos recursos hídricos 8,9. No entanto, os organismos diferem em termos de captação de sonda molecular e efluxo devido aos poros e bombas nas paredes celulares e membranas, que levaram a uma série de design de sonda molecular e implementação do protocolo 6,10,11. Sondas moleculares disponíveis para fins comerciais e de pesquisa são muitas vezes fornecidos com um protocolo genérico que pode ser aplicável a um tipo de célula muito diferente. É preciso ser muito cauteloso na transferência de protocolos desenvolvidos para um tipo de célula para outra 6, é, portanto, uma tarefa essencial para otimizar sondas moleculares de forma eficaz antes da utilização.
As sondas de verde e laranja ácidos nucleicos se ligam a ambos os ácidos nucleicos de cadeia simples e duplas com base minimalista selecioneivity e são utilizados para avaliar a integridade da membrana plasmática das células. A sonda de ácido nucleico verde tem um sinal de fluorescência marcação celular marcadamente melhorado em comparação com outras sondas moleculares, tais como os compostos à base de iodeto de propídio 12, que também pode actuar como um indicador da viabilidade celular. O termo "viabilidade celular 'aqui assume que a degradação do DNA ocorre após a perda da integridade da membrana plasmática. As sondas de ácidos nucleicos são corantes assimétricos cianina com três cargas positivas e não podem entrar nas células com membranas íntegras sob concentrações caracterizadas, em ambos os eucariotas e procariotas 14,15 11,13 organismos. A ligação de uma sonda de ácido nucleico de ácidos nucleicos podem resultar em até um aumento> 500 vezes de emissões de fluorescência de sinais endógenos em células que tenham a sua integridade da membrana comprometida. Embora sondas moleculares, tais como o verde sonda de ácido nucleico pode ser um bom indicador da fisiologia da célula única, há uma necessidade To otimizar cada sonda com o organismo-alvo a que se destina, como os tempos de incubação variaram de 7 min - 30 min e concentração varia de 0,1 mM - 0,5 M em experimentos Microcystis sozinho 15-19.
Aqui apresentamos um protocolo para otimizar os ensaios de citometria de verde e os relativamente novos laranja sondas de ácidos nucleicos (o que até à data não foram testados nas espécies de cianobactérias M.aeruginosa). A seguinte metodologia desenvolvida pode então ser transferido para outras espécies e usado como uma plataforma para optimizar protocolos de outras sondas moleculares, aumentando assim a compreensão de micróbios e o seu comportamento ecológico.
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Protocol
1. Preparação da sonda molecular e Citómetro de Fluxo
- Dilui-se as soluções de reserva das sondas de ácidos nucleicos, que são fornecidos como uma solução a 5 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) a alíquotas de concentrações requeridas em ultrapura filtrada H2O
- Armazene as sondas de ácido nucleico em condições escuras entre -5 ° C e - 25 ° C até o uso.
- Ligue o citômetro de fluxo e pacote de software de carga (veja a tabela de materiais / equipamentos para as especificações FCM).
- Coloque um tubo de hemólise vazio (12 x 75 mm) na sonda de injecção de amostra (SIP), clique desobstruir e, em seguida, lave novamente para iniciar o processo de limpeza FCM.
NOTA: Algumas etapas de exemplo para a SIP pode acomodar vários tipos de tubos, incluindo tubos de microcentrífuga. O diluente e a bainha da sonda molecular de fluido usado no aparelho é de uma FCM grau analítico "tipo 1" membrana de 0,22 um filtrado fonte. - Lugarum tubo de hemólise fresco com 2 ml de ultrapura filtrada H2O na SIP, defina um limite de tempo para 10 - 15 min e uma velocidade fluidic a jejuar (ou uma taxa de fluxo de> 66 mL / min).
- Selecione uma nova célula de dados, colocar em limiares relevantes para a fluorescência e canais de dispersão de luz para reduzir o ruído de fundo e clique em "Executar".
- Se o total de eventos por segundo não são inferiores a recomendação dos fabricantes, em seguida, executar uma amostra de 2 ml de solução de descontaminação por 2 min em rápida e repita as etapas 1.4 e 1.5.
NOTA: Verifique as recomendações dos fabricantes para FCM start-up limpeza protocolos, como eles podem variar entre os modelos. Testes de limites específicos também precisa estar em linha com o modelo FCM como algum equipamento permite que o usuário aplique tensões ganhos para os tubos fotomultiplicadores (PMTs) aumentando ou diminuindo o sinal elétrico gravado a partir de detectores ópticos. O modelo utilizado na presente FCM expemento fixou PMT tensão e utilizado um limiar de 80.000 dispersão frontal de luz (FSC-H) para excluir as partículas menores que 2,0 mm e de ruído eletrônico.
2. Preparação de Culturas e contagens iniciais de células
- Autoclave 98 ml de ultrapura filtrada H2O e 2 ml de meio (concentração de algas x50) em um copo de 250 ml durante 20 min a 120 ° C.
- A partir de uma monocultura inicial de M.aeruginosa (PCC 7806) em um lugar alto densidade estado estacionário 2 ml da amostra para um tubo sob a SIP. Desagregar qualquer formação de colónias por vórtex ou sonicação 20 e confirmar células uniformemente dispersas através da microscopia de luz.
NOTA: A exposição excessiva à ondas ultra-sônicas pode levar a lise celular e deve ser usado com cautela. Desde sonicação pode recolher vesículas de gás (como os encontrados em espécies como M.aeruginosa) saídas, tais como luz dispersão lateral (SSC-H) pode se tornar mais intensidade sensitive. - Dentro do software FCM, seleccionar um histograma para gravar dados de dispersão de luz para a frente (FSC-H) e configurar as especificações de plotagem, clicando em "log" para ver em uma escala logarítmica no eixo.
- Em uma saída separada, selecione outro histograma (eixo log) para gravar fluorescência natural, como o phycocyanin acessório pigmento fotossintético (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), encontrado em M.aeruginosa.
- Utilizar uma fonte de luz que pode excitar ficocianina e um detector que pode filtrar as emissões de fluorescência resultante.
NOTA: fotossintético pigmento tais como clorofila pode ser animado com o comumente usado 488 nm laser azul, enquanto phycocyanin está animado mais de 600 nm e será detectado apenas com uma fonte de luz vermelha 21. Verifique com o fabricante citómetros de fluxo para fontes de luz de excitação e os espectros de detectores de emissão, tanto aqui a 488 nm e um laser de 640 nm foram usadas juntamente comum 675 ± 12,5 nm, filtro óptico. - Para a gravação das configurações escolha de mais alta resolução mais próximo do tamanho do núcleo do organismo alvo (10 pM) e uma taxa de fluxo relativamente lento (14 ul / min).
NOTA: Para obter os melhores amostras de resolução deve ser executado de acordo com a recomendação fabrica de eventos por segundo. - Antes de aquisição de dados usar um limiar para deixar de fora a dispersão de luz e / ou sinais de fluorescência que são causados pelo ruído de fundo eletrônico ou detritos amostra de células.
- Selecione uma nova célula de dados, criar uma trama densidade com parâmetros SSC-H FSC-H e em uma escala log e clique em Executar.
- Se a densidade da amostra leva a uma taxa de eventos em excesso, podem ser tomadas medidas de diluição para aumentar a precisão e precisão.
- Na trama densidade aplicar portões de software a partir do histograma anterior para excluir sinais de baixa nível de dispersão, produzidos pelo ruído de fundo ou detritos (FSC <320.000). Por outro lado a porta de fluorescência relativa mais elevadaficocianina sinais de células e incluem apenas esses eventos (FL4, 56.000 - 1.950.000).
- Use o número de células registrados nas áreas fechadas e dividi-lo pelo volume total da amostra que passou pela FCM, trabalhar para fora como muitas células por ml.
NOTA: O modelo utilizado aqui FCM tem um sistema de bomba peristáltica microprocessador controlado, o volume da amostra a ser determinada. Outro equipamento FCM pode necessitar de uma suspensão de esferas calibrado ou um cálculo de diferenças de H 2 S de peso / volume para verificar se o volume total da amostra. - Adicionar o volume necessário de células para os meios recém-preparados, a fim de iniciar um ciclo de crescimento de lote (250.000 células / ml) de M.aeruginosa.
NOTA: Espécie serão diferentes das taxas de crescimento em função das suas parâmetros in-situ ambientais e disponibilidade de nutrientes, assim um ciclo de lote deve ser pré-gravadas para determinar as fases do ciclo de vida.
3. Optimização da Sonda Molecular Captação celular
- Colheita metade da cultura M.aeruginosa preparado no passo 2 a partir de uma fase exponencial e usar como um controle 'ao vivo'.
NOTA: As amostras diluídas a partir de uma cultura de alta densidade em linha reta a uma fase exponencial podem afetar os resultados de otimização através de renovação celular morto, comparada com a de culturas inoculadas a partir de uma fase inicial lag / indução. - Preparar a outra metade como um controlo "morto", utilizando métodos tais como etanol 70%, as amostras de aquecimento a 60 ° C durante 1 h, paraformaldeído ou formaldeído a 4% durante 30 min 6,11,22. Verificar variações no microambiente amostras (por exemplo., Ph).
NOTA: A, controle positivo mortos pelo calor "morto" em M.aeruginosa se distingue de uma amostra de "ao vivo" através da sua redução em sinais ficocianina. Induzindo a mortalidade por outros métodos podem não provocar o mesmo resultado e vary em espécies. - Configurar amostras misturadas em proporções diferentes de "ao vivo" e amostras de 'mortos' (por exemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
- Desagregar a formação de colónias por vórtex ou ultra-sons e verificar o pH.
- Selecione um laser de 488 nm ao lado de detectores que podem gravar fluorescência do verde (FL1, 530 ± 15 nm) e laranja (FL2, 585 ± 20 nm) sondas de ácido nucleico e o laser 640 nm para gravar sinais de ficocianina através de seu respectivo detector.
NOTA: Quando ligado ao DNA, a sonda verde ácido nucléico tem um comprimento de onda de excitação de fluorescência de aproximadamente 504 maxima nm e emissão de 523 nm, enquanto a sonda de laranja ácido nucléico tem um comprimento de onda de excitação de 547 nm e as emissões maxima de 570 nm. Um ião árgon laser em estado sólido a 488 nm pode ser utilizado para excitar as duas sondas moleculares, no entanto, um laser verde (547 nm até) irá produzir uma maior fluorescência laranja. - Como ponto de partida, introduzir asonda molecular com os fabricantes de concentração recomendada para os 50% "ao vivo" e 50% de cultura "morto" e incubar no escuro.
- Selecione uma nova célula de dados, colocar a amostra sob a SIP com limites e gatilhos que irão reduzir o ruído de fundo (FSC-H 80.000).
- Criar uma trama densidade com parâmetros SSC-H FSC-H e, e três histogramas. Um histograma usando a respectiva sonda molecular canal detector óptico (FL1 ou 2), um para detectar emissões de ficocianina (FL4-H) e o outro FSC-H, tudo numa escala logarítmica.
- Incubar as amostras de M.aeruginosa com as sondas de ácido nucleico no escuro durante até 60 minutos, a gravação de dados em células separadas, a um número de pontos de tempo (1, 5, 10, 15, 30 e 60 min).
NOTA: Ao ajustar os parâmetros, tais como verificação de pH com os fabricantes para reações potenciais de certos produtos químicos (para o ácido nucleico testado investiga um buffer não pode conter fosfatos ou altos níveis de monovalente ou divacátions emprestados, como a ligação com DNA será reduzida). - Aplicar um portão de software para incluir apenas o histograma do FSC-H (320.000 - 1.500.000) para o alvo de organismos tamanho de célula, para o respectivo canal do histograma de fluorescência da sonda.
NOTA: As concentrações utilizadas neste protocolo foram 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 um, que podem ser alteradas aumentando ou diminuindo o volume de amostra M.aeruginosa ou solução estoque inicial de sondas nucleicos. - No canal de sonda fluorescente, aplique outro portão software inclusivo para o pico mais alto do histograma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, laranja FL2-H, 30.000 - 165.000) e, posteriormente, portão que sonda positivo de fluorescência na trama densidade.
- Executar os passos 3.1 - 3.11 com 100%, e todas as amostras de cultura mista "mortas" 100% "ao vivo", ajustando as concentrações de sondas moleculares (por exemplo, 0,1 x a x 10) e / ou a temperatura e os níveis de pH, se necessário. <li> comparar o número de sinais positivos de fluorescência da sonda molecular para a densidade de células inicial de células "mortas" (feita a partir de metade total de FSC-H ou um de 100% de cultura 'morta') para encontrar a percentagem total de células coradas com o ácido nucleico sondas.
- Faça isso para cada período de tempo dentro de cada concentração para encontrar o protocolo ideal para o maior percentual de nucleico celular captação sonda sem produzir coloração não específica (usar os meios em um One-Way ANOVA ou Teste de Kruskal-Wallis, Se os dados são não-paramétrico).
4. Molecular Probe Fluorescência Discriminação
- Para os testes de interferência fluorescência / sobreposição de coloração celular intrínseca ou não-específica selecionar os dados cultura mista "mortas" 50% "ao vivo" e 50% e tirar todas as portas.
- Aplicar um portão de software para incluir apenas o histograma do FSC-H (320.000 - 1.500.000) para o alvo de organismos tamanho de célula, para a ficocianinahistograma canal.
- Portão ao pico mais alto phycocyanin e etiqueta como "ao vivo", com a adição do menor pico rotulados como "morto".
- Execute mais um passo portão para o respectivo canal do histograma de fluorescência sonda molecular, usando um de cada vez, sinais do "ao vivo" e, em seguida, phycocyanin 'morto' (FL4), a gravação de ambos os comprimentos de onda médios.
NOTA: O modo para induzir mortalidade neste experimento foi feito por tratamento térmico, que ao abrigo deste protocolo diminui claramente sinais ficocianina. Outros métodos de produção de populações de células "mortas" podem originar diferentes resultados nos funcionamentos adquiridos. - Rácio os comprimentos de onda médios da fluorescência positivo molecular sonda ("morto") eo sinal intrínseco / não-específico ("ao vivo") para determinar a sensibilidade do protocolo.
NOTA: Para melhorar a fluorescência de discriminação "ao vivo" e popul "morto"ções, aumentar a fonte de carbono para a absorção da mancha activa em células sem nutrientes ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para melhorar a permeabilidade da parede celular e sinais de fluorescência resultantes 6. Compensação limitado em alguns modelos FCM para sobreposição espectral pode ser realizada por correção de pares manipulado pelo usuário durante a aquisição da amostra (variações de tensão PMT) ou de software especializado de pós-analítica. - Seleccionar o protocolo optimizado onde a maior quantidade de células "mortas" foi corado sem a ocorrência de coloração não específica. Se um número de teste tem resultados semelhantes aceitar o protocolo com o menor tempo de incubação e concentração, juntamente com uma boa discriminação do sinal de fluorescência. Siga instruções do fabricante para o procedimento de desligamento citômetro.
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Representative Results
Dispersão directa da luz (FSC) e luz dispersão lateral (SSC) saídas a partir de uma cultura de lote M.aeruginosa em fase exponencial fornece informação sobre o tamanho das células (diâmetro) e granularidade interna, respectivamente (Figura 1A). FSC pode discriminar células que são demasiado grandes e / ou pequenos para serem M.aeruginosa. Esta discriminação ou gating pode ser feito por dados refinação entre certos pontos da saída de um FSC (Figura 1C). Ficocianina, um grande constituição do aparelho fotossintético M.aeruginosa produz um sinal forte, quando interrogados por uma fonte de luz vermelha (ex: 640; in: 675 ± 12,5 nm), que pode ser utilizado para outras populações de porta, semelhante ao que foi feito no FSC gating mas com fluorescência (Figura 1D). A partir de sinais FSC e de fluorescência, os dados podem ser fechado a partir da saída original (Figura 1A) para dados específicos sobre a M.aeruginosa para fAs contagens de células inal (Figura 1B).
A autofluorescência por célula em populações de cianobactérias difere em função do estado fisiológico. Aqui as células foram colhidas a partir de uma cultura em fase exponencial mostrando relativamente elevado de fluorescência vermelha extrema para uma população de controlo "ao vivo" e controle "morto" foi exposto a 60 o C de calor durante 1 h. Quando 'viver' controles pigmentadas inferiores pigmentadas e 'mortos' mais elevados são misturados a mudança diminuindo em autofluorescência é clara (Figuras 2A e B). A fluorescência celular 'morto' e os parâmetros do FSC pode ser usado para discriminar as células totais que assumiram a sonda molecular. Na membrana comprometido ou células "mortas" as sondas de ácidos nucleicos irá produzir um sinal adicional quer por; FL1 canal (530 ± 15 nm) para a sonda de ácido nucleico verde ou FL2 canal (585 ± 20 nm) para o ac nucleico laranjasonda id (Figuras 3A e B), em comparação com a 'viver' sinal de fluorescência nativa. Confirmação de ambas as sondas de ácidos nucleicos em células com membranas de dano podem ser vistos através de microscopia de epifluorescência (Figuras 4A & D).
A percentagem total de células que tinham sido corados pela sonda de ácido nucleico verde foi obtido a partir de amostras misturadas, que foram pré-gated para incluir apenas M.aeruginosa dimensionada células a partir de um histograma do FSC-H (320.000 - 1.500.000). Em um 'live: morto "50:50 amostra, as células de fluorescência verde fechado desde o pico mais alto em um FL1 (530 ± 15 nm) histograma foi comparada à densidade original na população de células" morto "(seja por reduzir para metade o total de FSC H ou executando uma contagem de células separado apenas nas amostras de células "mortas" 100%). Acima de 100% indica que a coloração não específica ocorre. A porcentagem média de células que tinham tomado o Nucle verdeic sonda de ácido variou de; 15 ± 0,3% em 0,05 uM após 1 min a 177,1 ± 5,1% em 100 uM durante 10 min de incubação (Quadro 1). Concentrações mais de 1 PM (não incluindo) mostrou coloração não específica (ie., As células 'ao vivo', que começaram a ocupar a sonda molecular). Uma ANOVA two-way entre as concentrações que não exibem coloração não específica (0,05 - 1 uM) e mostraram uma diferença significativa em geral a interacção entre a concentração de sonda de ácido nucleico verde e tempo de incubação na M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Houve um efeito principal em frente as concentrações de sonda verde ácido nucleico utilizado F (3, 40) = 836,92, p <0,001 e tempos de incubação F (4,40) = 347,98, p <0,001. Um teste post-hoc de Tukey indicou uma diferença significativa entre todas as concentrações exceto 0,5 e 1 mM (p <0,001) e umdiferença significativa entre todos os tempos de incubação de 1 - 60 minutos (p <0,001). No entanto, um Post Hoc de Tukey a partir de um One Way ANOVA revelou a média de captação de sonda verde ácido nucleico não difere entre 30 e 60 min para 0,05 mM (p> 0,05) e 1 mM (p> 0,05) (Figura 5A). A razão média de sinais de 'ao vivo' e 'mortos' relativos de fluorescência em FL1 para discriminação de populações (medido através FL4) variou na sonda de ácido nucleico verde desde o mais alto em 0,1 mM após 60 min de 714 ± 14,8 (RFU) para o menor de 0,8 ± 0,0 (RFU) em 100 ^ M após 30 minutos (Tabela 2). Comparando as proporções de unidades de fluorescência relativa (RFU) para a discriminação em intensidade "ao vivo" e "morto" FL1 sinaliza uma Two Way ANOVA relata uma diferença significativa global na interação entre as concentrações e tempos de incubação F p <0,001 com a sonda de ácido nucleico verde. Houve também uma diferença significativa no efeito principal em todas as concentrações de F (7,80) = 475,41, p <0,001 e tempos de incubação de F (4,80) = 78,28, p <0,001. Os rácios de discriminação de sinais de fluorescência entre o "ao vivo" e células mortas pelo calor "mortas" aumentou com o tempo entre as concentrações de 0,05 uM e 1 uM, mas diminuiu entre 5 uM e 100 uM (Figura 5B).
A percentagem de células que foram coradas com a sonda de laranja ácido nucleico vi uma baixa percentagem média de 4 ± 0,3%, numa concentração de 0,05 uM após 1 min, aumentando para 166 ± 3,5% em 100 ^ M após 10 min de incubação (Quadro 3). Novamente concentrações acima de 1 uM também apresentaram coloração não específica de células vivas. A Two-Way ANOVA between as concentrações que não revelaram nenhuma coloração não específica (0,05 - 1 uM) relataram uma diferença global significativo na interacção entre todas as concentrações do ácido nucleico sonda de laranja e os tempos de incubação em M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, P <0,001. Houve um efeito principal significativo estatisticamente entre as concentrações de F (3, 40) = 6919,67, p <0,001 e períodos de incubação de F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. No entanto, um teste Post Hoc Tukey através de uma ANOVA One Way em apenas 1 PM indicaram que os tempos de incubação entre 10, 30 e 60 min não apresentaram diferença estatística para a utilização de sonda de ácido nucleico laranja (todos p> 0,05) (Figura 6A). Fluorescência sinal discriminação entre as populações 'ao vivo' e 'mortas' manchado em FL2 variou em laranja sonda de ácido nucleico a partir do menor de 0,3 ± 0,0 (RFU) após 60 min em 50 mm e 30 mem em 100 uM para a mais alta de 158,3 ± 0,4 (RFU) após 60 min a uma concentração de 0,1 uM (Tabela 4). A Two Way ANOVA relatou uma significância estatística global nas interações entre concentrações e tempo de incubação F (28, 80) = 28,12, p <0,001. Os principais efeitos de concentração de F (7, 80) = 607,9, p <0,001 e períodos de incubação de F (4, 80) = 31,24, p <0,001, também foram consideradas todas significativamente diferentes. Discriminação entre os sinais de fluorescência de células 'ao vivo' e de calor matou 'mortos' em FL2 aumentou com o tempo entre as concentrações de 0,05 mM e 0,5 mM mas diminuíram entre 1 mM e 100 mM (Figura 6B). Por conseguinte, a concentração óptima para a sonda de ácido nucleico verde é de 0,5 | iM, com um tempo de incubação de 30 minutos e para a sonda de ácido nucleico de laranja a concentração óptima é de 1 uM incubated durante 10 min.
Figura 1. FCM Saídas de M.aeruginosa Através FSC, SSC & Far Red fluorescência (675 ± 12,5 nm). (A) FSC e SSC de M.aeruginosa PCC 7806. (B) A mesma saída que figura 1A com FSC fechado e longe fluorescência vermelha (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) representa os tamanhos FSC da célula. A seta indica a vermelho forrado a área que é fechado para reduzir o ruído de fundo ou de outras partículas de tamanho. (D) sinais ficocianina alto produzidos a partir de M.aeruginosa em uma cultura lote fase exponencial com vermelho de Arrowed áreas fechado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Mudança Phycocyanin Signal em M.aeruginosa Quando tratada pelo calor. Mudança de M.aeruginosa autofluorescência em células 'ao vivo' e 'mortas' usados para validar nucleico captação sonda de ácido. (A) Far sinais vermelhos deslocando de uma maior pigmentada 'ao vivo' da população (verde) para uma população inferior pigmentada 'morto' (vermelho). (B) FSC e fluorescência vermelha saídas combinadas longe com um deslocamento de cerca de duas ordens de grandeza. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Deslocamento laranja fluorescente in M.aeruginosa De 'Live' Unstained de células coradas 'morto'. 'ao vivo' e controlos "mortas" misturados M.aeruginosa incubadas com sonda de ácido nucleico de laranja em uma concentração de 1,0 mm para 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) canal relata um aumento da passagem de uma população sem mácula "ao vivo" (verde) para a população 'morto' manchado (laranja) por meio de duas ordens de magnitude. (B) A população manchado 'morto' (laranja), que diminuiu sinais muito vermelho, mas aumentou sinais FL2 de uma população "ao vivo" (verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Microscopia de epifluorescência M.aeruginosa com sondas moleculares. Microscope imagens de um M.aeruginosa 50:50 em directo: população mortos incubadas com sondas de ácidos nucleicos, todas as imagens x1,000 ampliação. Uma imagem de epifluorescência de sonda de ácido nucleico verde tomado pelas células "mortas" (A). Células "ao vivo" aparecem em vermelho devido ao autofluorescência de clorofila. (B) vista microscópio de luz da figura 4A mostrando células 'ao vivo' verdes pigmentadas e células pigmentadas menores "mortas", com dano à membrana. (C) Live: mortos 50:50 população mista M.aeruginosa. (D) Laranja nucleico incubação sonda de ácido a partir da Figura 4C, com células "mortas" revelando uma cor de laranja através de microscopia de epifluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Percentagem de células marcadas com verde de Ácido Nucleico Probe eo Índice de 'Live' para Signals FL1 "morto". A média de porcentagem de células M.aeruginosa corados com a sonda de ácido nucleico verde em diferentes momentos de concentração e de incubação. (A) 0.1 uM não coraram células suficientes, a coloração não específica e 5 uM mostra concentrações de 0,5 uM e 1 uM coradas quase 100% da população, que mostra tempos de incubação óptimos após 30 min (a). (B) "ao vivo: Dead 'proporções de sinais FL1 de uma fase de crescimento exponencial e amostras tratadas termicamente. Concentrações de 0,5 uM e 1 uM mostram boa discriminação de sinais FL1 aumentando com o tempo de incubação (RFU rácios duas ordens de grandeza). As concentrações de 10 mM e mais (não representados no gráfico) mostram pobre discriminação sinal de fluorescência e sobreposição de 'ao vivo' umd populações 'mortos'. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Percentual de células marcadas com a Orange Nucleic Acid Probe eo Índice de 'Live' para Signals 'morto'. Os resultados de concentração e do tempo de incubação alterações em populações de M.aeruginosa. (A) Média percentagem de células que tinha gravado um sinal de fluorescência laranja em FL2 com concentrações de; 0,1 uM e 0,5 uM não coloração de células suficientes, 5 uM de coloração de células vivas (coloração não específica), juntamente com a concentração óptima de 1 uM, após 10 min (a). (B) A sonda de ácido nucleico laranja 'ao vivo: mortas "rácios em FL2 mostrar boa discriminação e não sobre rodandode sinais de fluorescência em concentrações de 1 mM ou menos e sinais pobres sobrepostas FL2 (rácios mais baixos do que uma ordem de grandeza) com concentrações superiores a 1 �. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Conc. | O tempo de incubação (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 15,0 | 0,3 | 22,1 | 0,9 | 28,1 | 1.9 | 41,0 | 1.9 | 50,2 | 2.1 |
| 0,1 | 23,5 | 1,5 | 44,1 | 1.8 | 54,7 | 1.6 | 70,5 | 0,8 | 78,3 | 1.0 |
| 0,5 | 49,0 | 3.4 | 74,8 | 4.8 | 87,6 | 3.6 | 97,3 | 0,8 | 98,8 | 0,1 |
| 1 | 58,5 | 1.6 | 77,4 | 0,7 | 88,4 | 0,4 | 98,0 | 0,1 | 99,2 | 0,1 |
| 5 | 91,4 | 0,9 | 98,7 | 0,5 | 99,3 | 0,7 | 102.2 | 1.3 | 106.3 | 0,8 |
| 10 | 96,1 | 0,5 | 97,7 | 0,1 | 97,9 | 0,1 | 102.0 | 0,5 | 113.4 | 5.1 |
| 50 | 94,6 | 0,6 | 99,5 | 2.3 | 112,7 | 3.8 | 148,7 | 2.4 | 153,9 | 13,0 |
| 100 | 165,8 | 3.1 | 174.4 | 5,7 | 177.1 | 5.1 | 161,5 | 2.5 | 159,7 | 6.6 |
Tabela 1. Porcentagem de Captação de Green Nucleic Acid Probe em Células. Os dados da tabela que mostra a experiência de otimização utilizando a sonda de ácido nucleico verde e um "ao vivo" e 50% "morto" (tratamento térmico) amostra populacional de 50%. Os percentuais médios de células que tenha gravadoácido nucleico sonda de fluorescência verde (FL1) foram calculados em relação ao número total de células "mortas" obtidos a partir de uma contagem de FSC-H. Valores acima de 100% apresentam coloração não específica (SE sublinhado).
| Conc. | O tempo de incubação (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 92,9 | 5.4 | 170,0 | 10,9 | 237.2 | 14,9 | 385.5 | 15,0 | 481,9 | 17,7 |
| 0,1 | 178.3 | 18,1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20,6 | 619.1 | 12.1 | 714.1 | 14,8 |
| 0,5 | 202.5 | 5.9 | 308,3 | 13,1 | 365,8 | 33,5 | 426,8 | 67,2 | 480,4 | 73,2 |
| 1 | 205,8 | 12.1 | 225,9 | 13,7 | 237,3 | 15,6 | 241.5 | 5.8 | 263.1 | 8.1 |
| 5 | 69,9 | 2.6 | 53,0 | 0,6 | 40,2 | 1.7 | 27,1 | 3.7 | 21,1 | 3.4 |
| 10 | 44,3 | 2.9 | 28,7 | 5.6 | 23,6 | 4.9 | 11,6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0,1 | 3.9 | 0,1 | 2.9 | 0,1 | 1.2 | 0,1 | 1.1 | 0,1 |
| 100 | 1.7 | 0,1 | 1.3 | 0,1 | 1.1 | 0,1 | 0,8 | 0,1 | 0,8 | 0,1 |
Tabela 2. Proporção de sinais de fluorescência verdes em 'ao vivo' e manchado M.aeruginosa Cells 'morto'. Discriminação sinal FL1 entre células marcadas com a sonda de ácido nucleico verde e gravações intrínsecas não-específicas. A amostra continha um 50% "ao vivo" e 50% "morto" (tratamento térmico) M.aeruginosada mesma população medida ao longo de todo o tempo de incubação e concentração (SE sublinhado).
| Conc. | O tempo de incubação (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 4 | 0,3 | 14,9 | 0,2 | 23,5 | 0,8 | 39,1 | 2.4 | 37,6 | 1,5 |
| 0,1 | 14,6 | 0,4 | 42,2 | 0,5 | 55,0 | 1.1 | 72,8 | 0,9 | 80,2 | 0,1 |
| 0,5 | 54,5 | 0,4 | 79,8 | 1.2 | 86,4 | 0,4 | 91,2 | 0,1 | 93,2 | 0,1 |
| 1 | 92,0 | 0,8 | 94,8 | 0,1 | 96,9 | 0,6 | 98,4 | 0,6 | 98,4 | 0,3 |
| 5 | 91,4 | 1,5 | 93,5 | 1.8 | 102.9 | 5.4 | 118,9 | 0,1 | 124,8 | 0,1 |
| 10 | 95,9 | 1.0 | 102.4 | 1.8 | 132,9 | 6 | 148,9 | 4.8 | 132,8 | 5.1 |
| 50 | 107.5 | 3.7 130,6 | 16,6 | 145.2 | 0,2 | 135,4 | 16,2 | 114,6 | 6.6 | |
| 100 | 97,1 | 0,1 | 130,7 | 7.8 | 166.1 | 3,5 | 144,7 | 6.8 | 115.1 | 6.2 |
Tabela 3. Percentagem de Captação de Orange Nucleic Acid Probe em Células. Tabela com dados de otimização utilizando a sonda de ácido nucleico de laranja e um "morto" (tratamento térmico) amostra populacional de 50% "ao vivo" e 50%. A percentagem média de células que tenham gravado fluorescência laranja nucleico sonda de ácido (FL2) foram calculados em relação ao número total de células "mortas" de uma contagem de FSC-H (SE sublinhado).
| Conc. | O tempo de incubação (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0,05 | 20,4 | 0,9 | 41,3 | 1.3 | 56,1 | 2.4 | 80,4 | 3.6 | 83,3 | 1.8 |
| 0,1 | 31,2 | 1.4 | 76,1 | 2.4 | 100.9 | 3.1 | 146,2 | 0,6 | 158.3 | 0,4 |
| 0,5 | 80,6 | 0,4 | 124,9 | 2.4 | 137,3 | 1.1 | 138,7 </ td> | 2.1 | 132,8 | 3.9 |
| 1 | 89,7 | 16,0 | 80,9 | 16,9 | 69,1 | 10,7 | 43,0 | 5,7 | 35,9 | 6.5 |
| 5 | 10,4 | 0,6 | 7,5 | 0,1 | 5 | 1.0 | 2.7 | 0,5 | 1,5 | 0,1 |
| 10 | 7 | 0,1 | 3.6 | 0,3 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0,1 | 1.2 | 0,1 |
| 50 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0,3 | 1.3 | 0.0 | 0,6 | 0,1 | 0,3 | 0.0 |
| 100 | 1.7 | 0,1 | 1.1 | 0,1 | 0,7 | 0,1 | 0,3 | 0.0 | 0,5 | 0,2 |
Tabela 4. Proporção de Ácido Nucleico Laranja em 'Ao Vivo' e manchado M.aeruginosa Cells 'morto'. Discriminação sinal FL2 entre células marcadas a partir da sonda de ácido nucleico laranja (FL2) e gravações intrínsecas não-específicas. A amostra continha um 50% "ao vivo" e 50% "morto" (tratamento térmico) M.aeruginosa da mesma população medido ao longo de todos os momentos de concentração e de incubação (SE sublinhado).
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Discussion
O aumento do número de publicações que utilizam sondas moleculares indica que dados confiáveis e informativas podem ser obtidas 5,6,8 - 15,19,22,23. Como ainda não há nenhuma mancha perfeita para a viabilidade das células que podem ser eficazes em todas as espécies com a mesma concentração e tempo de incubação 6,10. Mesmo o mesmo tipo de sonda com emissões de fluorescência alteradas mostra a necessidade de estabelecer a concentração e tempo de incubação correta (Tabelas 1 e 3). Como pode ser visto quando se usa este protocolo, a concentração e tempo de incubação ideal para a sonda de laranja ácido nucleico é de 10 min a 1 PM, ao passo que a sonda verde ácido nucleico só precisa de metade da concentração, mas leva três vezes mais tempo (Figuras 5 e 6). Ambas estas células-impermeant monómeros cianina com concentrações superiores a 1,0 mM começou a produzir uma sobreposição em emissões espectrais com células não-membrana feridos. Esta sobreposição de signals fornece evidências de que a coloração não específica ocorre quando células 'ao vivo' estão ocupando a sonda molecular. A resultante sobre fluorescência de coloração não específica gerada falsos positivos, sublinhando a necessidade de desenvolvimento de protocolo para ser cuidadosamente estabelecido para cada sonda molecular e organismo alvo. Os passos mais importantes na optimização de uma sonda molecular seria: 1) compreender como sonda molecular interage com o instrumento FCM; 2) a adopção de viver adequado e controles mortos; 3) desenvolver o conhecimento de gating parâmetros de saídas FCM e 4) modificar o protocolo através da compreensão de ambientes in-situ.
A fonte de luz, filtros ópticos, a capacidade para alterar a voltagem PMT e detectores dentro citómetros de fluxo variam de fabricante para fabricante, de modo que a consciência do que o comprimento de onda de excitação do laser e em que o espectro de emissão encontra-se em relação aos canais de fluorescência são cruciais. Com aquisições de dados,limiares pode ser imposta aumentando a resolução que de outra forma seriam perdidos para talvez o ruído de fundo, detritos ou agregados de células mortas. Sondas moleculares podem oferecer insights sobre a viabilidade das espécies sem cultivo, através de parâmetros individuais, tais como, potencial de membrana, conteúdo de DNA e atividade enzimática. No entanto, no prazo de amostras ambientais, pode haver muitos organismos de um tamanho e de fluorescência de células semelhantes. Além disso dentro de culturas uniagal, populações de células terá inevitavelmente um grau de estados fisiológicos 3, que podem afetar a absorção de sonda molecular. Uma das principais vantagens de FCM é a sua capacidade para distinguir e caracterizar estados fisiológicos ao nível das células individuais e em tempo real, o que é essencial quando se estuda a viabilidade microorganismos in situ, à medida que são frequentemente sujeitos a condições rápidas e dinâmicas. Apesar de seu uso freqüente, o conceito de viabilidade celular continua a ser difícil de definir. Geralmente aplicada à proliferação celular,viabilidade é muito marcado em uma abordagem baseada crescimento. Este pressuposto subjacente pode ficar aquém, pois as condições não pode servir para reproduzir células individuais, mas eles ainda podem ser tolerável. As células em um estado fisiológico nonproliferating que tenham apresentado uma quietude ou um G (0) fase do ciclo celular 27 não pode interagir com uma sonda molecular dar falsos negativos no ciclo de DNA ou metabólica sondas baseadas.
Usando células de laboratório cultivados ou recentemente isolados para otimizar sondas moleculares ajudará a refinação de dados utilizados em estudos ecológicos. As células utilizadas na optimização de culturas descontínuas são comummente tomados em fases estacionárias exponencial ou no início e assumiu-se a viabilidade mais elevada. No entanto, cuidado extra deve ser tomado quando se utiliza altas densidades celulares, aqueles em uma fase estacionária tarde ou micróbios que produzem matrizes extracelulares. Neste protocolo de controlo para a população de células mortas foram expostos a 60 ° C de calor durante 1 h,com a confirmação de danos e degradação da membrana pigmento visto através de microscopia (Figura 4) e FCM saídas de fluorescência (Figuras 2 e 3). Simulando as causas de morte celular natural é extremamente difícil como; ingestão por animais de pasto, lise viral, a morte celular programada ou a possibilidade de divisão assimétrica 24 não são sempre viável ou ser observado em condições de laboratório. Modos experimentais de moral são frequentemente questionada uma vez que não pode ser equivalente a tensões induzidas a partir do ambiente (por exemplo, o abate de calor) e que pode haver uma resposta heterogénea, pelo que determinados indivíduos são mortos e outras células não mostram nenhuma degradação celular observável ou morte 3 , 25. Para evitar tal paradoxo a definição operacional pelo qual os experimentos medidos devem ser claramente estabelecida de modo a não gerar confusão 6,23, facilitando a normalização entre os estudos.
Vários métodos alternativos Have foi utilizado para análise de viabilidade celular em culturas em conjunto com sondas moleculares. Microscopia de epifluorescência é uma técnica tradicional utilizada, embora a fotodegradação ou a introdução de sinais de artefatos a partir de células vizinhas pode dar uma sob ou sobre a estimativa de um estado fisiológico não se registrou com rapidez suficiente populações. Isso faz com que a otimização através de imagens muito difícil, com potencialmente baixa precisão. Genomic avaliação da viabilidade celular utilizando ambos os ADN e ARN, tais como métodos de amplificação; reacção em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase (RT-PCR) e amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) reversa, também têm sido utilizados. No entanto, a avaliação genômica serve apenas como um método indireto de validação viabilidade como a persistência de ácido nucleico depende fortemente das condições ambientais, com a correlação de viabilidade celular real potencialmente variando imensamente 28. Usando uma combinação de dispersão de luz e / ou de fluorescência através de fotos naturaispigmentos ynthetic (Figura 1) gating das populações pode: aumentar a resolução dos dados, identificar as respostas da população raras e reduzir falsos resultados positivos. FCM juntamente sondas moleculares destaca-se a partir das técnicas anteriores mencionados no teste fisiológico única célula por sua velocidade, precisão e gravação de vários parâmetros.
FCM é uma poderosa ferramenta analítica na microbiologia aquática e com a adição de sondas moleculares tem uma grande potencial em uma série de áreas, incluindo, unicelulares e análise comunidade para setores industriais (por exemplo., Monitorização abastecimento de água potável). Os avanços futuros podia ver FCM incorporar hibridização fluorescente in situ (FISH), que pode detectar e localizar seqüências genéticas específicas em células individuais dentro de amostras heterogêneas densas. O desenvolvimento da FCM e portabilidade sonda molecular para gravações in situ poderia fornecer dados vitais sobre as fontes de água para implementar primeiros sSTRATÉGIAS para a gestão dos recursos. Seguindo o protocolo desenvolvido aqui optimização, FCM e sondas moleculares podem potencialmente desempenhar um papel crucial no fornecimento de dados de valor sobre a fisiologia microbiana em ambientes aquáticos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer doutorando Dave Hartnell e da Universidade de Bournemouth para apoio e financiamento para a pesquisa e instalações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
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