Summary
Mikrobielle populationer indeholder væsentlig celle heterogenitet, som kan diktere den samlede adfærd. Molekylær sonde analyse gennem flowcytometri kan bestemme fysiologiske tilstande af celler, men dens anvendelse varierer mellem arter. Denne undersøgelse giver en protokol til nøjagtigt at bestemme celle dødelighed inden for en cyanobakterie befolkning, uden at undervurdere eller optagelse falske positive resultater.
Abstract
Mikrobielle subpopulationer i marken og laboratorieundersøgelser har vist sig at vise høj heterogenitet i morfologiske og fysiologiske parametre. Bestemmelse af tidstro tilstand af en mikrobiel celle går ud over levende eller døde kategorier, som mikroorganismer kan eksistere i en sovende tilstand, hvor celledeling og metaboliske aktiviteter er reduceret. På grund af behovet for detektion og kvantificering af mikrober, flowcytometri (FCM) med molekylære sonder giver en hurtig og præcis metode til at hjælpe med at bestemme den samlede befolkning levedygtighed. Ved at bruge SYTOX Green og SYTOX Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa at opdage membranintegritet, vi udvikler et overdrages metode til hurtig indikation af enkelt dødelighed celle. De molekylære prober anvendes inden dette tidsskrift, vil blive omtalt som grønne eller orange nukleinsyreprober henholdsvis (selv om der er andre produkter med lignende excitations- og emissions- bølgelængder, der har en tilsvarende former for action, vi specifikt henvises til i forgrunden nævnte sonder). Protokoller der anvender molekylære sonder varierer mellem arterne, adskiller hovedsagelig i koncentrations- og inkubationstider. Efter denne protokol er fastsat på M.aeruginosa den grønne nukleinsyreprobe blev optimeret ved koncentrationer på 0,5 uM efter 30 minutters inkubation, og den orange nukleinsyreprobe på 1 uM efter 10 min. I begge prober koncentrationer mindre end den angivne optimal ført til en under rapportering af celler med skader membran. Omvendt 5 pM koncentrationer og højere i begge sonder udviste en form for ikke-specifik farvning, hvorved 'live' celler produceret et mål fluorescens, hvilket fører til en over repræsentation af "ikke-levedygtige 'celletal. De positive kontroller (varme-dræbt) forudsat testbare døde biomasse, selv om det hensigtsmæssige i kontrol generation er fortsat genstand for debat. Ved at demonstrere en logisk sekvens af trin til optimering af de grønne og orange nukleinsyreprober vi demonstrate hvordan man skaber en protokol, som kan anvendes til at analysere cyanobakteriel fysiologiske tilstand effektivt.
Introduction
Cellen er et komplekst system, der konstant reagerer på miljøet ved at modificere fysiologiske parametre og ændre dets funktion. Populationsdynamik af isogene mikrobielle populationer både i naturen og laboratorium påvirkes af udviklingen af subpopulationer, der forekommer selv under forholdsvis konstante miljøforhold 1 - 3. Variabiliteten af naturlige mikrobielle samfund opstår på grund af den meget varierende natur miljøforhold. Disse tider stokastiske processer efterfølgende producerer subpopulationer, der er meget anderledes end gennemsnittet af befolkningen. De seneste oplysninger har vist, at disse fysiologiske delpopulationer reagerer forskelligt på miljøforhold og kan producere signal forbindelser eller inhibitorer, der dramatisk indflydelse og påvirke den samlede befolkning 3,4.
Etablering af en metode til at definere heterogenitet inden for en population er nøglen til unståelse økologi mikrober i forskellige miljøer og er afgørende, når man bygger viden om gener cyanobakterier, såsom giftige Microcystis, som påvirker tungt på menneskelig vandsikkerhed. arter såsom Anabaena vise morfologiske heterogenitet som reaktion på miljømæssige udsving, udvikle specialiserede celler som heterocysts og akinetes 2. I modsætning hertil Microcystis celler ikke vise indlysende morfologiske heterogenitet under en stress-respons. Forskelsbehandlingen mellem levedygtige og ikke-levedygtige celler er det vigtigste aspekt af fysiologisk differentiering og tillader en bedre forståelse af mikrobielle populationsdynamik. Er dog stadig svært og dårligt karakteriseret 1,5,6 den konceptuelle problem med bakteriel levedygtighed selv.
Flowcytometri (FCM) er en pålidelig og hurtig fremgangsmåde til analyse af enkelte celler. For at øge forståelsen af enkelt celle fysiologi gennem FCM, er blevet anvendt molekylære prober til at skelne et antal metaboliske og biokemiske processer 7. Dette har ført til øget viden om arter på et cellulært og befolkningsniveau og til gengæld hjalp vandressourceforvaltning 8,9. Men organismer forskellige med hensyn til molekylær sonde optagelse og udstrømning grund porerne og pumper i cellevæggene og membraner, som har ført til en række molekylær sonde design og implementering af protokol 6,10,11. Molekylære sonder til rådighed for kommercielle og forskningsformål leveres ofte med en generisk protokol, som kan være gældende for en meget anderledes celletype. Man skal være meget forsigtig med at overføre protokoller udviklet til en celle til en anden 6, er det derfor en væsentlig opgave at optimere molekylære prober effektivt før brug.
De grønne og orange nukleinsyreprober binder til både dobbelt- og enkeltstrengede nucleinsyrer med minimal BASEVALGcering og anvendes til at vurdere plasmamembranintegritet af celler. Den grønne nukleinsyreprobe har en markant forbedret cellemærkning fluorescenssignal i forhold til andre molekylære prober, såsom propidiumiodid-baserede forbindelser 12, som også kan virke som en indikator for cellelevedygtighed. Udtrykket "cellelevedygtighed" her ud fra, at DNA-nedbrydning sker efter tabet af plasmamembranintegritet. De nukleinsyreprober usymmetriske cyaninfarvestoffer med tre positive ladninger og kan ikke trænge ind i celler med intakte membraner under karakteriseret koncentrationer, både eukaryote og prokaryote 11,13 14,15 organismer. Bindingen af en nukleinsyreprobe til nukleinsyrer kan resultere i op til en> 500 gange forøgelse af fluorescens-emissioner fra endogene signaler i celler, der har deres membran integritet kompromitteres. Selv molekylære prober såsom den grønne nukleinsyreprobe kan være en god indikator for enkelt celle fysiologi, der er behov to optimere hver probe med den tilsigtede målorganismen, som inkubationstider har varieret fra 7 min - 30 min og koncentrationsintervaller fra 0,1 pM - 0,5 pM i Microcystis eksperimenter alene 15-19.
Her præsenterer vi en protokol til at optimere cytometriske analyser af grøn og de relativt nye appelsin nukleinsyreprober (som til dato ikke er blevet testet på de cyanobakterielle arter M.aeruginosa). Følgende udviklede metode kan derefter overføres til andre arter og anvendes som platform til optimering protokoller i andre molekylære prober og derved øge forståelsen af mikrober og deres økologiske adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af Molekylær Probe og Flow Cytometer
- Fortynd stamopløsninger af nukleinsyreprober, der leveres som en 5 mM opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) til portioner af passende koncentrationer i ultrarent filtreret H 2 O.
- Opbevar nukleinsyreprober i mørke omgivelser mellem -5 ° C og - 25 ° C indtil anvendelse.
- Tænd flowcytometeret og belastning softwarepakke (se tabel Materialer / Udstyr til FCM specifikationer).
- Placer en tom hæmolyse rør (12 x 75 mm) på prøven strømindkoblingsanordningen (SIP), klik unclog og derefter skylle tilbage for at starte FCM renseprocessen.
BEMÆRK: Nogle eksempler etaper for SIP kan rumme flere typer af rør, herunder mikrocentrifugerør. Den molekylære probe fortyndingsmiddel og kondomvæske anvendes i FCM-apparatet er fra en analytisk kvalitet "type 1" 0,22 um membran filtreret kilde. - Placereen frisk hæmolyse rør med 2 ml ultrarent filtreret H2O på SIP, sætte en tidsfrist for 10 - 15 min og en fluidisk hastighed til hurtig (eller en flowhastighed på> 66 ul / min).
- Vælg en ny data celle, sat på relevante tærskler for fluorescens og lette scatter-kanaler for at reducere baggrundsstøj og klik på 'køre'.
- Hvis de samlede hændelser per sekund er ikke under fabrikanternes anbefaling, derefter køre en 2 ml prøve af dekontaminering løsning for 2 minutter på hurtigt og derefter gentage trin 1.4 & 1.5.
BEMÆRK: Tjek venligst producentens anbefalinger til FCM opstart rengøring protokoller, da de kan variere mellem modeller. Testning for specifikke tærskelværdier skal også være i overensstemmelse med FCM modellen som noget udstyr giver brugeren mulighed for at anvende spændinger gevinster til fotomultiplikatorrørene (PTM'er) forbedring eller faldende det elektriske signal optaget fra de optiske detektorer. FCM model, der anvendes i denne erfaling har fast spænding PMT'er og brugte en tærskel på 80.000 frem lysspredning (FSC-H) for at udelukke partikler mindre end 2,0 um og elektronisk støj.
2. Udarbejdelse af Cultures og Initial celletal
- Autoklave 98 ml ultrarent filtreret H 2 O og 2 ml alger medier (x50 koncentration) i et 250 ml bægerglas i 20 min ved 120 ° C.
- Fra en indledende monokultur af M.aeruginosa (PCC 7806) i en høj stabil tilstand tæthed sted 2 ml af prøven i et rør under SIP. Disaggregere enhver kolonidannelse ved hvirvelblanding eller lydbehandling 20 og bekræft jævnt spredte celler gennem lysmikroskopi.
BEMÆRK: Overdreven udsættelse for ultralydsbølger kan føre til cellelyse og bør anvendes med forsigtighed. Da lydbehandling kan kollapse gas vesikler (som findes i arter som M.aeruginosa) udgange såsom side lysspredning (SSC-H) intensitet kan blive mere selvnsitive. - Inden for FCM-softwaren, skal du vælge et histogram plot til at registrere data fra fremad lysspredning (FSC-H) og konfigurere plot specifikationer ved at klikke på "log" for at se i en log skala på aksen.
- I en separat udgang, skal du vælge en anden histogram (log aksen) for at optage naturlige fluorescens såsom tilbehøret fotosyntetiske pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), der findes i M.aeruginosa.
- Brug en lyskilde, der kan excitere phycocyanin og en detektor, som kan foretage emissionerne fra den resulterende fluorescens.
BEMÆRK: Fotosyntetisk pigment, såsom klorofyl kan exciteres med almindeligt anvendte 488 nm blå laser, mens phycocyanin exciteres over 600 nm og vil kun blive detekteret med en rød lyskilde 21. Check med flowcytometre producenten for excitation lyskilder og spektre af emission detektorer, her både en 488 nm og en 640 nm laser blev brugt sammen meden 675 ± 12,5 nm optisk filter. - Til optagelse af den højeste opløsning vælge indstillinger nærmest kernen størrelse målorganismen (10 um) og en forholdsvis langsom strømningshastighed (14 ul / min).
BEMÆRK: de bedste prøver opløsning skal køres efter fremstiller anbefaling af hændelser per sekund. - Før erhverve data bruger en tærskel til gate ud lysspredning og / eller fluorescens signaler, der er forårsaget af elektronisk baggrundsstøj eller celleprøve vragrester.
- Vælg en ny data celle, skal du oprette en massefylde plot med FSC-H og SSC-H-parametre på en logaritmisk skala, og klik på Kør.
- Hvis prøvens densitet medfører en overdreven hændelsesfrekvens, kan tages fortyndingstrin at øge nøjagtighed og præcision.
- På tætheden plot anvende software porte fra den tidligere histogram at udelukke lavt niveau scatter signaler, produceret af baggrundsstøj eller snavs (FSC <320.000). Omvendt gate højere relative fluorescensphycocyanin signaler fra celler og kun omfatter disse hændelser (FL4, 56.000 - 1.950.000).
- Brug antallet af celler, der er optaget i låge områder og dividere det med den samlede mængde prøve, som har passeret gennem FCM, at finde ud af, hvor mange celler pr ml.
BEMÆRK: FCM-model anvendes her har en mikroprocessorstyret peristaltisk pumpe system, der giver prøvevolumen, der skal fastlægges. Andre FCM udstyr kan kræve en kalibreret perle suspension eller en beregning af H 2 O vægt / volumen forskelle for at kontrollere den samlede prøvevolumen. - Tilsæt nødvendige mængde af celler til den friskfremstillede medier med henblik på at starte en batch vækstcyklus (250.000 celler / ml) af M.aeruginosa.
BEMÆRK: Arter vil variere i vækstrater, afhængigt af deres miljø parametre i situ og næringsstof tilgængelighed, så en batch cyklus bør være præ-indspillet til at bestemme livets cyklus faser.
3. Optimization for Molekylær Probe Cell Optagelse
- Høst halvdelen af M.aeruginosa kultur forberedt i trin 2 fra en eksponentiel fase og bruge som en 'live' kontrol.
BEMÆRK: Prøver fortyndet fra en høj densitet kultur lige til en eksponentiel fase kan påvirke optimering resultater gennem døde omsætning celle, sammenlignet med kulturer podet fra en indledende lag / induktionsfasen. - Forbered den anden halvdel som et "dødt" kontrol ved hjælp af fremgangsmåder, såsom 70% ethanol, opvarmning af prøver ved 60 ° C i 1 time, paraformaldehyd eller 4% formaldehyd i 30 minutter 6,11,22. Check variationer i prøver mikromiljø (f.eks., Ph).
BEMÆRK: positive, varme-dræbt, 'døde' kontrol i M.aeruginosa adskiller sig fra et "live" prøven gennem sit fald i phycocyanin signaler. Fremkalde dødelighed ved andre metoder må ikke forårsage den samme effekt og vil VaRå i arter. - Opsætning blandede prøver ved hjælp af forskellige forhold mellem 'live' og 'døde' prøver (f.eks 0%, 25%, 50%, 100%).
- Opdele kolonidannelse ved hvirvelblanding eller lydbehandling og pH kontrolleres.
- Vælg en 488 nm laser sammen med detektorer, der kan optage fluorescens fra grøn (FL1, 530 ± 15 nm) og orange (FL2, 585 ± 20 nm) nukleinsyreprober og 640 nm laser til at optage phycocyanin signaler gennem sin respektive detektor.
BEMÆRK: Når de er bundet til DNA, den grønne nukleinsyreprobe har en omtrentlig fluorescens excitationsbølgelængde på 504 nm og emission maxima på 523 nm, medens den orange nukleinsyreprobe har en excitationsbølgelængde på 547 nm og emission maxima på 570 nm. En 488 nm argon-ion solid state laser kan anvendes til at excitere begge molekylære prober vil imidlertid en grøn laser (op til 547 nm) producere en højere orange fluorescens. - Som udgangspunkt, indføremolekylær sonde med producenterne anbefalede koncentration til 50% 'live' og 50% 'døde' kultur og inkuberes i mørke.
- Vælg en ny data celle, prøven sted under SIP med tærskler og udløsere, der vil reducere baggrundsstøj (FSC-H 80.000).
- Opret en tæthed plot med FSC-H og SSC-H-parametre, og tre histogrammer. Et histogram ved hjælp af respektive molekylære probe optisk detektor kanal (FL1 eller 2), til en påvisning af phycocyanin emissioner (FL4-H) og den anden FSC-H, alle på en logaritmisk skala.
- Inkubér prøver af M.aeruginosa med nucleinsyreprober i mørket i op til 60 minutter, der optages i separate dataceller på en række tidspunkter (1, 5, 10, 15, 30 og 60 min).
BEMÆRK: Når du justerer parametre som pH-kontrol med fremstiller for potentielle reaktioner fra visse kemikalier (for den testede nukleinsyre sonder en buffer kan ikke indeholde fosfater eller høje niveauer af monovalente eller divaudlånt kationer, som binding med DNA vil blive reduceret). - Påfør en software port til kun indeholde FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) for målorganismer cellestørrelse, ind i den respektive fluorescens sonden kanal histogram.
BEMÆRK: Koncentrationerne anvendt i denne protokol var 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 og 100 uM, som kan ændres ved enten at øge eller mindske mængden af M.aeruginosa prøve eller indledende stamopløsning af nukleinsyre sonder. - I fluorescens sonden kanal, anvende en anden inklusiv software porten til det højeste bjerg i histogrammet (grøn FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30.000 - 165.000) og efterfølgende gate at positiv sonde fluorescens i tætheden plot.
- Run trin 3.1 - 3.11 med 100% "levende", 100% "døde" og alle blandede kulturprøver, tilpasning af molekylære probekoncentrationer (f.eks x 0,1 x 10 til) og / eller temperatur og pH niveauer, hvis det er nødvendigt. <li> Sammenlign antallet af positive molekylær probe fluorescenssignaler til den oprindelige celledensitet på "døde" celler (taget fra en halv total FSC-H eller en 100% 'dead' kultur) for at finde den samlede procentdel af cellerne farvet med nukleinsyren prober.
- Gør dette for hver tidsperiode inden for hver koncentration at finde den optimale protokol for den højeste procentdel af celle nukleinsyre sonde optagelse uden at producere ikke-specifik farvning (brug midlerne i en One-Way ANOVA eller Kruskal-Wallis test, hvis dataene er ikke-parametrisk).
4. Molekylær Probe Fluorescens Diskrimination
- Til prøvning af fluorescens interferens / overlapning fra iboende eller ikke-specifik cellefarvning vælge de 50% 'live' og 50% 'døde' kultur data blandet og tage off alle porte.
- Påfør en software port til kun indeholde FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) for målorganismer cellestørrelse, ind i phycocyaninkanal histogram.
- Gate den højeste phycocyanin peak og etiket som 'live', med tilføjelse af den laveste top mærket som "døde".
- Udfør en yderligere port skridt til den respektive molekylære sonde fluorescens histogram kanal, ved hjælp af en ad gangen, den 'live' og derefter 'døde' phycocyanin (FL4) signaler, optagelse både gennemsnitlige bølgelængder.
BEMÆRK: tilstand for at fremkalde dødelighed i dette forsøg blev gjort ved varmebehandling, der i henhold til denne protokol klart falder phycocyanin signaler. Andre metoder til at producere populationer af 'døde' celler kan give forskellige udgange i de tilkøbte kørsler. - Forholdet de gennemsnitlige bølgelængder af den positive molekylære sonde fluorescens ("døde"), og den iboende / ikke-specifikt signal ('live') for at bestemme protokol følsomhed.
BEMÆRK: For at forbedre fluorescens diskrimination af 'live' og 'døde' popultioner, øge carbonkilde til aktiv plet optag i næringsstoffer udtømte celler eller ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) for at forbedre cellevæggen permeabilitet og deraf fluorescenssignaler 6. Begrænset kompensation i nogle FCM modeller for spektral overlapning kan udføres af bruger-manipuleret parvis korrektion under erhvervelse prøve (PMT spændingsændringer) eller fra post-analytisk specialiseret software. - Vælg den optimerede protokol, hvor det højeste beløb af 'døde' celler er blevet farvet uden forekomst uspecifik farvning. Hvis en række test har lignende resultater accepterer protokol med den laveste koncentration og inkubationstid, sammen med god fluorescenssignal diskrimination. Følg fremstiller instruktioner til cytometret nedlukning procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frontal lysspredning (FSC) og side lysspredning (SSC) udgange fra en M.aeruginosa batch-kultur i eksponentiel fase indeholder oplysninger om cellestørrelse (diameter) og intern granularitet (figur 1A). FSC kan skelne celler, som er for store og / eller små til at være M.aeruginosa. Denne diskrimination eller gating kan gøres ved raffinering data mellem visse punkter i et FSC output (figur 1C). Phycocyanin, en stor forfatning M.aeruginosa fotosyntetiske apparat frembringer et stærkt signal, når interrogeres med en rød lyskilde (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), som kan anvendes til yderligere gate populationer, svarende til den, udført i FSC gating men med fluorescens (figur 1D). Fra FSC og fluorescenssignaler kan data gated fra den oprindelige udgang (figur 1A) til specifikke data om M.aeruginosa for fnelle celletal (figur 1b).
Autofluorescens per celle i cyanobakterier populationer adskiller som en funktion af fysiologisk tilstand. Her celler blev høstet fra en eksponentiel fase kultur viser relativt høje langt rød fluorescens for en "live" kontrol befolkning og den "døde" kontrol blev udsat for 60 ° C varme i 1 time. Når 'lever' højere pigmenterede og "døde" lavere pigmenterede kontroller blandes den faldende skift i autofluorescens er klart (figur 2A & B). Den "død" celle fluorescens og FSC parametre kan anvendes til at skelne de totale celler, der har optaget den molekylære probe. I membran kompromitteret eller "døde" celler nucleinsyreproberne vil producere et yderligere signal enten på; FL1 kanal (530 ± 15 nm) for den grønne nukleinsyreprobe eller FL2 kanal (585 ± 20 nm) for den orange nukleinsyre acid sonde (figur 3A & B), sammenlignet med den indfødte 'live' fluorescenssignal. Bekræftelse af begge nukleinsyreprober i celler med skader membraner kan ses gennem epifluorescensmikroskopi (figur 4A & D).
Den samlede procentdel af celler, der var blevet farvet med den grønne nucleinsyreprobe blev opnået fra blandede prøver, som var præ-gated til kun at omfatte M.aeruginosa størrelse celler fra en FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000). I en 50:50 "live: dead 'prøve, grøn fluorescens celler gated fra det højeste bjerg i en FL1 (530 ± 15 nm) histogram blev sammenlignet med oprindelige tæthed i" døde "cellepopulation (enten ved at halvere den samlede FSC- H eller kører en separat celletal på kun de 100% 'døde' celleprøver). Over 100% indikerer, at ikke-specifik farvning forekommer. Den gennemsnitlige procentdel af celler, der var taget op grønne Nucleic-proben strakte sig fra; 15 ± 0,3% i 0,05 uM efter 1 min til 177,1 ± 5,1% i 100 uM løbet af 10 minutter af inkubation (tabel 1). Koncentrationer over 1 uM (ikke inklusive) viste uspecifik farvning (dvs.., 'Live' celler, der begyndte at tage den molekylære sonden). En to-vejs ANOVA mellem de koncentrationer, der ikke udviser ikke-specifik farvning (0,05 - 1 uM) og påviste en samlet signifikant forskel i samspillet mellem koncentrationen af grønne nukleinsyreprobe og inkubationstid i M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Der var en hovedvirkning tværs koncentrationerne af grønne nukleinsyreprobe anvendes F (3, 40) = 836,92, p <0,001 og inkubationstider F (4,40) = 347,98, p <0,001. En post-hoc Tukey testen viste en signifikant forskel mellem alle koncentrationer undtagen 0,5 og 1 uM (p <0,001) og ensignifikant forskel mellem alle inkubationstider på 1 - 60 min (p <0,001). Men en post hoc Tukey Test fra en envejs-ANOVA viste den gennemsnitlige optagelse af grønne nukleinsyreprobe ikke variere mellem 30 og 60 minutter for 0,05 pm (p> 0,05) og 1 uM (p> 0,05) (figur 5A). Den gennemsnitlige andel af 'levende' og 'døde' relative fluorescens signaler i FL1 til forskelsbehandling af befolkninger (målt via FL4) varierede i den grønne nukleinsyreproben fra det højeste i 0,1 uM efter 60 min af 714 ± 14,8 (RFU) til laveste på 0,8 ± 0,0 (RFU) i 100 uM efter 30 minutter (tabel 2). Sammenligning af forhold mellem relativ fluorescens enheder (RFU) til intensitet diskrimination i "live" og "døde" FL1 signalerer en Two Way ANOVA rapporter en samlet signifikant forskel i samspillet mellem koncentrationer og inkubationstider F p <0,001 med den grønne nukleinsyreprobe. Der var også en signifikant forskel i det primære effekt på tværs af alle koncentrationer F (7,80) = 475,41, p <0,001 og inkubationstider F (4,80) = 78,28, p <0,001. Forholdene diskriminering af fluorescenssignaler mellem 'live' og varmedræbte "døde" celler steg med tiden mellem koncentrationer på 0,05 uM og 1 uM, men faldt mellem 5 um og 100 um (figur 5B).
Procentdelen af celler, som blev farvet med den orange nukleinsyreprobe oplevede en gennemsnitlig lav procentdel af 4 ± 0,3%, i en koncentration på 0,05 uM efter 1 min, stigende til 166 ± 3,5% i 100 uM efter 10 minutters inkubation (tabel 3). Igen koncentrationer over 1 uM præsenterede også ikke-specifik farvning af levende celler. En to-vejs ANOVA mellem kølinglem de koncentrationer, der ikke viste nogen ikke-specifik farvning (0,05 - 1 uM) rapporterede en samlet signifikant forskel i samspillet mellem alle koncentrationer af den orange nukleinsyreprobe og inkubationstider i M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Der var en statistisk signifikant hovedvirkning tværs koncentrationer F (3, 40) = 6919,67, p <0,001 og inkubationstider F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Men en Post Hoc Tukey testen gennem en One Way ANOVA på kun 1 uM angivet at inkuberingstider mellem 10, 30 og 60 min havde ingen statistisk forskel i optagelsen af appelsin nukleinsyreprobe (alle p> 0,05) (Figur 6A). Fluorescens diskrimination signalet mellem »levende« og »døde« farvede befolkninger i FL2 varierede i orange nucleinsyresonde fra det laveste på 0,3 ± 0,0 (RFU) efter 60 min i 50 uM og 30 mi i 100 um til den højeste af 158,3 ± 0,4 (RFU) efter 60 minutter ved en koncentration på 0,1 uM (tabel 4). En to Way ANOVA rapporterede en samlet statistisk signifikans i samspillet mellem koncentrationer og inkubationstid F (28, 80) = 28,12, p <0,001. De vigtigste virkninger af koncentration F (7, 80) = 607,9, p <0,001 og inkubationstider F (4, 80) = 31,24, p <0,001 viste sig også at være alt væsentligt anderledes. Diskrimination Fluorescens mellem signalerne fra "levende" og varme dræbt 'døde' celler i FL2 steg med tiden mellem koncentrationer på 0,05 uM og 0,5 uM men faldt mellem 1 uM og 100 pM (figur 6b). Derfor den optimale koncentration for den grønne nukleinsyreprobe er 0,5 uM med en inkubationstid på 30 minutter og til den orange nukleinsyreprobe den optimale koncentration er 1 uM INCUpyres i 10 minutter.
Figur 1. FCM udgange af M.aeruginosa Gennem FSC, SSC & Far rød fluorescens (675 ± 12,5 nm). (A) FSC og SSC af M.aeruginosa PCC 7806. (B) Den samme output som figur 1A med gated FSC og langt rød fluorescens (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC repræsenterer størrelsen af cellen. Den røde foret pil angiver det område, der er gated for at reducere baggrundsstøj eller andre størrelse partikler. (D) Høje phycocyanin signaler fremstillet af M.aeruginosa i en eksponentiel fase batch kultur med røde pile gated områder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. phycocyanin Signal Shift i M.aeruginosa Når varmebehandlet. Ændring af M.aeruginosa autofluorescens i "levende" og "døde" celler, der anvendes til at validere nucleinsyresonde optagelse. (A) Far røde signaler flytte fra et højere pigmenteret 'live' population (grøn) til en lavere pigmenteret "døde" population (rød). (B) FSC og langt rød fluorescens kombineret udgange med en forskydning af næsten to størrelsesordener. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Orange Fluorescens Shift i M.aeruginosa Fra 'live' Unstained til 'Dead' farvede celler. M.aeruginosa 'levende' og 'døde' blandet kontroller inkuberet med orange nukleinsyreprobe i en koncentration på 1,0 um i 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) kanal rapporterer en øget skift fra et "live" ufarvet befolkning (grøn) til en "død" farvede befolkning (orange) gennem to størrelsesordener. (B) A 'døde' farvede befolkning (orange), der er faldet langt røde signaler men steg FL2 signaler fra en 'live' befolkning (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. epifluorescensmikroskopi for M.aeruginosa med Molecular Probes. Microscope billeder fra en M.aeruginosa 50:50 levende: dead population inkuberet med nukleinsyreprober, alle billeder X1000 forstørrelse. (A) En epifluorescens billede af grønne nukleinsyreprobe optages af "døde" celler. 'Levende' celler bliver røde på grund af autofluorescens af klorofyl. (B) lys mikroskop billede af figur 4A viser 'live' grønne pigmenterede celler og mindre pigmenterede 'døde' celler, med skader membran. (C) Live: dead 50:50 blandet M.aeruginosa befolkning. (D) Orange nukleinsyreprobe inkubation fra figur 4C, med 'døde' celler afslører en orange farve gennem epifluorescens mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Andel af celler Mærkede med grøn nucleinsyreproben og forholdet mellem "Live 'til' Dead 'FL1 Signaler. Mean procentdel af M.aeruginosa celler farvet med den grønne nukleinsyreproben i forskellige koncentrations- og inkubationstider. (A) 0,1 uM farvede ikke nok celler, 5 pM viser uspecifik farvning og koncentrationer på 0,5 uM og 1 uM farvet næsten 100% af befolkningen, der viser optimale inkubationstider efter 30 minutter (a). (B) 'Levende: dead' forhold mellem FL1 signaler fra en eksponentiel vækstfase og varmebehandlede prøver. Koncentrationer på 0,5 uM og 1 uM viser god diskrimination af FL1 signaler stigende med inkubationstiden (RFU nøgletal to størrelsesordener). Koncentrationer på 10 uM og over (ikke repræsenteret i grafen) viser dårlig diskrimination fluorescens signal og overlapning af 'live' end 'døde' befolkninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Andel af celler Mærkede med Orange nucleinsyreproben og forholdet mellem "Live 'til' Dead" Signaler. Resultater fra koncentrations- og inkubationstid ændringer i populationer af M.aeruginosa. (A) Gennemsnitlig procentdel af celler, der var registreret en orange fluorescens signal i FL2 med koncentrationer af; 0,1 uM og 0,5 uM ikke farvning nok celler, 5 uM farvning levende celler (ikke-specifik farvning), sammen med den optimale koncentration på 1 uM efter 10 min (a). (B) Den orange nukleinsyreprobe "live: døde 'nøgletal i FL2 viser god diskrimination og ingen over lapningaf fluorescens signaler i koncentrationer på 1 uM eller mindre og fattige overlappende FL2 signaler (nøgletal lavere end en størrelsesorden) med koncentrationer over 1 uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 15,0 | 0,3 | 22.1 | 0,9 | 28.1 | 1.9 | 41,0 | 1.9 | 50.2 | 2.1 |
| 0.1 | 23.5 | 1.5 | 44,1 | 1.8 | 54,7 | 1.6 | 70.5 | 0,8 | 78.3 | 1,0 |
| 0,5 | 49,0 | 3.4 | 74.8 | 4.8 | 87,6 | 3.6 | 97,3 | 0,8 | 98,8 | 0.1 |
| 1 | 58,5 | 1.6 | 77,4 | 0,7 | 88.4 | 0,4 | 98,0 | 0.1 | 99,2 | 0.1 |
| 5 | 91.4 | 0,9 | 98,7 | 0,5 | 99,3 | 0,7 | 102.2 | 1.3 | 106,3 | 0,8 |
| 10 | 96.1 | 0,5 | 97,7 | 0.1 | 97,9 | 0.1 | 102,0 | 0,5 | 113,4 | 5.1 |
| 50 | 94.6 | 0.6 | 99,5 | 2.3 | 112,7 | 3.8 | 148,7 | 2.4 | 153,9 | 13,0 |
| 100 | 165,8 | 3.1 | 174,4 | 5.7 | 177,1 | 5.1 | 161,5 | 2.5 | 159,7 | 6.6 |
Tabel 1. Procent Optagelse af Green nucleinsyreproben i celler. Tabel, der viser data fra optimering eksperiment ved hjælp af grønne nukleinsyreprobe og en "live" og 50% "død" (varmebehandlet) befolkning prøve 50%. De gennemsnitlige procentdele af celler, der har optagetgrøn nukleinsyreprobe fluorescens (FL1) er blevet beregnet over det samlede antal "døde" celler opnået fra en FSC-H tæller. Værdier over 100% viser ikke-specifik farvning (SE understreget).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 92,9 | 5.4 | 170,0 | 10.9 | 237,2 | 14.9 | 385,5 | 15,0 | 481,9 | 17.7 |
| 0.1 | 178,3 | 18.1 | 343,0 | 19.5 | 437,0 | 20,6 | 619,1 | 12.1 | 714,1 | 14.8 |
| 0,5 | 202,5 | 5.9 | 308,3 | 13.1 | 365,8 | 33.5 | 426,8 | 67,2 | 480,4 | 73.2 |
| 1 | 205.8 | 12.1 | 225,9 | 13.7 | 237,3 | 15.6 | 241,5 | 5.8 | 263,1 | 8.1 |
| 5 | 69.9 | 2.6 | 53,0 | 0.6 | 40,2 | 1.7 | 27.1 | 3.7 | 21.1 | 3.4 |
| 10 | 44,3 | 2.9 | 28,7 | 5.6 | 23.6 | 4.9 | 11.6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0.1 | 3.9 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.2 | 0.1 | 1.1 | 0.1 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0,8 | 0.1 | 0,8 | 0.1 |
Tabel 2. Andel af grøn fluorescens Signaler i 'live' og 'Dead' Stained M.aeruginosa Cells. Diskrimination FL1 signalet mellem celler farvet med den grønne nukleinsyreproben og ikke-specifikke iboende optagelser. Prøven indeholdt en 50% "live" og 50% "død" (varmebehandlet) M.aeruginosaaf samme population målt over alle koncentrations- og inkubationstider (SE understreget).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 4.0 | 0,3 | 14.9 | 0,2 | 23.5 | 0,8 | 39.1 | 2.4 | 37,6 | 1.5 |
| 0.1 | 14.6 | 0,4 | 42.2 | 0,5 | 55,0 | 1.1 | 72.8 | 0,9 | 80,2 | 0.1 |
| 0,5 | 54,5 | 0,4 | 79,8 | 1.2 | 86.4 | 0,4 | 91,2 | 0.1 | 93,2 | 0.1 |
| 1 | 92.0 | 0,8 | 94,8 | 0.1 | 96.9 | 0.6 | 98,4 | 0.6 | 98,4 | 0,3 |
| 5 | 91.4 | 1.5 | 93,5 | 1.8 | 102,9 | 5.4 | 118,9 | 0.1 | 124,8 | 0.1 |
| 10 | 95,9 | 1,0 | 102,4 | 1.8 | 132,9 | 6,0 | 148,9 | 4.8 | 132,8 | 5.1 |
| 50 | 107,5 | 3.7 130,6 | 16.6 | 145,2 | 0,2 | 135,4 | 16.2 | 114,6 | 6.6 | |
| 100 | 97,1 | 0.1 | 130,7 | 7.8 | 166,1 | 3,5 | 144,7 | 6.8 | 115,1 | 6.2 |
Tabel 3. Andel Optagelse af Orange nucleinsyreproben i celler. Bord med optimering af data ved hjælp den orange nukleinsyreprobe og en 50% "live" og 50% "død" (varmebehandlet) befolkning prøve. Den gennemsnitlige procentdel af celler, der har optaget Orange nukleinsyreprobe fluorescens (FL2) er blevet beregnet over det samlede antal "døde" celler fra en FSC-H count (SE understreget).
| Konc. | Inkubationstid (min) | |||||||||
| (uM) | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 20.4 | 0,9 | 41.3 | 1.3 | 56,1 | 2.4 | 80,4 | 3.6 | 83.3 | 1.8 |
| 0.1 | 31.2 | 1.4 | 76,1 | 2.4 | 100,9 | 3.1 | 146,2 | 0.6 | 158,3 | 0,4 |
| 0,5 | 80,6 | 0,4 | 124,9 | 2.4 | 137,3 | 1.1 | 138,7 </ td> | 2.1 | 132,8 | 3.9 |
| 1 | 89,7 | 16,0 | 80,9 | 16.9 | 69.1 | 10.7 | 43.0 | 5.7 | 35.9 | 6.5 |
| 5 | 10.4 | 0.6 | 7.5 | 0.1 | 5.0 | 1,0 | 2.7 | 0,5 | 1.5 | 0.1 |
| 10 | 7,0 | 0.1 | 3.6 | 0,3 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0.1 | 1.2 | 0.1 |
| 50 | 2.2 | 0,4 | 1.6 | 0,3 | 1.3 | 0,0 | 0.6 | 0.1 | 0,3 | 0,0 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0,7 | 0.1 | 0,3 | 0,0 | 0,5 | 0,2 |
Tabel 4. Ratio Orange nukleinsyre i "live" og "Dead 'Stained M.aeruginosa Cells. Diskrimination FL2 signalet mellem celler farvet fra den orange nukleinsyreproben (FL2) og ikke-specifikke iboende optagelser. Prøven indeholdt en 50% "live" og 50% "død" (varmebehandlet) M.aeruginosa af samme population målt over alle koncentrations- og inkubationstider (SE understreget).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De øgede antal publikationer gennem molekylære sonder viser, at pålidelige og informative data kan fås 5,6,8 - 15,19,22,23. Som i endnu er der ingen perfekte pletten for celle levedygtighed, der kan være effektiv på tværs af alle arter med samme koncentration og inkubationstid 6,10. Selv den samme type probe med ændrede fluorescens-emissioner viser et behov for at etablere den korrekte koncentration og inkubationstid (tabel 1 og 3). Som det ses ved brug af denne protokol, den optimale koncentration og inkubationstid efter orange nucleinsyresonde er 10 min ved 1 uM, mens den grønne nukleinsyreproben kun skulle halvdelen af koncentrationen, men tager tre gange så lang (figur 5 & 6). Begge disse celle-impermeabel cyanin monomerer med koncentrationer over 1,0 uM begyndte at producere et overlap i emissionerne spektre med ikke-membran sårede celler. Denne overlapning af signals dokumenterer, at ikke-specifik farvning forekommer, hvor 'live' celler optage den molekylære sonde. Den resulterende løbet fluorescens fra uspecifik farvning genererede falske positiver, hvilket understreger behovet for protokollen udvikling nøje fastlagt for hver molekylær probe og mål organisme. De mest kritiske trin i optimering af en molekylær sonde ville være: 1) at forstå, hvordan den molekylære sonde interagerer med FCM instrument; 2) at vedtage passende levende og døde kontrol; 3) udvikling viden om gating parametre fra FCM udgange og 4) modificere protokollen gennem forståelse af in-situ miljøer.
Lyskilden, optiske filtre, mulighed for at ændre PMT spænding og detektorer inden flowcytometre varierer fra producent til producent, så en bevidsthed om, hvad excitationsbølgelængde fra laseren, og hvor emissionsspektrene ligger i forhold til fluorescens-kanaler er afgørende. Med opkøb af data,tærskler kan pålægges stigende resolution, som ellers ville være tabt for måske baggrundsstøj, vragrester eller døde celle aggregater. Molekylære prober kan give indsigt i levedygtigheden af arter uden dyrkning, gennem enkelte parametre, såsom membranpotentiale, DNA-indhold og enzymaktivitet. Men inden miljøprøver der kan være mange organismer af samme cellestørrelse og fluorescens. Ud inden uniagal kulturer, vil populationer af celler uundgåeligt have en grad af fysiologiske tilstande 3, der kan påvirke molekylær sonde optagelse. En af de vigtigste fordele ved FCM er dens evne til at skelne og karakterisere fysiologiske tilstande på det individuelle celleniveau i realtid, hvilket er afgørende, når man studerer mikroorganismer levedygtighed in situ, da de ofte er udsat for hurtige og dynamiske forhold. På trods af sin hyppige brug, begrebet cellelevedygtighed fortsat vanskelig at definere. Normalt anvendes på cellulær proliferation,levedygtighed er i høj grad scoret på en vækst baseret tilgang. Denne antagelse underbygning kan falde kort, da betingelserne ikke kan passe enkelte celler til at reproducere, men de kan stadig være tåleligt. Celler i en nonproliferating fysiologisk tilstand, som er trådt en ubevægelighed eller en G (0) cellecyklus fase 27 kan ikke interagere med en molekylær sonde giver falsk negative i DNA cyklus eller metabolisk baserede sonder.
Brug laboratorium dyrket eller frisk isolerede celler til at optimere molekylære prober vil støtte raffinering af data, der anvendes i økologiske undersøgelser. Celler, der anvendes i optimering fra batchkulturer er almindeligt taget på eksponentielle eller tidlige stationære faser og antages at have den højeste levedygtighed. Dog skal ekstra forsigtighed udvises forsigtighed ved brug af høj celletætheder, der i en sen stationær fase eller mikrober producerer ekstracellulære matricer. I denne protokol for styring af døde population af celler blev udsat for 60 ° C varme i 1 time,med en bekræftelse af skader membran og pigment nedbrydning set gennem mikroskopi (figur 4) og FCM fluorescens output (figur 2 & 3). Simulering årsagerne til naturlige celledød er yderst vanskeligt som; indtagelse af grazers, viral lysis, programmeret celledød eller muligheden for asymmetriske division 24 er ikke altid muligt eller observeres under laboratorieforhold. Eksperimentelle former for moral er ofte spørgsmålstegn, da de ikke kan svare til spændinger induceret fra miljøet (f.eks, varme drab) og der kan være en heterogen reaktion, hvorved visse personer bliver dræbt og andre celler viser ingen observerbar celle nedbrydning eller død 3 , 25. For at undgå en sådan et paradoks den operationelle definition, som forsøgene målte skal være klart fastlagt for ikke at skabe forvirring 6,23, lempelse normalisering mellem studier.
Forskellige alternative metoder have været ansat til analyse celle levedygtighed i kulturer i forbindelse med molekylære prober. Epifluorescens mikroskopi er en traditionel teknik, der anvendes, selv fotoblegning eller indførelse af artefakt signaler fra nærliggende celler kan give en under eller over skøn over en populationer fysiologiske tilstand, hvis ikke registreret hurtigt nok. Dette gør optimering gennem billeddannelse meget vanskeligt, med potentielt lav nøjagtighed. Genomisk vurdering af cellulær levedygtighed ved hjælp af både DNA- og RNA-amplifikationsmetoder såsom; polymerasekædereaktion (PCR), revers transkriptase (RT-PCR) og nukleinsyresekvens-baseret amplifikation (NASBA) er også blevet anvendt. Men genomisk vurdering tjener kun som en indirekte metode til levedygtighed validering som den vedvarende nukleinsyre stærkt afhængig af miljøforhold, med korrelationen af faktiske cellelevedygtighed potentielt varierende uhyre 28. Ved at anvende en kombination af lysspredning og / eller fluorescens gennem naturlige billederynthetic pigmenter (figur 1) gating af befolkninger kan: stigning opløsning af data, identificere sjældne population svarene og reducerer falske positive resultater. FCM langs molekylære prober skiller sig ud fra de tidligere nævnte teknikker i at teste enkelt celle fysiologiske for sin hurtighed, præcision og registrering af flere parametre.
FCM er et stærkt analytisk værktøj i akvatisk mikrobiologi og med tilføjelsen af molekylære sonder har et stort potentiale inden for en række områder, herunder, enkelt celle og fællesskab analyse til industrielle sektorer (f.eks., Overvågning drikkevandsforsyningen). Fremtidige fremskridt kunne se FCM indarbejde fluorescens in situ hybridisering (FISH), som kan detektere og lokalisere specifikke genetiske sekvenser i individuelle celler inden for tætte heterogene prøver. Udviklingen af FCM og molekylær probe overføre til in-situ optagelser kunne levere vigtige oplysninger om vandkilder at gennemføre tidlige strategies til ressourcestyring. Efter optimering protokol udviklet her, kan FCM og molekylære prober potentielt spille en afgørende rolle i at yde værdifulde data om mikrobiel fysiologi i akvatiske miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende ph.d.-studerende Dave Hartnell og Bournemouth University for støtte og finansiering til forskning og faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
References
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
