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Medicine

Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique ( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

Les populations microbiennes contiennent hétérogénéité cellulaire importante, qui peut dicter le comportement global. L'analyse de la sonde moléculaire par cytométrie en flux peut déterminer états physiologiques de cellules, mais son application varie selon les espèces. Cette étude fournit un protocole de déterminer avec précision la mortalité cellulaire dans une population de cyanobactérie, sans sous-estimer ou l'enregistrement des résultats faussement positifs.

Abstract

Sous-populations microbiennes dans les études de terrain et de laboratoire ont été montré pour afficher une forte hétérogénéité dans les paramètres morphologiques et physiologiques. Déterminer l'état en temps réel d'une cellule microbienne va au-delà des catégories vivants ou morts, que les microbes peuvent exister dans un état dormant, où la division cellulaire et activités métaboliques sont réduits. Compte tenu de la nécessité pour la détection et la quantification des microbes, la cytométrie en flux (FCM) avec des sondes moléculaires fournit une méthode rapide et précise pour aider à déterminer la viabilité globale de la population. En utilisant SYTOX vert et SYTOX Orange dans le modèle cyanobactéries Microcystis aeruginosa pour détecter intégrité de la membrane, nous développons une méthode transférable pour une indication rapide de la mortalité d'une cellule unique. Les sondes moléculaires utilisés dans ce journal seront appelées acides nucléiques sondes en vert ou orange, respectivement (bien qu'il y ait d'autres produits avec excitation et d'émission des longueurs d'onde similaires qui ont un mode de actio comparablesn, nous nous référons spécifiquement à l'avant mentionné sondes). Protocoles utilisant des sondes moléculaires varient entre les espèces, qui diffèrent principalement en concentration et d'incubation fois. Suite à ce protocole défini sur M.aeruginosa la sonde d'acide nucléique vert a été optimisé à des concentrations de 0,5 pm après 30 min d'incubation et de la sonde d'acide nucléique d'orange à 1 uM après 10 min. Dans les deux sondes des concentrations inférieures à la valeur optimale déclaré conduit à une sous-déclaration des cellules avec des dommages à la membrane. Inversement, 5 uM concentrations et supérieur dans les deux sondes ont présenté un type de coloration non spécifique, par lequel les cellules «live» produit une fluorescence cible, conduisant à une sur-représentation du nombre de cellules «non viables». Les contrôles positifs (tuées par la chaleur) fournis biomasse morte testable, bien que la pertinence de génération de commande reste sujet à débat. En démontrant une séquence logique d'étapes pour optimiser les vert et orange acide sondes nucléiques Wé demonstrate comment créer un protocole qui peut être utilisé pour analyser l'état physiologique de cyanobactéries efficacement.

Introduction

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La cellule est un système complexe qui répond en permanence à l'environnement par la modification des paramètres physiologiques et modifier sa fonction. La dynamique des populations des populations microbiennes isogéniques à la fois dans la nature et le laboratoire sont affectés par le développement des sous-populations, survenant même dans des conditions relativement constants environnementales 1 - 3. La variabilité des communautés microbiennes naturelles se pose en raison de la nature très variable des conditions environnementales. Ces processus parfois stochastiques produisent ensuite des sous-populations qui sont très différents de la moyenne de la population. Des preuves récentes ont révélé que ces sous-populations physiologiques répondent différemment à des conditions ambiantes et peut produire des composés de signal ou des inhibiteurs qui affectent de façon spectaculaire et influent sur ​​l'ensemble de la population 3,4.

Établir une méthode pour définir l'hétérogénéité au sein d'une population est la clé de l'ONUcompré- l'écologie des microbes dans divers environnements et est essentielle lors de la construction des connaissances des cyanobactéries indésirables, tels que le Microcystis toxiques, ce qui affecte lourdement sur ​​la sécurité humaine de l'eau. Les espèces telles que Anabaena afficher hétérogénéité morphologique en réponse aux fluctuations de l'environnement, le développement des cellules spécialisées comme hétérocystes et akinètes 2. En revanche, les cellules de Microcystis ne présentent pas l'hétérogénéité morphologique évidente lors d'une réaction de stress. La discrimination entre les cellules viables et non viables est l'aspect le plus important de différenciation physiologique et permet une meilleure compréhension de la dynamique des populations microbiennes. Cependant, le problème conceptuel de la viabilité bactérienne elle-même reste difficile et mal caractérisé 1,5,6.

La cytométrie en flux (FCM) est une méthode fiable et rapide d'analyse de cellules individuelles. Pour augmenter la compréhension de kiné seule cellulelogie entremise de la FCM, sondes moléculaires ont été utilisés pour distinguer un certain nombre de processus métaboliques et biochimiques 7. Cela a conduit à une meilleure connaissance des espèces à un niveau cellulaire et de la population et à son tour aidé gestion de l'eau 8,9. Cependant, les organismes diffèrent en termes de capture de la sonde moléculaire et efflux en raison des pores dans les murs et les pompes et les membranes cellulaires, qui ont conduit à un certain nombre de conception de la sonde moléculaire et la mise en œuvre du protocole 6,10,11. Sondes moléculaires disponibles à des fins commerciales et de recherche sont souvent fournis avec un protocole générique qui peut être applicable à un type de cellule très différent. Il faut être très prudent dans le transfert de protocoles développés pour un type de cellule à l'autre 6, il est donc une tâche essentielle pour optimiser sondes moléculaires efficacement avant utilisation.

Les sondes d'acide nucléique vert et orange se lient à la fois des acides doubles et nucléique simple brin avec une base minimale sélectionnezivité et sont utilisés pour évaluer l'intégrité de la membrane plasmique des cellules. La sonde d'acide nucléique vert a un signal de fluorescence de marquage cellulaire nettement améliorée par rapport aux autres sondes moléculaires, tels que les composés à base d'iodure de propidium-12, qui peut également agir comme un indicateur de la viabilité cellulaire. Le terme «viabilité cellulaire 'ici suppose que la dégradation de l'ADN se produit après la perte de l'intégrité de la membrane plasmique. Les sondes d'acide nucléique sont des colorants cyanine asymétriques avec trois charges positives et ne peuvent pas pénétrer dans les cellules avec des membranes intactes, caractérisé en vertu des concentrations, dans les deux eucaryotes et procaryotes 14,15 11,13 organismes. La liaison d'une sonde d'acide nucléique à des acides nucléiques peut entraîner jusqu'à une augmentation d'un facteur> 500 des émissions de fluorescence à partir de signaux endogènes dans des cellules qui ont leur intégrité membranaire compromise. Bien que sondes moléculaires tels que la sonde d'acide nucléique vert peut être un bon indicateur de la physiologie de la cellule unique, il ya un besoin to optimiser chaque sonde avec l'organisme cible prévue, que les temps d'incubation varient de 7 min - 30 min et les gammes de concentration de 0,1 uM - 0,5 pM dans des expériences Microcystis seul 15-19.

Nous présentons ici un protocole d'optimiser les dosages de cytométrie de vert et relativement nouvelles sondes d'acide nucléique orange (qui à ce jour pas été testé sur les espèces de cyanobactéries M.aeruginosa). La méthodologie développée suivante peut alors être transféré à d'autres espèces et utilisé comme une plate-forme pour l'optimisation de protocoles dans d'autres sondes moléculaires, augmentant ainsi la compréhension des microbes et leur comportement écologique.

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Protocol

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1. Préparation de la sonde moléculaire et Cytomètre de flux

  1. Diluer solutions d'achat d'actions des sondes d'acide nucléique, qui sont fournis en tant que solution à 5 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à des parties d'concentrations requises ultrapure filtrée H 2 O.
  2. Stocker les sondes d'acide nucléique dans des conditions d'obscurité entre -5 ° C et - 25 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Allumez le cytomètre de flux et de logiciel de charge (voir tableau des Matériaux / Équipement pour les spécifications de la FCM).
  4. Placez un tube à hémolyse vide (12 x 75 mm) sur la sonde d'injection d'échantillon (SIP), cliquez déboucher, puis de nouveau au ras de commencer le processus de nettoyage de la FCM.
    NOTE: Certaines étapes échantillon pour le SIP peuvent accueillir plusieurs types de tubes, y compris des microtubes. La sonde et la gaine de fluide diluant moléculaire utilisé dans l'appareil FCM est d'une qualité analytique "type 1" membrane de 0,22 um source filtré.
  5. Lieuun tube à hémolyse frais avec 2 ml de ultrapure filtrée H 2 O sur le SIP, fixer un délai pendant 10 - 15 min et une vitesse de fluide de jeûner (ou un taux de> 66 pi / min).
  6. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, mis sur les seuils pertinents pour la fluorescence et des canaux de diffusion de la lumière pour réduire le bruit de fond et cliquez sur "Exécuter".
  7. Si le total des événements par seconde ne sont pas au-dessous de la recommandation des fabricants, puis exécutez un échantillon de 2 ml de solution de décontamination pendant 2 min sur rapide et puis répétez les étapes 1.4 et 1.5.
    NOTE: S'il vous plaît vérifier les recommandations du fabricant pour FCM démarrage protocoles de nettoyage, car ils peuvent varier selon les modèles. Test des seuils spécifiques doit également être en conformité avec le modèle de la FCM que certains équipements permet à l'utilisateur d'appliquer des tensions gains aux tubes photomultiplicateurs (PMT) renforcement ou à la baisse le signal électrique enregistré par les détecteurs optiques. Le modèle FCM utilisé dans cette expément a fixé PMT de tension et utilisé un seuil de 80.000 prodiffusion lumière (FSC-H) pour exclure les particules inférieures à 2,0 um et de bruit électronique.

2. Préparation de cultures et nombre initial de cellules

  1. Autoclave de 98 ml d'H 2 ultrapure filtrée et O 2 ml de milieu de concentration d'algues (x50) dans un bêcher de 250 ml pendant 20 min à 120 ° C
  2. À partir d'une monoculture initiale de M.aeruginosa (PCC 7806) dans un état ​​stable à haute densité lieu 2 ml de l'échantillon dans un tube sous la SIP. Ventiler toute formation de colonies par vortex ou sonication 20 et confirmer cellules réparties de façon égale par microscopie optique.
    NOTE: Une exposition excessive aux ondes ultrasonores peut conduire à la lyse des cellules et doit être utilisé avec prudence. Depuis sonication peut effondrer vésicules de gaz (que l'on trouve des espèces comme M.aeruginosa) sorties tels que la lumière de diffusion latérale (SSC-H) intensité peut devenir plus soinsitive.
  3. Dans le logiciel de la FCM, sélectionner un histogramme pour enregistrer des données à partir de l'avant dispersion de la lumière (FSC-H) et configurer les spécifications de l'intrigue en cliquant sur "log" pour afficher dans une échelle logarithmique sur l'axe.
  4. Dans une sortie séparée, sélectionnez un autre histogramme (axe log) pour enregistrer la fluorescence naturelle telle que l'accessoire phycocyanine photosynthétique de pigment (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), trouvé dans M.aeruginosa.
  5. Utilisez une source de lumière qui peut exciter la phycocyanine et un détecteur qui peut filtrer les émissions résultant de la fluorescence.
    REMARQUE: pigment photosynthétique telle que la chlorophylle peut être excité à l'couramment utilisé 488 nm laser bleu, alors que la phycocyanine est excité de plus de 600 nm et qui ne sera détecté avec une source de lumière rouge 21. Vérifiez avec le fabricant de cytomètres de flux pour les sources de lumière d'excitation et les spectres de détecteurs d'émission, ici à la fois un 488 nm et d'un laser 640 nm ont été utilisés avecun filtre optique 675 nm ± 12,5.
  6. Pour l'enregistrement de la plus haute résolution sélectionner les paramètres les plus proches de la taille de base de l'organisme cible (10 um) et un débit relativement lent (14 pi / min).
    NOTE: Pour les meilleurs échantillons de résolution doit être exécuté selon la fabrique recommandation d'événements par seconde.
  7. Avant l'acquisition de données utilisent un seuil de porte à diffusion de la lumière et / ou des signaux de fluorescence qui sont causés par le bruit de fond électronique ou les débris de l'échantillon de cellules.
  8. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, créer un nuage de densité avec le FSC-H et les paramètres SSC-H sur une échelle logarithmique et cliquez sur Exécuter.
  9. Si la densité de l'échantillon conduit à un taux d'événements excessive, des étapes de dilution peuvent être prises pour augmenter la précision et la précision.
  10. Sur la parcelle de densité appliquer portes de logiciels à partir de l'histogramme précédente pour exclure des signaux de diffusion de niveau bas, produites par le bruit de fond ou de débris (FSC <320000). Inversement la porte de fluorescence relative plus élevéesignaux de phycocyanine de cellules et ne comprennent que ces événements (FL4, 56.000 - 1.950.000).
  11. Utilisez le nombre de cellules enregistrées dans les zones bloquées et le diviser par le volume total de l'échantillon qui a traversé la FCM, à travailler sur la façon de nombreuses cellules par ml.
    NOTE: Le modèle utilisé ici FCM a un système de pompe péristaltique commandé par microprocesseur permettant volume de l'échantillon à déterminer. Autre équipement de la FCM peut exiger une suspension de billes étalonné ou un calcul de H 2 différences de poids O / volume pour vérifier que le volume total de l'échantillon.
  12. Ajouter le volume requis de cellules pour les médias fraîchement préparés afin de commencer un cycle de croissance de lot (250.000 cellules / ml) de M.aeruginosa.
    REMARQUE: Les espèces seront différer des taux de croissance en fonction de leurs paramètres in-situ de l'environnement et de la disponibilité des nutriments, donc un cycle de lot doit être pré-enregistrée pour déterminer les phases du cycle de vie.

3. Optimsation de la sonde moléculaire et cellulaire absorption

  1. Récolte moitié de la culture M.aeruginosa préparé à l'étape 2 à partir d'une phase exponentielle et l'utiliser comme un contrôle «en direct».
    Note: Les échantillons dilués à partir d'une culture de haute densité directement à une phase exponentielle peuvent affecter les résultats d'optimisation grâce morts renouvellement cellulaire, par rapport à celle de cultures inoculées à partir d'une phase initiale lag / d'induction.
  2. Préparer l'autre moitié comme une «mort» contrôle en utilisant des méthodes telles que 70% d'éthanol, des échantillons de chauffage à 60 ° C pendant 1 heure, le paraformaldéhyde ou 4% de formaldéhyde pendant 30 min 6,11,22. Vérifiez variations dans les échantillons microenvironnement (ex., PH).
    NOTE: Le positif, «morte» le contrôle de la chaleur tués dans M.aeruginosa se ​​distingue d'un échantillon «en direct» à travers sa baisse dans les signaux de phycocyanine. Induisant la mortalité par d'autres méthodes ne peut pas causer la même sortie et Vary en espèces.
  3. Mettre en place des échantillons mixtes utilisant différents rapports «en direct» et des échantillons «mort» (par exemple, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Ventiler la formation de colonies par vortex ou ultrasons et contrôler le pH.
  5. Sélectionner un laser 488 nm le long de détecteurs qui peuvent enregistrer fluorescence du vert (FL1, 530 ± 15 nm) et orange (FL2, 585 ± 20 nm) sondes d'acide nucléique et le laser de 640 nm pour enregistrer des signaux de phycocyanine par son détecteur respectif.
    REMARQUE: Lorsqu'il est lié à l'ADN, la sonde d'acide nucléique vert a une approximative excitation de fluorescence longueur d'onde de 504 maxima nm et une émission de 523 nm, tandis que la sonde d'acide nucléique d'orange a une longueur d'onde d'excitation de 547 nm et les émissions maxima de 570 nm. Un ion argon à 488 nm laser à l'état solide peut être utilisé pour exciter les deux sondes moléculaires, cependant, un laser vert (547 nm jusqu'à) va produire une fluorescence orange ultérieure.
  6. Comme point de départ, introduire lasonde moléculaire avec les fabricants recommandé concentration à la culture 50% «en direct» et 50% «mort» et incuber dans l'obscurité.
  7. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, placez l'échantillon dans le cadre du SIP avec des seuils et les déclencheurs qui permettront de réduire le bruit de fond (FSC-H 80000).
  8. Créez un nuage de densité avec le FSC-H et les paramètres SSC-H, et trois histogrammes. Un histogramme en utilisant le canal respectif de la sonde moléculaire de détecteur optique (FL1 ou 2), de détecter les émissions de phycocyanine (FL4-H) et l'autre FSC-H, le tout sur une échelle logarithmique.
  9. Incuber les échantillons de M.aeruginosa avec les sondes d'acide nucléique dans l'obscurité pendant 60 min à, enregistrer dans les cellules de données séparées, à un certain nombre de points (1, 5, 10, 15, 30 et 60 min) temps.
    REMARQUE: Lors du réglage de paramètres tels que la vérification de pH avec les fabricants pour les réactions potentielles de certains produits chimiques (pour l'acide nucléique testé sondes un tampon ne peut pas contenir des phosphates ou des niveaux élevés de monovalent ou divacations prêtés, que la liaison avec l'ADN sera réduit).
  10. Appliquer une porte de logiciels pour inclure uniquement les FSC-H histogramme (320.000 - 1.500.000) pour la organismes cibles taille de la cellule, dans le canal de la sonde histogramme de fluorescence respective.
    REMARQUE: Les concentrations utilisées dans ce protocole étaient de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 et 100 um, qui peuvent être modifiées, soit en augmentant ou en diminuant le volume de l'échantillon M.aeruginosa ou une solution de stock initial de sondes nucléiques.
  11. Dans le canal de la sonde de fluorescence, appliquer une autre porte de logiciels compris au plus haut sommet de l'histogramme (vert FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30 000 - 165 000) et par la suite porte qui sonde positive de fluorescence dans le complot de densité.
  12. Exécuter les étapes 03.01 à 03.11 100% "en direct", 100% «morts» et tous les échantillons de culture mixte, en ajustant les concentrations de sonde moléculaire (par exemple x 0,1 à x 10) et / ou de la température et les niveaux de pH si nécessaire.
  13. <li> Comparer le nombre de signaux de fluorescence de sonde moléculaire positifs à la densité cellulaire d'origine des cellules «mortes» (extrait de la moitié du total FSC-H ou une culture 100% «mort») pour trouver le pourcentage total de cellules colorées avec l'acide nucléique sondes.
  14. Pour ce faire, pour chaque période de temps dans chaque concentration pour trouver le protocole optimal pour le plus haut pourcentage de nucléique cellulaire sonde absorption sans produire coloration non spécifique (utiliser les moyens dans un One-Way ANOVA ou de Kruskal-Wallis analyse de la variance à un facteur, si les données sont non paramétrique).

4. Molecular Probe fluorescence discrimination

  1. Pour les tests de fluorescence interférences / chevauchement de coloration cellulaire intrinsèque ou non spécifique sélectionner les données de 50% «en direct» et 50% «morts» mélangés culture et enlever toutes les portes.
  2. Appliquer une porte de logiciel pour inclure uniquement le FSC-H histogramme (320.000 - 1.500.000) pour la cible organismes taille de la cellule, dans la phycocyaninecanal histogramme.
  3. Porte le plus haut sommet de la phycocyanine et étiqueter comme «en direct», avec l'ajout de la plus faible pic étiquetés comme «morte».
  4. Effectuez une autre étape de la porte dans le canal respectif de l'histogramme de fluorescence de sonde moléculaire, en utilisant un à la fois, les signaux «en direct» puis phycocyanine «mort» (FL4), l'enregistrement de deux longueurs d'onde moyennes.
    REMARQUE: Le mode d'induction de la mortalité dans cette expérience a été réalisée par traitement thermique, qui, en vertu de ce protocole diminue clairement signaux de phycocyanine. Autres méthodes de production de populations de cellules «mortes» peuvent produire différentes sorties dans les essais acquises.
  5. Ratio des longueurs d'onde moyennes de la fluorescence moléculaire positif de la sonde («mort») et le signal intrinsèque / non spécifique («live») pour déterminer la sensibilité de protocole.
    NOTE: Pour améliorer la discrimination de fluorescence de 'live' et popul «mort»ations, augmentent la source de carbone à absorption de colorant actif dans les cellules appauvri en éléments nutritifs ou de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour améliorer la perméabilité de la paroi cellulaire et des signaux de fluorescence résultants 6. Une rémunération limitée dans certains modèles de la FCM pour chevauchement spectral peut être effectuée par la correction par paires manipulé par l'utilisateur lors de l'acquisition de l'échantillon (des variations de tension de PMT) ou à partir d'un logiciel spécialisé post-analytique.
  6. Sélectionnez le protocole optimisé où la plus grande quantité de cellules «mortes» a été souillé sans coloration d'apparition non spécifique. Si un certain nombre de tests ont des résultats similaires accepter le protocole avec la concentration et l'incubation, le meilleur temps, avec une bonne discrimination de signal de fluorescence. Suivre les instructions du fabricant pour la procédure d'arrêt cytomètre.

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Representative Results

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Prodiffusion lumière (FSC) et de la lumière de diffusion latérale (SSC) sorties à partir d'une culture discontinue M.aeruginosa en phase exponentielle fournit des informations sur la taille des cellules (de diamètre) et la granularité interne respectivement (figure 1A). FSC peut distinguer les cellules qui sont trop grands et / ou petits pour être M.aeruginosa. Cette discrimination ou ouverture de porte peuvent être faites par des données de raffinage entre certains points d'une sortie de FSC (figure 1C). Phycocyanine, une constitution importante de l'appareil photosynthétique M.aeruginosa produit un signal fort lorsqu'il a été interrogé par une source de lumière rouge (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), qui peut être utilisé à d'autres populations de grille, similaire à celui fait dans FSC déclenchement mais avec fluorescence (Figure 1D). De signaux FSC et de fluorescence, les données peuvent être déclenchés à partir de la sortie d'origine (Figure 1A) pour des données spécifiques sur M.aeruginosa pour fnumérations cellulaires tones (figure 1B).

Autofluorescence par cellule dans les populations de cyanobactéries diffère en fonction de l'état physiologique. Voici les cellules ont été récoltées à partir d'une culture en phase exponentielle montrant relativement élevé fluorescence rouge lointain pour une population «en direct» de commande et la «mort» de contrôle a été exposé à 60 o C la chaleur pendant 1 heure. Lorsque 'Live' contrôles pigmentées inférieurs pigmentées et «mort» plus élevés sont mélangés le décalage diminue dans autofluorescence est clair (Figures 2A et B). La «mort» de fluorescence de la cellule et les paramètres FSC peuvent être utilisés pour discriminer les cellules totales qui ont eu jusqu'à la sonde moléculaire. Dans membrane compromis ou des cellules «mortes» les sondes d'acide nucléique vont produire un signal supplémentaire soit; FL1 canal (530 ± 15 nm) pour la sonde d'acide nucléique ou le canal FL2 vert (585 nm ± 20) pour le courant alternatif d'orange nucléiquesonde de id (figures 3A et B), par rapport à la 'Live' signal de fluorescence native. Confirmation de deux sondes d'acide nucléique dans des cellules avec des membranes dommages peut être vu par microscopie à épifluorescence (figures 4A et D).

Le pourcentage total de cellules qui avaient été colorées par la sonde d'acide nucléique vert a été obtenu auprès échantillons mélangés, qui ont été pré-fermée afin d'inclure uniquement les cellules M.aeruginosa dimensionné à partir d'un histogramme FSC-H (320.000 - 1.500.000). Dans un 'live: mort »50:50 échantillon, les cellules de fluorescence verte déclenchés à partir du plus haut sommet dans un FL1 (530 ± 15 nm) histogramme a été comparé à la densité originale dans la" mort "population de cellules (soit par la réduction de moitié de la FSC totale H ou l'exécution d'un nombre de cellules séparées uniquement sur les échantillons de cellules 100% «morts»). Au-dessus de 100% indiquerait que la coloration non spécifique se produit. Le pourcentage moyen de cellules qui avaient pris la Nucle vertic sonde acide variait de; 15 ± 0,3% dans 0,05 uM après 1 min à 177,1 ± 5,1% à 100 uM pendant 10 min d'incubation (tableau 1). Concentrations plus de 1 pm (non compris) ont présenté une coloration non spécifique (ie., Les cellules «en direct» qui ont commencé à prendre la sonde moléculaire). Une ANOVA à deux voies entre les concentrations qui ne présentent pas de coloration non spécifique (0,05 - 1 pM) et ont montré une différence significative globale de l'interaction entre la concentration de la sonde d'acide nucléique vert et le temps d'incubation dans M.aeruginosa, F (12 , 40) = 6,48, p <0,001. Il y avait un effet principal sur les concentrations de sonde vert d'acide nucléique utilisé F (3, 40) = 836,92, p <0,001 et temps d'incubation F (4,40) = 347,98, p <0,001. Un test post-hoc de Tukey a indiqué une différence significative entre toutes les concentrations, sauf 0,5 et 1 pm (p <0,001) et unedifférence significative entre les temps d'incubation de 1 à 60 min (p ​​<0,001). Cependant, un Post Hoc Tukey test à partir d'un ANOVA Un révélé l'absorption moyenne de sonde d'acide nucléique vert ne diffère pas entre 30 et 60 min pour 0,05 pm (p> 0,05) et 1 pm (p> 0,05) (figure 5A). Le rapport moyen des signaux de fluorescence relative «en direct» et «mort» dans FL1 pour la discrimination des populations (mesuré par FL4) variait dans la sonde d'acide nucléique vert de la plus haute dans 0,1 uM après 60 min de 714 ± 14,8 (RFU) à la le plus bas de 0,8 ± 0,0 (RFU) dans 100 uM après 30 min (tableau 2). En comparant les ratios d'unités de fluorescence relative (RFU) pour la discrimination d'intensité dans «en direct» et «mort» FL1 signale une ANOVA deux rapports d'une différence significative globale dans l'interaction entre les concentrations et les temps d'incubation F p <0,001 avec la sonde d'acide nucléique vert. Il y avait aussi une différence significative dans le principal effet sur ​​l'ensemble des concentrations F (7,80) = 475,41, p <0,001 et temps d'incubation F (4,80) = 78.28, p <0,001. Les ratios de discrimination de signaux de fluorescence entre le «live» et de la chaleur tués cellules «mortes» ont augmenté avec le temps entre les concentrations de 0,05 pm et 1 uM, mais ont diminué entre 5 um et 100 um (figure 5B).

Le pourcentage de cellules qui ont été colorées avec la sonde d'acide nucléique d'orange a vu un faible pourcentage de 4 ± 0,3% en moyenne, dans une concentration de 0,05 pM après 1 min, pour atteindre 166 ± 3,5% à 100 uM après 10 min d'incubation (Tableau 3). Encore une fois concentrations plus 1 uM également présentés coloration non-spécifique de cellules vivantes. A Two-Way ANOVA entreen les concentrations qui montraient aucune coloration non spécifique (0,05 à 1 M) a signalé une différence significative globale dans l'interaction entre toutes les concentrations de la sonde d'acide nucléique d'orange et des temps d'incubation dans M.aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Il y avait un effet significatif sur le plan statistique principal concentrations F (3, 40) = 6919,67, p <0,001 et temps d'incubation F (3, 40) = 1161,45, p <0,001. Cependant un test post hoc de Tukey par un ANOVA Un sur seulement 1 uM a indiqué que des temps d'incubation entre 10, 30 et 60 min eu aucune différence statistique dans l'absorption de sonde d'acide nucléique orange (tous les p> 0,05) (figure 6A). Discrimination de signal de fluorescence entre les populations «en direct» et «mortes» teinté dans FL2 variait en sonde d'acide nucléique orange du plus bas de 0,3 ± 0,0 (RFU) après 60 min dans 50 um et 30 mà 100 uM dans les plus hautes de 158,3 ± 0,4 (RFU) après 60 min à une concentration de 0,1 pM (tableau 4). A Two Way ANOVA signalé une signification statistique globale dans les interactions entre les concentrations et les temps d'incubation F (28, 80) = 28,12, p <0,001. Les principaux effets de concentration F (7, 80) = 607,9, p <0,001 et temps d'incubation F (4, 80) = 31,24, p <0,001 On a également constaté que toutes sensiblement différentes. Discrimination entre les signaux de fluorescence de 'Live' et de chaleur tué les cellules «mortes» dans FL2 augmenté avec le temps entre les concentrations de 0,05 pm et 0,5 um, mais a diminué entre 1 um et 100 um (figure 6B). Par conséquent, la concentration optimale de la sonde d'acide nucléique est de 0,5 uM vert avec un temps d'incubation de 30 min et de la sonde d'acide nucléique d'orange est la concentration optimale 1 uM incuretenant pendant 10 min.

Figure 1
Figure 1. FCM sorties de M.aeruginosa Grâce FSC, SSC et Extrême-Rouge fluorescence (675 ± 12,5 nm). (A) FSC et SSC de M.aeruginosa PCC 7806. (B) le même résultat que la figure 1A avec FSC et fermée loin fluorescence rouge (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) représentant les tailles FSC de la cellule. La flèche rouge indique bordée la zone qui est fermée pour réduire le bruit de fond ou d'autres particules de taille. (D) des signaux de Haute phycocyanine produites à partir M.aeruginosa dans une culture de lots de phase exponentielle de rouge Arrowed zones gated. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2. phycocyanine Signal Maj dans M.aeruginosa Lorsque traités à la chaleur. Changement de M.aeruginosa autofluorescence dans les cellules «en direct» et «mortes» utilisés pour valider l'absorption nucléique de sonde d'acide. (A) des signaux rouges Loin de passer d'une plus pigmentée «en direct» la population (vert) pour une population inférieure pigmentée «mort» (rouge). (B) FSC et lointains fluorescence rouge sorties combinées avec un décalage de près de deux ordres de grandeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. orange fluorescence Maj dans M.aeruginosa De 'Live' UnstaineD à cellules colorées 'mort'. et des contrôles «mortes» 'Live' M.aeruginosa mixtes incubées avec sonde d'acide nucléique d'orange à une concentration de 1,0 um pour 30 min. (A) FL2 (585 ± 20 nm) canal signale un changement accrue d'une population «en direct» sans tache (vert) à une «mort» la population colorées (orange) à travers deux ordres de grandeur. (B) Un «mort» la population taché (orange) qui a diminué signaux rouge lointain mais a augmenté signaux FL2 partir d'une population «en direct» (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. épifluorescence Microscopie de M.aeruginosa avec Molecular Probes. Microscope images d'un direct M.aeruginosa 50:50: population morts incubées avec des sondes d'acide nucléique, toutes les images x1,000 grossissement. (A) Une image d'épifluorescence de sonde d'acide nucléique vert pris par les cellules «mortes». Cellules 'Live' apparaissent en rouge en raison de l'auto-fluorescence de la chlorophylle. (B) Vue au microscope optique de la figure 4A montrant des cellules 'Live' verts et des cellules pigmentées moins pigmentées «morts», avec des dommages de la membrane. (C) En direct: 50:50 morts mixte population M.aeruginosa. (D) Orange nucléique sonde d'acide incubation de la figure 4C, avec des cellules «mortes» révélant une couleur orange par microscopie à épifluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 Figure 5. Pourcentage de cellules marquées avec Green Nucleic Acid sonde et le ratio de 'Live' à des signaux de FL1 «mort». Pourcentage de cellules colorées avec M.aeruginosa la sonde d'acide nucléique vert dans différentes concentration et d'incubation Mean Times. (A) 0,1 um ne se colorent pas suffisamment de cellules, 5 montrent uM coloration non spécifique et des concentrations de 0,5 um et 1 um colorées près de 100% de la population, montrant des temps d'incubation optimales après 30 min (a). (B) 'Live: morts «ratios de signaux de FL1 d'une phase de croissance exponentielle et des échantillons traités à la chaleur. Les concentrations de 0,5 um et 1 um montrent une bonne discrimination des signaux de FL1 croissantes avec le temps d'incubation (ratios RFU deux ordres de grandeur). Les concentrations de 10 um et plus (non représentés sur le graphique) montrent une faible discrimination de signal de fluorescence et le chevauchement des 'live' d'un«mort» des populations d. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Pourcentage de cellules marquées avec Orange Nucleic Acid sonde et le ratio de «Live» vers les signaux «mort». Les résultats de concentration et le temps d'incubation de changements dans les populations de M.aeruginosa. (A) pourcentage moyen de cellules qui avaient enregistré une signal de fluorescence orange dans FL2 avec des concentrations; 0,1 pM et 0,5 pM pas assez de coloration des cellules, des cellules vivantes 5 uM de coloration (coloration non-spécifique), ainsi que la concentration optimale de 1 uM 10 min après (a). (B) La sonde d'orange d'acide nucléique 'live: mortes »dans les rapports FL2 montrent une bonne discrimination et pas plus de rodagedes signaux de fluorescence à des concentrations de 1 uM ou moins pauvres et les signaux de FL2 chevauchent (ratios inférieure d'un ordre de grandeur) avec des concentrations plus de 1 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Conc. Le temps d'incubation (min)
(uM) 1 5 10 30 60
0,05 15,0 0,3 22,1 0,9 28,1 1.9 41,0 1.9 50,2 2.1
0,1 23,5 1.5 44,1 1.8 54,7 1.6 70,5 0,8 78,3 10
0,5 49,0 3.4 74,8 4.8 87,6 3.6 97,3 0,8 98,8 0,1
1 58,5 1.6 77,4 0,7 88,4 0,4 98,0 0,1 99,2 0,1
5 91,4 0,9 98,7 0,5 99,3 0,7 102,2 1.3 106,3 0,8
10 96,1 0,5 97,7 0,1 97,9 0,1 102,0 0,5 113,4 5.1
50 94,6 0,6 99,5 2.3 112,7 3.8 148,7 2.4 153,9 13,0
100 165,8 3.1 174,4 5.7 177,1 5.1 161,5 2.5 159,7 6.6

Tableau 1. Pourcentage absorption de vert acide nucléique sonde dans les cellules. Tableau montrant les données de l'expérience d'optimisation en utilisant la sonde d'acide nucléique vert et un «live» et 50% «mort» (traité thermiquement) échantillon de population de 50%. Les pourcentages moyens de cellules qui ont enregistrévert nucléique sonde d'acide fluorescence (FL1) ont été calculés par rapport au nombre total de cellules «mortes» obtenus à partir d'un compte FSC-H. Les valeurs supérieures à 100% montrent une coloration non spécifique (SE soulignés).

Conc. Le temps d'incubation (min)
(uM) 1 5 10 30 60
0,05 92,9 5.4 170,0 10,9 237,2 14,9 385,5 15,0 481,9 17,7
0,1 178,3 18.1 343,0 19.5 437,0 20,6 619,1 12.1 714,1 14,8
0,5 202,5 5.9 308,3 13.1 365,8 33,5 426,8 67,2 480,4 73,2
1 205,8 12.1 225,9 13,7 237,3 15,6 241,5 5.8 263,1 8.1
5 69,9 2.6 53,0 0,6 40,2 1.7 27,1 3.7 21,1 3.4
10 44,3 2.9 28,7 5.6 23,6 4.9 11,6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0,1 3.9 0,1 2.9 0,1 1.2 0,1 1.1 0,1
100 1.7 0,1 1.3 0,1 1.1 0,1 0,8 0,1 0,8 0,1

Tableau 2. Taux de Green signaux de fluorescence dans des cellules 'Live' et 'mort' Stained M.aeruginosa. FL1 discrimination de signal entre les cellules colorées avec la sonde d'acide nucléique vert et enregistrements intrinsèques non-spécifiques. L'échantillon contenait 50% «en direct» et 50% «mort» (traité thermiquement) M.aeruginosade la même population mesurée sur tous les temps d'incubation et la concentration (SE souligné).

Conc. Le temps d'incubation (min)
(uM) 1 5 10 30 60
0,05 4.0 0,3 14,9 0,2 23,5 0,8 39,1 2.4 37,6 1.5
0,1 14,6 0,4 42,2 0,5 55,0 1.1 72,8 0,9 80,2 0,1
0,5 54,5 0,4 79,8 1.2 86,4 0,4 91,2 0,1 93,2 0,1
1 92,0 0,8 94,8 0,1 96,9 0,6 98,4 0,6 98,4 0,3
5 91,4 1.5 93,5 1.8 102,9 5.4 118,9 0,1 124,8 0,1
10 95,9 10 102,4 1.8 132,9 6.0 148,9 4.8 132,8 5.1
50 107,5 3.7 130,6 16,6 145,2 0,2 135,4 16.2 114,6 6.6
100 97,1 0,1 130,7 7.8 166,1 3.5 144,7 6.8 115,1 6.2

Tableau 3. Pourcentage absorption d'Orange Nucleic Acid sonde dans les cellules. Tableau avec les données d'optimisation à l'aide de la sonde d'acide nucléique orange et un «mort» (traité thermiquement) échantillon de 50% «en direct» et 50% de la population. Le pourcentage moyen de cellules qui ont enregistré d'orange nucléique sonde d'acide fluorescence (LV2) ont été calculés par rapport au nombre total de cellules «mortes» d'un dénombrement FSC-H (SE souligné).

Conc. Le temps d'incubation (min)
(uM) 1 5 10 30 60
0,05 20,4 0,9 41,3 1.3 56,1 2.4 80,4 3.6 83,3 1.8
0,1 31,2 1.4 76,1 2.4 100,9 3.1 146,2 0,6 158,3 0,4
0,5 80,6 0,4 124,9 2.4 137,3 1.1 138,7 </ td> 2.1 132,8 3.9
1 89,7 16,0 80,9 16,9 69,1 10,7 43,0 5.7 35,9 6.5
5 10.4 0,6 7.5 0,1 5.0 10 2.7 0,5 1.5 0,1
10 7.0 0,1 3.6 0,3 2.2 0,4 1.6 0,1 1.2 0,1
50 2.2 0,4 1.6 0,3 1.3 0.0 0,6 0,1 0,3 0.0
100 1.7 0,1 1.1 0,1 0,7 0,1 0,3 0.0 0,5 0,2

Tableau 4. Ratio d'Orange acide nucléique dans les cellules 'Live' et 'mort' Stained M.aeruginosa. FL2 discrimination de signaux entre cellules colorées de la sonde d'orange d'acide nucléique (LV2) et enregistrements intrinsèques non-spécifiques. L'échantillon contenait 50% «en direct» et 50% «mort» (traité thermiquement) M.aeruginosa de la même population mesurée sur tous les moments de concentration et d'incubation (SE souligné).

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Discussion

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L'augmentation du nombre de publications utilisant des sondes moléculaires indique que les données fiables et informatifs peuvent être obtenus 5,6,8 - 15,19,22,23. Pour l'instant il n'y a pas de tache parfaite pour la viabilité cellulaire qui peut être efficace dans toutes les espèces avec la même concentration et la durée d'incubation de 6,10. Même le même type de sonde avec des émissions de fluorescence altérées montre la nécessité d'établir la concentration et la durée d'incubation correcte (tableaux 1 et 3). Comme on le voit lors de l'utilisation de ce protocole, la concentration et la durée d'incubation optimale pour sonde d'acide nucléique d'orange est de 10 min à 1 uM, alors que la sonde d'acide nucléique vert ne devra moitié de la concentration, mais prend trois fois plus de temps (figures 5 et 6). Ces deux cyanines monomères de cellules-impermeant avec des concentrations supérieures à 1,0 um commencé à produire un chevauchement des émissions spectres avec des cellules non-membranaires blessés. Ce chevauchement des SIgnaux fournit la preuve que la coloration non spécifique survient lorsque les cellules «en direct» prennent la sonde moléculaire. Le résultat sur la fluorescence de coloration non spécifique généré de faux positifs, soulignant la nécessité pour le développement de protocole être soigneusement établie pour chaque sonde moléculaire et l'organisme cible. Les étapes les plus critiques dans l'optimisation d'une sonde moléculaire seraient: 1) de comprendre comment la sonde moléculaire interagit avec l'instrument de la FCM; 2) l'adoption en direct approprié et contrôles morts; 3) développer la connaissance des paramètres de déclenchement des sorties de la FCM et 4) modifiant le protocole à travers la compréhension des environnements in-situ.

La source de lumière, des filtres optiques, la capacité à modifier la tension de PMT et détecteurs à l'intérieur de cytomètres de flux varient d'un fabricant à l'autre, de sorte que la prise de conscience de ce que l'excitation de longueur d'onde du laser et où les spectres d'émission se trouve en relation avec les canaux de fluorescence sont cruciales. Avec les acquisitions de données,seuils peuvent être imposées augmentant la résolution qui serait autrement perdue à peut-être le bruit de fond, des débris ou des agrégats de cellules mortes. Des sondes moléculaires peuvent offrir un aperçu de la viabilité de la culture sans espèces, par l'intermédiaire des paramètres simples tels que, le potentiel de membrane, la teneur en ADN et l'activité enzymatique. Cependant, dans les échantillons de l'environnement ne peut y avoir de nombreux organismes d'une taille des cellules et la fluorescence similaire. En outre au sein des cultures uniagal, des populations de cellules auront inévitablement un degré d'états physiologiques 3, qui peuvent affecter l'absorption de sonde moléculaire. Un des principaux avantages de la FCM est sa capacité de distinguer et de caractériser les états physiologiques au niveau de la cellule individuelle en temps réel, ce qui est essentiel lorsque l'on étudie la viabilité des micro-organismes in situ, car ils sont souvent soumis à des conditions rapides et dynamiques. En dépit de son utilisation fréquente, le concept de la viabilité des cellules reste difficile à définir. Habituellement appliqué à la prolifération cellulaire,la viabilité est très marqué sur une approche fondée sur la croissance. Cette hypothèse qui sous-tend peut tomber à court, car les conditions peuvent ne pas convenir à des cellules individuelles pour reproduire, mais ils peuvent encore être tolérable. Les cellules dans un état ​​physiologique non proliférantes qui ont conclu un repos ou un G (0) la phase du cycle cellulaire 27 peuvent pas interagir avec une sonde moléculaire donner des faux négatifs dans le cycle de l'ADN ou des sondes basées métabolique.

En utilisant des cellules de laboratoire cultivés ou fraîchement isolés pour optimiser sondes moléculaires aidera le raffinage de données utilisées dans les études écologiques. Les cellules utilisées dans l'optimisation de cultures discontinues sont généralement effectuées à des phases stationnaires ou exponentielles début et supposés avoir la plus grande viabilité. Cependant, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l'utilisation de fortes densités cellulaires, ceux qui sont en fin de phase stationnaire ou des microbes produisant matrices extracellulaires. Dans ce protocole, le contrôle de la population de cellules mortes ont été exposés à 60 o C la chaleur pendant 1 heure,avec la confirmation de dommages à la membrane et de la dégradation de pigment vu au microscope (figure 4) et la FCM sorties de fluorescence (figures 2 et 3). Simulant les causes de la mort cellulaire naturelle est extrêmement difficile; par ingestion herbivores, la lyse virale, la mort cellulaire programmée ou de la possibilité de division asymétrique 24 ne sont pas toujours possible ou être observé dans des conditions de laboratoire. Modes expérimentaux de la morale sont souvent remis en question, car ils peuvent ne pas être équivalente à des contraintes induites de l'environnement (par exemple, le meurtre de chaleur) et il peut y avoir une réponse hétérogène, par lequel certaines personnes sont tuées et d'autres cellules présentent pas de dégradation cellulaire observable ou la mort 3 , 25. Pour éviter un tel paradoxe la définition opérationnelle par lequel les expériences mesurées doivent être clairement établis afin de ne pas prêter à confusion 6,23, ce qui facilite la normalisation entre les études.

Divers procédés alternatifs VHAe été utilisé pour l'analyse la viabilité des cellules dans les cultures en conjonction avec des sondes moléculaires. Microscopie à épifluorescence est une technique traditionnelle utilisée, bien que photoblanchiment ou l'introduction de signaux d'artefact à partir de cellules voisines peut donner un sous ou sur une estimation de l'état physiologique des populations de pas enregistrée si assez rapidement. Cela rend l'optimisation travers de l'imagerie très difficile, avec potentiellement une faible précision. Évaluation génomique de la viabilité cellulaire en utilisant les deux méthodes d'amplification d'ADN et d'ARN tels que; réaction en chaîne de la polymérase (PCR), la transcriptase inverse (RT-PCR) et l'amplification basée sur nucléique séquence d'acides (NASBA) ont également été utilisés. Toutefois, l'évaluation génomique sert seulement une méthode indirecte de la validation de la viabilité que la persistance de l'acide nucléique dépend fortement des conditions environnementales, de la corrélation de la viabilité cellulaire réelle potentiellement variées immensément 28. En utilisant une combinaison de dispersion et / ou de la fluorescence de lumière à travers des photos naturellespigments ynthetic (Figure 1) déclenchement des populations peut: augmentation résolution des données, identifier les rares réactions de la population et de réduire les faux résultats positifs. FCM long de sondes moléculaires se distingue des techniques mentionnées dans les précédents tests physiologiques de la cellule unique pour sa rapidité, l'exactitude et l'enregistrement de plusieurs paramètres.

FCM est un puissant outil d'analyse en microbiologie aquatique et avec l'ajout de sondes moléculaires dispose d'un large potentiel dans un certain nombre de domaines, y compris, unicellulaires et d'analyse de la communauté pour les secteurs industriels (par ex., La surveillance approvisionnement en eau potable). Les progrès futurs pourraient voir FCM incorporer hybridation fluorescente in situ (FISH), qui permet de détecter et de localiser des séquences génétiques spécifiques dans des cellules individuelles dans des échantillons hétérogènes denses. Le développement de la FCM et la portabilité de la sonde moléculaire pour les enregistrements in situ pourrait fournir des données vitales sur des sources d'eau à mettre en œuvre au début deSTRATÉGIES pour la gestion des ressources. Après le protocole d'optimisation développé ici, la FCM et des sondes moléculaires peuvent potentiellement jouer un rôle crucial en fournissant des données précieuses sur la physiologie microbienne dans les milieux aquatiques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier doctorant Dave Hartnell et Bournemouth University de soutien et de financement de la recherche et des installations.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

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References

  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144, (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6, (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8, (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77, (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42, (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28, (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47, (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57, (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64, (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47, (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517, (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19, (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8, (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47, (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13, (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60, (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36, (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62, (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53, (2), 175-183 (2003).
Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Par cytométrie en flux
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Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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