Summary
微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。
Abstract
微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。
Introduction
細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 3 -同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の3,4に影響を与えるシグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。
集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes 2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個体群動態をよりよく理解することができます。しかし、細菌の生存率そのものの概念の問題は難しいと特徴付けが乏しい1,5,6のまま。
フローサイトメトリー（FCM）は、個々の細胞を分析の信頼性が高く、迅速な方法です。単一細胞生理の理解を高めるためにFCMスルーでれっと、分子プローブは、代謝および生化学的プロセス7の数を区別するために使用されてきました。これは、携帯電話や人口レベルでの種の増加の知識につながったし、今度は水資源管理8,9を支援してきました。しかし、生物は、分子プローブ設計およびプロトコル実装6,10,11の数につながっている携帯壁や膜中の細孔やポンプ、に分子プローブの取り込みと排出の点で異なります。商業用および研究目的のために利用可能な分子プローブは、しばしば、非常に異なる細胞型にも適用可能である一般的なプロトコルを用いて供給されています。一つは、別の6に一つの細胞型のために開発されたプロトコルを転送するのに非常に慎重でなければならない、それは、したがって、効果的に使用する前に分子プローブを最適化するために不可欠な作業です。
緑とオレンジの核酸プローブは、最小限のベースとのダブルと一本鎖核酸の両方に結合し選択ivityとは、細胞の原形質膜の完全性を評価するために使用されます。緑色の核酸プローブは、また、細胞生存率の指標として機能することができるヨウ化プロピジウム系化合物12のような他の分子プローブに比べて著しく改善された細胞標識蛍光シグナルを有します。ここで用語「細胞生存率は、「DNA分解は、原形質膜完全性の喪失後に発生することを想定しています。核酸プローブは、3つの正電荷を有する非対称シアニン色素であり、真核生物の11,13および原核生物14,15の両方で、特徴づけられた濃度の下で、無傷の膜を有する細胞を入力することはできません。核酸に核酸プローブの結合は、それらの膜完全性が損なわれている細胞における内因性信号からの蛍光発光の> 500倍の増加までをもたらすことができます。このような緑色の核酸プローブとして分子プローブは、単一の細胞生理学の良い指標となることができますが、必要性のトンがありますだけではアオコの実験では0.5μM15 - - 0.1μMから30分であり、濃度範囲- 19インキュベーション時間は7分まで変化させてきたように、O、目的の標的生物に各プローブを最適化します。
ここでは、緑のサイトメトリーアッセイと（これまでにシアノバクテリア種M.aeruginosa上でテストされていない）比較的新しいオレンジ色の核酸プローブを最適化するためのプロトコルを提示します。次の発展の方法は、他の種に移し、それによって微生物およびそれらの生態行動の理解を増加させる他の分子プローブでプロトコルを最適化するためのプラットフォームとして使用することができます。
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Protocol
分子プローブおよびフローサイトメーターの作製
- 超純濾過H 2 Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈
- 25°Cの使用まで- -5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。
- フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様のための材料/機器の表を参照）をオンにします。
- 試料注入プローブ（SIP）の空の溶血チューブ（12×75 mm）を置いて、邪魔を除く、その後FCM洗浄プロセスを開始するためにフラッシュバックをクリックします。
注 ：SIPのためのいくつかのサンプルステージはマイクロ遠心チューブなどのチューブのいくつかのタイプを収容することができます。 FCM装置に用いられる分子プローブの希釈剤とシース液は分析グレード「タイプ1」、0.22μmのメンブレンフィルターのソースからです。 - 場所15分と速いために、流体の速度（または> 66マイクロリットル/分の流速） - SIPの超純フィルタリングの H 2 O 2 mlの新鮮な溶血管は、10の時間制限を設定します。
- 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズを低減し、「実行」をクリックする蛍光および光散乱チャネルに関連したしきい値に置きます。
- 秒あたりの総イベントは、製造業者の推薦の下にない場合は、高速で2分間の除染液2mlのサンプルを実行して、手順1.4＆1.5を繰り返します。
注 ：彼らはモデル間で変化させることができるよう、FCM起動クリーニングプロトコルについては、メーカーの推奨事項を確認してください。特定のしきい値のテストはまた、いくつかの機器は、ユーザは、光検出器から記録された電気信号を増強または減少する光電子増倍管（PMT）に電圧ゲインを適用することを可能にするようFCMモデルに沿ったものであることが必要です。このexperiで使用されるFCMモデルメントは、電圧のPMTを固定し、2.0ミクロンと電子ノイズよりも小さな粒子を除外80,000前方光散乱（FSC-H）のしきい値を使用しています。
文化と初期細胞数の調製
- 120 O℃で20分間、250mlビーカー中で藻類メディア（X50濃度）の超高純度フィルタH 2 Oおよび2ミリリットルのオートクレーブ98ミリリットル
- SIPの下のチューブにサンプル2mlの高い定常状態密度代わりにM.aeruginosa（PCC 7806）の初期のモノカルチャーから。ボルテックスまたは超音波処理20により任意のコロニー形成を脱凝集し、光学顕微鏡を通して均等に分散した細胞を確認します。
注 ：超音波への過度の露出は、細胞溶解につながることができますし、注意して使用する必要があります。 （M.aeruginosaのような種に見られるような）超音波処理は、側方光散乱（SSC-H）の強度として出力をよりSEになることができるガスの小胞を折りたたむことができますので、nsitive。 - FCMソフトウェアの中では、前方光散乱（FSC-H）からのデータを記録し、軸に対数スケールで表示するには、「ログイン」をクリックして、プロットの仕様を設定するには、ヒストグラムプロットを選択します。
- 別の出力では、このようなアクセサリ光合成色素フィコシアニン（FL4-H、675±12.5 nm）のM.aeruginosaで見つかった、などの自然蛍光を記録する（軸をログ）別のヒストグラムを選択します。
- フィコシアニンと得られる蛍光からの排出量をフィルタリングすることができる検出器を励起することができる光源を使用してください。
注 ：フィコシアニンは、600 nmでオーバー励起され、唯一の赤色光源21で検出されるのに対し、このようなクロロフィルなどの光合成色素は、一般的に使用される488nmの青色レーザーで励起することができます。ここでは、励起光源のためのフローサイトメーターのメーカーと発光検出器のスペクトルに確認してください両方488 nmおよび640 nmのレーザーを一緒に使用されました675±12.5 nmの光学フィルタ。 - 標的生物（10ミクロン）のコアサイズと比較的遅い流速（14μL/分）に最も近い最高の解像度を選択した設定を記録するために。
注 ：最高の解像度のサンプルについては、1秒あたりのイベント勧告を製造しているに応じて実行する必要があります。 - データ取得は、ゲートに電子バックグラウンドノイズまたは細胞サンプルの破片によって引き起こされる光散乱および/または蛍光シグナルをしきい値を使用する前に。
- 新しいデータセルを選択し、ログスケールのFSC-HおよびSSC-Hのパラメータを持つ密度プロットを作成して実行]をクリックします。
- サンプル密度が過剰イベント率につながる場合、希釈工程は、正確さと精度を高めるために取ることができます。
- 密度プロットでは、バックグラウンドノイズやゴミ（FSC <32万）によって製造される低レベルの散乱信号を除外するために、前のヒストグラムからソフトウェアゲートを適用します。逆にゲートより高い相対蛍光フィコシアニン細胞からの信号だけでは、これらのイベント（ - 1,950,000 FL4、56000）が挙げられます。
- ゲートされた領域に記録する細胞の数を使用し、1mlあたりどのように多くのセルを動作させるには、FCMを通過した試料の全容量で割り。
注 ：ここで使用されるFCMモデルは、試料体積を決定することを可能にするマイクロプロセッサ制御蠕動ポンプシステムを有しています。他のFCM装置を較正ビーズ懸濁液又は全試料容量を確認するためにH 2 O重量/体積の差の計算を必要とするかもしれません。 - M.aeruginosaのバッチ増殖サイクル（250,000細胞/ mlで）を開始するために新たに調製した培地に細胞の必要量を加えます。
注 ：種はそうバッチサイクルがライフサイクルの位相を決定するために、事前に記録されるべきであるそれらのインサイチュー環境パラメータおよび栄養素利用可能性に応じて成長速度が異なるであろう。
3.のOptim分子プローブの細胞取り込みの化
- M.aeruginosa文化の収穫の半分は対数期から、ステップ2で調製し、「ライブ」コントロールとして使用します。
注 ：ストレート指数期に高密度培養物から希釈されたサンプルは、初期の遅れ/誘導期から接種した培養物のそれに比べて、死んだ細胞のターンオーバーを介して最適化の結果に影響を及ぼす可能性があります。 - 1時間、パラホルムアルデヒドまたは30分6,11,22のための4％ホルムアルデヒド、60°Cの時に、このような70％エタノール、加熱サンプルのような方法を使って、「死んだ」コントロールとして残りの半分を準備します。サンプルの微小環境の変化（ 例えば 、pH値）を確認してください。
注 ：M.aeruginosaで陽性、熱殺菌された、「死んだ」制御フィコシアニン信号での減少を通じ「ライブ」のサンプルとは区別されます。他の方法により死亡率を誘導することは、同じ出力を発生させません。VARます種のY。 - 異なる比を使用して混合試料を設定する「ライブ」および「死んだ」サンプル（ 例えば 、0％、25％、50％、100％）。
- ボルテックスまたは超音波処理によって、コロニー形成を脱凝集し、pHを確認してください。
- 488 nmの緑色（FL1、530±15 nm）のからの蛍光を記録することができ、検出器と一緒にレーザーとオレンジ（FL2、585±20 nm）の核酸プローブとそれぞれの検出器をフィコシアニン信号を記録する640 nmのレーザーを選択します。
注 ：DNAに結合すると、オレンジ色の核酸プローブは、570 nmで547 nmおよび放射極大励起波長を有する一方で、緑の核酸プローブは、523 nmで504 nmおよび発光最大値のおおよその蛍光励起波長を有します。 488nmのアルゴンイオン固体レーザが両方の分子プローブを励起するために使用することができる、しかし、（547ナノメートルまで）緑色レーザは、より高いオレンジ色の蛍光を生成します。 - 出発点として、ご紹介メーカーとの分子プローブは、50％の「ライブ」50％「死んだ「文化への濃度を推奨し、暗闇の中でインキュベートします。
- 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズ（FSC-H 80,000）削減するしきい値とトリガーとSIPの下にサンプルを配置します。
- FSC-HおよびSSC-Hパラメータ、および3つのヒストグラムと密度プロットを作成します。フィコシアニンの排出量（FL4-H）と他のFSC-H、すべてのログスケールで検出するために、それぞれの分子プローブの光検出器チャンネル（FL1または2）、1つを使用して1つのヒストグラム。
- 時点（1、5、10、15、30および60分）の数で、別のデータセルに記録し、最大60分間、暗闇の中で核酸プローブとM.aeruginosaのサンプルをインキュベートします。
注 ：特定の化学物質からの潜在的な反応のために製造して例えばpHチェックなどのパラメータを調整するとき（テスト核酸ためのバッファがリン酸または一価または歌姫の高いレベルを含めることはできませんプローブDNAとの結合が減少されるように）、陽イオンを貸し。 - それぞれの蛍光プローブチャネルヒストグラムに、セルサイズの生物標的に対して - のみFSC-Hヒストグラム（150万32万）を含むようにソフトウェアゲートを適用します。
注意 ：このプロトコルで使用される濃度はM.aeruginosa試料または核酸プローブの初期ストック溶液の体積を増加または減少のいずれかによって変更することができ0.05、0.1、0.5、1、5、10、50および100μMでした。 - 蛍光プローブチャネルでは、ヒストグラムの最高ピークに別の包括的なソフトウェアゲートを適用（緑FL1-H 24万 - 165万、オレンジFL2-H 30,000 - 165,000）、続いてゲートそのポジティブプローブ蛍光密度プロットに。
- 分子プローブの濃度（例えば、x〜0.1×10）、および/または温度およびpHレベルを必要に応じて調整し、100％の「ライブ」、100％の「死んだ 'とすべての混合培養試料で3.11 - を実行して、3.1を繰り返します。 <LI>核酸で染色した細胞の合計割合を見つけるために、（合計の半分のFSC-Hまたは100％ '死んだ「文化から取られた）「死んだ」細胞の元の細胞密度に正の分子プローブの蛍光シグナルの数を比較プローブ。
- 非特異的な染色（一方向ANOVAまたはクラスカル・ウォリス検定で手段を使用を生じることなく、細胞の核酸プローブの取り込みの割合が最も高いのための最適なプロトコルを見つけるために、各濃度内の各時間帯のためにこれを行い、データは、ノンパラメトリックである場合）。
4.分子プローブの蛍光差別
- 真性または非特異的な細胞染色からの蛍光干渉/重複のテストのために50％の「ライブ」50％「死んだ」混合培養データを選択して、すべてのゲートを脱ぎます。
- フィコシアニンに、標的生物の細胞の大きさのために - FSC-Hヒストグラム（150万32万）にのみ含まれるようにソフトウェアゲートを適用しますチャネルヒストグラム。
- 門「死んだ」とラベルされた最低のピークを追加した「ライブ」として最高フィコシアニンピークとラベル、。
- 平均波長の両方を記録し、一度に一つ、「ライブ」、次に「死んだ」フィコシアニン（FL4）信号を使用して、それぞれの分子プローブの蛍光ヒストグラムチャネルにさらにゲートステップを実行します。
注記 ：この実験では死亡率を誘導するためのモードは、このプロトコルの下で明らかにフィコシアニン信号を減少させる熱処理によって行われました。 「死んだ」細胞の集団を産生する他の方法は、取得した実行で異なる出力をもたらすことができます。 - 比プラスの分子プローブの蛍光（ '死んだ'）および固有/非固有の信号（「ライブ」）の平均波長は、プロトコルの感度を決定します。
注：「ライブ」と「死んだ」populの蛍光識別を改善するために、ationsは、細胞壁の透過性、得られる蛍光信号6を改善するために栄養枯渇細胞又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で活性染色取り込みの炭素源を増加させます。スペクトル重複のためのいくつかのFCMモデルで限定補償はサンプル取得（PMT電圧が変化する）の間または後分析専用ソフトウェアからのユーザー操作ペアごとの補正によって行うことができます。 - 「死んだ」細胞の最高額が発生非特異的な染色せずに染色された最適化されたプロトコルを選択します。テストの数は、同様の結果を持っている場合は、良好な蛍光信号識別とともに、最低濃度およびインキュベーション時間でプロトコルを受け入れます。フォローサイトメーターはシャットダウン手順のための指示を製造しています。
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Representative Results
対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定の点の間の精錬データによって行うことができます。赤色光源によって問い合わせたときフィコシアニンは、M.aeruginosa光合成装置の主要な構成は、強い信号を生成する（例：640; EM：675±12.5 nm）のFSCで行われたものと同様、さらにゲート集団に使用することができ、ゲーティングが、蛍光を発する（ 図1D）。 FSCと蛍光信号から、データは、fに対するM.aeruginosa上の特定のデータに元の出力（ 図1A）から、ゲートされたことができますinal細胞数（ 図1B）。
シアノバクテリア集団における細胞当たりの自家蛍光は生理状態の関数として異なります。ここで細胞が比較的高い遠くに「ライブ」コントロール集団と「死んだ」制御用の赤色蛍光が1時間60°Cの熱にさらされた示す指数増殖期培養物から採取しました。 「ライブ」より高い顔料着色と「死んだ」低い着色されたコントロールが混在している場合、自己蛍光における減少シフトが（ 図2AおよびB）は明らかです。 「死んだ」細胞蛍光とFSCパラメータは、分子プローブを取り込んだ全細胞を区別するために使用することができます。妥協膜または「死んだ」細胞では、核酸プローブは、いずれかの追加の信号を生成します。オレンジ核酸交流のための緑の核酸プローブまたはFL2チャネル（585±20 nm）のためのFL1チャネル（530±15 nm）のネイティブの蛍光シグナル「ライブ」に比べてIDプローブ（ 図3AおよびB）。損傷膜と細胞の両方の核酸プローブの確認は、落射蛍光顕微鏡を通して見ることができる（ 図4AおよびD）。
M.aeruginosaのみが含まれるように予めゲーティングした混合試料から得られた緑色の核酸プローブで染色された細胞の全パーセンテージは、FSC-Hヒストグラム（ - 150万32万）から細胞を大きさ。 50:50「ライブ：死んだ 'はサンプル、緑色蛍光細胞は「死んだ」細胞集団の元の密度（と比較したヒストグラムFL1（530±15 nm）の最高峰からゲートされたいずれかの合計FSC-を半減することにより、唯一の100％「死んだ」細胞試料上の別の細胞数をHまたは実行しています）。 100％以上の非特異的染色が起こることを示します。グリーンnucleを取っていた細胞の平均割合IC酸プローブは、の範囲でした。インキュベーションの10分（ 表1）中の100μMの中で177.1±5.1％の1分後、0.05μMで15±0.3％。 （含まない）、1μMを超える濃度は、非特異的な染色を示した（ すなわち、分子プローブを取るようになった「ライブ」細胞）。 （ - 1μM0.05）とM.aeruginosa、F（12の緑色の核酸プローブの濃度とインキュベーション時間の間の相互作用の全体的な有意差が認められた非特異的な染色を示さなかった濃度との間の双方向ANOVA 、40）= 6.48、P <0.001。緑の核酸F（3、40）使用するプローブ= 836.92、P <0.001およびインキュベーション時間F（4,40）= 347.98、P <0.001の濃度全体の主効果がありました。ポストホックTukey検定は、0.5および1μM た （p <0.001）、以外のすべての濃度の間に有意な差を示しました60分（p <0.001） - 1の全てのインキュベーション時間の間に有意差。ただし、一元配置ANOVAから事後テューキーテストは、0.05μM（P> 0.05）および1μM（P> 0.05）（ 図5A）、30および60分の間に違いはありません緑の核酸プローブの平均摂取量を明らかにしました。 （FL4で測定）集団の識別のためのFL1の「ライブ」と「死んだの相対的蛍光シグナルの平均比が714±14.8（RFU）の60分後に0.1μMで最高の緑の核酸プローブでした30分（ 表2）の後、100μMで0.8±0.0（RFU）の最も低いです。 「ライブ」と「死んだ」で強度弁別のための相対蛍光単位（RFU）の比率を比較すると、FL1は、双方向ANOVAは、濃度及びインキュベーション時間Fとの相互作用の全体的な有意差を報告信号23.9、P <0.001緑の核酸プローブと。すべての濃度のF（7,80）= 475.41、P <0.001およびインキュベーション時間F（4,80）= 78.28、P <0.001全体の主効果に有意差がありました。 「ライブ」と熱殺した「死んだ」細胞間の蛍光信号の弁別比は、0.05μMおよび1μMの濃度の間の時間を増加したが、5μMおよび100μM（ 図5B）の間に減少しました。
オレンジ核酸プローブで染色した細胞の割合は、インキュベーションの10分（ 表後、100μMで166±3.5％に上昇し、1分後に0.05μMの濃度で、4±0.3％の平均の低い割合を見3）。再び1を超えるμMも生細胞の非特異的な染色を提示した濃度。二元配置ANOVA betwEENには非特異的な染色を示さなかった濃度（0.05 - 1μM）は、M.aeruginosa、F（12、40）= 133.55のすべてのオレンジ色の核酸プローブの濃度およびインキュベーション時間の間の相互作用の全体的な有意差を報告しP <0.001。濃度F（3、40）= 6919.67、P <0.001およびインキュベーション時間F（3、40）= 1161.45、P <0.001全体で統計的に有意な主効果がありました。しかしちょうど1μMの一元配置ANOVAを通じて事後Tukey検定は10、30および60分の間のインキュベーション時間はオレンジ核酸プローブ（すべてのP> 0.05）（ 図6A）の取り込みの統計的な差がなかったことを示しました。 「ライブ」とFL2の「死んだ」染色集団間の蛍光信号識別は、50μMで60分、30分後、0.3±0.0の低いものからオレンジ色の核酸プローブ（RFU）の範囲でした158.3±0.4（RFU）の最高に100μMの中で、0.1μM（ 表4）の濃度の60分後。双方向ANOVA濃度およびインキュベーション時間F（28、80）= 28.12、P <0.001の間の相互作用の全体的な統計的有意性を報告しました。濃度のF（7、80）= 607.9、p <0.001およびインキュベーション時間F（4、80）= 31.24、p <0.001の主な効果は、すべて有意に異なることが見出されました。 FL2で殺さ「ライブ」と熱からの信号との間の蛍光差別「 死んだ」細胞は、0.05μMおよび0.5μMの濃度の間の時間を増加したが、1μMおよび100μM（ 図6B）との間で減少しました。したがって緑核酸プローブの最適な濃度は、30分のインキュベーション時間での0.5μMであり、オレンジ核酸プローブに最適な濃度は、1μMでincu10分間減らきました。
図1. FSC、SSC＆M.aeruginosa PCC 7806.（B）ゲートされたFSCと、図1Aと同じ出力の遠赤色蛍光（675±12.5 nm）と。（A）FSCとSSCおよびを通じてM.aeruginosaのFCM出力遠赤色蛍光（例：640; EM：675±12.5 nm）で。セルの大きさを表す（C）FSC。赤並ぶ矢印は背景雑音または他のサイズの粒子を減少させるためにゲートされる領域です。 （D）赤指数相バッチ培養でM.aeruginosaから生産高フィコシアニン信号がゲート付き領域を矢印が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
M.aeruginosa熱処理した。核酸プローブの取り込みを検証するために使用される「ライブ」と「死んだ」細胞におけるM.aeruginosaの自家蛍光の変化図2.フィコシアニン信号シフト 。 （A）下着色された「死者」の人口（赤）に高い顔料着色「ライブ」人口（緑）からシフト遠赤の信号。 （B）FSCとほぼ2桁のシフトと遠赤色蛍光を合わせて出力する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
「ライブ」UnstaineからM.aeruginosa図3.オレンジ蛍光シフト「デッド」染色細胞にD。30分間1.0μmの濃度でオレンジ色の核酸プローブとインキュベートM.aeruginosa「ライブ」と「死んだ」混合を制御します。 （A）FL2（585±20 nm）のチャネルが二桁を経て「死んだ」染色人口（オレンジ）に「ライブ」未染色人口（緑）から増加したシフトを報告します。（B）A '死んだ」染色人口遠赤色の信号を減少させたが、「ライブ」人口（緑）からFL2信号を増加している（オレンジ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.分子プローブとM.aeruginosaの落射蛍光顕微鏡。マイクroscope M.aeruginosa 50:50ライブからの映像：核酸プローブとインキュベートした死者の人口は、すべての画像は倍率x1,000。 （A）「死んだ」細胞によって取り込ま緑核酸プローブの落射蛍光画像。 「ライブ」細胞は、クロロフィルの自家蛍光に赤く見えます。 （B）膜の損傷と「ライブ」の緑色色素性細胞およびより少ない着色された「死んだ」細胞を、示した図4（a）の光学顕微鏡ビュー。 （C）はライブ：死ん50:50混合M.aeruginosa集団を 。 （D）、図4（c）からオレンジ核酸プローブのインキュベーションは、「死んだ」細胞は、落射蛍光顕微鏡を介してオレンジ色を明らかに。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.グリーン核酸プローブで標識した細胞の割合と「デッド」FL1信号に「ライブ」の割合が異なる濃度およびインキュベーション時間の緑色の核酸プローブで染色したM.aeruginosa細胞の割合を意味します。 （A）0.1μMは十分な細胞を染色しなかった、5μM、0.5μMおよび1μMの非特異的な染色および濃度は、30分（a）の後に最適なインキュベーション時間を示す、人口のほぼ100％を染色を示しています。 （B）「ライブ：死んだ「指数増殖期および熱処理されたサンプルからFL1信号の比率。 0.5μMおよび1μMの濃度は、培養時間とともに増加FL1信号（RFU比二桁）の良好な識別を示します。 10μMの濃度とオーバー（グラフに示されていない）「ライブ」の貧弱な蛍光シグナルの差別や重複を示しますD '死んだ」集団。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6.オレンジの核酸プローブで標識した細胞の割合と「死者」の信号に「ライブ」の比率。M.aeruginosaの集団中の濃度およびインキュベーション時間変化の結果。録音した細胞の（A）の平均割合の濃度とFL2でオレンジ色の蛍光シグナル; 0.1と0.5μmは10分後に1μMの最適濃度とともに、5μMの染色生細胞（非特異的な染色）十分な細胞を染色していない（A）。 「ライブ：死んだ'（B）オレンジ核酸プローブFL2における比率はラッピングなしにわたって良好な差別とを表示1μM以下の濃度および1μMを超える濃度の悪い重複FL2信号（大きさの比率より低い1次）における蛍光シグナルの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| コンク。 | インキュベーション時間（分） | |||||||||
| （μM） | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 15.0 | 0.3 | 22.1 | 0.9 | 28.1 | 1.9 | 41.0 | 1.9 | 50.2 | 2.1 |
| 0.1 | 23.5 | 1.5 | 44.1 | 1.8 | 54.7 | 1.6 | 70.5 | 0.8 | 78.3 | 1.0 |
| 0.5 | 49.0 | 3.4 | 74.8 | 4.8 | 87.6 | 3.6 | 97.3 | 0.8 | 98.8 | 0.1 |
| 1 | 58.5 | 1.6 | 77.4 | 0.7 | 88.4 | 0.4 | 98.0 | 0.1 | 99.2 | 0.1 |
| 5 | 91.4 | 0.9 | 98.7 | 0.5 | 99.3 | 0.7 | 102.2 | 1.3 | 106.3 | 0.8 |
| 10 | 96.1 | 0.5 | 97.7 | 0.1 | 97.9 | 0.1 | 102.0 | 0.5 | 113.4 | 5.1 |
| 50 | 94.6 | 0.6 | 99.5 | 2.3 | 112.7 | 3.8 | 148.7 | 2.4 | 153.9 | 13.0 |
| 100 | 165.8 | 3.1 | 174.4 | 5.7 | 177.1 | 5.1 | 161.5 | 2.5 | 159.7 | 6.6 |
細胞におけるグリーン核酸プローブの表1パーセントの取り込み。緑の核酸プローブと50％の「ライブ」50％「死んだ」（熱処理）人口サンプルを用いた最適化実験からの表を示すデータ。記録した細胞の平均割合緑の核酸プローブの蛍光（FL1）は、FSC-Hカウントから得られた「死んだ」細胞の合計数に対して計算されています。 100％のショー非特異的な染色（SEは下線）上記の値。
| コンク。 | インキュベーション時間（分） | |||||||||
| （μM） | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 92.9 | 5.4 | 170.0 | 10.9 | 237.2 | 14.9 | 385.5 | 15.0 | 481.9 | 17.7 |
| 0.1 | 178.3 | 18.1 | 343.0 | 19。5 | 437.0 | 20.6 | 619.1 | 12.1 | 714.1 | 14.8 |
| 0.5 | 202.5 | 5.9 | 308.3 | 13.1 | 365.8 | 33.5 | 426.8 | 67.2 | 480.4 | 73.2 |
| 1 | 205.8 | 12.1 | 225.9 | 13.7 | 237.3 | 15.6 | 241.5 | 5.8 | 263.1 | 8.1 |
| 5 | 69.9 | 2.6 | 53.0 | 0.6 | 40.2 | 1.7 | 27.1 | 3.7 | 21.1 | 3.4 |
| 10 | 44.3 | 2.9 | 28.7 | 5.6 | 23.6 | 4.9 | 11.6 | 1.2 | 7.6 | 1.4 |
| 50 | 6.9 | 0.1 | 3.9 | 0.1 | 2.9 | 0.1 | 1.2 | 0.1 | 1.1 | 0.1 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.3 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.8 | 0.1 | 0.8 | 0.1 |
「ライブ」と「デッド」ステンド M.aeruginosa 細胞における 緑色蛍光シグナルの表2 比率 。緑の核酸プローブとの非特異的な固有の録音で染色した細胞間のFL1信号識別。サンプルはM.aeruginosa 50％「ライブ」50％「死んだ」（熱処理）を含有していましたすべての濃度およびインキュベーション時間（SEは下線付き）で測定された同じ人口の。
| コンク。 | インキュベーション時間（分） | |||||||||
| （μM） | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 4.0 | 0.3 | 14.9 | 0.2 | 23.5 | 0.8 | 39.1 | 2.4 | 37.6 | 1.5 |
| 0.1 | 14.6 | 0.4 | 42.2 | 0.5 | 55.0 | 1.1 | 72.8 | 0.9 | 80.2 | 0.1 |
| 0.5 | 54.5 | 0.4 | 79.8 | 1.2 | 86.4 | 0.4 | 91.2 | 0.1 | 93.2 | 0.1 |
| 1 | 92.0 | 0.8 | 94.8 | 0.1 | 96.9 | 0.6 | 98.4 | 0.6 | 98.4 | 0.3 |
| 5 | 91.4 | 1.5 | 93.5 | 1.8 | 102.9 | 5.4 | 118.9 | 0.1 | 124.8 | 0.1 |
| 10 | 95.9 | 1.0 | 102.4 | 1.8 | 132.9 | 6.0 | 148.9 | 4.8 | 132.8 | 5.1 |
| 50 | 107.5 | 3.7 130.6 | 16.6 | 145.2 | 0.2 | 135.4 | 16.2 | 114.6 | 6.6 | |
| 100 | 97.1 | 0.1 | 130.7 | 7.8 | 166.1 | 3.5 | 144.7 | 6.8 | 115.1 | 6.2 |
表細胞におけるオレンジの核酸プローブの3パーセントの取り込み。オレンジ核酸プローブと50％の「ライブ」50％「死んだ」を使用して最適化データを持つテーブル（熱処理）人口サンプル。オレンジ色の核酸プローブの蛍光（FL2）を記録した細胞の平均割合は、FSC-Hカウント（SEは下線）から「死んだ」細胞の合計数に対して計算されています。
| コンク。 | インキュベーション時間（分） | |||||||||
| （μM） | 1 | 5 | 10 | 30 | 60 | |||||
| 0.05 | 20.4 | 0.9 | 41.3 | 1.3 | 56.1 | 2.4 | 80.4 | 3.6 | 83.3 | 1.8 |
| 0.1 | 31.2 | 1.4 | 76.1 | 2.4 | 100.9 | 3.1 | 146.2 | 0.6 | 158.3 | 0.4 |
| 0.5 | 80.6 | 0.4 | 124.9 | 2.4 | 137.3 | 1.1 | 138.7 </ TD> | 2.1 | 132.8 | 3.9 |
| 1 | 89.7 | 16.0 | 80.9 | 16.9 | 69.1 | 10.7 | 43.0 | 5.7 | 35.9 | 6.5 |
| 5 | 10.4 | 0.6 | 7.5 | 0.1 | 5.0 | 1.0 | 2.7 | 0.5 | 1.5 | 0.1 |
| 10 | 7.0 | 0.1 | 3.6 | 0.3 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.1 | 1.2 | 0.1 |
| 50 | 2.2 | 0.4 | 1.6 | 0.3 | 1.3 | 0.0 | 0.6 | 0.1 | 0.3 | 0.0 |
| 100 | 1.7 | 0.1 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 | 0.3 | 0.0 | 0.5 | 0.2 |
「ライブ」と「デッド」ステンド M.aeruginosa 細胞における オレンジの核酸の表4 比率 。オレンジ核酸プローブ（FL2）および非特異的な固有の記録から染色された細胞間のFL2信号識別。サンプルは（SEは下線）すべての濃度およびインキュベーション時間にわたって測定し、50％同じ母集団の「ライブ」50％「死んだ」（熱処理）M.aeruginosaを含んでいました。
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Discussion
15,19,22,23 -分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃度およびインキュベーション時間（表1＆3）を確立する必要性を示しています。このプロトコルを使用するときに見られるように、オレンジ色の核酸プローブの最適な濃度及びインキュベーション時間は緑、核酸プローブは、半分の濃度を必要とするのに対し、1μMで10分間であるが、3倍の時間（ 図5および6）をとります。 1.0μM以上の濃度でこれらの細胞非透過性シアニンモノマーの両方が非膜損傷細胞とスペクトル排出量の重複を生成するために始めました。 SIのこの重なりgnalsは「ライブ」細胞は分子プローブを取っている場合は非特異的な染色が発生するという証拠を提供します。非特異的な染色からの蛍光の上に結果を慎重に各分子プローブおよび標的生物のために確立するプロトコルの開発の必要性を強調し、偽陽性を生成しました。分子プローブの最適化に最も重要なステップは次のようになります。1）分子プローブは、FCM機器とどのように相互作用するかを理解します。 2）適切な生死のコントロールを採用。 3）FCMの出力からパラメータをゲーティングの知識を開発し、4）その場の環境の理解を通してプロトコルを変更します。
光源は、光学フィルタは、フローサイトメーター内のPMT電圧および検出器を変更する能力は、そのように発光スペクトルは、蛍光チャネルに関係にあるレーザと、そこからどのような励起波長の認識が重要であり、製造業者から製造業者に変わります。データの取得と、しきい値は、そうでなければ、おそらくバックグラウンドノイズ、ゴミや死んだ細胞凝集体のために失われることになる高解像度化を課すことができます。分子プローブは、膜電位、DNA含量および酵素活性のような単一のパラメータを介して、培養することなく、種の生存性への洞察を提供することができます。しかしながら、環境試料内の同様のセルサイズおよび蛍光の多くの生物が存在し得ます。 uniagal文化の中また、細胞の集団は、必然的に分子プローブの取り込みに影響を与える可能性がある、生理的状態3度を持つことになります。 FCMの主な利点の1つは、区別し、それらはしばしば迅速で動的な条件にさらされるように、その場での微生物の生存能力を研究する際に必須であるリアルタイムで個々の細胞レベルでの生理的状態を特徴付ける能力です。その頻繁な使用にもかかわらず、細胞生存度の概念は依然として困難なままで定義します。通常、細胞増殖に適用し、生存率は非常に成長ベースのアプローチで採点されます。条件を再現するために、個々のセルに合わないことがあり、この基礎仮定は、短い落ちるかもしれないが、彼らはまだ許容してもよいです。休止またはGを入力した非増殖生理状態の細胞は（0）細胞周期27は、プローブベースのDNAサイクルまたは代謝に偽陰性を与える分子プローブと相互作用しない場合があります。
分子プローブを最適化するために実験室に成長または新たに単離された細胞を使用することにより、生態研究に使用されるデータの精製を助けます。バッチ培養の最適化に使用される細胞は、一般的に指数関数的または早期定常期で採取し、最も高い生存率を有すると仮定されています。外マトリックスを生産する高い細胞密度、定常期後期のものまたは微生物を使用している場合ただし、特別な注意を払わなければなりません。このプロトコールでは、細胞集団の死者のための制御は、1時間60 O Cは熱にさらされました、顕微鏡を通して見た膜損傷および顔料の劣化を確認する（ 図4）とFCM蛍光出力（ 図2＆3）で。天然の細胞死の原因をシミュレートするように非常に困難です。草食動物、ウイルス溶解、プログラムされた細胞死または非対称分裂24の可能性による摂取は、必ずしも実現可能か、実験室条件下で観察することができません。道徳の実験モードは、彼らが環境から生じる応力と同等ではないかもしれないとして、多くの場合（例えば、熱死滅）を疑問視されており、特定の個人が死亡し、他の細胞が観察可能な細胞の低下や死亡3を示さないされていることにより、異種の応答があってもよいです、25。研究間の正規化を緩和、混乱6,23につながるしないように測定された実験は明確に確立されなければならない操作的定義することにより、このような矛盾を避けるために。
様々な代替方法がHAVEは、分子プローブと一緒に培養物中の分析細胞生存率に使用されて。十分にすぐに記録されていない場合は退色したり、近くの細胞からのアーチファクト信号の導入は集団生理状態の推定値の下または上を与えるかもしれないが、落射蛍光顕微鏡は、使用される伝統的な技法です。これは、潜在的に低精度で撮像して最適化が非常に困難にします。以下のようなDNAおよびRNA増幅法の両方を用いて、細胞生存率のゲノム評価。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素（RT-PCR）および核酸配列ベースの増幅（NASBA）を逆にも使用されています。核酸の持続性が重く実際の細胞生存率の相関関係は、潜在的に非常に28を変化させることで、環境条件に依存するが、ゲノムの評価は、生存能力の検証の間接的な方法として役立ちます。自然の写真を光散乱および/または蛍光の組み合わせを使用することによりynthetic顔料（ 図1）は、集団のゲーティングができます、データの解像度を高める希少な人口応答を特定し、偽陽性の結果を減少させます。分子プローブに沿っFCMは、そのスピード、正確性、複数のパラメータを記録するために、単一細胞生理をテストする際に、前に述べた技術から際立っています。
FCMは、水生微生物学における強力な分析ツールであり、分子プローブを加えて産業部門に、単一のセルやコミュニティ分析など多くの分野での幅広い可能性を有する（ 例えば 、飲料水の供給を監視します）。今後の進歩が密集し、不均一試料内の個々の細胞における特定の遺伝子配列を検出し、ローカライズすることができる、FCMは、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を組み込んで見ることができました。 その場でレコーディングのためのFCMと分子プローブの移植の開発は早期のを実装するために水源の重要なデータを提供することができます資源管理のためのtrategies。ここで開発最適化プロトコルに続いて、FCMと分子プローブは、潜在的に水環境中の微生物の生理機能に関する貴重なデータを提供することに重要な役割を果たすことができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、研究施設のための支援と資金調達のための博士課程の学生デイブハートネルとボーンマス大学を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min. Followed by 2 min of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | by request | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO |
References
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