Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов ( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.

Abstract

Микробные субпопуляции в полевых и лабораторных исследований было показано, проявлять высокую неоднородность в морфологических и физиологических параметров. Определение в реальном времени состояния микробной клетке выходит за пределы живые или мертвые категорий, как микробы могут существовать в неактивном состоянии, в котором деление клеток и метаболические активности уменьшаются. Учитывая необходимость выявления и количественного определения микробов, проточной цитометрии (FCM) с молекулярными зондами обеспечивает быстрое и точный метод для определения общей жизнеспособности населения. При использовании Sytox зеленый и оранжевый Sytox в модельном цианобактерий Microcystis палочка для обнаружения целостности мембраны, мы разрабатываем передаче метод для быстрого указанием смертности одного элемента. Молекулярные зонды, используемые в этом журнале будет называться зеленым или оранжевым зондов нуклеиновых кислот соответственно (хотя существуют и другие продукты, обладающие аналогичными возбуждения и излучения длин волн, которые имеют сравнимую режимы Actioп, мы специально относятся к выше упомянутых зондов). Протоколы, использующие молекулярных зондов варьироваться между видами, отличаясь в основном в концентрации и инкубационных раз. После этого протокола, установленного на M.aeruginosa зеленый зонд нуклеиновой кислоты была оптимизирована при концентрации 0,5 мкМ после 30 мин инкубации и оранжевой зондом нуклеиновой кислоты в концентрации 1 мкМ, после 10 мин. В обоих зондов концентрации менее, чем указано оптимального привело к отчетности в соответствии с клеток с повреждением мембран. Наоборот, 5 мкМ концентрации и выше в обоих зондов выставлены тип неспецифической окрашивания, в результате чего "живые" клетки, полученные целевой флуоресценции, что приводит к более представления "нежизнеспособных" количества клеток. Положительные контроли (тепловые убитых) при условии, проверяемые мертвую биомассу, хотя целесообразность выработки управления остается предметом обсуждения. Демонстрируя логическую последовательность шагов для оптимизации зеленый и оранжевый зондов нуклеиновых кислот мы, деmonstrate как создать протокол, который может быть использован для эффективного анализа цианобактерий физиологическое состояние.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ячейка представляет собой сложную систему, которая постоянно реагирует на окружающую среду, изменяя физиологические параметры и изменения ее функции. Динамика численности населения изогенных микробных как в природе, и лабораторных зависят от развития субпопуляций, происходящих даже в относительно постоянных условиях окружающей среды 1 - 3. Изменчивость природных микробных сообществ возникает из-за весьма переменной природе условий окружающей среды. Эти иногда стохастические процессы впоследствии производить субпопуляции, которые очень отличаются в среднем населения. Последние данные показали, что эти физиологические субпопуляции по-разному реагируют на условия окружающей среды и может производить соединения сигнальных или ингибиторы, которые существенно повлиять и влияют на общее 3,4 населения.

Создание метода для определения неоднородность в популяции является ключом к ООНderstanding экологию микробов в различных средах и имеет важное значение при создании знания ложных цианобактерий, например, токсического Microcystis, который воздействует в основном на безопасности человека воды. видов, таких как Anabaena отображения морфологическую неоднородность в ответ изменений окружающей среды, разработки специализированных клеток, таких как heterocysts и akinetes 2. В отличие от этого, Microcystis клетки не проявляют очевидную неоднородность морфологического во время стрессовой реакции. Различение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток является наиболее важным аспектом физиологической дифференциации и позволяет лучше понять динамику микробных популяций. Однако, концептуальная проблема самой бактериальной жизнеспособности остается сложной и плохо характеризуется 1,5,6.

Проточная цитометрия (FCM) является надежным и быстрым методом анализа отдельных клеток. Для более глубокого понимания одного физио клетоктупой через FCM, молекулярных зондов были использованы, чтобы отличить ряд метаболических и биохимических процессов 7. Это привело к увеличению знания о видах на клеточном и населения уровне и, в свою очередь помогло управление водными ресурсами 8,9. Однако, организмы отличаются по молекулярной поглощения зонда и оттока из-за поры и насосов в клеточных стенок и мембран, которые привели к ряду молекулярного дизайна зонда и реализации протокола 6,10,11. Молекулярные зонды доступны для коммерческих и научных целей часто поставляются с общим протоколом, который может быть применим к очень разного типа клеток. Надо быть очень осторожным в передаче протоколов, разработанных для одного типа клеток в другой 6, поэтому важной задачей для оптимизации молекулярных зондов эффективно перед использованием.

Зеленые и оранжевые зонды нуклеиновых кислот связываются с обеих двухместных и одноместных мель нуклеиновых кислот с минимальной базой выберитеivity и используются для оценки целостности плазматической мембране клеток. Зеленый зонд нуклеиновой кислоты имеет значительно улучшенные сигнала флуоресценции мечения клеток по сравнению с другими молекулярных зондов, таких как пропидийиодидом основе соединений 12, которые могут также действовать в качестве индикатора клеточной жизнеспособности. Термин «Жизнеспособность клеток" здесь подразумевает, что деградация ДНК происходит после потери целостности мембраны плазмы. Зонды нуклеиновых кислот несимметричные цианиновые красители с тремя положительными зарядами и не может проникать в клетки с неповрежденными мембранами под характеризующихся концентрации, в обоих эукариот 11,13 и 14,15 прокариотических организмов. Связывание зонда нуклеиновой кислоты нуклеиновых кислот может привести к до> 500-кратному увеличению выбросов флуоресценции эндогенных сигналов в клетках, которые имеют их целостность мембраны под угрозу. Хотя молекулярных зондов, таких как зеленый зондом нуклеиновой кислоты может быть хорошим индикатором одной физиологии клеток, существует необходимость тО оптимизировать каждый зонд с намеченной целевой организма, а время инкубации менялись от 7 мин - 30 мин и концентрации колеблется от 0,1 мкМ - 0,5 мкм Microcystis экспериментов одна 15 - 19.

Здесь мы приводим протокол, чтобы оптимизировать цитометрии анализы зеленый и относительно новые оранжевые зонды нуклеиновых кислот (которые на сегодняшний день не были проверены на цианобактерий вида M.aeruginosa). Ниже развиты методика может быть передана на другие виды и использовали в качестве платформы для оптимизации протоколов в других молекулярных зондов, тем самым увеличивая понимание микробов и их экологического поведения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка Molecular Probe и проточной цитометрии

  1. Развести исходные растворы зондов нуклеиновых кислот, которые поставляются в 5 мМ раствора в диметилсульфоксид (ДМСО) в аликвоты требуемой концентрации в сверхчистой фильтруют H 2 O.
  2. Храните зондов нуклеиновых кислот в темных условиях между -5 ° С и - 25 ° С до использования.
  3. Включите цитометра и программного обеспечения нагрузки пакета (см таблицу материалов / Оборудование для спецификации ТСМ).
  4. Поместите пустую трубу гемолиза (12 х 75 мм) на инъекции образца зонда (SIP), нажмите прочистить, а затем обратно на одном уровне, чтобы начать процесс очистки FCM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые примеры этапы для SIP может вместить несколько типов труб, включая микропробирок. Молекулярная разбавитель зонда и оболочки жидкости, используемый в устройстве FCM от аналитического сорта "типа 1" 0,22 мкм мембранный источника фильтрованной.
  5. Местосвежий гемолиз трубка с 2 мл сверхчистой фильтрованной H 2 O на SIP, установить лимит времени для 10 - 15 мин и текучей скоростью быстро (или скорости потока> 66 мкл / мин).
  6. Выберите новую ячейку данных, положить на соответствующих пороговых значений для флуоресценции и рассеяния света каналов, чтобы уменьшить фоновый шум и нажмите «Выполнить».
  7. Если общая сумма событий в секунду не ниже рекомендации производителя, и, затем запустить 2 мл образец обеззараживания раствора в течение 2 мин на быстрый и повторите шаги 1.4 & 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, проверьте рекомендации изготовителя по ТСМ запуска очистки протоколы, так как они могут варьироваться в зависимости от модели. Тестирование для конкретных порогов также должен быть в соответствии с моделью ТСМ, как некоторое оборудование позволяет пользователю применять напряжений выгоды для фотоэлектронных трубок (ФЭУ) повышение или уменьшение электрического сигнала, записанного от оптических детекторов. ТСМ модель, используемая в этой экспериментовния зафиксировала ФЭУ напряжения и используется порог 80000 вперед рассеяния света (FSC-H), чтобы исключить частицы меньше, чем 2,0 мкм и электронным шума.

2. Подготовка культур и начальных кровяных клеток

  1. Автоклав 98 мл сверхчистой фильтруют H 2 O и 2 мл водорослей СМИ (концентрация x50) в 250 мл стакане в течение 20 мин при 120 о С.
  2. Из первоначального монокультуры M.aeruginosa (PCC 7806) в высоком стационарном плотности месте 2 мл образца в трубке под SIP. Обеспечить представление какое-либо образование колоний встряхиванием или обработкой ультразвуком 20 и подтвердите равномерно распределены клетки через световой микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное воздействие ультразвуковых волн может привести к лизису клеток и должны быть использованы с осторожностью. С ультразвуком может рухнуть газа пузырьки (как найти в таких видов, как M.aeruginosa) выходов, таких как сторона рассеяния света (SSC-H) интенсивность может стать более себеУчитывать регистр.
  3. В программном обеспечении ТСМ, выберите гистограммы участок для записи данных из рассеяния вперед свет (FSC-H) и настроить параметры сюжет, нажав "войти", чтобы посмотреть в логарифмической шкале по оси.
  4. В отдельный выход, выберите другой гистограмму (войти ось), чтобы записать природного флуоресценции, такие как принадлежность фотосинтетических пигментов фикоцианина (FL4-H, 675 ± 12,5 нм), найденной в M.aeruginosa.
  5. Используйте источник света, который может возбуждать фикоцианин и детектор, который может фильтровать выбросы из полученного флуоресценции.
    Примечание: фотосинтетических пигментов, таких как хлорофилл может возбуждаться с обычно используемой длине волны 488 нм синим лазером, тогда как фикоцианина возбуждается более 600 нм и будут обнаружены только с красным источника 21 света. Проконсультируйтесь с производителем цитометров для источников света возбуждения и спектров детекторов излучения, тут и 488 нм и 640 нм лазера были использованы наряду с675 ± 12,5 нм оптический фильтр.
  6. Для записи избранных настроек, наиболее близких к основной размер организма-мишени (10 мкм) и с относительно низкой скоростью потока (14 мкл / мин) с самым высоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших образцов разрешением должен работать в соответствии с рекомендацией производит событий в секунду.
  7. Прежде, чем приобрести данные использовать порог ворот из рассеяния света и / или флуоресцентных сигналов, которые вызваны электронной фонового шума или образца клеток мусора.
  8. Выберите новую ячейку данных, создать плотность участок с FSC-H и параметров SSC-H на логарифмической шкале и выберите пункт Выполнить.
  9. Если плотность образца приводит к чрезмерному скоростью событий, шаги разведение могут быть приняты для повышения точности и точности.
  10. На участке плотности применяются программные ворота от предыдущего гистограммы, чтобы исключить сигналы низкого уровня рассеяния, произведенные фонового шума и мусора (FSC <320,000). Наоборот, чем выше ворот относительная флуоресценциификоцианин сигналы от клеток и включают в себя только эти события (FL4, 56000 - 1,950,000).
  11. Используйте количество клеток, записанных в закрытых районах и разделить его на общий объем образца, который прошел через ТСМ, чтобы работать, как много клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ТСМ модель используется здесь имеет микропроцессорный блок управления системы перистальтического насоса, позволяющий объем выборки будет определен. Другое оборудование ТСМ может потребовать калиброванный шарик суспензии или расчет H 2 различия веса O / громкость, чтобы проверить общий объем выборки.
  12. Добавить необходимый объем клеток свежеприготовленных СМИ, чтобы начать цикл роста партия (250000 клеток / мл) M.aeruginosa.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вид будет отличаться темпов роста в зависимости от их в месте параметров окружающей среды и питательных веществ, наличии так производственного цикла должна быть предварительно записанных для определения фазы жизненного цикла.

3. Оптимзация Molecular Probe сотовый Поглощение

  1. Урожай половина культуры M.aeruginosa полученного на стадии 2 из экспоненциальной фазе и использовать как "живой" контроль.
    Примечание: Образцы, разбавленные с высокой плотностью культуры прямо к экспоненциальной фазе может повлиять на результаты оптимизации через оборота мертвые клетки, по сравнению с культурами, привитых от начальной латентной фазы / индукции.
  2. Приготовьте другую половину как «мертвый» управления с помощью методов, таких как 70% этанола, образцы нагревании при 60 ° С в течение 1 ч, параформальдегид или 4% формальдегиде в течение 30 мин 6,11,22. Проверьте изменения в микросреде образцов (например., Ph).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позитивная, убитых нагреванием, "мертвых" контроль в M.aeruginosa отличается от "живой" образца через его снижения в фикоцианина сигналов. Стимулирование смертности другими методами, не может привести к такой же вывод и VARу видами.
  3. Настройка смешанные образцы, используя различные соотношения "живой" и "мертвой" образцы (например, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Обеспечить представление образование колоний встряхиванием или обработкой ультразвуком и проверить рН.
  5. Выберите 488 нм лазер наряду детекторов, которые могут записывать флуоресценции от зеленого (FL1, 530 ± 15 нм) и оранжевые (fL2, 585 ± 20 нм) зондов нуклеиновых кислот и 640 нм лазера для записи сигналов через фикоцианин соответствующей детектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При связывается с ДНК, зеленый зонд нуклеиновой кислоты имеет приблизительную длину волны возбуждения флуоресценции 504 нм и эмиссии максимумов 523 нм, в то время как оранжевый зонд нуклеиновой кислоты имеет длину волны возбуждения 547 нм и эмиссии максимумов 570 нм. Аргоновый ионный лазер твердотельного лазера 488 нм могут быть использованы для возбуждения как молекулярных зондов, однако, зеленый лазер (до 547 нм) будет производить более высокую оранжевый флуоресценции.
  6. В качестве отправной точки, ввестимолекулярный зонд с производителями рекомендуется концентрацию в 50% "живой" и 50% «мертвый» культуры и инкубировать в темноте.
  7. Выберите новую ячейку данных, поместить образец в соответствии с SIP с порогами и триггеров, которые позволят уменьшить фоновый шум (FSC-H 80000).
  8. Создать плотности участок с FSC-H и параметров SSC-H, и три гистограммы. Один гистограмма с помощью соответствующего датчика молекулярной оптический детектор канал (FL1 или 2), чтобы обнаружить выбросы фикоцианин (FL4-H), а другая FSC-H, все на логарифмической шкале.
  9. Инкубируйте образцы M.aeruginosa с зондами нуклеиновых кислот в темноте в течение до 60 мин, записи в отдельных ячейках данных, в ряде временных точек (1, 5, 10, 15, 30 и 60 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При регулировке параметров, таких как проверка рН с производителями для потенциальных реакций от некоторых химических веществ (для тестируемой нуклеиновой кислоты зондов буфер не может содержать фосфаты или высокие уровни моновалентному или дивыкредитов, предоставленных катионы, а связывание с ДНК будет снижена).
  10. Применить программное обеспечение ворота включают только FSC-H гистограммы (320,000 - 1,500,000) для нецелевых организмов размер клетки, в соответствующей гистограммы канала флуоресценции зонда.
    Примечание: Концентрации, используемые в этом протоколе было 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 и 100 мкМ, которые могут быть изменены, увеличивая или уменьшая объем образца M.aeruginosa или начального исходного раствора нуклеиновых зондов.
  11. В канале зонда флуоресценции, нанесите еще один всеобъемлющий программный ворота на самый высокий пик на гистограмме (зеленый FL1-H, 240000 - 1,650,000, оранжевый FL2-H, 30000 - 165000), а затем ворота, которые положительно зонд флуоресценции в плотности участка.
  12. Выполнить шаги 3.1 - 3.11 со 100% "живых", 100% "мертвых" и всех смешанных образцов культуры, регулируя молекулярные концентрации зонда (например х 0,1 х 10 в) и / или температуры и уровня рН в случае необходимости.
  13. <LI> Сравните число положительных сигналов флуоресценции молекулярной зонд к оригинальной плотности клеток «мертвых» клеток (взято из половины общего FSC-H или 100% «мертвый» культуры), чтобы найти общий процент клеток, окрашенных с нуклеиновой кислотой зонды.
  14. Делайте это в течение каждого периода времени, в течение каждой концентрации, чтобы найти оптимальный протокол для наибольший процент поглощения зонда клеток нуклеиновой без получения неспецифического окрашивания (использовать средства в односторонний ANOVA или Крускала-Уоллиса-дисперсионного анализа, если данные непараметрической).

4. Молекулярный зонд флуоресценции Дискриминация

  1. Для тестирования флуоресценции вмешательства / перекрытия от окрашивания внутренней или неспецифической клеточной выбрать 50% "живые" и 50% "мертвых" смешанные данные культуры и снять все ворота.
  2. Применить программного ворота включают только FSC-H гистограммы (320,000 - 1,500,000) для нецелевых организмов размер клетки, в фикоцианинаГистограмма канала.
  3. Ворота самый высокий пик фикоцианин и этикетки, как "живой", с добавлением низкой пика помечены как "мертвым".
  4. Выполните следующий шаг ворота в соответствующей молекулярной гистограммы канала флуоресценции зонда, используя по одному, тем "живой", а затем "мертвых" фикоцианин (FL4) сигналы, записи двух средних длин волн.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Режим для индукции смертность в этом эксперименте было сделано с помощью термической обработки, которая при этом протокол явно уменьшается фикоцианин сигналы. Другие способы получения населением «мертвых» клеток может давать разные выходы в приобретенных трасс.
  5. Коэффициент средние длины волн положительной молекулярной флуоресценции зонда («мертвый») и внутренней / неспецифической сигнала («живой») для определения чувствительности протокола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения флуоресценции дискриминации "живой" и "мертвой" Пополь-димости увеличить источник углерода для активного поглощения питательных пятно в обедненный клеток или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), чтобы улучшить проницаемость клеточной стенки и в результате сигналов флуоресценции 6. Общество с ограниченной компенсации в некоторых моделях ТСМ для спектрального перекрытия могут быть выполнены пользователем манипулировать попарно коррекции во время сбора образца (изменение напряжения ФЭУ) или пост-аналитического специализированного программного обеспечения.
  6. Выберите оптимизированный протокол, в котором наибольшее количество «мертвых» клеток, окрашенных без возникновения неспецифического окрашивания. Если количество теста имеют аналогичные результаты принимать протокол с низкой концентрацией и инкубации времени, наряду с хорошей дискриминации сигналов флуоресценции. Последующие инструкции производителя для процедуры цитометра отключения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Вперед рассеяние света (FSC) и бокового рассеивания света (SSC) выходы из партии культуры M.aeruginosa в экспоненциальной фазе обеспечивает информацию о размере клеток (диаметр) и внутренней детализации соответственно (рис 1а). FSC может различать клетки, которые слишком велики и / или мал, чтобы быть M.aeruginosa. Такое различение или стробирования может быть сделано путем переработки данных между определенными точками выхода FSC (рис 1С). Фикоцианин, главным строение M.aeruginosa фотосинтетического аппарата производит сильный сигнал при опрошен красной источника света (например: 640; ет: 675 ± 12,5 нм), которые могут быть использованы для дальнейшего популяций затвора, аналогично сделано в FSC стробирования, но с флуоресценции (рис 1D). Из FSC и флуоресцентных сигналов, данные могут быть закрытого от первоначального выхода (фиг.1А) конкретных данных по M.aeruginosa для FИнал количество клеток (рис. 1b)

Автофлуоресцентной на ячейку в популяциях цианобактерий отличается в зависимости от физиологического состояния. Здесь клетки собирали из экспоненциальной фазы культуры, показывая относительно высокую далеко красную флуоресценцию для "живой" контрольной популяции и "мертвых" контроль был выставлен 60 ° C тепла в течение 1 часа. Когда "жить" выше пигментированные и «мертвых» нижние пигментные управления смешиваются уменьшение сдвиг в автофлуоресценции ясно (2А и В). СО «мертвых» флуоресценции клеток и параметры FSC может быть использован для дискриминации общее клеток, которые составляют молекулярную зонд. В мембране угрозу или «мертвых» клеток зонды нуклеиновых кислот будет производить дополнительный сигнал либо на; FL1 канала (530 ± 15 нм) для зеленой зондом нуклеиновой кислоты или FL2 канала (585 ± 20 нм) для оранжевого нуклеиновой переменногоID зонд (3А и В), по сравнению с родной «живые» сигнала флуоресценции. Подтверждение обоими зондами нуклеиновых кислот в клетки с повреждением мембран можно увидеть через эпифлуоресцентной микроскопии (4А & D).

Общий процент клеток, которые были обработаны с помощью зеленой зондом нуклеиновой кислоты был получен из смешанных образцов, которые были предварительно закрытого включать только M.aeruginosa размером ячеек от FSC-H гистограммы (320,000 - 1500000). В "живой": Dead 50:50 образца, зеленые флуоресцентные клетки закрытого от самого высокого пика в FL1 (530 ± 15 нм) гистограммы сравнивали с плотностью оригинала в «мертвый» клеточной популяции (либо вдвое общее FSC- Н или работает отдельный подсчет клеток на только 100% "мертвых" образцов клеток). Выше 100% будет означать, что неспецифическое окрашивание происходит. Средний процент клеток, которые поглощают зеленый NucleIC кислоты зонда в диапазоне от; 15 ± 0,3% в 0,05 мкМ 1 после мин до 177,1 ± 5,1% в 100 мкМ в течение 10 мин инкубации (Таблица 1). Концентрации более 1 мкм (не включая) показали, неспецифический окрашивание (т.е.., "Живые» клетки, которые начали занимать молекулярную зонд). Двусторонний ANOVA между концентрациями, которые не обладают неспецифической окрашивание (0,05 - 1 мкм) и показали общее значительное различие во взаимодействии между концентрацией зеленого зонда нуклеиновой кислоты и времени инкубации в M.aeruginosa, F (12 40) = 6,48, р <0,001. Был главный эффект по концентрации зеленого зондом нуклеиновой кислоты, используемой F (3, 40) = 836.92, р <0,001 и времени инкубации F (4,40) = 347.98, р <0,001. Тест-Hoc сообщение Таки указано существенное различие между концентрациями всех, кроме 0,5 и 1 мкМ (р <0,001) изначительная разница между всеми времени инкубации на 1 - 60 мин (р <0,001). Тем не менее, сообщение Специальной Тьюки тест из One Way ANOVA показал средний поглощение зеленого зонда нуклеиновой кислоты не отличается между 30 и 60 мин для 0,05 мкм (р> 0,05) и 1 мкМ (р> 0,05) (рис 5А). Среднее соотношение «живых» и «мертвых» относительно сигналов флуоресценции в FL1 для дискриминации населения (измеряется через FL4) колебалась в зеленой зонда нуклеиновой кислоты из самых высоких в 0,1 мкМ через 60 мин 714 ± 14,8 (РФС) к низкая 0,8 ± 0,0 (РФС) в 100 мкМ через 30 мин (таблица 2). Сравнивая коэффициенты относительной флуоресценции единиц (РФС) за дискриминацию интенсивности в 'живой' и '' мертвых FL1 сигнализирует двухсторонняя ANOVA сообщает общую существенную разницу во взаимодействии концентрации и времени инкубации F р <0,001 с зеленой зонда нуклеиновой кислоты. Был также значительная разница в основной эффект по всей концентрации F (7,80) = 475.41, р <0,001 и инкубационных раз F (4,80) = 78.28, р <0,001. В дискриминация отношения флуоресцентных сигналов между «живым» и тепла убитых "мертвые" клетки возрастает со временем, между концентрациями 0,05 мкм и 1 мкм, но снизился от 5 мкм и 100 мкМ (рис 5б).

Процент клеток, которые окрашивали с оранжевой зондом нуклеиновой кислоты видел средний низкий процент 4 ± 0,3%, в концентрации 0,05 мкМ до 1 мин, повышение до 166 ± 3,5% в 100 мкМ, после 10-минутной инкубации (табл 3). Опять концентрации выше 1 мкМ, также представлены неспецифического окрашивания живых клеток. Двусторонний ANOVA betwееп концентрации, которая не показала неспецифический окрашивание (0,05 - 1 мкм) сообщил общий существенное различие во взаимодействии между всеми концентраций оранжевой зондом нуклеиновой кислоты и времени инкубации в M.aeruginosa, F (12, 40) = 133.55, р <0,001. Был статистически значимая основной эффект по концентрации F (3, 40) = 6919.67, р <0,001 и времени инкубации F (3, 40) = 1161.45, р <0,001. Однако тест постфактум Туки через One Way ANOVA на всего 1 мкМ указано, что время инкубации от 10, 30 и 60 мин не было статистической разницы в поглощении апельсинового зонда нуклеиновой кислоты (все р> 0,05) (рис 6а). Дискриминация сигнала флуоресценции между «живыми» и «мертвыми» окрашивали населения в FL2 колебалась в оранжевой зондом нуклеиновой кислоты от низших 0,3 ± 0,0 (РФС) после 60 мин в 50 мкМ и 30 мв в 100 мкм до самых высоких 158,3 ± 0,4 (РФС) после 60 мин при концентрации 0,1 мкМ (таблица 4). Двусторонний ANOVA сообщили общую статистическую значимость в взаимодействий между концентрацией и времени инкубации F (28, 80) = 28,12, р <0,001. Основные эффекты концентрации F (7, 80) = 607,9, р <0,001 и времени инкубации F (4, 80) = 31,24, р <0,001 были также установлено, что все значительно отличается. Флуоресценции дискриминации между сигналами от "живых" и тепловых убил "мертвых" клеток в FL2 возрастает со временем, между концентрациями 0,05 мкм и 0,5 мкм, но снизился в период с 1 мкМ и 100 мкМ (рис 6В). Поэтому оптимальная концентрация для зеленого зондом нуклеиновой кислоты составляет 0,5 мкМ с инкубационного периода 30 мин и для оранжевого зондом нуклеиновой кислоты оптимальной концентрации 1 мкМ в INCUзатаив в течение 10 мин.

Рисунок 1
Рисунок 1. FCM Выходы M.aeruginosa Через FSC, SSC и Дальнего красной флуоресценции (675 ± 12,5 Нм). (A) FSC и SSC в PCC M.aeruginosa 7806. (Б) тот же вывод, рис 1А с закрытого ФСБ и дальнего красного флуоресцентного (например: 640 ЕМ: 675 ± 12,5 нм). (С) FSC представляющих размеры клетки. Облицованного стрелка красный обозначает область, которая коттеджный снизить фоновый шум или другие частицы размера. (D) Высокие фикоцианин сигналы, полученные из M.aeruginosa в экспоненциальной фазе периодической культуре с красной стрелкой воротами области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Рисунок 2. Фикоцианин сигнал Сдвиг в M.aeruginosa Когда термически обрабатываются. Изменение M.aeruginosa флуоресценции в «живых» и «мертвых» клеток, используемых для проверки поглощение нуклеиновой кислоты зонда. (А) Далеко красные сигналы переход от высшего пигментного "живой" населения (зеленый) к нижней мертвой пигментного '' населения (красный). (B), FSC и дальнего красного флуоресцентного комбинированные выходы со сдвигом почти на два порядка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оранжевый флуоресцентный Сдвиг в M.aeruginosa От "Live" Unstained, чтобы "мертвых" окрашенных клеток. M.aeruginosa 'живые' и "мертвые" смешанные управления инкубировали с апельсиновым зондом нуклеиновой кислоты в концентрации 1,0 мкм в течение 30 мин. (А) FL2 (585 ± 20 нм) канал сообщает повышенный переход от "живой" незапятнанной населения (зеленый) к "мертвой" окрашенных населения (оранжевый) через два порядка. (B) "мертвых" пятнами населения (оранжевый), который снизился до красных сигналов, но увеличилась сигналы FL2 из "живой" населения (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. эпифлуоресцентной микроскопия M.aeruginosa с молекулярной зондов. Microscope изображений с M.aeruginosa 50:50 LIVE: мертвой населения инкубировали с зондами нуклеиновых кислот, все изображения x 1000 увеличение. (А) эпифлуоресцентной изображение зеленого зонд нуклеиновой кислоты рассмотрен "мертвых" клеток. "Живые" клетки появляются красные из-за флуоресценции хлорофилла. (B), свет микроскопа вид фиг.4А, показывающий «живые» зеленые пигментированные клетки и меньшие пигментные «мертвых» клеток, с повреждения мембраны. (С) Live: мертвый 50:50 смешанное население M.aeruginosa. (D), Оранжевый нуклеиновой кислоты зонда инкубации с фиг.4С, с «мертвых» клеток, раскрывающих оранжевый цвет через эпифлуоресцентной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 Рисунок 5. Процент клеток Маркируется Green Нуклеиновой Кислоты зондом и отношение "живой", чтобы FL1 сигналов "мертвой". Средний процент M.aeruginosa клеток, окрашенных зеленой зондом нуклеиновой кислоты в различной концентрации и инкубации раз. (A) 0,1 мкм не окрашивали клетки, достаточно 5 мкМ шоу неспецифического окрашивания и концентрации 0,5 мкМ и 1 мкМ окрашенных почти 100% населения, показывающий оптимальные времени инкубации, после 30 мин (а). (Б) "Live: Dead 'отношения FL1 сигналы от экспоненциальной фазе роста и термообработанных образцов. Концентрации 0,5 мкм и 1 мкм показать хорошую дискриминацию FL1 сигналов возрастает со временем инкубации (РФС отношений двух порядков). Концентрации 10 мкМ и более (не представленных на графике) демонстрируют плохую дискриминации сигнала флуоресценции и перекрытия "живой"D '' мертвые популяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Процент клеток с маркировкой Orange нуклеиновых кислоты зонда и отношение "Live" сигналов, "мертвых". Результаты концентрации и времени инкубации изменений в популяциях M.aeruginosa. (А) Среднее процент клеток, которые записал оранжевый сигнал флуоресценции в FL2 с концентрациями; 0,1 мкм и 0,5 мкм, не окрашивания клеток достаточно, 5 мкМ окрашивания живые клетки (неспецифическое окрашивание), наряду с оптимальной концентрации 1 мкМ через 10 мин (а). (B) оранжевый зонд нуклеиновой кислоты "в прямом эфире:" мертвые отношения в FL2 показать хорошую дискриминацию и не над притиркифлуоресцентных сигналов в концентрации 1 мкМ или менее и бедных перекрывающихся сигналов FL2 (соотношение ниже, чем на порядок) с концентрацией более 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Конц. Время инкубации (мин)
(мкМ) 1 5 10 30 60
0,05 15.0 0,3 22.1 0.9 28.1 1.9 41,0 1.9 50,2 2.1
0,1 23,5 1.5 44,1 1.8 54,7 1.6 70,5 0,8 78,3 1.0
0,5 49,0 3.4 74,8 4.8 87,6 3.6 97,3 0,8 98,8 0,1
1 58,5 1.6 77,4 0,7 88,4 0,4 98,0 0,1 99,2 0,1
5 91,4 0.9 98,7 0,5 99,3 0,7 102.2 1.3 106.3 0,8
10 96,1 0,5 97,7 0,1 97,9 0,1 102,0 0,5 113,4 5.1
50 94,6 0,6 99,5 2.3 112,7 3.8 148,7 2.4 153,9 13.0
100 165,8 3.1 174,4 5.7 177,1 5.1 161,5 2.5 159,7 6.6

Таблица 1. Доля Поглощение Зеленый нуклеиновых кислоты зонда в клетках. Таблица, показывающая данные оптимизации эксперимента с использованием зеленого зонд нуклеиновой кислоты и 50% "живой" и 50% "мертвых" (термообработанный) образец населения. Средние процентные доли клеток, которые записанызеленая флуоресценция зонда нуклеиновой кислоты (FL1) были рассчитаны по отношению к общему количеству "мертвых" клеток, полученных из подсчета FSC-H. Значения выше 100% шоу неспецифической окрашивания (SE подчеркнуто).

Конц. Время инкубации (мин)
(мкМ) 1 5 10 30 60
0,05 92,9 5.4 170.0 10.9 237,2 14.9 385,5 15.0 481,9 17,7
0,1 178,3 18.1 343,0 19.5 437,0 20,6 619,1 12.1 714,1 14.8
0,5 202,5 5.9 308,3 13.1 365,8 33,5 426,8 67,2 480,4 73,2
1 205,8 12.1 225,9 13.7 237,3 15.6 241,5 5.8 263,1 8.1
5 69,9 2.6 53.0 0,6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44,3 2.9 28,7 5.6 23,6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0,1 3.9 0,1 2.9 0,1 1.2 0,1 1.1 0,1
100 1.7 0,1 1.3 0,1 1.1 0,1 0,8 0,1 0,8 0,1

Таблица 2. Соотношение Зеленые сигналов флуоресценции в "живой" и Витражи M.aeruginosa клеток "мертвых". Дискриминация FL1 сигнала между клетками, окрашенных зеленой зонда нуклеиновой кислоты и неспецифических внутренних записей. Образец содержал 50% "живой" и 50% "мертвых" (термообработке) M.aeruginosaиз той же популяции, измеренной по всем концентрации и инкубационных раз (SE подчеркнуто).

Конц. Время инкубации (мин)
(мкМ) 1 5 10 30 60
0,05 4.0 0,3 14.9 0,2 23,5 0,8 39,1 2.4 37,6 1.5
0,1 14.6 0,4 42,2 0,5 55,0 1.1 72,8 0.9 80,2 0,1
0,5 54,5 0,4 79,8 1.2 86,4 0,4 91,2 0,1 93,2 0,1
1 92,0 0,8 94,8 0,1 96,9 0,6 98,4 0,6 98,4 0,3
5 91,4 1.5 93,5 1.8 102.9 5.4 118,9 0,1 124,8 0,1
10 95,9 1.0 102,4 1.8 132,9 6.0 148,9 4.8 132,8 5.1
50 107,5 3.7 130,6 16,6 145,2 0,2 135,4 16.2 114,6 6.6
100 97,1 0,1 130,7 7.8 166,1 3.5 144,7 6.8 115,1 6.2

Таблица 3. Процент Поглощение Orange нуклеиновых кислоты зонда в клетках. Таблица с данными по оптимизации, используя оранжевый зонд нуклеиновой кислоты и 50% "живой" и 50% "мертвых" (термообработанный) образец населения. Средний процент клеток, которые записаны оранжевый флуоресценции зонда нуклеиновой кислоты (FL2) были рассчитаны по отношению к общему количеству "мертвых" клеток из подсчета FSC-H (SE подчеркнуты).

Конц. Время инкубации (мин)
(мкМ) 1 5 10 30 60
0,05 20.4 0.9 41,3 1.3 56,1 2.4 80,4 3.6 83,3 1.8
0,1 31,2 1.4 76,1 2.4 100,9 3.1 146,2 0,6 158,3 0,4
0,5 80,6 0,4 124,9 2.4 137,3 1.1 138,7 </ TD> 2.1 132,8 3.9
1 89,7 16.0 80,9 16,9 69,1 10.7 43,0 5.7 35,9 6.5
5 10.4 0,6 7.5 0,1 5.0 1.0 2.7 0,5 1.5 0,1
10 7.0 0,1 3.6 0,3 2.2 0,4 1.6 0,1 1.2 0,1
50 2.2 0,4 1.6 0,3 1.3 0.0 0,6 0,1 0,3 0.0
100 1.7 0,1 1.1 0,1 0,7 0,1 0,3 0.0 0,5 0,2

Таблица 4. Соотношение Orange нуклеиновых кислот в "живой" и Витражи M.aeruginosa клеток "мертвых". Дискриминация FL2 сигнала между клеток, окрашенных с оранжевой зонда нуклеиновой кислоты (FL2) и неспецифических внутренних записей. Образец содержал 50% "живой" и 50% "мертвых" (термической обработке) M.aeruginosa из той же популяции, измеренной по всем концентрации и инкубационных раз (SE подчеркнуто).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Увеличение числа публикаций с использованием молекулярных зондов указывает, что надежные и информативные данные могут быть получены 5,6,8 - 15,19,22,23. Пока еще нет идеально пятно для жизнеспособности клеток, которые могут быть эффективными во всех видах с той же концентрации и инкубации времени 6,10. Даже тот же тип датчика с измененными выбросов флуоресценции показывает необходимость создания правильной концентрации и инкубации времени (таблицы 1 и 3). Как видно при использовании этого протокола, оптимальная концентрация и инкубацию время оранжевой зондом нуклеиновой кислоты составляет 10 мин при 1 мкМ, в то время как зеленый зонд нуклеиновой кислоты потребуется только половину концентрации, но занимает в три раза длиннее (фиг.5 и 6). Оба этих клеток-impermeant мономеров цианиновых с концентрацией выше 1,0 мкм начали производить перекрытие спектров выбросов с не-мембранных ранения клеток. Это перекрытие сиgnals обеспечивает доказательства того, что неспецифическое окрашивание происходит там, где «живые» клетки занимают молекулярные зонд. В результате в течение флуоресценции неспецифической окрашивания генерируется ложных срабатываний, подчеркивая необходимость разработки протокола должен быть тщательно установлены для каждого молекулярного зонда и целевой организма. Наиболее критические шаги в оптимизации молекулярную зонд будет: 1) понимание того, как молекулярная зонд взаимодействует с инструментом FCM; 2) принятие подходящий живых и мертвых управления; 3) развитие знаний стробирования параметры из ТСМ выходов и 4) изменения протокола через понимание в месте средах.

В качестве источника света, светофильтры, возможность изменять напряжение ФЭУ и детекторы в цитометров отличаться от производителя к производителю, так что осознание того, что возбуждение волны от лазера, и где спектры излучения лежит в отношении к флуоресценции каналов имеют решающее значение. С приобретением данных,пороги могут быть наложены большее разрешение, в противном случае будут потеряны, чтобы, возможно фоновый шум, мусор или мертвых клеточных агрегатов. Молекулярные зонды могут предложить понимание жизнеспособности видов без культивирования, через отдельных параметров, таких как, мембранного потенциала, содержания ДНК и активности ферментов. Тем не менее, в пробах окружающей среды может быть много организмов аналогичного размера ячейки и флуоресценции. Кроме того в uniagal культур, популяции клеток неизбежно будет иметь степень физиологических состояниях 3, которые могут повлиять на поглощение молекул зонда. Одним из главных достоинств ТСМ является его способность различать и характеризуют физиологические состояния на индивидуальном уровне клеток в реальном времени, что очень важно при изучении микроорганизмов жизнеспособность на месте, так как они часто подвергаются частым и динамических условиях. Несмотря на частое использование, понятие жизнеспособности клеток остается трудно определить. Обычно применяется к клеточной пролиферации,жизнеспособность очень забил на подходе, основанном роста. Это предположение фундаментом может упасть Короче, как условия могут не соответствовать отдельные клетки для воспроизведения, но они все еще могут быть терпимым. Клетки в неразрастающийся физиологического состояния, вошедшие в состояние покоя или G (0) фазу клеточного цикла 27 не может взаимодействовать с молекулярной зонда дает ложные негативы в цикле ДНК или метаболических зондов на основе.

С помощью лабораторных выросли или только выделенные клетки для оптимизации молекулярных зондов будет способствовать переработку данных, используемых в экологических исследованиях. Клетки, используемые в оптимизации из пакетных культур обычно принято на показательных или начале стационарной фазы и предполагается, что самый высокий жизнеспособность. Тем не менее, особую осторожность следует проявлять при использовании высоких плотностей клеток, тех, кто в конце стационарной фазы или микробы, производящие внеклеточные матрицы. В этом протоколе контроль за мертвого популяции клеток были подвержены 60 ° C тепла в течение 1 часа,с подтверждением повреждения мембран и деградации пигмента видели через микроскопии (рис 4) и ТСМ флуоресценции выходов (рис 2 и 3). Моделирование причин естественной смерти клеток чрезвычайно трудно, как, Проглатывание травоядные, вирусной лизиса, запрограммированной клеточной смерти или возможность асимметричного деления 24 не всегда возможно или наблюдается в лабораторных условиях. Экспериментальные режимы морали часто ставится под сомнение, поскольку они не могут быть эквивалентны напряжений, возникающих из окружающей среды (например, тепло убийство) и могут быть гетерогенными ответ, с помощью которого отдельные лица были убиты и другие клетки не показывают наблюдаемый деградации или гибели 3 клеток 25. Чтобы избежать такой парадокс оперативное определение, по которому эксперименты измеренные должны быть четко установленный таким образом, чтобы не привести к путанице 6,23, ослабление нормализацию отношений между исследований.

Различные альтернативные методы ВГАе были использованы для анализа жизнеспособности клеток в культурах в сочетании с молекулярными зондами. Эпифлуоресцентной микроскопия является традиционная техника используется, хотя фотообесцвечивания или введение артефакт сигналов от соседних клеток может дать под или над подсчету населения физиологическое состояние, если не записано достаточно быстро. Это делает оптимизацию путем создания образов очень трудно, с потенциально низкой точностью. Геномную оценка жизнеспособности клеток с использованием как ДНК и РНК способы амплификации, такие как; полимеразной цепной реакции (ПЦР), обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР) и последовательностью нуклеиновой кислоты на основе амплификации (NASBA) также были использованы. Тем не менее, геномная оценка служит только в качестве косвенного метода проверки жизнеспособности, как сохранение нуклеиновой кислоты в значительной степени зависит от условий окружающей среды, с соотношением фактического жизнеспособности клеток потенциально разной безмерно 28. При использовании комбинации светорассеяния и / или флуоресценции через естественные фотографийynthetic пигменты (Рисунок 1) стробирование населения может: увеличение разрешения данных, выявления редких ответов населения и снижения ложных положительных результатов. ТСМ по молекулярных зондов выделяется от предыдущих упомянутых методов в тестировании одного физиологического клеток за скорость, точность и запись нескольких параметров.

ТСМ является мощным аналитическим инструментом в водной микробиологии и с добавлением молекулярных зондов имеет широкий потенциал в ряде областей, включая, одноклеточных и анализа сообщество промышленных секторах (например,., Контроль качества питьевой воды). Будущие успехи могли видеть ТСМ включить флуоресценции в гибридизация (FISH), которая может обнаружить и локализовать специфические генетические последовательности в отдельных клеток в плотных гетерогенных образцов. Развитие ТСМ и переносимости молекулярной зонда для набивных записей может обеспечить жизненно важные данные об источниках воды для реализации досрочных Strategies для управления ресурсами. После протокола оптимизации развитой здесь, ТСМ и молекулярные зонды могут потенциально играть важную роль в обеспечении данных о ценных микробной физиологии в водных средах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность аспирант Дэйв Хартнелл и Борнмут университет для поддержки и финансирования исследований и удобствам.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
  2. Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144, (1), 3-33 (1999).
  3. Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6, (10), 705-712 (2010).
  4. Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8, (1), 30-36 (2006).
  5. Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
  6. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77, (16), 5571-5576 (2011).
  7. Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. 273-410 (2003).
  8. Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42, (1-2), 269-277 (2008).
  9. Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28, (8), 416-424 (2010).
  10. Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
  11. Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47, (3), 692-702 (2011).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, (6), (1997).
  13. Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57, (1), 305-317 (2012).
  14. Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64, (7), 2697-2700 (1998).
  15. Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47, (July), 195-206 (2012).
  16. Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517, (1-3), 107-120 (2004).
  17. Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19, (1), 20-25 (2004).
  18. Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8, (6), 857-863 (2009).
  19. Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47, (6), 1316-1325 (2011).
  20. Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13, (3), 269-277 (1978).
  21. Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. Andersen, R. A. Academic press. 253-268 (2005).
  22. Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
  23. Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60, (4), 641-696 (1996).
  24. Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division? J. Plankton Res. 36, (1), 11-17 (2013).
  25. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62, (4), 1311-1316 (1996).
  26. Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).
  27. Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, (2), 187-206 (2004).
  28. Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53, (2), 175-183 (2003).
Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов (<em&gt; Microcystis палочки</em&gt;), Используя проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter