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Medicine

Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo ( doi: 10.3791/53036 Published: January 29, 2016

Summary

Las poblaciones microbianas contienen heterogeneidad celular sustancial, que puede dictar el comportamiento general. Análisis de la sonda molecular a través de citometría de flujo puede determinar estados fisiológicos de las células, sin embargo su aplicación varía entre las especies. Este estudio proporciona un protocolo para determinar con precisión la mortalidad celular dentro de una población cianobacteria, sin menospreciar o grabación de resultados falsos positivos.

Abstract

Subpoblaciones microbianos en los estudios de campo y de laboratorio se ha demostrado que mostrar una alta heterogeneidad en los parámetros morfológicos y fisiológicos. Determinar el estado en tiempo real de una célula microbiana va más allá de las categorías vivos o muertos, como los microbios pueden existir en un estado latente, en el que la división celular y las actividades metabólicas se reducen. Teniendo en cuenta la necesidad de detección y cuantificación de los microbios, citometría de flujo (FCM) con sondas moleculares proporciona un método rápido y preciso para ayudar a determinar la viabilidad global de la población. Mediante el uso de SYTOX verde y SYTOX naranja en el modelo de cianobacterias Microcystis aeruginosa para detectar la integridad de membrana, desarrollamos un método transferible para la indicación rápida de la mortalidad de células individuales. Las sondas moleculares utilizados en esta revista se hará referencia a sondas de ácido nucleico como verde o naranja, respectivamente (aunque hay otros productos con longitudes de onda de excitación y emisión similares que tienen unos modos comparables de action, nos referimos específicamente a la palestra mencionó sondas). Protocolos utilizando sondas moleculares varían entre especies, que difieren principalmente en la concentración y el tiempo de incubación. Siguiendo este protocolo establecido en M. aeruginosa la sonda de ácido nucleico verde se optimizó en concentraciones de 0,5 M después de 30 minutos de incubación y la sonda de ácido nucleico naranja en 1 M después de 10 min. En ambas sondas concentraciones inferiores a la óptima indicado conducido a un bajo notificación de células con daño de la membrana. Por el contrario, 5 M concentraciones y superior en ambas sondas mostraron un tipo de tinción no específica, mediante el cual las células 'en vivo' producen una fluorescencia de destino, lo que lleva a una representación más del número de células "no viables". Los controles positivos (con el calor mató), siempre biomasa muerta comprobable, aunque la adecuación de la generación de control sigue siendo objeto de debate. Al demostrar una secuencia lógica de pasos para la optimización de las sondas de ácido nucleico verde y naranja de nosotrosmonstrate cómo crear un protocolo que se puede utilizar para analizar el estado fisiológico de cianobacterias con eficacia.

Introduction

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La célula es un sistema complejo, que responde constantemente con el medio ambiente mediante la modificación de parámetros fisiológicos y alterar su función. La dinámica poblacional de las poblaciones microbianas isogénicas tanto en la naturaleza y el laboratorio se ven afectados por el desarrollo de las subpoblaciones, ocurriendo incluso en relativamente constantes las condiciones ambientales 1 - 3. La variabilidad de las comunidades microbianas naturales surge debido a la naturaleza altamente variable de condiciones ambientales. Estos procesos estocásticos veces posteriormente producen subpoblaciones que son muy diferentes a la media de la población. La evidencia reciente ha revelado que estas subpoblaciones fisiológicos responden de manera diferente a las condiciones ambientales y pueden producir compuestos de señal o inhibidores que afectan e influyen en el 3,4 de la población general de forma espectacular.

El establecimiento de un método para definir la heterogeneidad dentro de una población es clave para la ONUcomprensión de la ecología de microbios en distintos ambientes y es esencial en la construcción de conocimiento de cianobacterias molestia, como la Microcystis tóxico, lo que afecta en gran medida de la seguridad del agua humana. Especies como Anabaena mostrar la heterogeneidad morfológica en respuesta a las fluctuaciones ambientales, el desarrollo de las células especializadas como heterocistos y acinetas 2. En contraste, las células Microcystis no se muestran heterogeneidad morfológica evidente durante una respuesta de estrés. La discriminación entre células viables y no viables es el aspecto más importante de la diferenciación fisiológica y permite una mejor comprensión de la dinámica de la población microbiana. Sin embargo, el problema conceptual de la viabilidad bacteriana en sí sigue siendo difícil y mal caracterizado 1,5,6.

La citometría de flujo (FCM) es un método fiable y rápida de analizar las células individuales. Para aumentar la comprensión de la única fisio celularlogía a través de FCM, sondas moleculares se han utilizado para distinguir una serie de procesos metabólicos y bioquímicos 7. Esto ha llevado a un mayor conocimiento de las especies a nivel celular y la población y, a su vez ayudó a la gestión de los recursos hídricos 8,9. Sin embargo, los organismos difieren en cuanto a la captación de la sonda molecular y flujo de salida debido a los poros y las bombas en las paredes celulares y membranas, que han conducido a una serie de diseño de la sonda molecular y la aplicación del protocolo 6,10,11. Sondas moleculares disponibles para propósitos comerciales y de investigación se suministran a menudo con un protocolo genérico que puede ser aplicable a un tipo de célula muy diferente. Hay que ser muy prudente en la transferencia de los protocolos desarrollados para un tipo de célula a otro 6, por lo tanto, es una tarea esencial para optimizar sondas moleculares con eficacia antes de su uso.

Las sondas de ácido nucleico verde y naranja se unen a los dos ácidos nucleicos de cadena dobles e individuales con la base mínima seleccioneivity y se utilizan para evaluar la integridad de la membrana plasmática de las células. La sonda de ácido nucleico verde tiene una señal de fluorescencia etiquetado celular notablemente mejorado en comparación con otras sondas moleculares, tales como compuestos a base de yoduro de propidio 12, que también puede actuar como un indicador de la viabilidad celular. El término "viabilidad celular 'aquí presupone que la degradación del ADN se produce después de la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Las sondas de ácidos nucleicos son tintes de cianina asimétrica con tres cargas positivas y no pueden entrar en las células con membranas intactas bajo concentraciones caracterizadas, en ambas eucariotas y procariotas 14,15 11,13 organismos. La unión de una sonda de ácido nucleico a los ácidos nucleicos puede resultar en un aumento de hasta tapa> 500 de emisiones de fluorescencia a partir de señales endógenas en las células que tienen su integridad de la membrana comprometida. Aunque sondas moleculares, tales como la sonda de ácido nucleico verde puede ser un buen indicador de la fisiología de células individuales, hay una necesidad de to optimizar cada sonda con el organismo objetivo pretendido, como los tiempos de incubación han variado de 7 min - 30 min y rangos de concentración de 0,1 M - 0,5 M en experimentos Microcystis solo 15 - 19.

Aquí se presenta un protocolo para optimizar los ensayos de citometría de verde y las relativamente nuevas sondas de ácidos nucleicos naranja (que hasta la fecha no ha probado en las especies de cianobacterias M. aeruginosa). La siguiente metodología desarrollada puede entonces ser transferido a otras especies y se utiliza como una plataforma para la optimización de protocolos en otras sondas moleculares, aumentando con ello la comprensión de los microbios y su comportamiento ecológico.

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Protocol

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1. Preparación de la sonda Molecular y citómetro de flujo

  1. Diluir las soluciones madre de las sondas de ácido nucleico, que se suministran en forma de solución 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) a alícuotas de las concentraciones requeridas en ultrapura filtrada H2O
  2. Guarde las sondas de ácido nucleico en condiciones de oscuridad entre -5 ° C y - 25 ° C hasta su uso.
  3. Encienda el citómetro de flujo y el paquete de software de carga (ver tabla de Materiales / Equipo para especificaciones FCM).
  4. Coloque un tubo de hemólisis vacía (12 x 75 mm) en la sonda de inyección de muestra (SIP), haga clic en destapar y luego de vuelta al ras para iniciar el proceso de limpieza FCM.
    NOTA: Algunas etapas de la muestra para el SIP puede acomodar varios tipos de tubos, incluyendo tubos de microcentrífuga. El diluyente de la sonda y la vaina de fluido molecular utilizado en el aparato FCM es de una calidad analítica "tipo 1" 0,22 micras membrana fuente filtrada.
  5. Lugarun tubo de hemólisis fresca con 2 ml de ultrapura H 2 O filtrada en la SIP, establece un límite de tiempo para el 10 - 15 min y una velocidad de fluido a ayunar (o un caudal de> 66 l / min).
  6. Seleccione una nueva celda de datos, se puso umbrales relevantes para fluorescencia y canales de dispersión de luz para reducir el ruido de fondo y haga clic en "Ejecutar".
  7. Si los eventos totales por segundo no están por debajo de la recomendación de los fabricantes, a continuación, ejecutar una muestra de 2 ml de solución descontaminante durante 2 minutos en el rápido y luego repita los pasos 1.4 y 1.5.
    NOTA: Por favor, consulte las recomendaciones del fabricante para la FCM puesta en marcha de protocolos de limpieza, ya que pueden variar entre modelos. Pruebas de umbrales específicos también tiene que estar en línea con el modelo FCM como algunos equipos permite al usuario aplicar voltajes ganancias a los tubos fotomultiplicadores (PMT) mejorando o disminuyendo la señal eléctrica registrada por los detectores ópticos. El modelo utilizado en este FCM experición ha fijado PMT tensión y se utiliza un umbral de 80.000 dispersión frontal de luz (FSC-H) para excluir partículas menores de 2.0 micras y ruido electrónico.

2. Preparación de las Culturas y recuento de células iniciales

  1. Autoclave 98 ml de ultrapura filtrada H 2 O y 2 ml de medio de algas (concentración x50) en un vaso de 250 ml durante 20 minutos a 120 ° C
  2. Desde un monocultivo inicial de M. aeruginosa (PCC 7806) en un lugar de alta densidad constante estado 2 ml de la muestra en un tubo debajo de la SIP. Desglosar cualquier formación de colonias por agitación o sonicación 20 y confirme células uniformemente dispersadas a través de microscopía de luz.
    NOTA: La exposición excesiva a las ondas ultrasónicas puede conducir a la lisis celular y debe usarse con precaución. Desde sonicación puede colapsar vesículas de gas (como se encuentra en especies como M. aeruginosa) salidas como la luz de dispersión lateral (SSC-H) intensidad puede ser más en sínsitive.
  3. Dentro del software FCM, seleccionar un histograma para registrar los datos de dispersión de la luz hacia adelante (FSC-H) y configurar las especificaciones de la trama haciendo clic en "log" para ver en una escala logarítmica en el eje.
  4. En una salida independiente, seleccione otro histograma (log eje) para registrar la fluorescencia natural como la ficocianina accesorio pigmento fotosintético (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), que se encuentra en M. aeruginosa.
  5. Utilice una fuente de luz que puede excitar ficocianina y un detector que puede filtrar las emisiones de la fluorescencia resultante.
    NOTA: pigmento fotosintético como la clorofila puede ser excitado con el comúnmente utilizado 488 nm láser azul, mientras que la ficocianina se excita más de 600 nm y sólo se detecta con una fuente de luz roja 21. Consulte con el fabricante citómetros de flujo para fuentes de luz de excitación y los espectros de detectores de emisión, aquí tanto un 488 nm y un láser de 640 nm se utiliza junto con unaun filtro óptico de 675 nm ± 12,5.
  6. Para la grabación de los selectos configuración más alta resolución más cercanos al tamaño del núcleo del organismo objetivo (10 micras) y un caudal relativamente lento (14 l / min).
    NOTA: Para obtener los mejores muestras resolución debe ejecutarse de acuerdo con las manufacturas recomendación de eventos por segundo.
  7. Antes de la adquisición de datos utilizan un umbral de puerta de la luz de dispersión y / o señales de fluorescencia que son causadas por el ruido de fondo electrónica o escombros muestra celular.
  8. Seleccione una nueva celda de datos, cree una parcela densidad con parámetros SSC-H FSC-H y en una escala logarítmica y en Ejecutar.
  9. Si la densidad de la muestra lleva a una tasa de eventos excesivo, pasos de dilución se pueden tomar para aumentar la exactitud y precisión.
  10. En la parcela de densidad aplicar puertas de software desde el histograma anterior para excluir señales de dispersión de nivel bajo, producidas por el ruido de fondo o desechos (FSC <320.000). A la inversa puerta de la mayor fluorescencia relativaseñales ficocianina de células y sólo incluyen estos eventos (FL4, 56000 - 1.950.000).
  11. Utilice el número de células registradas en las zonas cerradas y se divide por el volumen total de la muestra que ha pasado a través de la FCM, de averiguar cómo muchas células por ml.
    NOTA: El modelo FCM usada aquí tiene un sistema de bomba peristáltica controlada por microprocesador que permite un volumen de muestra que se determine. Otros equipos FCM puede requerir una suspensión de perlas calibrado o un cálculo de H 2 diferencias de peso O / volumen para verificar el volumen total de la muestra.
  12. Añadir el volumen necesario de las células a los medios recién preparados con el fin de iniciar un ciclo de crecimiento por lotes (250.000 células / ml) de M. aeruginosa.
    NOTA: Las especies difieren en las tasas de crecimiento en función de sus parámetros de entorno in situ y la disponibilidad de nutrientes, por lo que un ciclo de lote debe ser pre-registrado para determinar las fases del ciclo de vida.

3. Optimzación de Molecular Probe captación celular

  1. Medio de la cosecha de la cultura M. aeruginosa preparado en el paso 2 desde una fase exponencial y utilizar como un control "en vivo".
    Nota: Las muestras diluidas partir de un cultivo de alta densidad directamente a una fase exponencial pueden afectar los resultados de optimización a través de la renovación celular muerto, en comparación con la de los cultivos inoculados a partir de una fase inicial lag / inducción.
  2. Preparar la otra mitad como control "muerto" mediante el uso de métodos tales como etanol 70%, las muestras de calefacción a 60 ° C durante 1 hr, paraformaldehído o 4% de formaldehído durante 30 min 6,11,22. Compruebe variaciones en el microambiente muestras (por ejemplo., Ph).
    NOTA: El,, control positivo muertos por calor "muerto" en M. aeruginosa se ​​distingue de una muestra "en vivo" a través de su disminución en señales ficocianina. Inducir la mortalidad por otros métodos no puede causar la misma salida y Vary en especie.
  3. Establecer muestras mixtas utilizando diferentes proporciones de "en vivo" y las muestras de 'muertos' (por ejemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
  4. Desglosar la formación de colonias por agitación o sonicación y comprobar el pH.
  5. Seleccionar un láser de 488 nm junto con detectores que pueden registrar la fluorescencia de la verde (FL1, 530 ± 15 nm) y naranja (FL2, 585 ± 20 nm) sondas de ácido nucleico y el láser 640 nm para grabar señales de ficocianina través de su respectivo detector.
    NOTA: Cuando se une al ADN, la sonda de ácido nucleico verde tiene una longitud de onda de excitación de fluorescencia aproximada de 504 nm y máximos de emisión de 523 nm, mientras que la sonda de ácido nucleico naranja tiene una longitud de onda de excitación de 547 nm y las emisiones máximas de 570 nm. Un ion argón láser de estado sólido 488 nm se puede emplear para excitar ambas sondas moleculares, sin embargo, un láser verde (547 nm hasta) producirá una fluorescencia naranja superior.
  6. Como punto de partida, la introducción de lasonda molecular con los fabricantes recomienda la concentración a la cultura "muerta" 50% "en vivo" y el 50% y se incuba en la oscuridad.
  7. Seleccione una nueva celda de datos, coloque la muestra bajo el SIP con umbrales y disparadores que reduzcan el ruido de fondo (FSC-H 80000).
  8. Crear una parcela densidad con parámetros SSC-H FSC-H y, y tres histogramas. Un histograma utilizando la sonda molecular canal detector óptico respectivo (FL1 o 2), uno para detectar las emisiones de ficocianina (FL4-H) y el otro FSC-H, todo en una escala logarítmica.
  9. Incubar las muestras de M. aeruginosa con las sondas de ácido nucleico en la oscuridad durante hasta 60 min, la grabación en las células de datos separados, en un número de puntos de tiempo (1, 5, 10, 15, 30 y 60 min).
    NOTA: Al ajustar parámetros como la verificación de pH con fabrica para las reacciones potenciales de ciertos productos químicos (por el ácido nucleico probado sondas un buffer no puede contener fosfatos o altos niveles de monovalente o divacationes prestados, como la unión con el ADN se reducirá).
  10. Aplique una puerta software para incluir sólo el histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000) para el objetivo organismos tamaño de la celda, en la respectiva sonda de fluorescencia canal histograma.
    NOTA: Las concentraciones utilizadas en este protocolo fueron 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 mM, que pueden ser alterados por ya sea aumentando o disminuyendo el volumen de la muestra M. aeruginosa o solución madre inicial de sondas nucleicos.
  11. En el canal de la sonda de fluorescencia, aplique otra puerta software incluido con el pico más alto en el histograma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, naranja FL2-H, 30000 - 165000) y, posteriormente, puerta que la sonda positiva de fluorescencia en la trama de densidad.
  12. Ejecutar los pasos 3.1 a 3.11, con, 100% y todas las muestras de cultivo mixtos "muertas" 100% "en vivo", el ajuste de las concentraciones de sondas moleculares (por ejemplo x 0.1 x 10 a) y / o la temperatura y los niveles de pH de ser necesario.
  13. <li> Comparar el número de señales de fluorescencia sonda molecular positivos a la densidad celular original de células muertas "(tomado de la mitad del total FSC-H o un cultivo de 100%" muerto ") para encontrar el porcentaje total de células teñidas con el ácido nucleico sondas.
  14. Haga esto para cada período de tiempo dentro de cada concentración para encontrar el protocolo óptimo para el mayor porcentaje de nucleico celular sonda de absorción sin producir tinción no específica (utilice los medios en un ANOVA de un factor o Prueba de Kruskal-Wallis, si los datos son no paramétrico).

4. Molecular sonda de fluorescencia Discriminación

  1. Para la prueba de fluorescencia interferencia / superposición de tinción celular intrínseca o no específica seleccionar los datos de cultivo de 50% 'en vivo' y el 50% 'muertas' mezclados y quitar todas las puertas.
  2. Aplique una puerta software para incluir sólo el histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000) para el objetivo Microorganismos tamaño de la celda, en la ficocianinahistograma canal.
  3. Puerta de la cumbre más alta ficocianina y etiqueta como "en vivo", con la adición del pico más bajo etiquetado como "muerto".
  4. Realizar un paso más en la puerta de canal respectivo histograma de fluorescencia de la sonda molecular, utilizando uno a la vez, el "en vivo" y, a continuación ficocianina "muerto" (FL4) señales, registrando ambas longitudes de onda medias.
    NOTA: El modo para inducir la mortalidad en este experimento se llevó a cabo por tratamiento térmico, que bajo este protocolo disminuye claramente señales ficocianina. Otros métodos de producción de las poblaciones de células muertas pueden producir diferentes resultados en las carreras adquiridos.
  5. Relación de las longitudes de onda media de la fluorescencia positiva molecular sonda ("muerto") y la señal intrínseca / no específica ("en vivo") para determinar la sensibilidad de protocolo.
    NOTA: Para mejorar la discriminación de fluorescencia de "en vivo" y Población "muerto"ciones, aumentan la fuente de carbono a la absorción de la mancha activa en las células de nutrientes agotados o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para mejorar la permeabilidad de la pared celular y señales de 6 fluorescencia resultante. Compensación limitada en algunos modelos FCM para solapamiento espectral se puede realizar mediante la corrección pairwise-manipulado usuario durante la adquisición de la muestra (cambios de voltaje PMT) o de software especializado post-analítica.
  6. Seleccione el protocolo optimizado, donde la mayor cantidad de células muertas '' se ha manchado sin la ocurrencia de tinción no específica. Si un número de prueba tiene resultados similares aceptar el protocolo con la concentración y el tiempo de incubación más bajo, junto con una buena discriminación de la señal de fluorescencia. Siga las instrucciones del fabricante para el procedimiento de apagado citómetro.

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Representative Results

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Dispersión frontal de luz (FSC) y salidas de luz lateral de dispersión (SSC) a partir de un cultivo discontinuo M. aeruginosa en fase exponencial proporciona información sobre el tamaño celular (diámetro) y granularidad interna, respectivamente (Figura 1). FSC puede discriminar las células que son demasiado grandes y / o pequeños para ser M. aeruginosa. Esta discriminación o compuerta se puede hacer mediante los datos de refinación entre determinados puntos de una salida de FSC (Figura 1C). Ficocianina, un importante constitución del aparato fotosintético M. aeruginosa produce una señal fuerte cuando es interrogado por una fuente de luz roja (ex: 640; em: 675 ± 12,5 nm), que se puede utilizar para otras poblaciones de puerta, similar al realizado en FSC gating pero con fluorescencia (Figura 1D). A partir de señales FSC y de fluorescencia, los datos pueden gated desde la salida original (Figura 1A) a los datos específicos de M. aeruginosa para frecuentos de células Inal (Figura 1B).

Autofluorescencia por célula en las poblaciones de cianobacterias difiere en función del estado fisiológico. Aquí se recogieron las células de un cultivo en fase exponencial que muestra relativamente alta fluorescencia rojo lejano para una población de control "en vivo" y el control "muerto" fue expuesto al calor C 60 ° durante 1 hora. Cuando 'viven' controles pigmentadas inferiores pigmentadas y 'muertos' más altos se mezclan el turno de la disminución en la autofluorescencia es clara (Figuras 2A y B). La fluorescencia celular "muerto" y los parámetros del FSC se pueden utilizar para discriminar las células totales que se han producido hasta la sonda molecular. En la membrana comprometida o células "muertas" las sondas de ácido nucleico producirán una señal adicional, ya sea en; Canal FL1 (530 ± 15 nm) para la sonda de ácido nucleico verde o canal FL2 (585 ± 20 nm) para la ac nucleico naranjasonda de Identificación (Figuras 3A y B), en comparación con el 'vivir' señal de fluorescencia nativa. Confirmación de ambas sondas de ácido nucleico en células con membranas daño puede ser visto a través de microscopía de epifluorescencia (Figuras 4A y D).

El porcentaje total de células que habían sido manchados por la sonda de ácido nucleico verde se obtuvo a partir de muestras mixtas, que eran pre-cerrada para incluir sólo M. aeruginosa dimensionado células de un histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000). En un 'vivo: muerto "50:50 muestra, las células de fluorescencia verde urbanización cerrada desde el pico más alto en un FL1 (530 ± 15 nm) histograma se comparó con la densidad original en la población de células" muerto "(ya sea por reducción a la mitad del total de FSC H o correr un recuento separado sólo los 100% de las muestras de células "muertas"). Por encima de 100% indicaría que se produce la tinción no específica. El porcentaje medio de células que habían asumido el nucle verdeic sonda de ácido osciló entre; 15 ± 0,3% en 0,05 M después de 1 min a 177,1 ± 5,1% en 100 mM durante 10 min de incubación (Tabla 1). Concentraciones más de 1 M (no incluidas) mostraron tinción no específica (es decir., Las células 'en vivo' que comenzaron a tomar la sonda molecular). Un ANOVA de dos sentidos entre las concentraciones que no exhiben tinción no específica (0,05 a 1 mM) y mostraron una diferencia significativa global en la interacción entre la concentración de sonda de ácido nucleico verde y el tiempo de incubación en M. aeruginosa, F (12 , 40) = 6.48, p <0.001. Hubo un efecto principal a través de las concentraciones de sonda verde ácido nucleico utilizado F (3, 40) = 836,92, p <0,001, y los tiempos de incubación F (4,40) = 347.98, p <0,001. Una prueba post-hoc de Tukey indicó una diferencia significativa entre todas las concentraciones, excepto 0,5 y 1 mM (p <0,001) y unadiferencia significativa entre todos los tiempos de incubación de 1 - 60 min (p ​​<0,001). Sin embargo, una prueba de Tukey post hoc de un One Way ANOVA reveló la absorción media de sonda de ácido nucleico verde no difiere entre los 30 y 60 minutos de 0,05 M (p> 0,05) y 1 M (p> 0,05) (Figura 5A). La proporción media de las señales de fluorescencia relativa 'en vivo' y 'muertos' en FL1 de la discriminación de las poblaciones (medido a través FL4) osciló en la sonda de ácido nucleico verde de las más altas de 0,1 M después de 60 minutos de 714 ± 14.8 (RFU) a la más bajo de 0,8 ± 0,0 (RFU) en 100 mM después de 30 min (Tabla 2). Comparando las proporciones de unidades de fluorescencia relativa (RFU) por discriminación en intensidad "en vivo" y "muerto" FL1 señala un ANOVA de un factor de dos reporta una diferencia global significativa en la interacción entre las concentraciones y tiempos de incubación F p <0,001 con la sonda de ácido nucleico verde. También hubo una diferencia significativa en el efecto principal a través de todas las concentraciones de F (7,80) = 475.41, p <0,001 y tiempos de incubación F (4,80) = 78.28, p <0,001. Las relaciones de discriminación de señales de fluorescencia entre el "en vivo" y el calor muertos células "muertas" aumentaron con el tiempo entre las concentraciones de 0,05 mM y 1 mM pero disminuyeron entre 5 mM y 100 mM (Figura 5B).

El porcentaje de células que se tiñeron con la sonda de ácido nucleico de naranja vio un bajo porcentaje media de 4 ± 0,3%, en una concentración de 0,05 mM después de 1 min, elevándose a 166 ± 3,5% en 100 mM después de 10 min de incubación (Tabla 3). Una vez más las concentraciones de más de 1 M también presentaron tinción no específica de células vivas. Una de dos vías ANOVA between las concentraciones que no mostraron tinción no específica (0,05 a 1 mM) informó de una diferencia significativa global en la interacción entre todas las concentraciones de la sonda de ácido nucleico de naranja y los tiempos de incubación en M. aeruginosa, F (12, 40) = 133,55, p <0,001. Hubo un efecto principal estadísticamente significativa a través de las concentraciones de F (3, 40) = 6919.67, p <0,001, y los tiempos de incubación F (3, 40) = 1161.45, p <0,001. Sin embargo una prueba Post Hoc de Tukey a través de un One Way ANOVA en sólo 1 M indica que los tiempos de incubación entre 10, 30 y 60 min tenido ninguna diferencia estadística en la absorción de la sonda de ácido nucleico naranja (todos p> 0,05) (Figura 6). La discriminación de la señal de fluorescencia entre las poblaciones 'en vivo' y 'muertos' manchado en FL2 osciló en sonda de ácido nucleico de naranja de la más baja de 0,3 ± 0,0 (RFU) después de 60 minutos en 50 mM y 30 men en 100 mM a la más alta de 158,3 ± 0,4 (RFU) después de 60 min a una concentración de 0,1 M (Tabla 4). Una de dos vías ANOVA reportó una significación estadística general de las interacciones entre las concentraciones y tiempo de incubación F (28, 80) = 28,12, p <0,001. También se encontraron Los principales efectos de la concentración F (7, 80) = 607,9, p <0,001 y tiempos de incubación F (4, 80) = 31,24, p <0,001 para ser todo significativamente diferentes. La discriminación de fluorescencia entre las señales de las células 'en vivo' y calor matado 'muertos' en FL2 aumentó con el tiempo entre las concentraciones de 0,05 M y 0,5 M, pero disminuyó entre 1 mM y 100 mM (Figura 6B). Por lo tanto la concentración óptima para la sonda de ácido nucleico verde es de 0,5 m con un tiempo de incubación de 30 min y para la sonda de ácido nucleico de naranja la concentración óptima se incu 1 Macanalados para 10 min.

Figura 1
Figura 1. Salidas FCM de M. aeruginosa través de FSC, SSC y Lejano Red de fluorescencia (675 ± 12,5 nm). (A) FSC y SSC de M. aeruginosa PCC 7806. (B) El mismo resultado que la figura 1A con FSC cerrada y ahora fluorescencia roja (por ejemplo: 640; em: 675 ± 12,5 nm). (C) FSC que representa los tamaños de la célula. La flecha roja indica la forrado área que está cerrada para reducir el ruido de fondo o otras partículas de tamaño. (D) las señales de alta ficocianina producidos a partir de M. aeruginosa en un cultivo discontinuo fase exponencial con rojo flechas áreas gated. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura Shift 2. Ficocianina señal de M. aeruginosa Cuando tratados térmicamente. Cambio de M. aeruginosa autofluorescencia en las células 'en vivo' y 'muertos' utilizados para validar nucleico captación sonda de ácido. (A) señales Lejos rojas cambiantes de una mayor pigmentada "en vivo" de la población (verde) para una población inferior pigmentada "muerto" (rojo). (B) del FSC y de fluorescencia roja salidas combinadas lejanos con un desplazamiento de casi dos órdenes de magnitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Naranja Fluorescencia Shift en M. aeruginosa De 'Live' Unstained para las células teñidas 'Dead'. 'vivo' y controles mezclados M. aeruginosa 'muertos' incubadas con sonda de ácido nucleico de naranja en una concentración de 1,0 m durante 30 minutos. (A) FL2 (585 ± 20 nm) de canal informa de un aumento del desplazamiento de una población sin mancha "en vivo" (verde) a una población "muerto" manchado (naranja) a través de dos órdenes de magnitud. (B) Una población "muerto" manchado (naranja), que ha disminuido señales ahora de color rojo, pero aumentó señales FL2 de una población "en vivo" (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. epifluorescencia Microscopía de M. aeruginosa con sondas moleculares. Microscope imágenes de un vivo M. aeruginosa 50:50: población muertos se incubaron con sondas de ácidos nucleicos, todas las imágenes x1.000 ampliación. (A) Una imagen de epifluorescencia de sonda de ácido nucleico verde absorbidos por las células "muertas". Células "en vivo" aparecen rojos debido a la autofluorescencia de la clorofila. (B) Vista de microscopio de luz de la figura 4A muestra células 'en vivo' verdes pigmentadas y células pigmentadas menores 'muertos', con daño de la membrana. (C) En vivo: 50:50 población M. aeruginosa mixta muerto. (D) Naranja nucleico incubación sonda de ácido en la Figura 4C, con células "muertas" que revelan un color naranja a través de microscopía de epifluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 Figura 5. Porcentaje de células marcadas con Verde de ácido nucleico de la sonda y la relación de 'Live' a señales FL1 "muerto". La media de porcentaje de células teñidas con M. aeruginosa la sonda de ácido nucleico verde en diferentes momentos de concentración y de incubación. (A) 0.1 M no manchan suficientes células, 5 muestran M tinción inespecífica y concentraciones de 0,5 M y 1 M manchadas casi el 100% de la población, mostrando los tiempos óptimos de incubación después de 30 minutos (a). (B) 'En vivo: muerto' proporciones de señales FL1 de una fase de crecimiento exponencial y las muestras tratadas térmicamente. Concentraciones de 0,5 mM y 1 mM muestran una buena discriminación de las señales FL1 aumentando con el tiempo de incubación (RFU ratios de dos órdenes de magnitud). Las concentraciones de 10 mM y más (no representados en el gráfico) muestran pobre discriminación de la señal de fluorescencia y la superposición de "vivir" unad 'muertas' poblaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Porcentaje de células marcadas con Orange sonda de ácido nucleico y la proporción de 'Live' a Signals "muerto". Los resultados de concentración y tiempo de incubación cambios en las poblaciones de M. aeruginosa. (A) Media porcentaje de células que habían registrado una señal de fluorescencia naranja en FL2 con concentraciones de; 0,1 mM y 0,5 mM no tinción suficientes células, 5 células vivas de tinción mu M (tinción no específica), junto con la concentración óptima de 1 mM después de 10 min (a). (B) La sonda de naranja ácido nucleico "en vivo: muertas" ratios en FL2 muestran una buena discriminación y no más de lapeadode señales de fluorescencia en concentraciones de 1 mM o menos y señales pobres superpuestas FL2 (proporciones inferiores a un orden de magnitud) con concentraciones de más de 1 M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Conc. El tiempo de incubación (min)
(M) 1 5 10 30 60
0.05 15.0 0.3 22.1 0.9 28.1 1.9 41.0 1.9 50.2 2.1
0.1 23.5 15 44.1 1.8 54.7 16 70.5 0.8 78.3 1.0
0.5 49.0 3.4 74.8 4.8 87.6 3.6 97.3 0.8 98.8 0.1
1 58.5 16 77.4 0.7 88.4 0.4 98.0 0.1 99.2 0.1
5 91.4 0.9 98.7 0.5 99.3 0.7 102.2 1.3 106.3 0.8
10 96.1 0.5 97.7 0.1 97.9 0.1 102.0 0.5 113.4 5.1
50 94.6 0.6 99.5 2.3 112.7 3.8 148.7 2.4 153.9 13.0
100 165.8 3.1 174.4 5.7 177.1 5.1 161.5 2.5 159.7 6.6

Tabla 1. Porcentaje de Captación verde ácido nucleico de la sonda en las células. Tabla que muestra los datos del experimento de optimización utilizando la sonda de ácido nucleico verde y un "en vivo" y 50% "muerto" muestra de población (tratado térmicamente) 50%. Los porcentajes medios de las células que han registradoverde fluorescente sonda de ácido nucleico (FL1) se han calculado con el número total de células "muertas" obtenidos a partir de un recuento de FSC-H. Los valores por encima del 100% muestran tinción no específica (SE subrayados).

Conc. El tiempo de incubación (min)
(M) 1 5 10 30 60
0.05 92.9 5.4 170.0 10.9 237.2 14.9 385.5 15.0 481.9 17.7
0.1 178.3 18.1 343.0 19.5 437.0 20.6 619.1 12.1 714.1 14.8
0.5 202.5 5.9 308.3 13.1 365.8 33.5 426.8 67.2 480.4 73.2
1 205.8 12.1 225.9 13.7 237.3 15.6 241.5 5.8 263.1 8.1
5 69.9 2.6 53.0 0.6 40.2 1.7 27.1 3.7 21.1 3.4
10 44.3 2.9 28.7 5.6 23.6 4.9 11.6 1.2 7.6 1.4
50 6.9 0.1 3.9 0.1 2.9 0.1 1.2 0.1 1.1 0.1
100 1.7 0.1 1.3 0.1 1.1 0.1 0.8 0.1 0.8 0.1

Tabla 2. Relación entre señales de fluorescencia verde en 'vivo' y células teñidas M. aeruginosa 'Dead'. Discriminación FL1 de señales entre las células teñidas con la sonda de ácido nucleico verde y grabaciones intrínsecas no específicos. La muestra contenía un 50% "en vivo" y 50% "muerto" (tratado térmicamente) M. aeruginosade la misma población medida durante todo el tiempo de concentración y de incubación (SE subrayado).

Conc. El tiempo de incubación (min)
(M) 1 5 10 30 60
0.05 4.0 0.3 14.9 0.2 23.5 0.8 39.1 2.4 37.6 15
0.1 14.6 0.4 42.2 0.5 55.0 1.1 72.8 0.9 80.2 0.1
0.5 54.5 0.4 79.8 1.2 86.4 0.4 91.2 0.1 93.2 0.1
1 92.0 0.8 94.8 0.1 96.9 0.6 98.4 0.6 98.4 0.3
5 91.4 15 93.5 1.8 102.9 5.4 118.9 0.1 124.8 0.1
10 95.9 1.0 102.4 1.8 132.9 6.0 148.9 4.8 132.8 5.1
50 107.5 3.7 130.6 16.6 145.2 0.2 135.4 16.2 114.6 6.6
100 97.1 0.1 130.7 7.8 166.1 3.5 144.7 6.8 115.1 6.2

Tabla 3. Porcentaje Captación de naranja ácido nucleico de la sonda en las células. La tabla con los datos de optimización de uso de la sonda de ácido nucleico de naranja y un 50% "en vivo" y 50% "muerto" muestra de población (tratado térmicamente). El porcentaje medio de células que se han registrado naranja fluorescente sonda de ácido nucleico (FL2) se han calculado con el número total de células "muertas" de un recuento de FSC-H (SE subrayado).

Conc. El tiempo de incubación (min)
(M) 1 5 10 30 60
0.05 20.4 0.9 41.3 1.3 56.1 2.4 80.4 3.6 83.3 1.8
0.1 31.2 1.4 76.1 2.4 100.9 3.1 146.2 0.6 158.3 0.4
0.5 80.6 0.4 124.9 2.4 137.3 1.1 138.7 </ td> 2.1 132.8 3.9
1 89.7 16.0 80.9 16.9 69.1 10.7 43.0 5.7 35.9 sesenta y cinco
5 10.4 0.6 7.5 0.1 5.0 1.0 2.7 0.5 15 0.1
10 7.0 0.1 3.6 0.3 2.2 0.4 16 0.1 1.2 0.1
50 2.2 0.4 16 0.3 1.3 0.0 0.6 0.1 0.3 0.0
100 1.7 0.1 1.1 0.1 0.7 0.1 0.3 0.0 0.5 0.2

Tabla 4. Relación entre el ácido nucleico de Orange en 'vivo' y células teñidas M. aeruginosa 'Dead'. Discriminación FL2 señales entre las células teñidas de la sonda nucleico naranja ácido (FL2) y grabaciones intrínsecas no específicos. La muestra contenía un 50% "en vivo" y 50% "muerto" (tratado térmicamente) M. aeruginosa de la misma población medida durante todo el tiempo de concentración y de incubación (SE subrayado).

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Discussion

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El aumento del número de publicaciones utilizando sondas moleculares indican que los datos fiables e informativas se pueden obtener 5,6,8 - 15,19,22,23. Hasta el momento no hay ninguna mancha perfecta para la viabilidad celular que puede ser eficaz en todas las especies con la misma concentración y tiempo de incubación 6,10. Incluso el mismo tipo de sonda con emisiones de fluorescencia alteradas muestra una necesidad de establecer la concentración y tiempo de incubación correcta (Tablas 1 y 3). Como se ve cuando se utiliza este protocolo, la concentración y el tiempo de incubación óptimo para la sonda de ácido nucleico de naranja es de 10 minutos a 1 M, mientras que la sonda de ácido nucleico verde sólo se necesitaría la mitad de la concentración, pero lleva tres veces más largo (Figuras 5 y 6). Ambos de estos monómeros de cianina de células impermeable con concentraciones superiores a 1,0 M comenzó a producir una superposición en las emisiones de los espectros con células no-membrana heridos. Esta superposición de siertas señales proporciona evidencia de que la tinción no específica se produce cuando las células 'en vivo' están tomando la sonda molecular. La resultante sobre la fluorescencia de la tinción inespecífica genera falsos positivos, lo que subraya la necesidad de que el desarrollo del protocolo de establecerse cuidadosamente para cada sonda molecular y organismo objetivo. Los pasos más críticos en la optimización de una sonda molecular serían: 1) la comprensión de cómo la sonda molecular interactúa con el instrumento FCM; 2) la adopción vivo adecuado y controles muertos; 3) el desarrollo del conocimiento de gating parámetros de salidas FCM y 4) la modificación del protocolo a través del entendimiento de los ambientes in-situ.

La fuente de luz, filtros ópticos, la capacidad de cambiar el voltaje PMT y los detectores dentro de citómetros de flujo varían de un fabricante a otro, por lo que una conciencia de lo excitación de longitud de onda del láser y donde los espectros de emisión se encuentra en relación con los canales de fluorescencia son cruciales. Con la adquisición de datos,umbrales pueden imponerse cada vez mayor resolución que de otro modo se perdería quizás el ruido de fondo, escombros o agregados de células muertas. Sondas moleculares pueden ofrecer una idea de la viabilidad de especies sin cultivo, a través de parámetros individuales tales como, el potencial de membrana, el contenido de ADN y la actividad enzimática. Sin embargo, dentro de las muestras ambientales puede haber muchos organismos de un tamaño de celda similar y de fluorescencia. Además dentro de las culturas uniagal, poblaciones de células inevitablemente tendrán un grado de estados fisiológicos 3, que pueden afectar la absorción de sonda molecular. Una de las principales ventajas de la FCM es su capacidad para distinguir y caracterizar estados fisiológicos a nivel de células individuales en tiempo real, que es esencial en el estudio de los microorganismos viabilidad in situ, ya que suelen ser sometidos a condiciones rápidas y dinámicas. A pesar de su uso frecuente, el concepto de viabilidad celular sigue siendo difícil de definir. Por lo general, se aplica a la proliferación celular,viabilidad está muy anotó con un enfoque basado en el crecimiento. Este supuesto apuntalamiento puede quedar corto, ya que las condiciones pueden no adaptarse a las células individuales para reproducir, pero todavía puede ser tolerable. Las células en un estado fisiológico nonproliferating que han entrado en una quietud o una G (0) fase del ciclo celular 27 no podrán interactuar con una sonda molecular dar falsos negativos en el ciclo de ADN o metabólica sondas basadas.

El uso de células de laboratorio crecido o recién aisladas para optimizar sondas moleculares ayudará al refinamiento de los datos utilizados en los estudios ecológicos. Las células utilizadas en la optimización de cultivos discontinuos se toman habitualmente en fases estacionarias exponenciales o temprano y supone que tienen la mayor viabilidad. Sin embargo, la precaución adicional debe ser tomado al usar altas densidades celulares, los que están en una fase estacionaria tardía o microbios que producen matrices extracelulares. En este protocolo el control de la población muerta de células fueron expuestas a C de calor 60 ° durante 1 hora,con la confirmación de daño de la membrana y la degradación del pigmento visto a través de microscopía (Figura 4) y FCM salidas de fluorescencia (Figuras 2 y 3). Simulación de las causas de la muerte celular natural es extremadamente difícil, ya que; la ingestión por los herbívoros, lisis viral, la muerte celular programada o la posibilidad de división asimétrica 24 no son siempre es factible o ser observado bajo condiciones de laboratorio. Modos experimentales de la moral son a menudo cuestionadas ya que pueden no ser equivalentes a las tensiones inducidas por el medio ambiente (por ejemplo, el asesinato de calor) y puede haber una respuesta heterogénea, por el cual ciertas personas mueren y otras células no muestran la degradación celular observable o muerte 3 , 25. Para evitar esta paradoja la definición operacional mediante el cual los experimentos medidos deben establecerse claramente para no dar lugar a confusión 6,23, facilitando la normalización entre los estudios.

Varios métodos alternativos have ha empleado para el análisis de la viabilidad celular en las culturas en conjunto con sondas moleculares. Microscopía de epifluorescencia es una técnica tradicional utilizada, aunque photobleaching o la introducción de señales de artefacto de células cercanas puede dar una sub o sobre estimación de un estado fisiológico si no se registra con la suficiente rapidez poblaciones. Esto hace que la optimización a través de la formación de imágenes muy difícil, con potencialmente baja precisión. Genomic evaluación de la viabilidad celular utilizando ambos ADN y ARN métodos de amplificación tales como; reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la transcriptasa (RT-PCR) y la amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) inversa también se han utilizado. Sin embargo, la evaluación genómica sirve sólo como un método indirecto de validación viabilidad como la persistencia de ácido nucleico depende en gran medida de las condiciones ambientales, con la correlación de la viabilidad celular real potencialmente variando inmensamente 28. Mediante el uso de una combinación de dispersión de luz y / o fluorescencia a través de fotos naturalespigmentos ynthetic (Figura 1) compuerta de las poblaciones puede: aumento resolución de los datos, identificar respuestas de la población raros y reducir falsos positivos. FCM junto sondas moleculares se destaca de las técnicas mencionadas en las pruebas anteriores única fisiológica de células por su velocidad, la precisión y la grabación de múltiples parámetros.

FCM es una poderosa herramienta analítica en microbiología acuática y con la adición de sondas moleculares tiene una gran potencial en una serie de áreas, incluyendo, unicelulares y análisis de la comunidad a los sectores industriales (por ejemplo., Monitoreo suministros de agua potable). Avances futuros podrían ver FCM incorporar hibridación in situ fluorescente (FISH), que puede detectar y localizar secuencias genéticas específicas en células individuales dentro de densas muestras heterogéneas. El desarrollo de la FCM y portabilidad sonda molecular para las grabaciones in situ podría proporcionar datos vitales sobre las fuentes de agua para poner en práctica principios de sstrategias para la gestión de recursos. Siguiendo el protocolo de optimización desarrollado aquí, FCM y sondas moleculares potencialmente pueden desempeñar un papel fundamental en el suministro de datos valiosos sobre la fisiología microbiana en ambientes acuáticos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer estudiante de doctorado de Dave Hartnell y la Universidad de Bournemouth para el apoyo y la financiación de la investigación y las instalaciones.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences by request BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO

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Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Usando citometría de flujo
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Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).More

Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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