Introduction
في العلاج الضوئي تدار (PDT) الضيائية لاستهداف الأنسجة، وعند التعرض للضوء الضيائي يولد أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). يمكن الأنواع ROS مثل الأكسجين القميص والفائق لحث الاكسدة وأضرار هيكلية لاحقة إلى الخلايا والأنسجة 1-4. نظرا لسهولة تطبيقه قد حققت هذه الطريقة بنشاط واتخذت التجارب السريرية مكان 5،6. ومع ذلك، لا تزال هناك قضايا هامة مثل سمية المظلمة للمحسسات، وحساسية المريض للضوء (بسبب التوزيع غير انتقائية المادة المحسسة)، وللا مائية من المحسسات (الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض التوافر البيولوجي والسمية الحادة المحتملة).
نحن هنا الإبلاغ عن طريقة لتصنيع وفي المختبر تقييم إجراء النانوية البوليمر المخلوطة مع فوليرين كما الضيائية الجيل القادم لPDT. تتشكل جزيئات طريق التجميع الذاتي للوشبه الموصلة البوليمر MEH-PPV (بولي [2-ميثوكسي-5- (2-ethylhexyloxy) -1،4-phenylenevinylene]) مع PCBM فوليرين (فينيل-C 61 حمض -butyric استر الميثيل) عندما تكون هذه المواد المذابة في متوافق مذيب يتم حقن بسرعة إلى مذيب غير متوافق (الشكل 1A). والدافع وراء اختيار مه PPV-كما البوليمر المضيف عن طريق معامل لانقراض العالية التي تؤدي إلى ارتفاع معدلات تشكيل الثلاثي، وكلاهما فعال وفائق السرعة تهمة ونقل الطاقة إلى PCBM فوليرين 7. هذه الخصائص هي مثالية للتوعية الأكسجين القميص وتشكيل الفائق في PDT.
وفي الواقع تم تطبيق فوليرين في PDT في كل من الشكل الجزيئي وجسيمات متناهية الصغر 13/08. ومع ذلك، سمية الخلايا الشديدة أعاقت مزيد من التطوير 12. نحن هنا تبين أن التغليف الفوليرين في مصفوفة كبيرة من MEH-PPV لانتاج مركب النتائج النانوية MEH-PPV / PCBM في مادة توعية PDT أننيليست السامة للخلايا في جوهرها، ويظهر خصوصية نحو الخلايا السرطانية بسبب حجم جسيمات متناهية الصغر وتهمة السطحية، وعوائد العلاج PDT فعالة للغاية في جرعات الإضاءة الخافتة وذلك بسبب خصائص بالفوتونات المذكورة آنفا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التثقيف خطوط الخليوي
- ذوبان الجليد TE 71 (ماوس الخلايا الظهارية الغدة الصعترية)، MDA-MB-231 (خلايا سرطان الثدي البشرية)، A549 (خلايا سرطان الرئة البشرية) وOVCAR3 (الخلايا السرطانية في المبيض الإنسان) من خلال عقد قارورة كريوجين في الماء الدافئ لمدة أقل من 2 دقيقة . إضافة 10 مل سائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS لكل خط الخلية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 106 ز س.
- نضح في التعليق وإضافة وسائط 3ML لبيليه. مزيج الخلايا بشكل صحيح من قبل pipetting عدة مرات. إضافة إلى هذا الحل الخلية قبل تحسنت 7 مل وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS في قوارير T75 والحفاظ على القوارير في جو مرطب من 95٪ الهواء / 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. تسمية هذا قارورة كما ممر 0.
- عندما confluency من الخلايا يصل 80٪، حصاد الخلايا التي تفرخ لهم مع التربسين 0.05٪ لمدة 10 دقيقة. تحييد التربسين بإضافة مبلغ مساو من وسائل الإعلام. الطرد المركزي هذا الحل لمدة 6 دقائق في 106 ز س. إزالة التعليق وإضافة 3 مل وسائل الإعلام الجديدة إليه. مزيج أهلا وسهلالتر ونقل كمية صغيرة (100 ميكرولتر) إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على 7 مل سائل الإعلام. احتضان قارورة الثقافة في الحاضنة. تسمية قارورة كما الممر 1.
- ثقافة خطوط الخلية حتى مرور 11 أو 12.
2. تصنيع النانوية
- إعداد ~ 10 -6 M (المعدل) مخفف مه-PPV حل الأوراق المالية
- في قارورة إضافة 1mg بولي [2-ميثوكسي-5- (2-ethylhexyloxy) -1،4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) مع الوزن الجزيئي (متوسط المنغنيز) 150،000-250،000 ز / مول و 3 مل رباعي هيدرو الفوران (THF) . يقلب الخليط لمدة 2 ساعة في حين تسخين في 80 ° C على طبق ساخن.
- تصفية الحل المذكور في قارورة جديدة باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرون. تسمية هذا الحل ب "مه-PPV مخفف محلول المخزون. سوف تشارك هذا الحل في إعداد جسيمات متناهية الصغر بعد ضبط تركيز كما هو موضح في الخطوات 2.1.3 و2.1.4.
- إضافة 50 ميكرولتر من مه-PPV حل سهم غير مخفف إلى 3 مل THF. تسمية هذا الحل ب "المخفف MEH-PPV حل سهم. نقل إلى 1 سم الكوارتز كفيت وقياس الامتصاصية في 495 نانومتر بواسطة الأشعة فوق البنفسجية تجاه الطيفي.
- إذا الامتصاصية للMEH-PPV حل سهم المخفف أعلى من 0.17، ويخفف من مه-PPV حل سهم غير مخفف عن طريق إضافة المزيد من THF 1 مل في كل مرة، وكرر الخطوة 2.1.3 حتى الامتصاصية تقاس في 495 نانومتر هو في تتراوح 0،13-0،17.
- حساب المولية للمه-PPV حل سهم المخفف باستخدام قانون لامبرت-البيرة كما هو مبين أدناه. هنا يستخدم 0.15 الامتصاصية كمثال للفترة المتبقية من البروتوكول (أي.، وضبط جميع العمليات الحسابية التالية استنادا الامتصاصية لاحظ)، ومعامل الانقراض MEH-PPV المستخدم هو 10 7 M -1 سم -1 وطول المسار المستخدم هو 1 سم.
A = ε xbxc (ؤ 1)
(ε - معامل الانقراض المولي، A - الامتصاصية، ب - طول المسار، ج - تركيز المحلول)
0.15 = 10 7 M -1 سم -1 × 1 سم اختراق الضاحيه (ؤ 2)
ج = 1.5 × 10 -8 M (ؤ 3)
استخدام هذا التركيز للعثور على تركيز مه-PPV حل سهم غير مخفف على النحو التالي:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (ؤ 4)
0.15 × 10 -7 M س 3050 ميكرولتر = M 2 × 50 ميكرولتر (ؤ 5)
M 2 = 9.15 × 10 -7 M (ؤ 6)
هذا هو تركيز 'تعديل مخفف مه-PPV حل سهم.
- حساب كتلة مه-PPV في المعدل مخفف مه-PPV حل الأوراق المالية
- حساب كتلة مه-PPV في 1 مل من محلول مخفف تعديل الأسهم كما هو موضح أدناه باستخدام المولية التي تم الحصول عليها في القسم 2.1.4 والوزن الجزيئي (M ث) من مه-PPV، وهو 10 6 ز / مول.
M = ن / V (ن - لا الشامات، V - حجم في L) (ؤ 7)
وهكذا، فإن كتلة مه-PPV في 1 مل من تعديل اوندحل سهم iluted هو 9.15 × 10 -4 ز.
- حساب كتلة مه-PPV في 1 مل من محلول مخفف تعديل الأسهم كما هو موضح أدناه باستخدام المولية التي تم الحصول عليها في القسم 2.1.4 والوزن الجزيئي (M ث) من مه-PPV، وهو 10 6 ز / مول.
- مزج PCBM في مه-PPV
- حساب كتلة فينيل-C 61 -butyric استر الميثيل حمض (PCBM) التي يمكن ان تضاف الى حل الأسهم MEH-PPV لجعل 50٪ بالوزن PCBM مخدر حل MEH-PPV، حيث يتم تعريف 50٪ بالوزن PCBM فيما يتعلق كتلة من MEH-PPV (أي نصف كتلة مه-PPV). باستخدام وزن MEH-PPV التي تم الحصول عليها في القسم 2.2.
كتلة PCBM / 9.15 × 10 -4 غرام من مه-PPV × 100٪ = 50٪ بالوزن PCBM (ؤ 8)
كتلة PCBM = 4.57 × 10 -4 ز (ؤ 9) - تزن 1 ملغ PCBM في قارورة وإضافة 500 ميكرولتر THF. حساب تركيز PCBM في هذا الحل باستخدام الوزن الجزيئي للPCBM كما 910.88 جم / مول
المولية من حل PCBM = 0.001 غرام / (910.88 جم / مول * 500 ميكرولتر) (ؤ 10)
المولية من حل PCBM = 2.19 × 10 -9 مول / ميكرولتر (ؤ 11) - حساب حجم محلول PCBM اللازمة إضافة إلى تعديل لم تهذبها MEحل سهم H-PPV للحصول على 50٪ بالوزن PCBM مخدر حل MEH-PPV في THF باستخدام المولية المحسوبة في الخطوة 2.3.2
4.57 × 10 -4 غرام من PCBM × 1 مول / 910.88 GX 1 ميكرولتر / 2.19 × 10 -9 مول = 229 ميكرولتر (ؤ 12)
إضافة 229 ميكرولتر من الحل PCBM في 1 مل من تعديل مخفف مه-PPV المحلول وتخلط جيدا.
- حساب كتلة فينيل-C 61 -butyric استر الميثيل حمض (PCBM) التي يمكن ان تضاف الى حل الأسهم MEH-PPV لجعل 50٪ بالوزن PCBM مخدر حل MEH-PPV، حيث يتم تعريف 50٪ بالوزن PCBM فيما يتعلق كتلة من MEH-PPV (أي نصف كتلة مه-PPV). باستخدام وزن MEH-PPV التي تم الحصول عليها في القسم 2.2.
- إعداد النانوية بطريقة reprecipitation
- نقل 1 مل من محلول مه-PPV / PCBM المخلوطة في حقنة 1 مل مع إبرة المرتبطة به.
- بسرعة حقن 1 مل من محلول مه-PPV / PCBM المخلوطة إلى 4 مل من الماء DI اثارة في 1200 دورة في الدقيقة. وقف اثارة مباشرة بعد الحقن. استخدام هذه الجسيمات النانوية دون مزيد من المعالجة.
3. الحضانة من خطوط الخليوي مع النانوية للتصوير
تم الانتهاء من جميع تجارب التصوير في أطباق بتري 35 مم ملاحظة:
- الإقبال على nanopartiجسيمات في خطوط الخلايا
- خطوط الخلايا الثقافة حتى مرور 12 عشر. في الخلايا الثقافة مرور ال 12 في 35 ملم أطباق بتري. ضبط تركيز خلايا تضاف إلى 35 ملم أطباق بتري هذه أنه بعد 24 ساعة من الخلايا هي 40٪ متموجة.
- في هذه المرحلة إزالة وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS من أطباق بتري، وغسل الخلايا مع 1X DPBS مرتين، وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق النانوية إلى 2 مل DMEM إلى أطباق بتري.
- بعد 24 ساعة إزالة DMEM / النانوية تعليق من أطباق بتري وغسل الخلايا مع 1X DPBS 3 مرات. ثم إصلاح الخلايا التي يحتضنها مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. وصمة عار على الخلايا مع 300 نيوتن متر دابي التي يحتضنها مع الصبغة لمدة 2 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. ثم إبقاء الخلايا في DPBS للتصوير.
- الكشف عن ROS
- ثقافة A549 وخطوط الخلايا OVCAR3 في أطباق بتري، 6 في خط الخلية، كما هو موضح في البند 3.1.1. تسميةأطباق بتري كما هو مبين في الجدول 1.
- إضافة 100 ميكرولتر من تعليق جسيمات متناهية الصغر إلى 2 مل DMEM إلى ثلاثة أطباق بتري كما هو مبين في الجدول رقم 1 واحتضان لمدة 24 ساعة. لأطباق بتري من شأنها أن تلقي الجرعات الخفيفة، وغسل الخلايا بعد 24 ساعة وتعليق الخلايا في HBSS (محلول الملح المتوازن هانك) صبغ الإعلام الحر.
- الاحماء مصباح من محاكاة الشمسية لمدة 15 دقيقة. وضع فلتر الأشعة فوق البنفسجية أمام مصباح لتصفية ضوء الأشعة فوق البنفسجية. معايرة مصباح مع الخلايا الشمسية إشارة عن طريق ضبط الطاقة مصباح للحصول على 0.5 الشمس (50 ميغاواط / سم 2) كثافة على سطح طبق بتري. في هذا الإعداد معين وقد تحقق هذا الشرط مع 218 W الطاقة الموردة للمصباح.
- وضع أطباق بتري تحت مصباح (غطاء مفتوح) لمدة 60 دقيقة، مما يؤدي إلى جرعة خفيفة من 180 J / سم 2 كما هو مبين في الحسابات التالية:
50 ميغاواط / سم 2 × 3600 ثانية / 1000 = 180 J / سم 2 - إزالة HBSS ودون غسل كذلك إضافة 2 مل سائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS إلى أطباق بتري. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة أخرى.
- لمراقبة إيجابية احتضان الخلايا مع 100 بيروكسيد الهيدروجين ميكرومتر (H 2 O 2) لمدة 30 دقيقة.
- وصمة عار على الخلايا في جميع أطباق بتري مع تركيز النهائي من 5 ميكرومتر من ROS كشف كاشف التي يحتضنها الخلايا مع صبغة لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- إصلاح الخلايا التي يحتضنها مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. وصمة عار على الخلايا مع 300 نيوتن متر دابي التي يحتضنها مع الصبغة لمدة 2 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. ثم إبقاء الخلايا في DPBS للتصوير.
- موت الخلايا المبرمج ونخر بواسطة PI وannexin V FITC
- ثقافة كل سطر خلية في 5 أطباق بتري. ثلاثة من هذه أطباق بتري سيكون للتجربة في حين أن 2 أطباق بتري المتبقية ستكون عينات السيطرة. احتضان 3 أطباق بتري لتجربة مع النانوية كبريدxplained في القسم 3.1.2. لا يتم تحضين العينات التحكم مع النانوية.
- بعد 24 ساعة حضانة اتبع الخطوة 3.2.3.
- ضع 3 أطباق بتري التجريبية تحت مصباح (غطاء مفتوح) وإزالة واحدة في 20 دقيقة، واحدة في 40 دقيقة واحد في 60 دقيقة. هذا ينتج ثلاث عينات التي تعرضت لجرعات خفيفة من 60 و 120 و 180 J / سم 2، على التوالي (الحساب في القسم 3.2.4). بعد ذلك، تدير 180 J / سم 2 ضوء جرعة واحدة من أطباق بتري السيطرة. هذا هو التحكم بجرعة خفيفة المطبقة في حالة عدم وجود الجسيمات النانوية. لا تنطبق جرعة خفيفة إلى عينة السيطرة المتبقية (أي الجسيمات النانوية وليس جرعة خفيفة التطبيقية).
- استبدال HBSS مع وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS والحفاظ على أطباق بتري في الحاضنة لمدة 4 ساعات.
- وصمة عار على الخلايا في التجريبية وأطباق بتري التحكم مع 20 ميكرولتر من annexin V FITC التي يحتضنها الخلايا مع صبغة لمدة 15 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. وصمة عار على جملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع 300 نيوتن متر دابي فضلا عن 300 نانومتر PI (يوديد propidium) التي يحتضنها مع الأصباغ لمدة 2 دقيقة. يغسل مرتين مع DPBS. ثم إبقاء الخلايا في DPBS للتصوير.
4. الذاتية السمسة من النانوية
- عد الخلايا وزراعة في لوحات 96-جيدا
- حصاد الخلايا من قوارير الثقافة عن طريق إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا مرتين مع DPBS تليها الحضانة من الخلايا مع التربسين 0.05٪ لمدة 10 دقيقة. إضافة 2 مل سائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS إلى حل الخلية الناتجة عن ذلك. مزيج الحل بشكل صحيح لفصل كتل الخلية إلى singlets ل.
- أخذ 100 ميكرولتر من تعليق خلية وإضافة إلى 900 ميكرولتر وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. تخلط جيدا. ضع 10 ميكرولتر من هذا التعليق على عدادة الكريات. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وضبط تركيز تعليق خلية في 4.1.1 إلى 5 × 10 4 خلية / مل.
- خذ 5 لوحات 96-جيدا وصفت ك 0 ساعة، 24 ساعةص، 48 ساعة، 72 ساعة و 96 ساعة. إضافة 50 ميكرولتر من 5 × 10 4 خلية / مل حلول الخلية (TE 71 و A549) في الآبار كما هو مبين في الجدول رقم 2، وبالتالي بذر 2500 خلية / جيدا. القيام بنفس الإجراء للخطوط الخلايا OVCAR3 وMDA-MB-231.
- بعد 24 ساعة غسل الآبار مع 1X DPBS وإضافة 50 ميكرولتر من زيادة تركيزات الجسيمات النانوية في الآبار كما هو مبين في الجدول رقم (2). إعداد تركيزات جسيمات متناهية الصغر مختلفة من خلال إضافة 20، و 100، و 180 ميكرولتر من جسيمات متناهية الصغر تعليق من 2.4.2 إلى DMEM ل الحصول على الحجم النهائي من 2 مل، والتي ينتج تركيزات جسيمات متناهية الصغر من 0.4 × 10 -4 ملغ / مل، 2.0 × 10 -4 ملغ / مل، و 3.6 × 10 -4 ملغ / مل على التوالي. كل سطر الخليوي لديها يثلث لكل تركيز الجسيمات النانوية.
- قياس بقاء الخلية في الظلام
- إضافة 10 ميكرولتر MTT لوحة 0 ساعة مباشرة بعد إضافة الجسيمات النانوية. احتضان لوحة لمدة 4 ساعات لcryst formazanالمرض لتشكيل. إضافة 50 ميكرولتر حل الإذابة في الآبار. احتضان لوحة لمدة 6 ساعات لإذابة البلورات formazan.
- قياس بقاء الخلية من لوحة 0 ساعة عن طريق تسجيل الامتصاصية في 570 نانومتر مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
- لوحة 24 ساعة، وغسل الخلايا مع 1X DPBS وإضافة 50 ميكرولتر وسائل الإعلام في كل حضانة جيدا بعد 24 ساعة مع النانوية. إضافة MTT وقراءة لوحة كما هو موضح في 4.2.1 و4.2.2.
- لمدة 48 ساعة، 72 ساعة، و 96 ساعة لوحات، وغسل الخلايا مع 1X DPBS وإضافة 50 ميكرولتر وسائل الإعلام في الآبار بعد 24 ساعة الحضانة مع النانوية. احتضان الخلايا لفترات الزمنية المتبقية.
- 4.2.5) قياس بقاء الخلية عند نقاط زمنية معينة كما هو موضح في 4.2.1 و4.2.2.
- تكرار التجربة كاملة لمدة 3 مرات (ن = 3)
5. قياس بقاء الخلية بعد PDT
- عد الخلايا وزرع في لوحات 96-جيدا.
- تسمية مجموعة من 96 لوحات جيدة كما هو مبين في الجدول رقم 3، سواء بالنسبة للTE 71 لوحات + A549 وOVCAR3 + MDA-MB-231 لوحات. سوف تخطيط لوحات تكون هي نفسها كما هو موضح في 4.1.3.
- البذور لوحات 96-جيدا كما هو موضح في القسم 4.1 مع نفس التصميم كما هو مبين في الجدول رقم 2 في القسم 4.1.2.
- بعد 24 ساعة إضافة النانوية إلى لوحات كما هو موضح في 4.1.4.
- 24 ساعة بعد إضافة النانوية غسل الخلايا مع 1X DPBS وإضافة 50 ميكرولتر HBSS إلى كل بئر.
- أشرق لوحات مع الجرعات الخفيفة منها كما هو موضح في 3.2.3.
- استبدال HBSS مع 50 ميكرولتر وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ FBS واحتضان لوحات لفترات زمنية منها بعد PDT.
- بعد كل فترة زمنية قياس بقاء الخلية كما هو موضح في 4.2.1 و4.2.2.
6. مضان المجهر
- امتصاص الجسيمات النانوية
- بدوره على مصابيح من المجهرالثانية ودقيقة ليزر 30 قبل التصوير. وضع طبق بتري تحتوي على خلايا ثابتة (كما هو موضح في القسم 3.1) على مسرح المجهر.
- جمع مضان من الجسيمات النانوية ودابي باستخدام مرشحات كما هو مبين في الجدول رقم (4). تراكب المرحلة النقيض من ذلك، جسيمات متناهية الصغر والصور دابي في برنامج يماغيج.
- الكشف عن ROS
- بدوره على مصابيح من دقيقة المجهر 30 قبل التصوير. وضع طبق بتري تحتوي على الخلايا (كما هو موضح في القسم 3.2) على مسرح المجهر.
- جمع مضان من الجسيمات النانوية، دابي، وROS كشف كاشف باستخدام مرشحات كما هو مبين في الجدول رقم (4). تراكب المرحلة النقيض من ذلك، جسيمات متناهية الصغر، دابي وROS الكشف عن الصور الكاشف في برنامج يماغيج.
- موت الخلايا المبرمج ونخر بواسطة PI وannexin V FITC
- بدوره على مصابيح من دقيقة المجهر 30 قبل التصوير. وضع طبق بتري تحتوي على الخلايا (كما هو موضح فيالقسم 3.3) على مسرح المجهر.
- جمع مضان من الجسيمات النانوية، دابي، PI، وAnnexin V FITC باستخدام مرشحات كما هو مبين في الجدول رقم (4). تراكب المرحلة النقيض من ذلك، جسيمات متناهية الصغر، دابي، PI والصور Annexin V FITC في برنامج يماغيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
امتصاص والسمية الخلوية الجوهرية النانوية
حضنت 50٪ بالوزن المخلوطة النانوية مه-PPV / PCBM مع TE 71، MDA-MB-231، A549 وخطوط الخلايا OVCAR3. وقد تم اختيار مستوى PCBM مزج إلى 50٪ بالوزن PCBM، وهو ما ثبت لتوفير مثالية تهمة ونقل الطاقة بين خصائص البوليمرات والفلورين 14 مترافق. وتظهر الصور مضان من امتصاص جسيمات متناهية الصغر في الشكل 1B. وحضنت الخلايا لمدة 24 ساعة مع النانوية لضمان امتصاص جسيمات متناهية الصغر. والخلايا ثم ثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪ قبل التصوير، وملطخة دابي من أجل الكشف عن خلايا وموقع نواة. من أجل صورة خلايا فصل بما فيه الكفاية واستمر 40٪ confluency. الصور مضان مع الصور على النقيض مرحلة المقابلة تبين أن هناك امتصاص تفضيلية النانوية من قبل A549 وOVCAR3 خطوط الخلايا السرطانية. لا يمكن رؤية مضان كشفها في TE 71 التحكموMDA-MB-231 خطوط الخلايا السرطانية، مما يدل على الإقبال محدود. من ناحية أخرى، وخطوط الخلايا السرطانية A549 وOVCAR3 يحمل امتصاص جسيمات متناهية الصغر كبير. تم تقييم السمية الخلوية الجوهرية (سمية المظلمة) من خلال الحضانة من 50٪ بالوزن المخلوطة النانوية مه-PPV / PCBM مع TE 71، MDA-MB-231، A549 وخطوط الخلايا OVCAR3 وقياس بقاء الخلية التي كتبها MTT الفحص. البيانات MTT في الشكل 1C تظهر انتشار الطبيعي للخطوط الخلايا.
النانوية كمصدر للROS
للتأكد من أن الجسيمات النانوية هي مصدر ROS، وفقط بعد التعرض للضوء، وقد قيمت تشكيل ROS مع ROS الكشف عن عدة كاشف. وأظهرت بيانات لOVCAR3 في الشكل 2 عدم وجود انبعاثات الأخضر في الشكل 2A - C يشير ROS لا يتم تشكيل لعينات السيطرة. لوحظ انبعاث الخضراء الزاهية من ROS كشف كاشف للعينات تعامل مع النانوية ويتعرضللضوء كما هو مبين في الشكلين 2D و E (مباشرة بعد PDT و2 ساعة بعد PDT)، مؤكدا أن ROS يتم إنشاؤها أثناء PDT.
التوقيت الصيفى الباسيفيكى
أداء مه-PPV / النانوية PCBM في PDT كان كميا بواسطة MTT فحص على الفور بعد PDT، وبعد 4 و 12 ساعة فترات ما بعد الحضانة. وتظهر البيانات في الشكل (3) لفترة ما بعد الحضانة 4 ساعة. خطوط A549 والخلايا السرطانية OVCAR3 يحمل موت الخلايا كبير بعد العلاج PDT: ما يصل إلى 60٪ لA549 و 100٪ للOVCAR-3. السيطرة TE 71 و MDA-MB-231 خطوط الخلايا السرطانية تظهر آثار محدودة. TE71 هو خط خلية مراقبة العادي وليس من المتوقع أن تستوعب النانوية. لوحظ انخفاض امتصاص غير محددة فقط من الجسيمات النانوية التي كتبها TE-71 تجريبيا. لوحظ انخفاض امتصاص جسيمات متناهية الصغر أيضا لMDA-MB-231، وهو في هذه الحالة يرجع ذلك إلى انخفاض معدل الأيض مقارنة مع غيرها من خطوط الخلايا السرطانية. وتظهر البيانات PDTأن الجسيمات النانوية MEH-PPV / PCBM هي فعالة للغاية المحسسات PDT، وأن فعالية PDT موازين مع امتصاص جسيمات متناهية الصغر. ومن المقرر أن الفرق في العدوانية (التمثيل الغذائي ومعدل الإلتقام) بين هذه خطوط الخلايا الاختلافات في نتائج PDT بين خطوط الخلايا السرطانية تعتبر هنا.
تطور موت الخلايا PDT التي يسببها
الحي / تلطيخ مزدوج الميت مع PI وAnnexin V FITC يوفر معلومات عن الآليات الميتة وأفكارك من موت الخلايا. تم تطبيق هذا المخطط تلطيخ إلى الخلية خطوط درس هنا بعد PDT لمعرفة المزيد عن PDT التي يسببها مسارات موت الخلية. ويبين الشكل 4 epiluminescence صور TE 71and OVCAR3 خطوط الخلايا ملطخة Annexin V FITC، PI ودابي. وتشير البيانات إلى أنه لا يوجد تأثير PDT على خط السيطرة خلية TE 71، بما يتفق مع امتصاص ضئيل من الجسيمات النانوية. وأبديت ملاحظة نفس لMDA-MB-231 (لا تظهر البيانات). عندما OVخضع CAR3 PDT في 60 ولوحظ 120 J / سم 2 تلطيخ مزدوج من PI (البنفسجية) وAnnexin V FITC (الخضراء). في 180 J / سم 2 فقط وصمة عار PI لوحظ، مما يشير إلى موت الخلايا الميتة الحاد تحت هذا الشرط.
الشكل 1. (A) تصنيع الجسيمات النانوية باستخدام طريقة reprecipitation، (B) TE 71، MDA-MB-231، وخطوط A549 والخلايا OVCAR3 حضنت مع النانوية. وترد النانوية في اللون الأخضر، يظهر النواة في اللون الأزرق. ومضافين الصور مضان مع الصور على النقيض مرحلة، على نطاق وبار = 20 ميكرون، (C) سمية الخلايا الذاتية النانوية تقييمها من خلال قياس بقاء الخلية لكل خط الخلية تصل إلى 96 ساعة. تتم مقارنة viabilities الخلية مع جرعة السيطرة على الجسيمات النانوية (0 ملغ / مل) من خلال تحديد جدوى مقاولاتعينات رأ ب 100٪ (لا يظهر). أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية للحصول على نتائج من 3 تجارب منفصلة (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الكشف عن ROS في خط الخلية OVCAR3 مع ROS كشف كاشف. (A) لا النانوية، أي التعرض للضوء، (ب) لا النانوية، ويتعرضون إلى 180 J / سم 2 ضوء، (C) 2 × 10 -4 ملغ / مل النانوية، أي التعرض للضوء، (D) مع النانوية والتعرض ل 180 J / سم 2 على ضوء ذلك، اتخذت على الفور بعد تلقي العلاج، (E) 2 ساعة بعد PDT، (F) مع 100 ميكرولتر H 2 O 2 السيطرة الإيجابية. انبعاث الخضراء الزاهية في DF ط الصورة من ROS كشف كاشف يؤكد تشكيل ROS. شريط النطاق = 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. viabilities خلية من TE 71، MDA-MB-231، خطوط الخلايا A549، وOVCAR3 تدار مع زيادة جرعة من الجسيمات النانوية والمشع مع 120 J / سم 2 جرعة خفيفة الساعة الحضانة بعد PDT هو 4 ساعة. الجرعات جسيمات متناهية الصغر في أسطورة هي في 10 -4 ملغ / مل. أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية للحصول على نتائج من 3 تجارب منفصلة (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
igure 4 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
الرقم 4. لايف / تلطيخ القتلى من TE 71 و OVCAR3 خطوط الخلايا مع FITC annexin V وPI. يناظر الانبعاثات الأخضر لannexin V FITC، يتوافق الانبعاثات الأرجواني لPI (الأحمر، مختلطة مع الانبعاثات دابي الأزرق)، ويقابل الانبعاثات الأزرق لدابي وصمة عار النووية. الصور هي تراكب المرحلة وعلى النقيض من الصور epiluminescence. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الشمسية الإعداد محاكاة لتعرض الخلايا مع ضوء معايرة. تم استخدام الخلايا الشمسية مرجعية للمعايرة، كما هو موضح في أقحم تسجيل 0،5 الشمس شدة الضوء (50 ميغاواط / سم 2)./53038/53038fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ضوابط السلبية | لا مصادر القدرة النووية، لا ضوء | لا مصادر القدرة النووية، مع الضوء | أي ضوء، مع مصادر القدرة النووية |
| مراقبة إيجابية | 100 ميكرولتر H 2 O 2 (لا مصادر القدرة النووية، أي ضوء) | --- | --- |
| تجريبي | 0 ساعة آخر PDT (NPS والضوء) | 2 ساعة آخر PDT (NPS والضوء) | --- |
الجدول 1: التصميم التجريبي للكشف عن ROS.
| لوحة 0 ساعة | وسائل الإعلام | TE 71 | A549 | وسائل الإعلام | ||||||||
| لا يوجد علاج | ||||||||||||
| 0 ملغ / مل | ||||||||||||
| 0.4 × 10 -4 ملغ / مل | ||||||||||||
| 2.0 × 10 -4 ملغ / مل | ||||||||||||
| 3.6 × 10 -4 ملغ / مل | ||||||||||||
الجدول 2: تخطيط لوحة 96-جيدا لحضانة النانوية لتقييم السمية الخلوية الجوهرية النانوية / PDT تأثير
| لوحة رقم | الجرعة الخفيفة (J / سم 2) | آخر PDT الوقت (ساعة) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
الجدول 3: وسم لوحات 96-جيدا لتقييم PDT.
| Fluorophore | مرشح الإثارة | مرآة مزدوج اللون | تصفية الانبعاثات | المجهر | مصدر الإثارة |
| جسيمات متناهية الصغر | 488/10 | 500 ليرة لبنانية | 510 ليرة لبنانية | متحد البؤر | AR-KR أيون الليزر |
| DAPI | 350/52 | 405 ليرة لبنانية | 450/20 | Epiluminescence | مصباح الزئبق |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | مصباح الزئبق |
| Annexin V FITC | 483/30 | 505 ليرة لبنانية | 535/40 | Epiluminescence | مصباح الزئبق |
| ROS كشف كاشف | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | مصباح الزئبق |
الجدول 4. المجهر التكوين لتجارب التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتحقيق امتصاص جسيمات متناهية الصغر من الضروري للحفاظ على بعض التدابير الحاسمة في حين افتعال النانوية. وكان 10 -6 M حل MEH-PPV (المخلوطة مع 50٪ بالوزن PCBM) في THF استعداد لضخ المياه إلى DI، كما لوحظ أن تركيز هذا الحل يلعب دورا هاما في تحديد حجم الجسيمات النانوية التي يجري تشكيلها. تم فحص تركيز الأشعة فوق البنفسجية لوجه الطيفي. لاحظ أنه في خطوة بروتوكول 2.1.3 كان من الضروري لتمييع الحل مه-PPV مستعد في البداية (مخفف مه-PPV حل الأسهم) أولا قبل اتخاذ الأشعة فوق البنفسجية في ضوء الأطياف منذ هذا الحل له الامتصاصية أكبر بكثير من 1. سرعة الحقن أيضا يلعب دورا حاسما في تحديد حجم الجسيمات النانوية، ويجب أن يكون في أسرع وقت ممكن مع التحريك بقوة الماء DI. وحقن بطيء يؤدي إلى النانوية أكبر. أيضا، يجب أن توقف التحريك مباشرة بعد الحقن لتجنب المزيد من التجميع. في حين حقنالحل في الماء فمن الضروري للحفاظ على إبرة بالقرب من السطح الداخلي للقارورة حين إدخال الإبرة تماما في الحل لتجنب تشكيل فقاعة، والتي سوف تؤثر على حجم الجسيمات النانوية. في أحجام التجارب جسيمات متناهية الصغر لدينا حصلت كانت 61.5 ± 23.3 نانومتر التي تقاس DLS. وقد تم اختيار DLS بدلا من TEM كما أنها سريعة وغير مكلفة، ويمكن الاعتماد عليها لهذا الحجم ومتاحة بسهولة. تم العثور على إمكانات زيتا على هذه الجسيمات النانوية أن تكون -9.66 ± 8.12 فولت، أي سلبية قليلا لتوجيه الاتهام سطح محايد.
ومن الضروري عدد الخلايا في حين تقييم السمية الخلوية الجوهرية النانوية وقياس النتائج PDT، كما تستند هذه التقنيات على فحص MTT الذي يوفر القياس الكمي للبقاء الخلية. ومن الضروري أن تبدأ التجربة مع نفس العدد من الخلايا في كل بئر من لوحة 96-جيدا، والذي يسمح للمقارنة بين بقاء الخلية فيما يتعلق جرعة من نانoparticles والضوء وكذلك تجارب السيطرة.
تم استخدام جهاز محاكاة الشمسية لأشرق العينات. يظهر الإعداد في الشكل (5)، ويتكون من مصدر الضوء، وهو مرشح للأشعة فوق البنفسجية، والخلايا الشمسية المرجعية. مع هذا المخطط الإضاءة يمكن تحقيق درجة عالية من السيطرة على الخصائص الطيفية وكثافة مصدر للضوء، مما أدى إلى نتائج استنساخه للغاية. من المهم جدا أن ندرك أن معظم مصادر الضوء لا توفر ملف كثافة موحد. جهاز محاكاة الشمسية، ومع ذلك، يمكن محاذاة لإنجاز بالقرب من كثافة موحدة في مجال الإضاءة. وتم التحقق من ذلك عن طريق الخلايا الشمسية المرجعية في مناطق مختلفة من المنطقة المضاءة. اتخذنا أيضا الحرص على وضع لوحات دائما في نفس المنطقة من بقعة ضوء وبنفس التوجه إلى مزيد من تقليل آثار التغير في كثافة. مصدر الضوء لأخذ عينات مسافة مبين في الشكل (5) قدم لنا 50ميغاواط / سم 2 (0.5 الشمس) لكثافة تحت مصباح الطاقة الكهربائية من 218 W. لهذه التجارب تم استخدام HBSS صبغ الإعلام الحر لتجنب امتصاص الضوء من الأصباغ المؤشر. بعد PDT، كانت الخلايا المحتضنة مرة أخرى لفترات زمنية معينة عند 37 درجة مئوية (بعد PDT الحضانة) لمراقبة سير PDT.
تلطيخ الخلايا يتطلب بعض التجربة والخطأ للعثور على التركيز الصحيح للصباغة منها. ويتحقق ذلك عن طريق تكرار التجربة مع زيادة تركيز الصبغة بشكل مطرد حتى تحققت النتائج المناسبة.
طريقة لديها أيضا زوجين من القيود، وتحديدا فيما يتعلق بنظام جسيمات متناهية الصغر والعلاج PDT. منذ يتم إعداد النانوية من خلال طريقة reprecipitation هناك بعض التباين في حجم جسيمات متناهية الصغر التي تم الحصول عليها من دفعة لدفعة، وبعض التشتت المتعدد في حجم جسيمات متناهية الصغر موجود لا يمكن السيطرة عليها. كما لم يكن من الممكن لجعل nanopart icles أقل من 20 نانومتر في الحجم. هذه القيود يمكن أن تكون التحديات في تطوير حجم الجسيمات النانوية الصغيرة monodisperse التي يمكن تطبيقها في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، التجربة PDT في المختبر تتطلب الخلايا لتكون خارج الحاضنة لمبلغ طويلة من الزمن، الذي قد يفرض بعض الضغط على الخلايا.
طريقة نوقشت هنا لPDT مهم فيما يتعلق النهج الحالية. PDT باستخدام محسسات جزيء صغير والمحسسات مخدر النانوية شهدت التطبيق السريري محدود بسبب القضايا الهامة مع سمية المظلمة للمحسسات، وحساسية المريض للضوء (بسبب التوزيع غير انتقائية المادة المحسسة)، وللا مائية من المحسسات (الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض التوافر البيولوجي والسمية الحادة المحتملة). في عملية جراحية، حتى إذا تمت إزالة الورم من الجسم، وتبقى عدد قليل من الخلايا السرطانية، ويمكن أن يؤدي إلى مغفرة. في العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي الأنسجة الطبيعية تتأثر أيضا.
معشوقة = "jove_content"> وباختصار، لقد أظهرنا أن جيلا الضيائي المقبل على أساس إجراء النانوية البوليمر هو تصميم واعد للتطبيقات PDT بسبب غياب سمية المظلمة، وتوليد ROS الفعال، والانتقائية معقولة من امتصاص، والقدرة على حمل موت الخلايا وفيرة. في المستقبل القريب سيتم تعديل هذه الجسيمات النانوية أيضا لاستهداف مستقبلات سطح الخلية من أجل تحقيق وتعزيز امتصاص والانتقائية. وسوف ينظر إجراء البوليمرات التي تحتوي على ذرات ثقيلة أو مراكز المعادن فضلا عن تعزيز معدلات عبور intersystem بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
