Introduction
В фотодинамической терапии (PDT) фотосенсибилизаторов вводят целевой ткани, и при воздействии на свет фотосенсибилизатора генерирует активные формы кислорода (АФК). Виды ROS, такие как синглетный кислород и супероксид может вызвать окислительный стресс и последующее повреждение конструкции клеток и тканей 1-4. Благодаря простоте применения этот метод активно исследуются и клинические испытания были проведены 5,6. Тем не менее, существенные вопросы, такие как темно-токсичности сенсибилизаторов, чувствительность пациента к свету (в связи с неизбирательным распределением сенсибилизатора), и гидрофобность сенсибилизаторов (что приводит к снижению биодоступности и потенциальной токсичности) острой остается.
Здесь мы приводим метод для изготовления и экстракорпоральное оценки проведения полимерные наночастицы, смешанные с фуллерена в качестве следующего поколения фотосенсибилизаторов для ФДТ. Наночастицы образованы себе агрегацииполупроводниковый полимер MEH-PPV (поли [2-метокси-5- (2-этилгексилокси) -1,4-фениленвинилен]) с фуллерена PCBM (фенил-С 61 кислоты метиловый эфир масляной), когда эти материалы, растворенное в совместимом растворитель быстро вводят в не-совместимым растворителем (рис 1А). Выбор MEH-PPV в полимере мотивируется его высоким коэффициентом экстинкции, что приводит к высоким темпам формирования триплетного и эффективной и сверхбыстрой зарядки и передачи энергии в фуллерена PCBM 7. Эти свойства идеально подходят для сенсибилизации синглетного кислорода и супероксида в формировании PDT.
Фуллерены, по сути, был применен в PDT и в молекулярной и наночастиц форме 8-13. Тем не менее, тяжелые цитотоксичность препятствует дальнейшему развитию 12. Здесь мы показываем, что инкапсуляции фуллерен в принимающей матрицы MEH-PPV с получением композитных наночастиц MEH-PPV / PCBM результаты в сенсибилизирующего материала PDT, что яS сути не цитотоксические, показывает специфику по отношению к раковым клеткам в связи с размера наночастиц и поверхностного заряда, а урожайность высоко эффективное лечение PDT при низких дозах из-за света с вышеупомянутыми фотофизических свойств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культивирование клеточных линий
- Оттепель TE 71 (Mouse тимуса эпителиальные клетки), MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы клетки), А549 (клетки рака легкого человека) и OVCAR3 (Human яичников опухолевые клетки) путем проведения криогенной флаконов в теплой воде в течение менее 2 мин , Добавьте 10 мл DMEM, дополненной 10% FBS в каждую клеточную линию и центрифуги в течение 6 мин при 106 х г в.
- Аспирируйте подвеску и добавить 3 мл средства массовой информации к осадку. Смешайте клетки должным образом с помощью пипетки несколько раз. Добавить эту ячейку решение подогретого 7 мл DMEM, дополненной 10% FBS в колбы Т75 и держать колбы в увлажненной атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2 при 37 ° С. Добавьте описание этого колбу проходом 0.
- Когда конфлюентности клеток достигает 80%, сбора клеток путем инкубации их с 0,05% трипсина в течение 10 мин. Нейтрализовать трипсина путем добавления равного количества средств массовой информации. Центрифуга это решение в течение 6 мин при 106 х г в. Снимите подвеску и добавить 3 мл свежей среды к нему. Смешайте WELл и передавать небольшое количество (100 мкл) в культуральную колбу, содержащую 7 мл среды. Выдержите колбу культуры в инкубатор. Этикетка колбу проходом 1.
- Культура клеточные линии до прохода 11 или 12.
2. Изготовление наночастиц
- Подготовка ~ 10 -6 М (скорректированного) неразбавленного MEH-PPV раствора
- В пробирку добавляют 1 мг поли [2-метокси-5- (2-этилгексилокси) -1,4-фениленвинилен] (MEH-PPV) с молекулярной массой (средняя Mn) 150,000-250,000 г / моль и 3 мл тетрагидрофуран (ТГФ) , Смесь перемешивают в течение 2 ч при нагревании при 80 ° С на горячей плите.
- Фильтр вышеуказанного раствора в новый флакон с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Добавьте это решение как «неразбавленном MEH-PPV раствора». Это решение будет принимать участие в подготовке наночастиц после тонкой настройки концентрации, как описано в шагах 2.1.3 и 2.1.4.
- Добавить 50 мкл неразбавленного MEH-PPV маточного раствора в 3 мл ТГФ, Добавьте это решение как «разбавляют MEH-PPV раствора». Трансфер в 1 см кварцевой кювете и измеряют поглощение при 495 нм с помощью УФ-спектроскопии по отношению.
- Если поглощение разбавленного MEH-PPV раствора выше, чем 0,17, разбавить в неразбавленном MEH-PPV маточного раствора, добавляя больше 1 мл ТГФ, в то время, и повторите шаг 2.1.3 до тех пор, измеряется оптическая плотность при 495 нм не в в диапазоне 0.13-0.17.
- Рассчитать молярность разбавленной MEH-PPV маточного раствора с помощью закона Ламберта-Бера, как показано ниже. Вот 0,15 поглощение используется в качестве примера для остальной части протокола (т.е.., Отрегулируйте все следующие расчеты основаны на наблюдаемой оптической плотности), то MEH-PPV коэффициент поглощения используется 10 7 М -1 см -1, а длина пути используется 1 см.
А = ε xbxc (уравнение 1)
(ε - молярный коэффициент экстинкции, А - оптическая плотность, б - длина пути, с - концентрация раствора)
0.15 = 10 7 М -1 см -1 х 1 см хс (уравнение 2)
с = 1,5 х 10 -8 М (уравнение 3)
Использование этой концентрации, чтобы найти концентрацию неразбавленного MEH-PPV маточного раствора следующим образом:
М 1 V 1 = М 2 V 2 (уравнение 4)
0,15 х 10 -7 М х 3050 мкл = М 2 х 50 мкл (уравнение 5)
М 2 = 9,15 х 10 -7 М (уравнение 6)
Это концентрация 'скорректированной неразбавленной MEH-PPV маточного раствора ".
- Расчет массы MEH-PPV в скорректированной неразбавленного MEH-PPV раствора
- Рассчитывают массу MEH-PPV в 1 мл скорректированного неразбавленного раствора, как показано ниже с помощью молярность полученной в разделе 2.1.4, а молекулярная масса (M w) от MEH-PPV, который 10 6 г / моль.
М = N / V (п -. Не родинок, В - объем в л) (уравнение 7)
Таким образом, масса MEH-PPV в 1 мл регулировать ундiluted раствор является 9,15 х 10 -4 г.
- Рассчитывают массу MEH-PPV в 1 мл скорректированного неразбавленного раствора, как показано ниже с помощью молярность полученной в разделе 2.1.4, а молекулярная масса (M w) от MEH-PPV, который 10 6 г / моль.
- Смешивание PCBM в MEH-PPV
- Рассчитайте массу фенил-C 61 масляной кислоты метилового эфира (PCBM), которые будут добавлены в фондовый MEH-PPV решения, чтобы сделать 50 мас% PCBM легированного решение MEH-PPV, где 50 мас% PCBM определяется по отношению к массе из MEH-PPV (т.е. половина масса MEH-PPV). При использовании вес MEH-PPV, полученного в разделе 2.2.
Масса PCBM / 9.15 х 10 -4 г MEH-PPV х 100% = 50% мас PCBM (уравнение 8)
Масса PCBM = 4,57 х 10 -4 г (уравнение 9) - Взвесьте 1 мг PCBM в пробирке и добавить 500 мкл ТГФ. Рассчитать концентрацию PCBM в этом растворе с использованием молекулярного веса, как PCBM 910,88 г / моль
Молярность раствора PCBM = 0,001 г / (910,88 г / моль * 500 мкл) (уравнение 10)
Молярность раствора PCBM = 2.19 х 10 -9 моль / мкл (уравнение 11) - Рассчитайте объем раствора PCBM нужно добавить к скорректированы в неразбавленном виде MEН-PPV раствор, чтобы получить 50 мас% PCBM легированного MEH-PPV раствор в ТГФ с помощью молярность рассчитывается в шаге 2.3.2
4.57 х 10 -4 г PCBM х 1 моль / 910,88 GX 1 мкл / 2,19 х 10 -9 моль = 229 мкл (уравнение 12)
Добавить 229 мкл раствора в PCBM 1 мл неразбавленной скорректированной MEH-PPV раствора и хорошо перемешать.
- Рассчитайте массу фенил-C 61 масляной кислоты метилового эфира (PCBM), которые будут добавлены в фондовый MEH-PPV решения, чтобы сделать 50 мас% PCBM легированного решение MEH-PPV, где 50 мас% PCBM определяется по отношению к массе из MEH-PPV (т.е. половина масса MEH-PPV). При использовании вес MEH-PPV, полученного в разделе 2.2.
- Приготовление наночастиц методом переосаждение
- Передача 1 мл смешанного MEH-PPV / PCBM раствора в 1 мл шприц с иглой, прикрепленной к нему.
- Быстро придать 1 мл смешанного раствора MEH-PPV / PCBM в 4 мл дистиллированной воды при перемешивании 1200 оборотов в минуту. Остановка перемешивании сразу же после инъекции. С помощью этих наночастиц без дальнейшей обработки.
3. Инкубация клеточных линий с наночастицами для визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты изображений были завершены в 35 мм чашках Петри
- Поглощение nanopartiциклы в клеточных линиях
- Культура клеток линии до 12-го прохода. На 12-й проезд культуры клеток в 35 мм чашки Петри. Регулировка концентрации клеток, добавленных к 35 мм чашки Петри таким, что после 24 ч клетки 40% сплошности.
- На этом этапе удалить носитель DMEM с добавлением 10% FBS из чашек Петри, промыть клетки с 1x ДЗФР дважды, и добавьте 100 мкл суспензии наночастиц в 2 мл DMEM с чашки Петри.
- После 24 часов удалить DMEM / наночастиц суспензии из чашек Петри и мыть клетки с 1x DPBS 3 раза. Затем зафиксировать клетки путем инкубации 4% параформальдегидом в течение 10 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно клеток с 300 нм DAPI путем инкубации с красителем в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.
- Обнаружение АФК
- Культура А549 и OVCAR3 клеточные линии в чашках Петри, 6 в клеточной линии, как объяснено в разделе 3.1.1. ЭтикеткеЧашки Петри, как показано в таблице 1.
- Добавить 100 мкл суспензии наночастиц в 2 мл DMEM до трех чашек Петри, как показано в таблице 1, и инкубируют в течение 24 ч. Для чашек Петри, которые будут получать доз света, омывающих клетки после 24 часов и приостановить клеток в HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) окрашивают свободных средств массовой информации.
- Разминка лампы солнечного симулятора в течение 15 мин. Поместите УФ-фильтр перед лампой, чтобы отфильтровать УФ-светом. Калибровка лампы с опорной солнечной батареи, регулируя мощность лампы, чтобы получить 0,5 солнце (50 мВт / см 2) интенсивности на поверхности чашки Петри. В данном конкретном установки, что состояние было достигнуто при 218 Вт мощности, подводимой к лампе.
- Поместите чашки Петри под лампой (открытой крышкой) в течение 60 мин, в результате чего светло дозе 180 Дж / см 2, как показано в приведенных ниже расчетов:
50 мВт / см 2 х 3600 сек / 1000 = 180 Дж / см 2 - Удалить HBSS и без стирки дополнительно добавляют 2 мл DMEM, дополненной 10% FBS в чашках Петри. Инкубируйте клетки в течение еще 2 ч.
- Для положительного контроля инкубировать клетки с 100 мкМ перекиси водорода (H 2 O 2) в течение 30 мин.
- Пятно клетки во всех чашках Петри с конечной концентрации 5 мкМ обнаружения реагента ROS инкубацией клеток с красителем в течение 30 мин при 37 ° С.
- Зафиксировать клетки путем инкубации 4% параформальдегидом в течение 10 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно клеток с 300 нм DAPI путем инкубации с красителем в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.
- Апоптоз и некроз П. И. и аннексином V FITC
- Культура каждого клеточной линии в 5 чашках Петри. Три из этих чашках Петри будет для эксперимента, а оставшиеся 2 чашки Петри будет контрольные образцы. Инкубируйте 3 чашки Петри для эксперимента с наночастицами, как еxplained в разделе 3.1.2. Контрольные образцы не инкубировали с наночастицами.
- После 24 ч инкубации следовать шаг 3.2.3.
- Поместите 3 экспериментальные чашки Петри под лампой (открытой крышкой) и снимите один на 20 мин, один на 40 мин и один в 60 мин. Это дает три образца, которые были под воздействием света доз 60, 120 и 180 Дж / см 2, соответственно (расчета в разделе 3.2.4). Далее, управлять 180 Дж / см 2 света дозировку на одну из управления чашках Петри. Это управление с легкой дозы, применяемой в отсутствие наночастиц. Не применять легкую дозу оставшихся контрольного образца (нет наночастиц и свет дозу прилагается).
- Заменить HBSS с DMEM среде с 10% FBS и держать чашки Петри в инкубаторе в течение 4 час.
- Пятно клетки в экспериментальных и контрольных чашках Петри с 20 мкл аннексина V FITC путем инкубации клеток с красителем в течение 15 мин. Вымойте дважды DPBS. Пятно Cлоктей с 300 нм DAPI, а также 300 нМ PI (пропидийиодидом) путем инкубации с красителями в течение 2 мин. Вымойте дважды DPBS. Тогда держите клеток в DPBS для визуализации.
4. Внутренняя цитотоксичность наночастиц
- Подсчет клеток и культивирование в 96-луночных планшетах
- Сбора клеток из колбы с культурой, удаляя материал и промывки клеток дважды DPBS последующей инкубацией клеток с 0,05% трипсина в течение 10 мин. Добавить 2 мл DMEM, дополненной 10% FBS к полученному раствору клеток. Смешайте раствор правильно разделить ячейки кластеров в синглеты.
- Возьмем 100 мкл клеточной суспензии и добавить к 900 мкл DMEM среде с 10% FBS. Хорошо перемешать. Поместите 10 мкл этой суспензии на гемоцитометре. Граф клеток с использованием гемоцитометра и регулировать концентрацию суспензии клеток в 4.1.1 до 5 х 10 4 клеток / мл.
- Возьмите 5 96-луночных планшетах помечены как 0 ч, 24 чг, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Добавьте 50 мкл 5 х 10 4 клеток / мл растворов клеточных (TE 71 и А549) в лунки, как показано в таблице 2, при этом посев 2500 клеток / лунку. Сделайте ту же процедуру для OVCAR3 и MDA-MB-231 клеточных линий.
- Через 24 часа мыть скважин с 1x DPBS и добавить 50 мкл возрастающих концентраций наночастиц в скважинах, как показано в таблице 2. Подготовьте различные концентрации наночастиц путем добавления 20, 100 и 180 мкл суспензии наночастиц из 2.4.2 DMEM к получения конечного объема 2 мл, что дает концентрации наночастиц 0,4 х 10 -4 мг / мл, 2,0 х 10 -4 мг / мл и 3,6 х 10 -4 мг / мл, соответственно. Каждая ячейка имеет трех повторах линия для каждой концентрации наночастиц.
- Измерение жизнеспособности клеток в темно-
- Добавить 10 мкл МТТ в 0 ч пластины сразу после добавления наночастиц. Инкубируйте планшет в течение 4 часов для формазанового CrystALS, чтобы сформировать. Добавить 50 мкл раствора солюбилизации в лунки. Инкубируйте планшет в течение 6 ч, чтобы растворить кристаллы формазана.
- Измерить клеток жизнеспособности 0 ч пластине путем записи оптической плотности при 570 нм микропланшет-ридере с.
- В течение 24 часов пластины, мыть клетки с 1x DPBS и добавить 50 мкл средств массовой информации в каждую лунку после 24 ч инкубации с наночастицами. Добавить МТТ и прочитать табличку, как это описывается в 4.2.1 и 4.2.2.
- В течение 48 ч, 72 ч и 96 ч пластин, промыть клетки 1х DPBS и добавить 50 мкл среды в лунки после 24 ч инкубации с наночастицами. Инкубируйте клетки для остальных периодов времени.
- 4.2.5) Измерьте жизнеспособность клеток в определенных точках времени, как описано в 4.2.1 и 4.2.2.
- Повторите эксперимент полный 3 раза (п = 3)
5. Измерение Жизнеспособность После PDT
- Подсчет клеток и культивирование в 96-луночных планшетах.
- Этикетка набор 96-луночные планшеты, как показано в таблице 3, как для ТЕ 71 + A549 пластин и OVCAR3 + MDA-MB-231 пластинах. Компоновка пластин будет таким же, как показано на 4.1.3.
- Семенной 96-луночных планшетах с, как описано в разделе 4.1 с же виде, как показано в таблице 2, в разделе 4.1.2.
- После 24 ч добавить наночастиц на пластины, как описано в разделе 4.1.4.
- 24 ч после добавления наночастиц промыть клетки 1х DPBS и добавить 50 мкл HBSS в каждую лунку.
- Облучают пластины с соответствующими световых дозах, как описано в пункте 3.2.3.
- Заменить HBSS с 50 мкл DMEM среде с 10% FBS и инкубировать пластины для соответствующих периодов времени после ФДТ.
- После каждого периода времени определения жизнеспособности клеток, как описано в 4.2.1 и 4.2.2.
6. флуоресцентной микроскопии
- Поглощение наночастиц
- Включите фонарей микроскопомй лазер 30 мин до визуализации. Поставьте чашку Петри, содержащую фиксированные клетки (как описано в разделе 3.1) на столик микроскопа.
- Сбор флуоресценции от наночастиц и DAPI, используя фильтры, как показано в таблице 4. Перекрытие фазового контраста, наночастицы и DAPI изображения в программном обеспечении ImageJ.
- Обнаружение АФК
- Включите ламп микроскопа 30 мин до визуализации. Поставьте чашку Петри, содержащую клетки (как описано в разделе 3.2) на столик микроскопа.
- Сбор флуоресценции от наночастиц, DAPI, и АФК обнаружения реагента с помощью фильтров, как показано в таблице 4. Наложение фазового контраста, наночастицы, DAPI и ROS обнаруживая реагентов изображения в программном обеспечении ImageJ.
- Апоптоз и некроз П. И. и аннексином V FITC
- Включите ламп микроскопа 30 мин до визуализации. Поместите чашку Петри, содержащую клетки (как описано враздел 3.3) на столик микроскопа.
- Сбор флуоресценции от наночастиц, DAPI, PI, и Аннексином V FITC, используя фильтры, как показано в таблице 4. Наложение фазового контраста, наночастицы, DAPI, PI и Аннексин V FITC изображения в программном обеспечении ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поглощение и внутренняя цитотоксичность наночастиц
В 50 мас% смешанные наночастицы MEH-PPV / PCBM инкубировали с 71 ТЕ, MDA-MB-231, 549 и клеточные линии OVCAR3. Уровень PCBM смешивания была выбрана в качестве 50% по весу PCBM, который, как было показано, чтобы обеспечить идеальную переноса заряда и энергии между свойствами сопряженных полимеров и фуллеренов 14. Флуоресцентные изображения взаимодействие наночастиц показаны на рисунке 1В. Клетки инкубировали в течение 24 ч с наночастицами, чтобы обеспечить взаимодействие наночастиц. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом, прежде изображений, и окрашивали DAPI для обнаружения клеток и расположение ядра. Для того, чтобы изображения достаточно разделенных клеток 40% слияния была сохранена. Флуоресцентные изображения с контрастными изображениями соответствующих фазовых показать, что есть льготный поглощение наночастиц в А549 и OVCAR3 клеточных линий рака. Без заметного флуоресценции можно увидеть в ТЕ 71 управленияи MDA-MB-231 линии раковых клеток, что указывает на ограниченный поглощение. С другой стороны, А549 и OVCAR3 линии раковых клеток демонстрируют значительное взаимодействие наночастиц. Внутренняя цитотоксичность (темно-токсичность) оценивали по инкубации 50 мас% смешанных наночастиц MEH-PPV / PCBM с ТЕ 71, MDA-MB-231, 549 и клеточные линии OVCAR3 и количественной оценки жизнеспособности клеток по МТТ. Данные МТТ на рисунке 1c показывают нормальную пролиферацию клеточных линий.
Наночастицы в качестве источника АФК
Чтобы убедиться, что наночастицы являются источником АФК, и только после воздействия света, формирование АФК оценивали с обнаружения набора реагентов ROS. Данные для OVCAR3 показаны на рис 2 Отсутствие зеленой эмиссии на рисунке 2А - С. Указывает ROS не образуются для контрольных образцов. Ярко-зеленый излучение от обнаружения реагента АФК наблюдается для образцов, обработанных наночастиц и подвергаютсяк свету, как показано на рисунках 2D и E (сразу после PDT и 2 ч после ФДТ), подтверждающее, что ROS генерируются при ФДТ.
Тихоокеанское летнее время
Производительность MEH-PPV / PCBM наночастицы в ФДТ количественно МТТ сразу после PDT, и после периодов после инкубации 4 и 12 ч. Данные показаны на рисунке 3 для 4 ч периода после инкубации. В А549 и OVCAR3 линии раковых клеток проявляют значительную гибель клеток после лечения PDT: до 60% для А549 и 100% для OVCAR-3. Контроль ТЕ 71 и MDA-MB-231 раковых клеток линии показывают ограниченный эффект. TE71 является нормальным линии контрольных клеток, и не ожидается усвоить наночастиц. Только легкий неспецифического поглощения наночастиц TE-71 наблюдается экспериментально. Низкий взаимодействие наночастиц наблюдается для MDA-MB-231, который в этом случае из-за низкой скорости обмена веществ по сравнению с другими клеточных линий рака. Устройство PDT данные показываютчто наночастицы MEH-PPV / PCBM высокоэффективны PDT сенсибилизаторы, и, что эффективность ФДТ весы с взаимодействие наночастиц. Различия в результатах ФДТ между линий раковых клеток, рассматриваемых здесь из-за разницы в агрессивности (метаболизм и скорость эндоцитоза) между этими клеточными линиями.
Прогрессирование PDT гибели клеток
Live / мертвых двойного окрашивания с PI и Аннексином V FITC предоставляет информацию о некротических и апоптотических механизмов клеточной смерти. Эта схема окрашивания наносили на клетки линии учился здесь после ФДТ, чтобы узнать больше о PDT-индуцированных путей клеточной гибели. Рисунок 4 показывает epiluminescence изображения ТЕ 71and OVCAR3 клеточных линий, окрашенных Аннексином V FITC, PI и DAPI. Данные показывают, что нет эффект ФДТ на ТЕ 71 линии управления клеток, в соответствии с незначительным поглощением наночастиц. То же наблюдение было сделано для MDA-MB-231 (данные не показаны). Когда О.В.CAR3 прошли PDT на 60 и наблюдался 120 Дж / см 2 двойного окрашивания PI (фиолетовый) и Аннексин V FITC (зеленый). В 180 Дж / см 2 только ПИ пятно наблюдается, предполагая, острый некротический смерть клеток в рамках этого состояния.
Рисунок 1. (А) Изготовление наночастиц методом переосаждение, (В) Т. 71, MDA-MB-231, А549 и OVCAR3 клеточные линии инкубируют с наночастицами. Наночастицы показаны зеленым цветом, ядро показан синим цветом. Флуоресцентные изображения накладываются с контрастных изображений фазовых, масштабную линейку = 20 мкм, (C) Внутренняя цитотоксичность наночастиц оценивали путем измерения жизнеспособности клеток для каждой клеточной линии вплоть до 96 часов. Клеточные viabilities сравнивают с контрольной дозы наночастиц (0 мг / мл), установив жизнеспособность ContrОбразцы ол при 100% (не показано). Усы являются стандартные отклонения для результатов от 3 отдельных экспериментов (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Обнаружение АФК в OVCAR3 клеточной линии с АФК обнаружения реагента. (А) не наночастицы, нет освещенность, (B) не наночастицы, открытые до 180 Дж / см 2 света (С) 2 х 10 -4 мг / мл наночастиц, нет освещенность (D) с наночастицами и воздействия 180 Дж / см 2 света, принято сразу же после лечения (E) 2 ч после ФДТ, (F) с 100 мкл H 2 O 2 в качестве положительного контроля. Яркий зеленый выбросов в DF I с от ROS обнаружения реагента, подтверждающего образование АФК. Масштаб бар = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сотовые viabilities ТЕ 71, MDA-MB-231, А549, и OVCAR3 клеточные линии, вводимые с увеличением дозы наночастиц и облученных 120 Дж / см 2 света дозы. Инкубационный период после ФДТ 4 ч. Дозы наночастиц в легенде в 10 -4 мг / мл. Усы являются стандартные отклонения для результатов от 3 отдельных экспериментов (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
igure 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Live / мертвых окрашивания TE 71 и OVCAR3 клеточные линии с аннексин V FITC и PI. Зеленый выбросов соответствует аннексином V FITC, фиолетовый выбросов соответствует PI (красный, смешанный с синим излучением DAPI), а синее излучение соответствует DAPI ядерная пятно. Изображения наложение фазового контраста и epiluminescence изображений. Масштаб бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. Солнечная установка тренажер для воздействия на клетки с калиброванного рис. Был использован ссылка солнечных батарей для калибровки, как показано на вставке регистрирующего 0,5 солнце интенсивность света (50 мВт / см 2)./53038/53038fig5large.jpg "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Отрицательные контроли | Нет НЧ, без света | Нет НЧ, с учетом | Нет света, с НП |
| Положительный контроль | 100 мкл Н 2 О 2 (не НЧ, ни света) | --- | --- |
| Экспериментальный | 0 ч после ФДТ (ИГ и свет) | 2 ч после ФДТ (ИГ и свет) | --- |
Таблица 1: Экспериментальный дизайн для обнаружения ROS.
| 0 ч пластины | СМИ | TE 71 | 549 | СМИ | ||||||||
| Нет лечения | ||||||||||||
| 0 мг / мл | ||||||||||||
| 0,4 х 10 -4 мг / мл | ||||||||||||
| 2,0 х 10 -4 мг / мл | ||||||||||||
| 3,6 х 10 -4 мг / мл | ||||||||||||
Таблица 2: Схема 96-луночный планшет для инкубации наночастиц оценить внутреннюю цитотоксичность наночастиц / Эффект ФДТ
| Пластина нет. | Свет доза (Дж / см 2) | Сообщение PDT время (час) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Таблица 3: Маркировка 96-луночных планшетах в течение PDT оценки.
| Флуорофорные | Возбуждение фильтр | Зеркальные | Фильтр выбросов | Микроскопия | Источник возбуждения |
| Наночастиц | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Конфокальный | Ионный лазер Ар-Кр |
| Д.ПИ | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescence | Ртутной лампы |
| ПИ | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | Ртутной лампы |
| Аннексин V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescence | Ртутной лампы |
| АФК обнаружения реагента | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | Ртутной лампы |
Таблица 4. микроскопия конфигурации для экспериментов изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для достижения поглощение наночастиц было необходимо для поддержания некоторые критические меры, а изготовления наночастиц. 10 -6 М MEH-PPV раствор (смешивается с 50% мас PCBM) в ТГФ был готов впрыснуть в деионизированной воде, как это было отмечено, что концентрация этого раствора играет важную роль в определении размера наночастиц формируется. Концентрация была проверена UV-VIS-спектроскопии. Обратите внимание, что в шаге протокола 2.1.3 нужно было разбавлять первоначально приготовленный раствор MEH-PPV (в неразбавленном виде MEH-PPV маточного раствора) прежде чем принимать UV-VIS спектры с этого решения имеет намного большую оптическую плотность, чем 1. Скорость впрыска также играет важную роль в решении вопроса о размерах наночастиц, и должен быть как можно быстрее при интенсивном перемешивании ди воды. Медленное введение приведет к более крупных наночастиц. Кроме того, перемешивание должно быть прекращено сразу после инъекции, чтобы избежать дальнейшего агрегирования. При введенииВодный раствор, необходимо, чтобы иглы вблизи внутренней поверхности флакона при вставке иглы полностью в раствор, чтобы избежать образования пузырьков, которые будут влиять на размер наночастиц. В наших экспериментах размеров наночастиц, полученных были 61,5 ± 23,3 нм, как измерено DLS. DLS был выбран вместо ПЭМ, как это быстрый, недорогой, надежный для такого размера и легко доступны. Был найден дзета-потенциал на этих наночастиц быть -9,66 ± 8,12 мВ, т.е., слегка отрицательной на нейтральную поверхностного заряда.
Важно, чтобы подсчитать клетки, оценивая внутреннюю цитотоксичность наночастиц и количественно результаты PDT, так как эти методы основаны на МТТ, который обеспечивает количественное измерение жизнеспособности клеток. Важно, чтобы начать эксперимент с тем же числом элементов в каждую лунку 96-луночного планшета, что позволяет для сравнения жизнеспособности клеток по отношению к дозе нанoparticles и свет, а также контрольные эксперименты.
Солнечная тренажер используется для облучения образцов. Установка показана на рисунке 5, и состоит из источника света, УФ-фильтра, и опорной солнечного элемента. С этой схемой освещения высокая степень контроля спектральных свойств и интенсивности источника света может быть достигнуто, в результате чего с высокой воспроизводимостью результатов. Это очень важно понимать, что большинство источников света не обеспечивают равномерный профиль интенсивности. Солнечная тренажера, однако, могут быть выровнены для достижения равномерного около интенсивности в области освещения. Это было проверено с помощью эталонного солнечного элемента в различных регионах освещенной области. Мы также позаботились, чтобы всегда поместить пластины в той же области светового пятна и в той же ориентации для дальнейшей минимизации последствий изменения в интенсивности. В качестве источника света в образец расстояние, указанное на рисунке 5, при условии нас с 50мВт / см 2 (0,5 солнце) интенсивности при электрической мощности лампы 218 Вт в этих экспериментов ССРХ краситель свободные средства массовой информации был использован, чтобы избежать поглощения света индикаторов красителей. После ФДТ, клетки снова инкубируют в течение определенных периодов времени при 37 ° С (после ФДТ инкубации), чтобы наблюдать за ходом PDT.
Окрашивание клеток требуется некоторое проб и ошибок, чтобы найти правильный концентрации соответствующего красителя. Это достигается путем повторения эксперимента при увеличении концентрации красителя постепенно до тех пор, пока соответствующие результаты были достигнуты.
Способ также имеет несколько ограничений, особенно в отношении системы наночастиц и ФДТ. Так наночастицы получают по методу переосаждение есть некоторые изменения в полученном размера наночастиц от партии к партии, а некоторые полидисперсности размера наночастиц существует, что не может контролироваться. Он также не было возможности сделать nanoparticles менее 20 нм по размеру. Эти ограничения могут быть проблемы в развитии малого размера монодисперсных наночастиц, которые могут быть применены в естественных условиях. Кроме того, PDT эксперимент в пробирке требует клеток, чтобы быть вне инкубатора в течение длительного периода времени, который может ввести некоторое напряжение на клетки.
Метод обсуждается здесь для ФДТ является существенным по отношению к текущим подходами. PDT с использованием малых сенсибилизаторов молекулы и сенсибилизирующим легированных наночастицы видел ограниченное клиническое применение из-за значительных проблем с темной токсичности сенсибилизаторов, чувствительность пациента к свету (в связи с неизбирательным распределением сенсибилизатора), и гидрофобность сенсибилизаторов (что приводит к снижается биодоступность и потенциал острая токсичность). В операции, даже если опухоль удаляется из организма, несколько раковых клеток остаются и могут привести к ремиссии. В лучевой терапии и химиотерапии нормальной ткани влияет также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
