Introduction
在光动力疗法（PDT）光敏剂施用给靶组织，并在接触光光敏剂产生活性氧（ROS）。活性氧物种如单线态氧和超氧化物可以诱导氧化应激和细胞和组织1-4后续结构损坏。因为它易于应用的这种方法已被积极地研究和临床试验已经发生5,6-。然而，显著的问题，如敏化剂的暗毒性，患者感光度（由于敏化剂的非选择性分布），以及疏水性的敏化剂（其导致生物利用度降低和潜在的急性毒性）保持。
这里，我们报告了一种用于制造和体外进行配合富勒烯作为下一代光敏剂用于光动力聚合物纳米颗粒的评价。纳米颗粒通过自聚集形成所述高分子半导体MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-（2-乙基己氧基）-1,4-亚苯基亚乙烯基]）与富勒烯PCBM（苯基-C 61 -丁酸甲酯）当溶解在相容的这些材料溶剂迅速注入到非相容的溶剂（图1A）。 MEH-PPV作为宿主聚合物的选择是由它的高消光系数，导致的激发三重态的形成率高激励，既高效又超快电荷和能量转移到富勒烯PCBM 7。这些特性非常适合单线态氧和超氧形成PDT的致敏。
富勒烯事实上已经在PDT中被应用在两个分子和纳米颗粒形式8-13。然而，严重的毒性阻碍了进一步的发展12。在这里，我们表明，在MEH-PPV的基质包封富勒烯，得到复合MEH-PPV / PCBM的纳米颗粒的结果在一个PDT敏化材料，我不是本质的细胞毒性，表明向癌细胞由于纳米颗粒尺寸和表面电荷，和产量高效PDT治疗在低光剂量的特异性由于上述光物理特性。
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Protocol
1.培养细胞系
- 解冻的TE 71（小鼠胸腺上皮细胞），MDA-MB-231（人乳腺癌细胞），A549（人肺癌细胞）和OVCAR3（人类卵巢癌细胞）由保持在温水中冷冻剂瓶为小于2分钟。添加补充有10％FBS的每个细胞系，离心6分钟，在106×g下10 ml的DMEM培养基。
- 吸出悬挂和3毫升媒体添加到沉淀。适当吹打几次的细胞混合。加该细胞溶液到预先温热7 ml，在T75烧瓶补充有10％FBS的DMEM培养基，并保持在95％空气/ 5％CO 2的潮湿气氛中的烧瓶在37℃。标签此瓶为通道0。
- 当细胞的汇合达到80％，通过将它们与0.05％胰蛋白酶10分钟收获细胞。通过加入媒体等量中和胰蛋白酶。离心该溶液6分钟，在106×g下。取下悬挂和中加3毫升的新鲜媒体吧。混合逢L和少量（100微升）转移到含有7毫升媒体培养瓶中。孵育培养瓶中的孵化器。标签的烧瓶通道1。
- 培养细胞系直至通路11或12。
2.制造纳米粒子
- 的〜10 -6 M（调整后）未稀释的MEH-PPV原液的制备
- 在小瓶中添加1mg的聚[2-甲氧基-5-（2-乙基己氧基）-1,4-亚苯基亚乙烯基]（MEH-PPV）与分子量（平均M n）150,000-250,000克/摩尔和3ml四氢呋喃（THF） 。 2小时搅拌混合物，同时在80℃的热板上加热。
- 使用0.2微米的注射器过滤器过滤在一个新的小瓶上述溶液中。标签这一解决方案为“未稀释的MEH-PPV原液”。该解决方案将参与集中的微调后的纳米颗粒制备如步骤2.1.3和2.1.4描述。
- 加50微升未稀释的MEH-PPV原液入3毫升THF。标签这个解决方案是“稀释MEH-PPV原液”。通过紫外可见光谱转移到1厘米石英试管，并测量吸光度495纳米。
- 如果稀释MEH-PPV原液的吸光度比0.17以上，稀释未稀释的MEH-PPV原液通过一次加入更多的THF 1毫升，并重复步骤2.1.3直到在495nm处测定的吸光度是在范围0.13-0.17。
- 通过使用朗伯 - 比尔定律，如下所示计算稀释MEH-PPV库存溶液的摩尔浓度。此处0.15吸光度用作示例的协议的其余部分（即，基于观察到的吸光度调整所有后面的计算），使用的MEH-PPV消光 系数为10 7 M -1 -1和所使用的路径长度是1厘米。
A =εxbxc（方程1）
（ε - 的摩尔消光系数，A - 吸光度，B - 路径长度和c - 溶液的浓度）
0。15 = 10 7 M -1 -1×1cm的XC（方程式2）
C = 1.5×10 -8 M（等式3）
使用此浓度找到未稀释的MEH-PPV原液的浓度如下：
M 1 -V 1 = M 2 V 2（方程4）
0.15×10 -7的M×3050微升= M 2×50微升（方程5）
M 2 = 9.15×10 -7 M（方程6）
这是'调整未稀释的MEH-PPV原液“的浓度。
- 计算MEH-PPV的质量在调整未稀释的MEH-PPV原液
- 计算MEH-PPV的质量在1毫升的调整未稀释原液如下所示使用在节2.1.4中获得的摩尔浓度和分子量（M w）的 MEH-PPV的，这是10 6克/摩尔。
M = N / V（N - 没有痣，V - L中量）（方程7）
由此，MEH-PPV在1ml质量调整UNDiluted原液是9.15×10 -4克
- 计算MEH-PPV的质量在1毫升的调整未稀释原液如下所示使用在节2.1.4中获得的摩尔浓度和分子量（M w）的 MEH-PPV的，这是10 6克/摩尔。
- 在MEH-PPV混合PCBM
- 计算的苯基-C 61 -丁酸甲酯（PCBM）的质量要加入到库存MEH-PPV溶液以使50％（重量）PCBM掺杂MEH-PPV溶液，其中50％（重量）PCBM定义相对于所述质量MEH-PPV（即MEH-PPV的质量的一半）。通过使用MEH-PPV的2.2节所获得的权重。
的PCBM / 9.15×10 -4克MEH-PPV×100％= 50％（重量）PCBM的质量（方程8）
对PCBM = 4.57×10 -4 g质量（方程9） - 重1毫克PCBM在小瓶中并加入500μlTHF中。使用PCBM的分子量计算PCBM的浓度在该溶液作为910.88克/摩尔
对PCBM溶液= 0.001克/（910.88克/摩尔* 500微升）摩尔浓度（方程10）
对PCBM溶液摩尔浓度= 2.19×10 -9摩尔/微升（方程11） - 计算PCBM溶液的体积需要添加至调整未稀释的急H-PPV原液通过利用在步骤2.3.2中计算的摩尔浓度，以获得在THF中50％（重量）PCBM掺杂MEH-PPV溶液
4.57×10 -4克PCBM×1摩尔/ 910.88 GX 1微升/ 2.19×10 -9摩尔= 229微升（方程12）
加入229微升PCBM溶液加入到1毫升稀释调节MEH-PPV原液拌匀。
- 计算的苯基-C 61 -丁酸甲酯（PCBM）的质量要加入到库存MEH-PPV溶液以使50％（重量）PCBM掺杂MEH-PPV溶液，其中50％（重量）PCBM定义相对于所述质量MEH-PPV（即MEH-PPV的质量的一半）。通过使用MEH-PPV的2.2节所获得的权重。
- 通过再沉淀法纳米粒子的制备
- 转移1毫升共混MEH-PPV / PCBM溶液入1ml注射器与连接到它的针头的。
- 迅速注入1毫升共混MEH-PPV / PCBM溶液加入到4毫升DI水在1,200rpm下搅拌。停止注射后立即搅拌。使用这些纳米粒子没有进一步处理。
3.孵化与纳米粒子细胞系成像
注：所有成像实验进行35毫米培养皿中完成
- nanoparti的吸收在细胞系克莱斯
- 培养细胞系直至12 个通道。在第 12次传代培养的细胞35毫米培养皿。调整加入到35毫米培养皿这种细胞的浓度在24小时后，细胞是40％汇合。
- 在这个阶段中删除添加有从培养皿10％FBS的DMEM培养基，洗涤细胞用1×DPBS两次，并添加100μl的纳米颗粒悬浮液于2ml DMEM中的培养皿。
- 24小时后除去从培养皿的DMEM /纳米颗粒悬浮液，并用1×DPBS 3次洗细胞。然后，通过用4％多聚甲醛孵育10分钟固定细胞。用DPBS洗两次。通过与染料孵育2分钟将细胞染色用300nM的DAPI染色。用DPBS洗两次。然后，使细胞保持在DPBS成像。
- 检测活性氧
- 文化A549和在培养皿中，6％的细胞系，如第3.1.1解释OVCAR3细胞系。标注培养皿的表1中所示。
- 加入100μl的纳米颗粒悬浮液的于2ml DMEM中成三个培养皿所示的表1中，并培育24小时。用于将接收的光的剂量，24小时后洗涤细胞并悬浮细胞在HBSS（Hank氏平衡盐溶液）染料可用媒体的培养皿。
- 预热太阳模拟器的灯15分钟。放置过滤紫外线灯的前方以滤除紫外光。通过调整灯的功率，以获得0.5太阳（50毫瓦/厘米2）强度在培养皿的表面校准与基准太阳能电池的灯。在这种特定的设置该条件是与提供给灯218功率W实现。
- 将培养皿在灯（盖打开）60分钟，这导致了180焦耳/厘米2，如下面的计算的光剂量：
50毫瓦/厘米2×3600秒/ 1000 = 180焦耳/ cm 2的 - 除去HBSS和不洗进一步添加补充有10％FBS的对陪替氏培养皿2 ml的DMEM培养基。孵育细胞另外2小时。
- 为阳性对照孵育细胞100μM的过氧化氢（H 2 O 2），30分钟。
- 通过在37℃下孵育细胞与染料30分钟将细胞染色在所有的培养皿中以5微米的活性氧检测用试剂的终浓度。
- 通过用4％多聚甲醛孵育10分钟固定细胞。用DPBS洗两次。通过与染料孵育2分钟将细胞染色用300nM的DAPI染色。用DPBS洗两次。然后，使细胞保持在DPBS成像。
- 细胞凋亡和坏死PI和Annexin V FITC
- 培养在5培养皿每个细胞系。这三个培养皿将是实验，而其余2培养皿将对照样品。孵育3培养皿的实验，纳米粒子为explained 3.1.2节。对照样品没有孵育纳米颗粒。
- 经过24小时培养遵循的步骤3.2.3。
- 将在3个实验培养皿灯（盖打开）下，并删除一个20分钟，一个在40分钟和一个60分钟。这就产生了暴露于光剂量的60，120和180焦耳/ 平方厘米，分别为（计算第3.2.4节）三个样品。其次，管理一个180焦耳/ 平方厘米的光剂量的控制培养皿之一。这与在不存在纳米颗粒的施加光剂量的控制。不要使用光剂量剩余的对照样品（无纳米粒子和没有光剂量应用）。
- 取代的HBSS用补充有10％FBS的DMEM培养基，并保持培养皿在培养箱4小时。
- 通过孵育细胞与染料15分钟将细胞染色在实验和对照培养皿与20μl膜联蛋白V FITC。用DPBS洗两次。染色的CELLS与300nM的DAPI以及300nM的PI（碘化丙啶）通过与染料2分钟孵育。用DPBS洗两次。然后，使细胞保持在DPBS成像。
纳米四固有细胞毒性
- 在96孔板计数细胞和培养
- 通过除去培养基并用DPBS后跟细胞0.05％胰蛋白酶进行10分钟的温育洗涤细胞两次收获从培养瓶中的细胞。添加补充有10％FBS的向所得细胞溶液2 ml的DMEM培养基。适当地混合该溶液到细胞团分离成单峰。
- 取100微升细胞悬浮液，并加入到补充有10％FBS的900微升DMEM培养基。拌匀。放置10微升此悬浮液到血球。计数使用血球细胞和调节细胞悬浮液的浓度在4.1.1至5×10 4个细胞/ ml。
- 取5 96孔板标记为0小时，24小时R，48小时，72小时和96小时。添加50微升5×10 4个细胞/ ml的细胞溶液（TE 71和A549）插入孔中作为示于表2中，从而接种2500个细胞/孔。执行相同的过程OVCAR3和MDA-MB-231细胞系。
- 24小时后洗掉的孔用1×DPBS添加增加纳米颗粒引入该井中的浓度如表 2所示的50微升。通过加入20，100，准备不同的纳米颗粒的浓度，和180微升纳米颗粒悬浮液的从2.4.2至DMEM中成获得的2毫升的最终体积，其产生0.4×10 -4毫克/毫升的纳米颗粒的浓度，2.0×10 -4毫克/毫升和3.6×10 -4毫克/毫升。每个细胞系具有一式三份对纳米颗粒的各浓度。
- 测量在黑暗的细胞生存力
- 加入纳米粒子后，立即加入10微升MTT到0小时板。将培养板4小时的甲臜crystALS形成。添加50μl的增溶溶液入井。孵育平板6小时以溶解甲臜晶体。
- 通过记录570nm处的吸光度与酶标仪测量0小时板的细胞生存力。
- 24小时盘，洗涤细胞与1X DPBS，并在每一个好后，24小时孵化与纳米粒子加入50微升的媒体。加入MTT和阅读4.2.1和4.2.2所解释的板块。
- 48小时，72小时，和96小时板，洗涤细胞用1×DPBS和24小时后孵育纳米颗粒添加50μl的介质插入到孔中。孵育细胞对剩余时间段。
- 4.2.5）测量细胞存活力在特定时间点在4.2.1和4.2.2说明。
- 重复整个实验进行3次（n = 3）
5.测量细胞活性PDT后
- 计数细胞并在96孔板中培养。
- 标注一组96孔板如表 3所示，无论对于TE 71 + A549板和OVCAR3 + MDA-MB-231板。如图4.1.3所述板的布局将是相同的。
- 种子96孔板如在第4.1节具有相同的布局说明如在4.1.2节示于表2。
- 24小时后添加纳米颗粒板作为4.1.4说明。
- 另外的纳米颗粒后24小时，洗涤细胞用1×DPBS并添加50微升HBSS到每个孔中。
- 照射与各光剂量的板块如3.2.3解释。
- 取代的HBSS用补充有10％FBS 50微升DMEM培养基孵育所述板对PDT后的各时间段。
- 后每个时间段测量细胞存活力在4.2.1和4.2.2说明。
6.荧光显微镜
- 纳米粒子的吸收
- 打开显微镜的灯第二成像前的激光30分钟。把含有固定的细胞在显微镜的阶段（如在第3.1节阐述）培养皿。
- 收集从纳米颗粒和DAPI通过使用过滤器如表 4中所示的荧光。叠加的相位相反，纳米颗粒和DAPI图像的ImageJ软件。
- 检测活性氧
- 打开的成像前的显微镜30分钟的灯。将含有细胞在显微镜的阶段（如第3.2节所述）的培养皿中。
- 收集从纳米颗粒，DAPI，和活性氧检测用试剂通过使用过滤器如表 4中所示的荧光。叠加的相位相反，纳米颗粒，DAPI和ROS检测试剂图像的ImageJ软件。
- 细胞凋亡和坏死PI和Annexin V FITC
- 打开的成像前的显微镜30分钟的灯。把含有细胞（如在解释培养皿在显微镜的阶段，第3.3节）。
- 收集从纳米颗粒，DAPI，PI和膜联蛋白V FITC通过使用过滤器如表 4中所示的荧光。叠加的相位相反，纳米颗粒，DAPI，PI和膜联蛋白V FITC图像的ImageJ软件。
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Representative Results
吸收和纳米粒子的固有细胞毒性
的50重量％的共混MEH-PPV / PCBM的纳米颗粒孵育用TE 71，MDA-MB-231，A549和OVCAR3细胞系。的PCBM共混水平被选为50重量％PCBM，这已被证明是提供共轭聚合物和富勒烯14之间理想电荷和能量转移性能。纳米颗粒摄取的荧光图像示于图1B。细胞孵育24小时，用纳米粒子，以确保纳米颗粒摄取。然后将细胞用4％多聚甲醛在成像之前，以及为了检测细胞和核的位置用DAPI染色。为了图像充分地分离的细胞40％汇合得到维持。荧光图像与相应的相位对比图像表明，有纳米颗粒由A549和OVCAR3癌细胞系的优先摄取。没有检出荧光能在TE 71对照可见和MDA-MB-231癌细胞系，表示有限摄取。另一方面，A549和OVCAR3细胞系表现出显著纳米颗粒摄取。固有的细胞毒性（暗毒性），通过与50％（重量）混合的MEH-PPV / PCBM纳米颗粒温育用TE 71评价，MDA-MB-231，A549和OVCAR3细胞系和定量MTT法细胞活力。在图1C的MTT数据显示细胞系的正常的增殖。
纳米颗粒作为活性氧的来源
确保了纳米颗粒的活性氧源，并且仅暴露于光后，ROS形成与该活性氧检测用试剂盒进行评价。对于OVCAR3数据示于图2缺失图 2A绿色发射的- C表示 ROS不形成为对照样品。从ROS检测试剂明亮的绿光是观察纳米粒子处理过的样品和曝光光，如图2D和 E（立即PDT后和PDT后2小时），确认PDT过程中产生活性氧。
太平洋夏令时
MEH-PPV的性能/在PDT PCBM纳米粒子立即PDT后进行量化MTT法，后4和12小时后的潜伏期。该数据示于图3为 4小时后潜伏期。在A549和OVCAR3细胞系PDT治疗后表现出显著的细胞死亡：高达60％的A549和100％OVCAR-3。该TE 71控制和MDA-MB-231肿瘤细胞株显示出有限的影响。 TE71是正常对照细胞系和预计不会内在化纳米颗粒。纳米颗粒通过TE-71仅低非特异性摄取实验观察。低纳米颗粒的摄取，也观察到对MDA-MB-231，这是在此情况下，由于相对于其他癌细胞系的代谢率降低。该PDT数据显示该MEH-PPV / PCBM纳米颗粒是高度有效的PDT敏化剂，并且该PDT效力磅秤与纳米粒子的吸收。在这里考虑的癌细胞系之间的PDT结果的差异是由于这些细胞系之间在攻击性的差（代谢和内吞的速率）。
PDT诱导的细胞死亡的进展
活/死双重染色与PI和Annexin V FITC提供了细胞死亡的坏死和凋亡机制的信息。这种染色方案应用到线在这里学习PDT后，进一步了解PDT诱导的细胞死亡途径的细胞。 图4显示 epiluminescence TE 71and OVCAR3细胞系的染色膜联蛋白V FITC，PI 和DAPI图像。数据表明，有PDT治疗该TE 71对照细胞系无影响，与纳米颗粒的可忽略的吸收是一致的。相同的观察的MDA-MB-231被做（数据未显示）。当OVCAR3行PDT在60和120焦耳/厘米的PI（紫色）和膜联蛋白V FITC（绿色）2双染色观察。在180焦耳/ 平方厘米只有PI染色观察，该条件下的提示急性坏死性细胞死亡。
图纳米颗粒1（A）的制备通过再沉淀法，（B）中的TE 71，MDA-MB-231，A549和OVCAR3细胞系孵育纳米颗粒。纳米颗粒显示为绿色的颜色，细胞核中示出蓝色。的荧光图像叠加与相位对比图像，比例尺=20μm时，（C）的纳米颗粒通过测量细胞存活力对每个细胞系最多96小时评价的内在毒性。的细胞存活率通过设置对照的可行性与纳米颗粒的对照剂量（0毫克/毫升）相比醇样品在100％的（未示出）。误差棒是标准差从3个独立的实验结果（N = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.检测ROS在与活性氧检测用试剂OVCAR3细胞系。 （A）中无纳米颗粒，无光照射，（B）的无纳米颗粒，暴露于180焦耳/ cm 2的光，（C）的2×10 -4毫克/毫升纳米颗粒，没有光照射，（D）的纳米粒子和暴露于180焦耳/ 平方厘米的光，治疗后立即服用，（E），2小时后PDT，（F）与100微升H 2 O 2作为阳性对照。在DF我明亮的绿光 ■从ROS检测试剂证实ROS形成。比例尺= 30微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
TE 71图3.细胞活力，MDA-MB-231，施用增加剂量的纳米颗粒，照射120焦耳/ cm 2的光剂量。该后PDT培养时间为4小时的A549，和OVCAR3细胞系。所述纳米颗粒的剂量在图例中是10 -4毫克/毫升。误差棒是标准差从3个独立的实验结果（N = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图4. TE 71和OVCAR3的活/死染色的细胞系与膜联蛋白V FITC和PI。格林发射对应于膜联蛋白V FITC，紫色发射对应的PI（红色，蓝色的DAPI发射混合），和蓝色发射对应于DAPI核染色。图像的相衬epiluminescence图像叠加。比例尺= 20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.太阳能模拟器设置为细胞校准光的曝光。参考太阳能电池被用于校准，在插图登记0.5太阳光强度（50毫瓦/厘米2）中所示。/53038/53038fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
| 阴性对照 | 没有纳米颗粒，无光 | 无纳米粒子，光 | 无光，与纳米颗粒 |
| 阳性对照 | 100微升H 2 O 2（无纳米颗粒，没有光） | --- | --- |
| 实验的 | 0小时后PDT（NPS和光） | 2小时后PDT（NPS和光） | --- |
表1：用于检测活性氧的实验设计。
| 0小时盘 | 传媒 | TE 71 | A549 | 传媒 | ||||||||
| 无治疗 | ||||||||||||
| 0毫克/毫升 | ||||||||||||
| 0.4×10 -4毫克/毫升 | ||||||||||||
| 2.0×10 -4毫克/毫升 | ||||||||||||
| 3.6×10 -4毫克/毫升 | ||||||||||||
表2：96孔板为纳米颗粒孵育布局来评估纳米颗粒的固有的细胞毒性/ PDT效果
| 板式无。 | 光剂量（J / cm 2）的 | 交的PDT时间（hr） |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 五 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
表3：标注的96孔板PDT的评估。
| 荧光基团 | 激发过滤器 | 分色镜 | 发射滤光片 | 显微镜 | 激励源 |
| 纳米粒子 | 一十分之四百八十八 | 500 LP | 510 LP | 共焦 | 氩氪离子激光 |
| DAPI | 五十二分之三百五十零 | 405 LP | 二十分之四百五十 | Epiluminescence | 汞灯 |
| PI | 二十二分之五百四十三 | 562 | 四十零分之五百九十二 | Epiluminescence | 汞灯 |
| 膜联蛋白V FITC | 三十零分之四百八十三 | 505 LP | 四十零分之五百三十五 | Epiluminescence | 汞灯 |
| ROS检测试剂 | 一十分之四百九十一 | 510 DCLP | 五十零分之五百二十五 | Epiluminescence | 汞灯 |
表4.显微镜配置成像实验。
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Discussion
为了实现纳米粒子吸收，有必要保持一定的临界措施而制造该纳米颗粒。甲10 -6 M的 MEH-PPV溶液（混合有50重量％PCBM）在THF准备注入DI水，因为据观察，这种溶液的浓度在确定纳米粒子的尺寸起重要作用而形成。浓度通过紫外可见光谱检查。需要注意的是在协议步骤2.1.3，有必要首先在服药前的UV-vis光谱，因为该溶液稀释最初制备的MEH-PPV溶液（未稀释MEH-PPV原液）具有吸光度大于1喷射的速度大得多也起着决定的纳米粒子的尺寸的关键作用，并且必须尽可能快的同时剧烈搅拌的去离子水。缓慢注射会导致更大的纳米粒子。另外，搅拌应立即注射后停止，以避免进一步的聚集。同时注入该溶液在水中，有必要保持在针小瓶的内表面附近，而完全将针插入该溶液，以避免形成气泡，这将影响纳米颗粒的大小。在我们的实验中得到的纳米颗粒尺寸为采用DLS测定61.5±23.3纳米。 DLS被选择的代替TEM，因为它是快速，廉价，可靠的这种尺寸和容易获得。这些纳米粒子的ζ电位被发现是-9.66±8.12毫伏， 即，轻微的负向中性表面电荷。
重要的是应计数细胞而评估纳米颗粒的内在细胞毒性和量化的PDT结果，因为这些技术都是基于MTT测定法，它提供的细胞生存力的定量测量。重要的是开始实验与细胞在96孔板的每个孔相同数量的，其允许细胞活力相比相对于楠的剂量oparticles和轻以及对照实验。
一种太阳能模拟器用于照射样品。设置示于图5中，并且由光源，紫外线过滤器，和一个基准太阳能电池的。用该照明控制方案的光谱特性和光源的强度的高度可达到，这导致高度可再现的结果。它是要认识到大多数光源不提供均匀的强度分布非常重要。太阳模拟器，但是，可以被对准来完成邻近均匀强度在照射区域。这是通过在照射区域的不同区域的基准的太阳能电池验证。我们也照顾到始终将板在光点的相同区域，并在相同的方向，以进一步减少变异的强度的影响。光源到样品的距离在图5中表示为我们提供了50强度毫瓦/ 平方厘米（0.5日光）下的218 W的电灯泡的功率对于这些实验HBSS染料自由媒体作为避免光吸收指示剂染料。 PDT后，将细胞再培养一定的时间段，在37℃（的后PDT培养）观察PDT治疗的进展。
细胞的染色需要一些反复试验来找到各个染料的正确浓度。这是通过重复该实验，同时提高染料浓度稳定，直到适当的结果取得实现。
该方法也有几个限制，特别是关于纳米颗粒系统和PDT治疗。因为纳米颗粒通过再沉淀方法制备有在所获得的纳米颗粒尺寸从批次一些可变性，并在纳米颗粒尺寸一些多分散存在不能被控制。它也不可能使nanoparticles尺寸小于20纳米。这些限制可能是在开发可在体内应用小尺寸的单分散纳米颗粒的挑战。此外， 在体外 PDT实验需要的细胞是培养箱外延长的时间量，这可能强加给细胞的一些应力。
本文所讨论的用于PDT的方法是相对于当前的方法显著。 PDT利用小分子敏化剂和敏化剂掺杂的纳米颗粒已经看到有限的临床应用由于与敏化剂的暗毒性，患者感光度（由于敏化剂的非选择性分布），以及疏水性的敏化剂（其导致显著问题生物利用度降低和潜在的急性毒性）。在外科手术，即使肿瘤被从体内除去，少数癌细胞残留，并可能导致缓解。在放疗和化疗的正常组织也受到了影响。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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