Introduction
光線力学療法（PDT）は、光増感剤は、光増感剤は、活性酸素種（ROS）を生成する光に標的組織に投与し、露光時にされています。そのような一重項酸素及びスーパーオキシドなどのROS種は、酸化ストレス、細胞および組織1-4に続く構造的損傷を誘発することができます。これにより、アプリケーションが容易にこの方法が盛んに研究されており、臨床試験が行わ5,6をとっています 。しかし、そのような（縮小生物学的利用能および潜在的な急性毒性につながる）増感剤の暗い増感剤の毒性、光（による増感剤の非選択的分布に）患者の感受性、および疎水性のような重要な問題が残っています。
ここでは、製造およびPDTの次世代光増感としてフラーレンを配合したポリマーナノ粒子を行うインビトロ評価のための方法を報告しています。ナノ粒子の自己凝集によって形成されます半導体ポリマーMEH-PPV（ポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]）、これらの材料は、互換性の中に溶解させたフラーレンPCBM（フェニルC 61 -酪酸メチルエステル）と溶媒を急速に非相溶性溶媒（ 図1A）に注入されます。ホストポリマーとしてMEH-PPVの選択は、三重形成率の高さにつながる、高い吸光係数によって動機づけ、およびフラーレンPCBM 7への効率的かつ超高速充電およびエネルギー転送の両方されています。これらのプロパティは、PDT内の一重項酸素とスーパーオキシド形成の感作のために理想的です。
フラーレンは、実際には両方の分子とナノ粒子の形態8-13に 、PDTに適用されています。しかし、重度の細胞毒性がさらなる発展を妨げている12。ここでは、MEH-PPVのホストマトリックス中にフラーレンをカプセル化すると、その私PDTの増感材料に複合MEH-PPV / PCBMのナノ粒子の結果を得るためにすることを示します本質的に細胞傷害性ではないよ、ナノ粒子サイズおよび表面電荷、および前述の光物理的特性に起因する低光用量で利回りの高い効果的なPDT治療による癌細胞に対する特異性を示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.培養細胞株
- 解凍TE 71（マウス胸腺上皮細胞）、MDA-MB-231（ヒト乳癌細胞）、A549（ヒト肺癌細胞）及びOVCAR3（ヒト卵巣癌細胞）未満で2分間温水に寒剤バイアルを保持することにより。 106×gで6分間のそれぞれの細胞株および遠心分離機に、10％FBSを補充した10ミリリットルDMEM培地を追加します。
- サスペンションを吸引除去し、ペレットに3ミリリットルのメディアを追加します。適切に数回ピペッティングして細胞を混ぜます。この細胞溶液をT75フラスコにおいて10％FBSを補充した7 mlのDMEM培地を温め事前に加え、37℃で95％空気/ 5％CO 2の加湿雰囲気中でフラスコを保ちます。継代0として、このフラスコにラベルを付けます。
- 細胞の密集度が80％に達すると、10分間、0.05％トリプシンでそれらをインキュベートすることによって細胞を収穫。培地の等量を添加することによりトリプシンを中和します。遠心106×gで6分間、このソリューション。サスペンションを削除し、それに3ミリリットルに新鮮な培地を追加します。ミックスWELリットルと7ミリリットル培地を含む培養フラスコに少量（100μl）を転送します。インキュベーター内で培養フラスコをインキュベートします。継代1としてフラスコにラベルを付けます。
- 通路11または12まで培養細胞株。
ナノ粒子の作製2。
- 〜10 -6 M（調整）希釈していないMEH-PPV原液の調製
- バイアル中の分子量（平均Mn）は150,000-250,000 /モルと3 mlのテトラヒドロフラン（THF）に1mgのポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]（MEH-PPV）を追加。ホットプレート上で80℃で加熱しながら2時間混合物を攪拌します。
- 0.2μmのシリンジフィルターを使用して、新しいバイアル中の上記溶液をフィルタリングします。 「希釈されていないMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。ステップ2.1.3と2.1.4で説明したように、この溶液は濃度の微調整後のナノ粒子製剤に関与することになります。
- 3ミリリットルのTHFに希釈されていないMEH-PPVストック溶液50μlを追加。 「希釈したMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。 1cmの石英キュベットに移し、UV-VIS分光法により495 nmの吸光度を測定します。
- 希釈したMEH-PPV原液の吸光度が0.17以上である場合には、一度に1ミリリットルをより多くのTHFを加えることで希釈されていないMEH-PPVの原液を希釈し、495 nmで測定された吸光度がであるまで、ステップ2.1.3を繰り返し0.13から0.17の範囲です。
- 以下に示すようにランベルト・ベールの法則を用いて、希釈したMEH-PPVストック溶液のモル濃度を計算します。ここでは0.15吸光度プロトコルの残りの一例として使用されている（ すなわち、観察された吸光度に基づいて、次のすべての計算を調整する）、使用MEH-PPVの吸光係数が10 7 M -1 cm -1で、使用するパスの長さがあります1センチメートル。
A =εxbxc（式1）
（ε - モル吸光係数、A - 吸光度、B - 経路長、C - 溶液の濃度）
0。15 = 10 7 M -1 cm -1で×1センチXC（式2）
C = 1.5×10 -8 M（式3）
次のように希釈されていないMEH-PPVストック溶液の濃度を見つけるために、この濃度を使用します。
M 1、V 1 = M 2、V 2（式4）
X 3050μlの0.15×10 -7 M = M 2×50μlの（式5）
M 2 = 9.15×10 -7 M（式6）
これは「調整希釈していないMEH-PPV原液」の濃度です。
- 調整希釈していないMEH-PPV原液にMEH-PPVの質量を計算します
- セクション2.1.4で得られたモル濃度は10 6グラム/モルであるMEH-PPVの分子量（M w）を用いて、以下のように調整し、未希釈ストック溶液1mlにMEH-PPVの質量を算出します。
M = N / V（N - 。ノーモル、V - Lでボリューム）（式7）
このように、1ml中のMEH-PPVの質量はウント調整しますiluted原液は9.15×10 -4 gです。
- セクション2.1.4で得られたモル濃度は10 6グラム/モルであるMEH-PPVの分子量（M w）を用いて、以下のように調整し、未希釈ストック溶液1mlにMEH-PPVの質量を算出します。
- MEH-PPVでブレンドPCBM
- PCBMは、50重量％のPCBMの質量に対して定義されたMEH-PPVの溶液を、ドープされた50重量％にするためにストックMEH-PPVの溶液に添加されるフェニル-C 61 -酪酸メチルエステル（PCBM）の質量を計算しますMEH-PPVの（ すなわち、MEH-PPVの半分質量）。 2.2節で得られたMEH-PPVの重量を使用することにより。
MEH-PPV×100％= 50重量％のPCBMのPCBM / 9.15×10 -4グラムの質量（式8）
PCBM = 4.57×10 -4グラムの質量（式9） - バイアル中に1mgのPCBMを計量し、500μlのTHFを加えます。 910.88グラム/モルとしてPCBMの分子量を用いて、この溶液にPCBMの濃度を算出します
PCBMのモル濃度の溶液= 0.001グラム/（* 500μlの910.88グラム/モル）（式10）
PCBMの溶液のモル濃度= 2.19×10 -9モル/μlの（式11） - PCBM溶液の体積を計算すると、調整に追加するために必要MEを原液PCBMは、ステップ2.3.2において算出モル濃度を用いて、THF中MEH-PPVの溶液をドープした50重量％を得るために、H-PPV原液
/ 910.88 GX PCBM×1モル1μL/ 2.19×10 -9モル= 229μlの（式12）の4.57×10 -4グラム
調整希釈していないMEH-PPVストック溶液1mlにPCBM溶液を229μl加え、よく混ぜます。
- PCBMは、50重量％のPCBMの質量に対して定義されたMEH-PPVの溶液を、ドープされた50重量％にするためにストックMEH-PPVの溶液に添加されるフェニル-C 61 -酪酸メチルエステル（PCBM）の質量を計算しますMEH-PPVの（ すなわち、MEH-PPVの半分質量）。 2.2節で得られたMEH-PPVの重量を使用することにより。
- 再沈殿法によるナノ粒子の作製
- 転送、それに接続された針で1mlシリンジにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1ml。
- 急速1,200rpmで攪拌しながら脱イオン水4mlにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1mlを注入します。注射直後に攪拌を停止します。さらに処理することなく、これらのナノ粒子を使用してください。
イメージングのためのナノ粒子を有する細胞株の3インキュベーション
注：すべての画像化実験は、35mmのペトリ皿に完成しました。
- nanopartiの取り込み細胞株におけるクル
- 12 継代まで培養細胞株。 35ミリメートルのペトリ皿中の12 番目の継代培養細胞で。 24時間後に細胞を40％コンフルエントとなるように35ミリメートルのペトリ皿に添加した細胞の濃度を調整します。
- この段階では、ペトリ皿から、10％FBSを補充したDMEM培地を除去回1×DPBSで細胞を洗浄し、ペトリ皿に2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加えます。
- 24時間後、ペトリ皿からDMEM /ナノ粒子懸濁物を除去し、1×DPBSで3回細胞を洗浄します。その後、10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。
- ROSの検出
- ペトリ皿、細胞株当たり6、文化A549およびOVCAR3細胞株セクション3.1.1で説明したように。ラベルペトリ皿は、 表1に示します 。
- 表1に示すように、ペトリ皿の3つに2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加え、24時間インキュベートします。 、光用量を投与された24時間後に細胞を洗浄し、HBSSで細胞を懸濁しますペトリ皿（ハンクス液）のための無料メディアを染めます。
- 15分間のソーラーシミュレータのランプをウォームアップ。 UV光をフィルタリングするために、ランプの前にUVフィルターを置きます。ペトリ皿の表面で0.5日（50ミリワット/ cm 2）での強度を得るためにランプ電力を調整することにより、基準太陽電池を有するランプを較正します。この特定の設定では、その状態は、ランプに供給される218 Wの電力で達成されました。
- 以下の計算に示すように、180 J / cm 2の光投与量になる60分のためにランプ（蓋オープン）の下でペトリ皿を置きます：
50 mWの/ cmで2×3600秒/千= 180 J / cm 2の - HBSSを取り外し、洗浄することなく、さらにペトリ皿に、10％FBSを補充した2ミリリットルDMEM培地を追加します。別の2時間細胞をインキュベートします。
- 陽性対照のために30分間、100μMの過酸化水素（H 2 O 2）で細胞をインキュベートします。
- 37℃で30分間の色素で細胞を培養することによって、ROS検出試薬の最終濃度5μMですべてのペトリ皿で細胞を染色。
- 10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定します。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。
- PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死
- 5ペトリ皿で培養それぞれの細胞株。残りの2ペトリ皿は対照試料となりながら、これらのペトリ皿のうち3つは実験のためになります。 Eなどのナノ粒子を用いた実験のために3ペトリ皿をインキュベートセクション3.1.2でxplained。対照サンプルは、ナノ粒子とともにインキュベートしていません。
- 24時間インキュベートした後ステップ3.2.3に従ってください。
- ランプ（蓋オープン）の下で3実験ペトリ皿を置き、20分、40分で1分および60分で1で1を削除します。これは、60、120及び180の光用量J / cm 2であり、それぞれ（セクション3.2.4で計算）に曝露された三つの試料が得られます。次に、制御ペトリ皿の一つに180 J / cm 2の光投与量を管理します。これは、ナノ粒子が存在しない場合に適用される光線量とコントロールです。残りのコントロールサンプル（無ナノ粒子及び適用されていない光線量）に光線量を適用しないでください。
- 10％FBSを補充したDMEM培地でHBSSを交換し、4時間インキュベーターでペトリ皿を保ちます。
- 15分間の色素で細胞をインキュベートすることにより実験的およびアネキシンV FITC20μlのと対照ペトリ皿で細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。 Cを染色2分間の色素を用いてインキュベートすることにより300 nmのDAPIと同様に300 nmのPI（ヨウ化プロピジウム）でells。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。
ナノ粒子の4固有細胞毒性
- 96ウェルプレート中の細胞培養を数えます
- 培地を除去し、10分間、0.05％トリプシンで細胞をインキュベートしたDPBSで細胞を2回洗浄することにより培養フラスコから細胞を収穫します。得られた細胞溶液に、10％FBSを補充した2 mlのDMEM培地を加えます。一重に細胞クラスターを分離するために、適切に解決策を混ぜます。
- 100μlの細胞懸濁液を取り、10％FBSを補充した900μlのDMEM培地に加えます。よく混ぜます。血球計数器上にこの懸濁液10μlを置きます。血球計数器を用いて細胞をカウントし4.1.1 4×10 5細胞/ mlで細胞懸濁液の濃度を調整します。
- 0時間とラベル5 96ウェルプレートを取り、24時間R、48時間、72時間および96時間。 表2に示すようなウェル/ 2,500細胞を播種、ウェルに5×10 4細胞 / mlの細胞液（TE 71およびA549）の50μLを追加します。 OVCAR3およびMDA-MB-231細胞株について、同じ手順を実行します。
- 24時間後、1×DPBSでウェルを洗浄し、 表2に示すようにウェル中にナノ粒子の濃度の増加の50μLを加える。へ2.4.2からDMEMに20、100、及びナノ粒子懸濁液180μLを添加することにより、種々のナノ粒子の濃度を準備それぞれ0.4×10 -4 mg / mlで、2.0×10 -4 mg / mlで、3.6×10 -4 mg / mlの、ナノ粒子の濃度を生じる2 mlの最終容積を得ます。各細胞株は、ナノ粒子の各濃度について三つ組を有します。
- 暗所での細胞生存率を測定します
- すぐにナノ粒子を添加した後、0時間プレートに10μlのMTTを追加します。ホルマザンcryst 4時間プレートをインキュベートALSを形成します。ウェルに50μlの可溶化溶液を追加します。ホルマザン結晶を溶解するために6時間プレートをインキュベートします。
- マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を記録することによって、0時間プレートの細胞生存率を測定します。
- 24時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子を各ウェル後24時間のインキュベーションに50μlのメディアを追加。 4.2.1と4.2.2で説明したように、MTTを加え、プレートをお読みください。
- 48時間、72時間、および96時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子と24時間のインキュベーション後にウェルに50μlのメディアを追加。残りの期間のために細胞をインキュベートします。
- 4.2.5 4.2.1と4.2.2で説明したように）特定の時点での細胞生存率を測定します。
- （n = 3）で3回完全な実験を繰り返します
5. PDT後細胞生存率を測定
- 細胞を計数し、96ウェルプレートで培養します。
- 9のセットにラベルを付けますTE 71 + A549プレート及びOVCAR3 + MDA-MB-231プレートの両方について、表3に示すように、6ウェルプレート、。 4.1.3に示すように、プレートのレイアウトは同じです。
- セクション4.1.2 の表2に示したのと同様のレイアウトでセクション4.1で説明したように96ウェルプレートをシード。
- 4.1.4で説明したように24時間後にプレートにナノ粒子を追加します。
- ナノ粒子を添加した後の24時間は、1×DPBSで細胞を洗浄し、各ウェルに50μlのHBSSを追加します。
- 3.2.3で説明したようにそれぞれの光用量でプレートを照射します。
- 10％FBSを補充した50μlのDMEM培地でHBSSを交換し、PDT後の各期間のプレートをインキュベート。
- 4.2.1及び4.2.2で説明したように各時間期間の後、細胞生存率を測定します。
6.蛍光顕微鏡
- ナノ粒子の取り込み
- 顕微鏡Aのランプをオンにしますイメージングの前にNDレーザ30分。顕微鏡のステージ上で（セクション3.1で説明したように）固定された細胞を含むペトリ皿を置きます。
- 表4に示すように、フィルタを使用して、ナノ粒子およびDAPIからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子及びDAPI画像をオーバーレイ。
- ROSの検出
- 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。顕微鏡のステージ上で（セクション3.2で説明したように）細胞を含むペトリ皿を置きます。
- 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、およびROS検出試薬からの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで試薬画像を検出位相差、ナノ粒子、DAPIおよびROSオーバーレイ。
- PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死
- 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。で説明したように細胞を含むペトリ皿（置きます顕微鏡のステージ上のセクション3.3）。
- 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITCからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITC画像をオーバーレイ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
取り込みおよびナノ粒子の本質的な細胞傷害性
50重量％ブレンドMEH-PPV / PCBMのナノ粒子は、TE 71、MDA-MB-231、A549及びOVCAR3細胞株と共にインキュベートしました。 PCBMブレンドレベルは、共役ポリマーとフラーレン14の間の理想的な電荷およびエネルギー伝達特性を与えることが示されている50重量％のPCBMとして選ば れました。ナノ粒子の取り込みの蛍光画像は、 図1Bに示されています。細胞は、ナノ粒子の取り込みを確実にするために、ナノ粒子と24時間インキュベートしました。次いで、細胞を画像化する前に、4％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞および核の位置を検出するためにDAPIで染色しました。画像十分に分離された細胞のために40％の集密度を維持しました。対応する位相コントラスト画像と蛍光画像をA549及びOVCAR3癌細胞株によるナノ粒子の優先的な取り込みがあることを示しています。検出可能な蛍光は、TE 71の制御に見ることができませんそしてMDA-MB-231癌細胞株、制限された取り込みを示します。一方、A549及びOVCAR3の癌細胞株は、かなりのナノ粒子の取り込みを示します。内因性細胞傷害性（暗毒性）がTE 71と50重量％のブレンドMEH-PPV / PCBMナノ粒子のインキュベーションによって評価した、MDA-MB-231、A549及びOVCAR3細胞株およびMTTアッセイにより細胞生存率を定量化します。 図1CにおけるMTTデータは、細胞株の正常な増殖を示します。
ROSの源としてのナノ粒子
ナノ粒子は、ROSの源であり、唯一の光にさらされた後、ROS形成をROS検出試薬キットを用いて評価したことを確認するために。 OVCAR3のデータは、図2に示されている図2Aの緑色発光の欠如を- Cは、ROSは、対照試料のために形成されていないことを示します。 ROS検出試薬から明るい緑色の発光は、ナノ粒子で処理された試料について観察されたと暴露されます図2DおよびE（すぐにPDT後とPDT後2時間）に示すように、光に、ROSはPDTの間に生成されていることが確認されました。
PDT
PDTにおけるMEH-PPV / PCBMナノ粒子の性能は直ちにPDT後、4および12時間後のインキュベーション期間後にMTTアッセイによって定量しました。データは、4時間後のインキュベーション期間のために、図3に示されています。 A549およびOVCAR3癌細胞株は、PDT治療後に有意な細胞死を示す：A549のための60％から100％までのOVCAR-3のために。 TE 71制御及びMDA-MB-231癌細胞株は、限られた効果を示します。 TE71は、正常対照細胞株であり、ナノ粒子を内在化することが期待されていません。 TE-71によるナノ粒子の唯一の低い非特異的な取り込みは、実験的に観察されます。低ナノ粒子の取り込みはまたによる他の癌細胞株と比較して低い代謝速度に、この場合であるMDA-MB-231で観察されます。 PDTデータショーMEH-PPV / PCBMのナノ粒子は、PDTの有効性は、ナノ粒子の取り込みに比例PDT増感剤、およびことが非常に有効であること。ここで考慮癌細胞株との間のPDTの結果の差異は、これらの細胞株の間で積極性（代謝およびエンドサイトーシスの速度）の違いによるものです。
PDT誘導性の細胞死の進行
PIおよびアネキシンV FITCと生/死二重染色は、細胞死の壊死性およびアポトーシスのメカニズムに関する情報を提供します。この染色スキームは、PDTにより誘導される細胞死経路の詳細を学ぶために、PDT後にここで研究の細胞株に適用された。4に示す。図アネキシンV FITC、PIおよびDAPIで染色し、TE 71and OVCAR3細胞株の画像をepiluminescence。データは、ナノ粒子のごくわずかな吸収と一致TE 71対照細胞株にPDTの効果がないことを示しています。同じ観察がMDA-MB-231（データは示していない）のために作られました。ときOVCAR3は60でPDTを受け、120 J / cmの（紫）PIおよびアネキシンV FITC（緑）の2重染色が観察されました。 180でJ / cm 2でのみPI染色は、その条件の下で、急性壊死性細胞死を示唆し、観察されました。
図再沈殿法によるナノ粒子の1（A）の作製、（B）TE 71は、MDA-MB-231、A549及びOVCAR3細胞株は、ナノ粒子とインキュベートしました。ナノ粒子は緑色で示され、核は青色で示されています。蛍光画像は、位相コントラスト画像にスケールバー=20μmで、（C）96時間までの各細胞株についての細胞生存率を測定することにより評価したナノ粒子の固有の細胞毒性を重ねています。細胞生存率はCONTRの生存率を設定することにより、ナノ粒子の制御量（0 mg / mlで）と比較されます100％でオール試料（図示せず）。エラーバーは、3つの別々の実験からの結果のための標準偏差である（n = 3）である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ROS検出試薬とOVCAR3細胞株におけるROSの図2.検出。 （A）ナノ粒子とに暴露されていないナノ粒子、無露光、（B）なしのナノ粒子、180 J / cm 2の光にさらされ、（C）2×10 -4 mg / mlのナノ粒子、無露光、（D） 100μlのH 2 O 2のようなポジティブコントロールですぐに処理した後に撮影した180 J / cm 2の光は、（E）2時間後にPDT、（F）。 DF私で明るい緑色の発光 ROS形成を確認し、ROS検出試薬からの。スケールバー=30μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TE 71の図3の細胞生存率、MDA-MB-231、A549、及びOVCAR3細胞株は、ナノ粒子の増加する用量で投与され、120 J / cm 2の光線量で照射した。後のPDTのインキュベーション時間は4時間です。凡例のナノ粒子の用量は、10 -4 mg / mlの中にあります。エラーバーは、3つの別々の実験からの結果のための標準偏差である（n = 3）である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
igure 4 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
アネキシンV FITCとPIと図4のTE 71及びOVCAR3のライブ/デッド・染色の細胞株。緑色発光は、アネキシンV FITCに対応は、紫色の発光は、PI（赤、青DAPI発光と混合）に対応し、青色発光をDAPIに対応核染色。画像は、位相コントラストとepiluminescence像のオーバーレイです。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5校正光による細胞の曝露のためのソーラーシミュレーターの設定基準太陽電池は0.5太陽光強度（50ミリワット/ cm 2で）を登録挿入図に示すように、キャリブレーションのために使用しました。/53038/53038fig5large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 陰性対照 | NPは、ノーライトなし | 光でのNP、ノー | NPと点灯しません、 |
| 正の制御 | 100μlのH 2 O 2（なしのNP、光なし） | --- | --- |
| 実験 | 0時間後にPDT（NPSと光） | 2時間後、PDT（NPSと光） | --- |
表1：ROSを検出するための実験的なデザイン。
| 0時間プレート | メディア | TE 71 | A549 | メディア | ||||||||
| 処置なし | ||||||||||||
| 0 mg / mlの | ||||||||||||
| 0.4×10 -4 mg / mlの | ||||||||||||
| 2.0×10 -4 mg / mlの | ||||||||||||
| 3.6×10 -4 mg / mlの | ||||||||||||
表2：ナノ粒子/ PDT効果の固有の細胞毒性を評価するためのナノ粒子のインキュベーションのために96ウェルプレートのレイアウト
| いいえプレート。 | 光線量（J / cm 2）を | ポストPDT時間（時間） |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
表3：PDTの評価のために96ウェルプレートにラベルを付けます。
| フルオロフォア | 励起フィルター | ダイクロイックミラー | 発光フィルター | 顕微鏡 | 励振源 |
| ナノ粒子 | 10分の488 | 500 LP | 510 LP | 共焦点 | AR-Krイオンレーザー |
| DAPI | 52分の350 | 405 LP | 20分の450 | Epiluminescence | 水銀ランプ |
| PI | 22分の543 | 562 | 40分の592 | Epiluminescence | 水銀ランプ |
| アネキシンV FITC | 30分の483 | 505 LP | 40分の535 | Epiluminescence | 水銀ランプ |
| ROS検出試薬 | 10分の491 | 510 DCLP | 50分の525 | Epiluminescence | 水銀ランプ |
イメージング実験のための表4.顕微鏡構成。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ナノ粒子を製造しながら、ナノ粒子の取り込みを達成するために、それはいくつかの重要な措置を維持するために必要でした。それは、この溶液の濃度は、形成されるナノ粒子のサイズを決定する上で重要な役割を果たしていることが観察されたように、THF中（50重量％のPCBMとブレンド）10 -6 M MEH-PPV溶液を、DI水に注入するように調製しました。濃度は、UV-VIS分光法により確認しました。プロトコルのステップでは、このソリューションが1よりもはるかに大きい吸光度注入の速度を有しているので、最初に第1のUV-Visスペクトルをとる前にMEH-PPV溶液（希釈していないMEH-PPV原液）を用意し希釈する必要があった2.1.3ことに注意してくださいまた、ナノ粒子のサイズを決定する際に重要な役割を果たし、激しくDI水を攪拌しながら、可能な限り速くなければなりません。ゆっくり注入は、大きなナノ粒子になります。また、撹拌をさらに凝集を回避するために、注射直後に停止する必要があります。注入しながら溶液を水では、ナノ粒子の大きさに影響を与える気泡形成を避けるために、溶液中に完全に針を挿入しながら、バイアルの内面の近くに針を維持することが必要です。我々の実験で得られたナノ粒子のサイズは、DLSによって測定されるように61.5±23.3 nmでした。 DLSそれは、高速で安価な、このサイズのための信頼性の高い、容易に入手可能であるとして代わりに、TEMで選ばれました。これらのナノ粒子上のゼータ電位は、中性の表面電荷に僅かに負-9.66±8.12 mVで、 すなわち、であることが見出されました。
これらの技術は、細胞の生存率の定量的測定を提供するMTTアッセイに基づいているように、それは、ナノ粒子の固有の細胞毒性を評価しながら、細胞をカウントし、PDTの結果を定量化するために不可欠でした。これはナンの用量に対する細胞生存率の比較を可能にする96ウェルプレートの各ウェル内の細胞の同じ数を用いた実験を開始するために不可欠ですoparticlesと光だけでなく、コントロール実験。
ソーラーシミュレータは、試料を照射するために使用されました。セットアップは 、図5に示すように、光源、UVフィルター、及び基準太陽電池から構成されています。この照明方式に光源のスペクトル特性及び強度の制御の高度は、高度に再現性のある結果をもたらした、達成することができます。これは、ほとんどの光源は均一な強度プロファイルを提供しないことを理解することが非常に重要です。ソーラーシミュレータは、しかしながら、照明の領域に近い均一な強度を達成するために整列させることができます。これは、照明領域の異なる領域に基準太陽電池によって確認しました。また、常に光スポットの同じ領域に、さらに強度の変化の影響を最小限に抑えるため、同じ方向にプレートを配置するために世話をしました。 図5に示したサンプル距離に光源50を提供してくれましたこれらの実験のために218 Wの電気ランプ電力の下で強度のMw / cm 2の（0.5日）HBSS色素を含まない培地は、指示色素による光の吸収を避けるために使用されました。 PDTの後、細胞を再びPDTの進行を観察するために37°C（ポストPDTのインキュベーション）で一定期間インキュベートしました。
細胞の染色は、それぞれの染料の正確な濃度を見つけるために、いくつかの試行錯誤が必要でした。これは、適切な結果が達成されるまで着実に色素濃度を増加させながら実験を繰り返すことにより達成されます。
この方法はまた、特にナノ粒子系とPDT治療に関しては、制限事項がいくつかあります。ナノ粒子は、再沈殿法により調製されるので、そこバッチからバッチへの得られたナノ粒子サイズの一部の変動があり、ナノ粒子の大きさのいくつかの多分散性は、それが制御することができない存在します。またnanopartを行うことができませんでしたサイズが20nm未満のicles。これらの制限は 、インビボで適用することができる小型の単分散ナノ粒子の開発に挑戦することができました。また、in vitroでのPDT実験は、細胞上のいくつかのストレスを与える可能性があり、長時間量、インキュベーター外に細胞を必要とします。
PDTのために本明細書で説明する方法は、現在のアプローチに関して重要です。小分子の増感剤と増感剤ドープナノ粒子を用いたPDT（による増感剤の非選択的分布に）光に増感剤の暗い毒性の重要な問題に起因する制限された臨床応用、患者の感度を見ていると、増感剤の疎水性（につながります減少した生物学的利用能および潜在的な急性毒性）。手術では、腫瘍が身体から除去された場合でも、いくつかの癌細胞が残り、寛解をもたらすことができます。放射線療法と化学療法の正常組織にも影響されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
