Introduction
I fotodynamisk terapi (PDT) fotosensibiliserare administreras till målvävnaden, och vid exponering för ljus fotosensibiliseraren genererar reaktiva syreradikaler (ROS). ROS arter såsom singlettsyre och superoxid kan framkalla oxidativ stress och efterföljande strukturella skador på celler och vävnader 1-4. På grund av dess lätt att tillämpa denna metod har aktivt undersökts och kliniska prövningar har ägt rum 5,6. Men viktiga frågor såsom mörk toxicitet av sensibiliserings, patient ljuskänslighet (på grund av icke-selektiv distribution av sensibilisator), och hydrofobicitet av sensibilisatorer (vilket leder till minskad biotillgänglighet och potentiell akut giftighet) kvar.
Här rapporterar vi en metod för tillverkning och in vitro utvärdering av ledande polymer nanopartiklar blandas med fulleren som nästa generations fotosensibiliserande för PDT. Nanopartiklarna bildas genom själv-aggregation avdet halvledande polymer MEH-PPV (poly [2-metoxi-5- (2-etylhexyloxi) -1,4-fenylenvinylen]) med fulleren PCBM (fenyl-Ci-61 -smörsyra-metylester) när dessa material löstes i en kompatibel lösningsmedel snabbt injiceras i ett icke-kompatibelt lösningsmedel (Figur 1A). Valet av MEH-PPV som värdpolymer motiveras av dess höga extinktionskoefficient som leder till höga hastigheter av triplett bildning, och både effektiva och ultrasnabb laddning och energiöverföring till fulleren PCBM 7. Dessa egenskaper är idealiska för sensibilisering av singlettsyre och superoxidbildning i PDT.
Fulleren har faktiskt använts i PDT både molekylära och nanopartiklar formulär 8-13. Dock har allvarlig cytotoxicitet hämmas vidareutveckling 12. Här visar vi att inkapsling av fulleren i en värdmatris av MEH-PPV till bildning av komposit MEH-PPV / PCBM nanopartiklar resulterar i ett PDT sensibiliserande material som jagär inte i sig cytotoxiska visar specificitet mot cancerceller på grund av nanopartiklar storlek och ytladdning, och ger mycket effektiv PDT behandling vid låga ljusdoser på grund av de ovan nämnda fotofysikaliska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odling cellinjer
- Tina TE 71 (mus tymiska epitelceller), MDA-MB-231 (Human bröstcancerceller), A549 (Human lungcancerceller) och OVCAR3 (Human äggstockstumörceller) genom att hålla kryogenen flaskorna i varmt vatten för mindre än 2 minuter . Tillsätt 10 ml DMEM-medium kompletterat med 10% FBS till varje cellinje och centrifugera i 6 min vid 106 x g.
- Aspirera suspensionen och lägga 3 ml media till pellets. Blanda cellerna ordentligt genom att pipettera flera gånger. Lägg till den här cellen lösningen att förvärmda 7 ml DMEM-medium kompletterat med 10% FBS i T75-kolvar och hålla kolvarna i fuktig atmosfär av 95% luft / 5% CO2 vid 37 ° C. Märk denna kolv som Passage 0.
- När konfluens av cellerna når 80%, skörda cellerna genom att inkubera dem med 0,05% trypsin under 10 min. Neutralisera trypsinet genom att tillsätta lika stor mängd medier. Centrifugera denna lösning under 6 minuter vid 106 x g. Ta suspensionen och tillsätt 3 ml färskt medium till det. Blanda well och överför liten mängd (100 | il) till en odlingskolv innehållande 7 ml medium. Inkubera odlingskolven i kuvös. Märk kolven som Passage 1.
- Kultur cellinjerna tills passage 11 eller 12.
2. Tillverkning av nanopartiklar
- Framställning av ~ 10 -6 MSEK (justerat) outspädd MEH-PPV stamlösning
- I en ampull lägg 1mg poly [2-metoxi-5- (2-etylhexyloxi) -1,4-fenylenvinylen] (MEH-PPV) med molekylvikt (medeltal Mn) 150,000-250,000 g / mol och 3 ml tetrahydrofuran (THF) . Rör om blandningen i 2 h under uppvärmning vid 80 ° C på en värmeplatta.
- Filtrera ovanstående lösning i en ny ampull med användning av ett 0,2 | im sprutfilter. Märk denna lösning som "outspädd MEH-PPV stamlösning". Denna lösning kommer att delta i nanopartiklar förberedelse efter finjustering av koncentrationen som beskrivs i steg 2.1.3 och 2.1.4.
- Tillsätt 50 pl av den outspädda MEH-PPV stamlösning i 3 ml THF. Märk denna lösning som "utspädd MEH-PPV stamlösning". Överföring till en 1 cm kvartskyvett och mät absorbansen vid 495 nm genom UV-vis-spektroskopi.
- Om absorbansen hos det utspädda MEH-PPV-förrådslösningen är högre än 0,17, späd outspädda MEH-PPV-förrådslösning genom tillsats av mer THF 1 ml åt gången, och upprepa steg 2.1.3 tills den uppmätta absorbansen vid 495 nm är i det intervallet 0,13-0,17.
- Beräkna molariteten för den utspädda MEH-PPV-förrådslösning med användning av Lambert-Beers lag, såsom visas nedan. Här 0,15 absorbans används som ett exempel för resten av protokollet (dvs.., Justera alla följande beräkningar baserade på observerade absorbansen) är MEH-PPV extinktionskoefficient används 10 7 M -1 cm -1 och banlängden används 1 cm.
A = ε xbxc (ekv 1)
(ε - den molära extinktionskoefficienten, A - absorbans, b - banlängd, c - koncentration av lösningen)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Eqn 2)
c = 1,5 x 10 -8 Mkr (Eqn 3)
Använd denna koncentration för att finna koncentrationen av det outspädda MEH-PPV-stamlösning på följande sätt:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (ekv 4)
0,15 x 10 -7 M x 3050 il = M 2 x 50 ^ (Eqn 5)
M 2 = 9,15 x 10 -7 Mkr (Eqn 6)
Detta är koncentrationen av den "justeras outspädda MEH-PPV-stamlösning".
- Beräkning massa MEH-PPV i justerade outspätt MEH-PPV stamlösning
- BERÄKNA MEH-PPV i en ml av den justerade outspädd förrådslösning som visas nedan med användning av molariteten erhållen i avsnitt 2.1.4 och molekylvikt (Mw) av MEH-PPV, vilket är 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. Antal mol, V - volym i L) (Eqn 7)
Således massan av MEH-PPV i 1 ml justerat undiluted förrådslösning är 9,15 x 10 -4 g.
- BERÄKNA MEH-PPV i en ml av den justerade outspädd förrådslösning som visas nedan med användning av molariteten erhållen i avsnitt 2.1.4 och molekylvikt (Mw) av MEH-PPV, vilket är 10 6 g / mol.
- Blandning PCBM i MEH-PPV
- BERÄKNA fenyl-C 61 -smörsyra-metylester (PCBM) som skall tillsättas i mälden MEH-PPV-lösning för att göra 50 vikt-% PCBM dopad MEH-PPV-lösning, där 50 vikt-% PCBM definieras med avseende på massa av MEH-PPV (dvs hälften massan av MEH-PPV). Genom att använda vikten av MEH-PPV som erhållits i avsnitt 2.2.
Massan av PCBM / 9,15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 vikt% PCBM (Eqn 8)
Massa av PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) - Väg 1 mg PCBM i en flaska och tillsätt 500 l THF. Beräkna koncentrationen av PCBM i denna lösning med användning av molekylvikten hos PCBM som 910,88 g / mol
Molaritet PCBM lösning = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 l) (Eqn 10)
Molaritet PCBM lösning = 2,19 x 10 -9 mol / il (ekv 11) - Beräkna volymen av PCBM lösning behövs för att lägga till den justerade outspätt MEH-PPV stamlösning för att erhålla 50 vikt-% PCBM dopad MEH-PPV-lösning i THF med hjälp av molariteten beräknad i steg 2.3.2
4,57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 pl / 2.19 x 10 -9 mol = 229 il (Eqn 12)
Lägg 229 pl av PCBM lösningen i 1 ml justerat outspätt MEH-PPV stamlösningen och blanda väl.
- BERÄKNA fenyl-C 61 -smörsyra-metylester (PCBM) som skall tillsättas i mälden MEH-PPV-lösning för att göra 50 vikt-% PCBM dopad MEH-PPV-lösning, där 50 vikt-% PCBM definieras med avseende på massa av MEH-PPV (dvs hälften massan av MEH-PPV). Genom att använda vikten av MEH-PPV som erhållits i avsnitt 2.2.
- Framställning av nanopartiklar genom återutfällning metod
- Transfer 1 ml av den blandade MEH-PPV / PCBM lösningen i 1 ml sprutan med nålen fäst vid den.
- Snabbt injicera 1 ml av den blandade MEH-PPV / PCBM lösningen i 4 ml avjoniserat vatten under omröring vid 1200 varv per minut. Stoppa omröring omedelbart efter injektion. Använd dessa nanopartiklar utan vidare bearbetning.
3. Inkubation av cellinjer med nanopartiklar för Imaging
OBS: Alla imaging experiment genomfördes i 35 mm petriskålar
- Upptag av nanopartilarna i cellinjer
- Kultur cellinjerna upp till 12: e passagen. Vid 12: e passage kulturceller i 35 mm petriskålar. Justera koncentrationen av celler läggs till de 35 mm petriskålar så att efter 24 timmar är cellerna 40% sammanflytande.
- I detta skede avlägsna DMEM-medium kompletterat med 10% FBS från petriskålarna, tvätta cellerna med 1x DPBS två gånger, och tillsätt 100 | il av nanopartiklar suspensionen i 2 ml DMEM till petriskålarna.
- Efter 24 timmar bort DMEM / nanopartiklar avstängning från petriskålar och tvätta cellerna med 1x DPBS 3 gånger. Fixera sedan cellerna genom inkubering med 4% paraformaldehyd under 10 minuter. Tvätta två gånger med DPBS. Färga cellerna med 300 nM DAPI genom inkubering med färgämnet för 2 min. Tvätta två gånger med DPBS. Sedan hålla cellerna i DPBS för avbildning.
- Detektion av ROS
- Kultur A549 och OVCAR3 cellinjer i petriskålar, 6 per cellinje, som förklaras i avsnitt 3.1.1. MärkPetriskålar som visas i Tabell 1.
- Tillsätt 100 | il av nanopartikelsuspension i 2 ml DMEM till tre av de petriskålar som visas i Tabell 1 och inkubera i 24 h. För petriskålar som kommer att få ljusdoser, tvätta cellerna efter 24 timmar och suspendera cellerna i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Dye fria medier.
- Värma upp lampa solsimulator under 15 minuter. Placera UV-filter framför lampan för att filtrera bort UV-ljus. Kalibrera lampa med en referens solcell genom justering av lampeffekten för att erhålla 0,5 solen intensitet (50 mW / cm 2) vid ytan av petriskålen. I denna specifika konfiguration som villkor uppnåddes med 218 W ström till lampan.
- Placera petriskålar under lampan (locket öppet) i 60 minuter, vilket resulterar i en lätt dosering av 180 J / cm 2, såsom visas i beräkningarna nedan:
50 mW / cm 2 x 3600 sek / 1000 = 180 J / cm2 - Avlägsna HBSS och utan tvättning ytterligare 2 ml DMEM-medium kompletterat med 10% FBS till petriskålarna. Inkubera cellerna under ytterligare 2 timmar.
- För den positiva kontrollen inkubera cellerna med 100 | iM väteperoxid (H 2 O 2) under 30 minuter.
- Färga cellerna i alla petriskålar med en slutlig koncentration av 5 ^ M av ROS detekteringsreagenset genom inkubering av cellerna med färgämnet för 30 min vid 37 ° C.
- Fixera cellerna genom inkubering med 4% paraformaldehyd under 10 minuter. Tvätta två gånger med DPBS. Färga cellerna med 300 nM DAPI genom inkubering med färgämnet för 2 min. Tvätta två gånger med DPBS. Sedan hålla cellerna i DPBS för avbildning.
- Apoptos och nekros av PI och annexin V FITC
- Kultur varje cellinje i 5 petriskålar. Tre av dessa petriskålar kommer att vara för experiment medan de återstående 2 petriskålar blir kontrollprover. Inkubera 3 petriskålar för experiment med nanopartiklar som explained i avsnitt 3.1.2. De kontrollprover är inte inkuberats med nanopartiklar.
- Efter 24 timmars inkubation följ steg 3.2.3.
- Placera 3 experimentella petriskålar under lampan (locket öppet) och ta ett vid 20 min, en på 40 minuter och en på 60 minuter. Detta ger tre prover som exponerats för ljusdoser på 60, 120 och 180 J / cm2, respektive (beräkning i avsnitt 3.2.4). Nästa, administrera en 180 J / cm 2 ljusdoseringen till en av de styrpetriskålar. Detta är kontrollen med ljusdos tillämpas i avsaknad av nanopartiklar. Applicera inte ljusdos till den återstående kontrollprov (inga nanopartiklar och inget ljus dos tillämpas).
- Ersätt HBSS med DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och hålla petriskålar i inkubatorn i 4 timmar.
- Färga cellerna i den experimentella och kontrollpetriskålar med 20 pl annexin V-FITC genom inkubering av cellerna med färgämnet för 15 minuter. Tvätta två gånger med DPBS. Fläck calnar med 300 nM DAPI samt 300 nM PI (propidiumjodid) genom att inkubera med de färgämnen för 2 min. Tvätta två gånger med DPBS. Sedan hålla cellerna i DPBS för avbildning.
4. Intrinsic Cytotoxicitet av nanopartiklar
- Räkna celler och odling i 96-brunnsplattor
- Skörda cellerna från odlingskolvarna genom att avlägsna mediet och tvättning av cellerna två gånger med DPBS, följt av inkubering av cellerna med 0,05% trypsin under 10 min. Tillsätt 2 ml DMEM-medium kompletterat med 10% FBS till den resulterande cellösningen. Blanda lösningen ordentligt för att separera cellkluster i sing.
- Ta 100 pl av cellsuspensionen och tillsätt till 900 | il DMEM-medium kompletterat med 10% FBS. Blanda väl. Placera 10 il av denna suspension på en hemocytometer. Räkna celler med användning av hemocytometer och justera koncentrationen av cellsuspensionen i 4.1.1 till 5 x 10 4 celler / ml.
- Ta 5 plattor med 96 brunnar märkta som 0 tim, 24 timr, 48 timmar, 72 timmar och 96 timmar. Tillsätt 50 pl av de 5 x 10 4 celler / ml celllösningar (TE 71 och A549) i brunnarna såsom visas i tabell 2, därmed sådd 2500 celler / brunn. Gör samma procedur för OVCAR3 och MDA-MB-231-cellinjer.
- Efter 24 h tvättas brunnarna med 1x DPBS och tillsätt 50 pl av ökande koncentrationer av nanopartiklar i brunnarna såsom visas i tabell 2. Förbered olika nanopartiklar koncentrationer genom tillsats 20, 100, och 180 | il av nanopartikelsuspension från 2.4.2 till DMEM till erhålla en slutlig volym av 2 ml, som ger nanopartikelkoncentrationer av 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 X 10 -4 mg / ml, och 3,6 x 10 -4 mg / ml, respektive. Varje cellinje har triplikat för varje koncentration av nanopartiklar.
- Mätning av cellviabilitet i mörker
- Tillsätt 10 pl MTT till 0 timmar plattan omedelbart efter tillsats nanopartiklar. Inkubera plattan under 4 h för formazan kristals bildas. Tillsätt 50 pl solubilisering lösning i brunnarna. Inkubera plattan under 6 timmar för att upplösa formazankristallema.
- Mät genom registrering av absorbansen vid 570 nm med mikroläsare cellviabiliteten av 0 hr plattan.
- För 24 timmar platta, tvätta cellerna med 1x DPBS och tillsätt 50 pl media i varje brunn efter 24 timmars inkubation med nanopartiklar. Lägg MTT och läsa plattan enligt beskrivningen i 4.2.1 och 4.2.2.
- För 48 timmar, 72 timmar och 96 timmar plattor, tvätta cellerna med 1x DPBS och tillsätt 50 pl media i brunnarna efter 24 timmars inkubation med nanopartiklar. Inkubera cellerna i de återstående tidsperioderna.
- 4.2.5) Mät cellviabilitet vid speciella tidpunkter såsom förklaras i 4.2.1 4.2.2.
- Upprepa hela experimentet för 3 gånger (n = 3)
5. Mätning Cellviabiliteten Efter PDT
- Räkna celler och odling i 96-brunnsplattor.
- Märka en uppsättning av 96-brunnsplattor som visas i tabell 3, både för TE 71 + A549 plattor och OVCAR3 + MDA-MB-231 plattor. Layouten av plattorna kommer att vara densamma som visas i 4.1.3.
- Seed de 96 brunnar som förklaras i avsnitt 4.1 med samma layout som visas i tabell 2 i avsnitt 4.1.2.
- Efter 24 timmar tillnanopartiklar till plattorna som beskrivs i 4.1.4.
- 24 h efter tillsats av nanopartiklar tvätta cellerna med 1x DPBS och tillsätt 50 | il HBSS till varje brunn.
- Bestråla plattorna med respektive ljusdoser som förklaras i 3.2.3.
- Ersätt HBSS med 50 fil DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och inkubera plattorna under de respektive tidsperioder efter PDT.
- Efter varje tidsperiod mäta cellviabiliteten som beskrivs i 4.2.1 och 4.2.2.
6. Fluorescensmikroskopi
- Upptag av nanopartiklar
- Slå på lamporna i mikroskop ennd lasern 30 minuter innan avbildning. Placera petriskål som innehåller de fixerade cellerna (som förklaras i avsnitt 3.1) på scenen av mikroskopet.
- Samla fluorescensen från nanopartiklar och DAPI med hjälp av filter, såsom visas i tabell 4. Överlägg faskontrast, nanopartikel och DAPI bilder i ImageJ programvara.
- Detektion av ROS
- Slå på lamporna i mikroskopet 30 minuter innan avbildning. Placera petriskål innehållande cellerna (som förklaras i avsnitt 3.2) på scenen av mikroskopet.
- Samla fluorescensen från nanopartiklar, DAPI och ROS detekteringsreagens med hjälp av filter, såsom visas i tabell 4. Överlägg faskontrast, nanopartikel, DAPI och ROS detekteringsreagensbilder i ImageJ programvara.
- Apoptos och nekros av PI och annexin V FITC
- Slå på lamporna i mikroskopet 30 minuter innan avbildning. Placera petriskålen innehållande cellerna (som förklaras iavsnitt 3,3) på scenen av mikroskopet.
- Samla fluorescensen från nanopartiklar, DAPI, PI och Annexin V FITC med hjälp av filter, såsom visas i tabell 4. Överlägg faskontrast, nanopartikel, DAPI, PI och Annexin V FITC bilder i ImageJ programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upptag och inneboende cytotoxicitet av nanopartiklar
De 50 vikt-% blandade MEH-PPV / PCBM nanopartiklar inkuberades med TE 71, MDA-MB-231, A549 och OVCAR3 cellinjer. Den PCBM blandningsnivån valdes som 50 vikt% PCBM, som har visat sig ge perfekt laddning och energiöverföringsegenskaper mellan konjugerade polymerer och fullerener 14. Fluorescens bilder av nanopartiklar upptag visas i figur 1B. Cellerna inkuberades under 24 h med nanopartiklar för att säkerställa nanopartiklar upptag. Cellerna fixerades sedan med 4% paraformaldehyd före avbildning, och färgades med DAPI för att detektera celler och placeringen av kärnan. För att bild tillräckligt åtskilda celler 40% konfluens bibehållas. Fluorescens bilder med motsvarande fas kontrastrika bilder visar att det finns upptag av nanopartiklar från A549 och OVCAR3 cancercellinjer. Ingen detekterbar fluorescens kan ses i TE 71 kontrolloch MDA-MB-231 cancercellinjer, indikerande begränsad upptag. Å andra sidan, A549 och OVCAR3 cancercellinjer uppvisar signifikant nanopartiklar upptag. Inneboende cytotoxicitet (mörk toxicitet) utvärderades genom inkubation av 50 vikt% blandade MEH-PPV / PCBM nanopartiklar med TE 71, MDA-MB-231, A549 och OVCAR3 cellinjer och kvantifiera cellviabiliteten med MTT-analys. MTT data i Figur 1C visar normala proliferation av cellinjerna.
Nanopartiklar som källa för ROS
För att säkerställa att nanopartiklarna är källan till ROS, och endast efter exponering för ljus, var ROS bildning utvärderades med en ROS detekteringsreagenssats. Data för OVCAR3 visas i figur 2 Avsaknad av grön emission i figur 2A -. C indikerar ROS bildas inte för kontrollproverna. Ljust grön emission från ROS detekteringsreagenset observeras för prover som behandlats med nanopartiklar och exponerasför ljus såsom visas i figurerna 2D och E (omedelbart efter PDT och 2 timmar efter PDT), vilket bekräftar att ROS genereras under PDT.
PDT
Utförandet av MEH-PPV / PCBM nanopartiklar i PDT kvantifierades genom MTT-analys omedelbart efter PDT, och efter 4 och 12 timmar efter inkubationsperioder. Data visas i figur 3 för 4 h efter inkubationsperioden. De A549 och OVCAR3 cancercellinjer uppvisar betydande celldöd efter PDT behandling: upp till 60% för A549 och 100% för OVCAR-3. TE 71 kontroll och MDA-MB-231 cancercellinjer visar begränsade effekter. TE71 är en normal kontroll-cellinje och förväntas inte internalisera nanopartiklar. Endast låga icke-specifikt upptag av nanopartiklar av TE-71 observeras experimentellt. Låg nanopartikel upptagning observeras även för MDA-MB-231, som är i detta fall på grund av den lägre metaboliska hastigheten jämfört med de andra cancercellinjer. PDT data visaratt MEH-PPV / PCBM nanopartiklar är mycket effektiva PDT sensibilisatorer, och att PDT effektiviteten skalor med nanopartiklar upptag. Skillnaderna i PDT resultat mellan de cancercellinjer som avses här är på grund av skillnaden i aggressivitet (metabolism och hastigheten för endocytos) mellan dessa cellinjer.
Progression av PDT-inducerad celldöd
Live / dead dubbel färgning med PI och Annexin V FITC ger information om nekrotiska och apoptotiska mekanismer för celldöd. Denna färgning system applicerades på cellinjer studerade här efter PDT för att lära sig mer om PDT-inducerad celldöd vägar. Figur 4 visar epiluminescence bilder av TE 71and OVCAR3 cellinjer färgade med Annexin V FITC, PI och DAPI. Data visar att det finns ingen effekt av PDT på TE 71 kontroll cellinje, i linje med den försumbara upptag av nanopartiklar. Samma observation gjordes för MDA-MB-231 (data visas ej). När OVCAR3 gick PDT vid 60 och 120 J / cm 2 dubbla färgning av PI (lila) och Annexin V FITC (grön) observerades. Vid 180 J / cm2 endast PI fläcken observerades, vilket tyder på akut förgiftning nekrotisk cell under detta villkor.
Figur 1. (A) Framställning av nanopartiklar genom återutfällning metod, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 och OVCAR3 cellinjer inkuberas med nanopartiklar. Nanopartiklarna visas i grön färg, är kärnan visas i blå färg. Fluorescens bilder är överlagrade med faskontrast bilder, skala bar = 20 | am, (C) Inneboende cytotoxicitet av nanopartiklar som utvärderats genom mätning av cellviabilitet för varje cellinje upp till 96 timmar. Cell viabilitet jämförs med kontroll dos av nanopartiklar (0 mg / ml) genom att ställa in livskraft CONTRol prover vid 100% (ej visad). Felstaplar är standardavvikelserna för resultat från 3 separata experiment (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Upptäckt av ROS i OVCAR3 cellinje med ROS detekteringsreagenset. (A) inga nanopartiklar, inget ljus exponering, (B) inga nanopartiklar, som exponerats för 180 J / cm2 ljus, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartiklar, ingen ljusexponering, (D) med nanopartiklar och exponering för 180 J / cm 2 ljus, tas omedelbart efter behandling, (E) 2 timmar efter PDT, (F) med 100 | j, l H2O 2 som positiv kontroll. Den ljusa gröna utsläpp i DF i s från ROS detekteringsreagenset bekräftar ROS-uppställning. Skala bar = 30 nm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cell viabilitet TE 71, MDA-MB-231, A549, och OVCAR3 cellinjer administrerade med ökande doser av nanopartiklar och bestrålades med 120 J / cm 2 ljusdos. Det post PDT inkubationstid är 4 timmar. De nanopartiklar doser i legenden är i 10 -4 mg / ml. Felstaplar är standardavvikelserna för resultat från 3 separata experiment (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
igure 4 "src =" / filer / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Figur 4. Live / död färgning av TE 71 och OVCAR3 cellinjer med annexin V FITC och PI. Grön utsläpp motsvarar annexin V FITC motsvarar lila utsläpp till PI (röd, blandat med blå DAPI emission) och blått utsläpp motsvarar DAPI nukleär färgning. Bilder är överlagring av faskontrast och epiluminescence bilder. Skala bar = 20 pm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. solsimulator setup för exponering av celler med kalibrerad ljus. En referens solcell användes för kalibrering, som visas i insättningen registrerar 0,5 solen ljusintensiteten (50 mW / cm 2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Negativa kontroller | Inga NP, inget ljus | Inga nationella parlamenten, med ljus | Inget ljus, med nationella parlamenten |
| Positiv kontroll | 100 pl H2O 2 (No nationella parlamenten, inget ljus) | --- | --- |
| Experimentellt | 0 timmar efter PDT (NPS och ljus) | 2 h efter PDT (NPS och ljus) | --- |
Tabell 1: Experimentell design för detektion av ROS.
| 0 tim platta | Medier | TE 71 | A549 | Medier | ||||||||
| Ingen behandling | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabell 2: Layout av 96-brunnar för inkubation av nanopartiklar för att utvärdera inneboende cytotoxicitet av nanopartiklar / PDT effekt
| Plate nej. | Ljusdos (J / cm 2) | Post PDT tid (h) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabell 3: Märkning av 96-brunnsplattor för PDT utvärdering.
| Fluorofor | Excitationsfilter | Dikroisk spegel | Emissionsfilter | Mikroskopi | Excitationskälla |
| Nanopartiklar | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Konfokal | Ar-Kr-jonlaser |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescence | Kvicksilverlampa |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | Kvicksilverlampa |
| Annexin V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescence | Kvicksilverlampa |
| ROS detekteringsreagenset | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | Kvicksilverlampa |
Tabell 4. Mikroskopi konfiguration för avbildning experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå nanopartiklar upptag det var nödvändigt att bibehålla vissa kritiska åtgärder och tillverkning av nanopartiklar. En 10 -6 M MEH-PPV-lösning (blandat med 50 vikt% PCBM) i THF var beredd att injicera i avjoniserat vatten, eftersom det konstaterades att koncentrationen av denna lösning spelar en viktig roll för att bestämma storleken på nanopartiklar bildas. Koncentrering kontrollerades med UV-vis-spektroskopi. Observera att i protokollet steg 2.1.3 det var nödvändigt att späda den ursprungligen beredd MEH-PPV-lösning (outspätt MEH-PPV stamlösning) först innan UV-vis spektra eftersom denna lösning har en absorbans mycket större än 1. Hastigheten på injektionen spelar också en avgörande roll för att avgöra storleken på nanopartiklar, och måste vara så snabbt som möjligt under kraftig omrörning DI vatten. Långsam injektion kommer att resultera i större nanopartiklar. Dessutom bör omrörningen stoppas omedelbart efter injektion för att undvika ytterligare aggregering. Medan injiceringlösningen i vatten är det nödvändigt att hålla nålen nära den inre ytan av flaskan medan nålen införing helt i lösning för att undvika bubbelbildning, vilket kommer att påverka storleken av nanopartiklarna. I våra experiment nanopartikelstorlekar som erhölls var 61,5 ± 23,3 nm, uppmätt genom DLS. DLS valdes i stället för TEM som den är snabb, billig, tillförlitlig för denna storlek och lätt tillgängliga. Zeta-potentialen på dessa nanopartiklar befanns vara -9,66 ± 8,12 mV, det vill säga, något negativ till neutral ytladdning.
Det var nödvändigt att räkna cellerna samtidigt utvärdera den inneboende cytotoxicitet av nanopartiklar och kvantifiera PDT resultat, eftersom dessa tekniker är baserade på MTT-analysen, som ger ett kvantitativt mått på cellviabilitet. Det är viktigt att starta försöket med samma antal celler i varje brunn i 96-brunnar, vilket möjliggör jämförelse av cellviabilitet med avseende på dosen av nanoparticles och ljus samt kontrollexperiment.
En solsimulator användes för att bestråla proven. Installationen visas i fig 5, och består av ljuskällan, ett UV-filter, och en referens solcell. Med denna belysning system en hög grad av kontroll över de spektrala egenskaperna och intensiteten hos ljuskällan kan uppnås, vilket resulterade i mycket reproducerbara resultat. Det är mycket viktigt att inse att de flesta ljuskällor inte skapa en enhetlig intensitetsprofil. Den solsimulator dock kan inriktas för att åstadkomma nära likformig intensitet i området för belysning. Detta verifierades genom en referens solcell i olika regioner av det belysta området. Vi tog även hand att alltid placera plattorna i samma region av ljusfläcken och i samma orientering för att ytterligare minimera effekterna av variationer i intensitet. Ljuskällan till provet avstånd som anges i fig 5 försett oss med 50mW / cm2 (0,5 sön) intensitet under en elektrisk lampa effekt 218 W. För dessa experiment HBSS färgämne fria medier användes för att undvika absorption av ljus av indikations färgämnen. Efter PDT ades cellerna åter inkuberades under vissa tidsperioder vid 37 ° C (efter PDT inkubation) för att observera utvecklingen av PDT.
Färgning av celler krävs några försök och misstag att hitta rätt koncentration av respektive färgämne. Detta uppnås genom att upprepa experimentet samtidigt öka färgämneskoncentrationen stadigt fram lämpliga resultat uppnåddes.
Metoden har också ett par begränsningar, särskilt när det gäller nanopartikelsystemet och PDT-behandling. Eftersom nanopartiklar framställs genom återutfällning metoden finns en viss variation i den erhållna nanopartiklar storlek från parti till parti, och en del polydispersitet i nanopartiklar storlek finns det kan inte styras. Det har inte heller varit möjligt att göra nanoparticles mindre än 20 nm i storlek. Dessa begränsningar kan finnas utmaningar i utvecklingen av små storlek monodispersa nanopartiklar som kan användas in vivo. Vidare kräver in vitro PDT experiment cellerna att vara utanför inkubatorn under en längre tid, vilket skulle kunna innebära en viss stress på cellerna.
Metoden diskuteras häri för PDT är av betydelse med hänsyn till nuvarande metoder. PDT med hjälp av små molekyler sensibiliserande och sensibiliserande dopade nanopartiklar har sett begränsad klinisk tillämpning på grund av betydande problem med mörk toxicitet av sensibiliserings, patient ljuskänslighet (på grund av icke-selektiv distribution av sensibilisator), och hydrofobicitet av sensibilisatorer (vilket leder till minskad biotillgänglighet och potentiell akut toxicitet). Vid kirurgi, även om tumören avlägsnas från kroppen, några cancerceller kvar och kan resultera i remission. I strålbehandling och kemoterapi normal vävnad påverkas också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
