Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Fotodynamisk terapi med Blended ledende polymer / Fullenanopartikkel fotosensibilisatorer

doi: 10.3791/53038 Published: October 28, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I fotodynamisk behandling (PDT) fotosensibilisatorer er gitt for å oppnå vev, og ved eksponering for lys fotosensibiliseringsmidlet genererer reaktive oksygen arter (ROS). ROS arter så som singlett-oksygen og peroksyd kan indusere oksidativt stress og påfølgende strukturell skade på celler og vev 1-4. På grunn av sin påsetting denne metoden har vært aktivt undersøkt og kliniske studier har funnet sted 5,6. Imidlertid betydelige problemer som mørk toksisitet av de sensitiveringsmidler, pasientens følsomhet overfor lys (på grunn av ikke-selektiv fordeling av sensibilisator), og hydrofobitet av sensibilisatorer (som fører til redusert biotilgjengelighet og potensiell akutt giftighet) forblir.

Her rapporterer vi en metode for fabrikasjon og in-vitro evaluering av ledende polymer nanopartikler blandet med Fulle som neste generasjon fotosensibilisatorer for PDT. Nanopartiklene dannes ved selv-aggregering avden halvledende polymer MEH-PPV (poly [2-metoksy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene]) med Fulle PCBM (fenyl-C 61 smørsyremetylester) når disse materialer oppløst i et kompatibelt Oppløsningsmidlet er raskt injiseres i en ikke-forenlig løsningsmiddel (figur 1A). Valget av MEH-PPV som vert polymer er motivert av sin høye ekstinksjonskoeffisient som fører til høye priser av lett formasjon, og både effektiv og lynraske lading og energioverføring til Fulle PCBM 7. Disse egenskapene er ideelle for sensibilisering av singlet oksygen og superoksyddannelse i PDT.

Fulle har faktisk blitt brukt i PDT både molekylære og nanopartikkel skjemaet 8-13. Imidlertid har cytotoksisitet alvorlig hemmet videre utvikling 12. Her viser vi at innkapsle Fulle i en rekke matrise av MEH-PPV å gi kompositt MEH-PPV / PCBM nanopartikler resultater i en PDT sensibiliserende materiale som jeger ikke egentlig cytotoksiske, viser spesifisitet mot kreftceller på grunn av nanopartikkelstørrelse og overflateladning, og gir svært effektive PDT-behandling på lite lys doser på grunn av de nevnte photophysical egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. dyrking cellelinjer

  1. Tine TE 71 (mus tymiske epitel-celler), MDA-MB-231 (human brystcancer-celler), A549 (human lungecancerceller) og OVCAR3 (menneskelige ovarietumorceller) ved å holde de kryogen hetteglassene i varmt vann til mindre enn 2 min . Tilsett 10 ml DMEM medium supplementert med 10% FBS for hver cellelinje og sentrifuger i 6 minutter ved 106 x g.
  2. Aspirer fjæring og legge 3ml media til pelleten. Bland godt ved å pipettere cellene flere ganger. Legg denne cellen løsningen forvarmet 7 ml DMEM medium supplementert med 10% FBS i T75-kolber og holde flaskene i fuktig atmosfære med 95% luft / 5% CO2 ved 37 ° C. Merke dette kolbe som Passage 0.
  3. Når sammenflyting av cellene når 80%, høste cellene ved å inkubere dem med 0,05% trypsin i 10 min. Nøytralisere trypsin ved tilsetning av tilsvarende mengde medium. Sentrifuger denne løsningen i 6 minutter ved 106 x g. Fjern fjæring og tilsett 3 ml ferske media til det. Bland well og overføre små mengder (100 ul) i en kulturflaske som inneholdt 7 ml media. Inkuber kulturflaske i inkubatoren. Merke flasken som Passage en.
  4. Kultur cellelinjene inntil passasje 11 eller 12.

2. Fabrikasjon av Nanopartikler

  1. Utarbeidelse av ~ 10 -6 M (justert) ufortynnet MEH-PPV stamløsning
    1. I en ampulle legge 1mg Poly [2-metoksy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) med molekylvekt (gjennomsnittlig Mn) 150,000-250,000 g / mol og 3 ml tetrahydrofuran (THF) . Omrør blandingen i 2 timer under oppvarming ved 80 ° C på en varm plate.
    2. Filtrer den ovennevnte løsning i en ny beholder ved hjelp av en 0,2 um sprøytefilter. Merke denne løsningen som "ufortynnet MEH-PPV stamløsning". Denne løsningen vil bli involvert i nanopartikkel forberedelse etter finjustering av konsentrasjonen som beskrevet i trinn 2.1.3 og 2.1.4.
    3. Tilsett 50 pl av den ufortynnede MEH-PPV stamløsning i 3 ml THF. Merke denne løsningen som "utvannet MEH-PPV stamløsning". Overfør til en 1 cm kvartskuvette og mål absorbansen ved 495 nm ved hjelp av UV-vis spektroskopi.
    4. Når absorbansen av den fortynnede MEH-PPV lagerløsning er høyere enn 0,17, fortynne ufortynnet MEH-PPV forrådsløsning ved tilsetning av mer THF 1 ml om gangen, og gjenta trinn 2.1.3 inntil den målte absorbans ved 495 nm er i spenner 0,13 til 0,17.
    5. Beregn molariteten av den fortynnede MEH-PPV stamløsning ved hjelp av Lambert-Beer lov som vist nedenfor. Her 0,15 absorbans er brukt som et eksempel for resten av protokollen (f.eks., Justere alle følgende beregninger basert på observerte absorbans), er MEH-PPV ekstinksjonskoeffisienten som anvendes er 10 7 M -1 cm -1, og banelengden er brukt 1 cm.
      A = ε xbxc (eqn 1)
      (ε - den molare ekstinksjonskoeffisient, A - absorbans, b - veilengde, c - konsentrasjon av oppløsningen)
      0.15 = 10 7 M -1 -1 cm x 1 cm xc (eqn 2)
      c = 1,5 x 10 -8 M (eqn 3)
      Bruk av denne konsentrasjon for å finne konsentrasjonen av ufortynnet MEH-PPV lagerløsning som følger:
      M 1 V 1 = M 2 V 2 (eqn 4)
      0,15 x 10 -7 M x 3050 mL = M 2 x 50 ul (eqn 5)
      M 2 = 9,15 x 10 -7 M (eqn 6)
      Dette er konsentrasjonen av den "justert ufortynnet MEH-PPV stamløsning".
  2. Beregne massen av MEH-PPV i den justerte ufortynnet MEH-PPV stamløsning
    1. Beregne massen av MEH-PPV i 1 ml av stamløsningen justeres ufortynnet som vist nedenfor ved hjelp av molariteten erholdt i avsnitt 2.1.4 og molekylvekt (Mw) av MEH-PPV, som er 10 6 g / mol.
      M = n / V (n - nr. Av føflekker, V - volum i L) (eqn 7)
      Således massen av MEH-PPV i 1 ml av justert undiluted stamoppløsning er 9,15 x 10 -4 g.
  3. Blending PCBM i MEH-PPV
    1. Beregne massen av fenyl-C 61 smørsyremetylester (PCBM) som skal legges inn i lager MEH-PPV-løsning for å gjøre 50 vekt% PCBM dopede MEH-PPV-løsning, hvor 50 vekt-% PCBM er definert med hensyn til massen av MEH-PPV (dvs. halvparten av massen av MEH-PPV). Ved å bruke vekten av MEH-PPV oppnådd i punkt 2.2.
      Masse av PCBM / 9,15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 vekt% PCBM (eqn 8)
      Masse av PCBM = 4,57 x 10 -4 g (eqn 9)
    2. Veie 1 mg PCBM i hetteglass og tilsett 500 mL THF. Beregn konsentrasjonen av PCBM i denne løsning ved hjelp av molekylvekten til PCBM som 910,88 g / mol
      Molaritet PCBM oppløsning = 0.001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (eqn 10)
      Molaritet PCBM løsning = 2.19 x 10 -9 mol / mikroliter (eqn 11)
    3. Beregn volumet av PCBM løsning for å legge til justert ufortynnet MEH-PPV stamløsning for å oppnå 50 vekt% PCBM dopede MEH-PPV-løsning i THF ved hjelp av molariteten beregnet i trinn 2.3.2
      4,57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 gx en ul / 2.19 x 10 -9 mol = 229 mL (eqn 12)
      Legg 229 mL av PCBM løsningen i 1 ml justert ufortynnet MEH-PPV stamløsning og bland godt.
  4. Utarbeidelse av nanopartikler av gjenutfelling metode
    1. Transfer 1 ml av blended MEH-PPV / PCBM oppløsningen inn i en ml sprøyten med kanylen til den.
    2. Hurtig injisere 1 ml av den blandede MEH-PPV / PCBM løsning i 4 ml avionisert vann under omrøring ved 1200 rpm. Stoppe stirring umiddelbart etter injeksjon. Bruk disse nanopartiklene uten ytterligere behandling.

3. Inkubasjon av cellelinjer med nanopartikler for Imaging

MERK: Alle bildebehandling eksperimenter ble gjennomført i 35 mm petriskåler

  1. Opptak av nanoparticles i cellelinjer
    1. Kultur cellelinjer opp til 12 th passasjen. På de 12 th passasje kultur celler i 35 mm petriskåler. Justere konsentrasjonen av celler lagt til 35 mm petriskåler slike at etter 24 timers cellene er 40% sammenflytende.
    2. På dette stadium fjernes de DMEM medium supplementert med 10% FBS fra petriskåler, vask cellene med 1x DPBS to ganger, og tilsett 100 ul av den nanopartikler suspensjonen i 2 ml DMEM til petriskåler.
    3. Etter 24 timers fjerne DMEM / nanopartikler suspensjon fra petriskåler og vaske cellene med 1x DPBS 3 ganger. Deretter fiksere cellene ved inkubering med 4% paraformaldehyd i 10 min. Vask to ganger med DPBS. Flekk cellene med 300 nM DAPI ved inkubering med fargestoff i 2 min. Vask to ganger med DPBS. Deretter holde cellene i DPBS for bildebehandling.
  2. Påvisning av ROS
    1. Kultur A549 og OVCAR3 cellelinjer i petriskåler, 6 per cellelinje, som forklart i avsnitt 3.1.1. MerkePetriskåler som vist i tabell 1.
    2. Tilsett 100 ul av nanopartikkelsuspensjonen i 2 ml DMEM til tre av petriskåler, som vist i tabell 1, og inkuber i 24 timer. For de petriskåler som vil motta lette doser, vaske cellene etter 24 timer og suspendere cellene i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) fargestoff frie medier.
    3. Varm opp lampen av solens simulator for 15 min. Plasser UV filter foran lampen for å filtrere bort UV-lys. Kalibrer lampe med en referanse solcelle ved justering av lampeeffekt for å oppnå 0,5 sol (50 mW / cm 2) intensitet på overflaten av petriskålen. I denne spesielle oppsett som betingelse ble oppnådd med 218 W strømtilførselen til lampen.
    4. Plasser petriskåler under lampen (lokket åpent) i 60 minutter, noe som resulterer i en lys dose på 180 J / cm 2, som vist i beregningene nedenfor:
      50 mW / cm 2 x 3600 sek / 1,000 = 180 J / cm2
    5. Fjern HBSS og uten vasking tilsett 2 ml DMEM medium supplementert med 10% FBS til petriskåler ytterligere. Cellene inkuberes i ytterligere 2 timer.
    6. For den positive kontrollen inkubere cellene med 100 mM hydrogenperoksyd (H 2 O 2) i 30 min.
    7. Flekk cellene i alle petriskåler med en endelig konsentrasjon på 5 uM av ROS påvisningsreagens ved å inkubere cellene med fargestoff i 30 minutter ved 37 ° C.
    8. Fiksere cellene ved inkubering med 4% paraformaldehyd i 10 min. Vask to ganger med DPBS. Flekk cellene med 300 nM DAPI ved inkubering med fargestoff i 2 min. Vask to ganger med DPBS. Deretter holde cellene i DPBS for bildebehandling.
  3. Apoptose og nekrose av PI og annexin V FITC
    1. Culture hver cellelinje i 5 petriskåler. Tre av disse petriskåler vil være for forsøket, mens de resterende 2 petriskåler blir kontrollprøver. Inkuber 3 petriskåler for forsøket med nanopartikler som explained i avsnitt 3.1.2. Kontrollprøvene ikke er inkubert med nanopartikler.
    2. Etter 24 timers inkubasjon følge trinn 3.2.3.
    3. Plasser de 3 eksperimentelle petriskåler under lampen (lokket åpent) og ta en på 20 min, en på 40 min og en på 60 min. Dette gir tre prøver som ble eksponert for lys doser på 60, 120 og 180 J / cm 2, henholdsvis (beregnings i avsnitt 3.2.4). Deretter administreres en 180 J / cm2 lys dosering til en av styrepetriskåler. Dette er kontrollen med lys dose anvendt i fravær av nanopartikler. Ikke påfør lys dose til de resterende kontrollprøve (ingen nanopartikler og ingen lys dose brukt).
    4. Sett på HBSS med DMEM medium supplementert med 10% FBS og holde petriskåler i inkubator i 4 timer.
    5. Flekk cellene i den eksperimentelle og kontrollpetriskåler med 20 ul av FITC-annexin V ved å inkubere cellene med fargestoff i 15 min. Vask to ganger med DPBS. Flekker på calen med 300 nM DAPI samt 300 nM PI (propidiumjodid) ved inkubering med fargestoffer for 2 min. Vask to ganger med DPBS. Deretter holde cellene i DPBS for bildebehandling.

4. Intrinsic Cytotoksisitet of Nanopartikler

  1. Telle celler og dyrking i 96-brønners plater
    1. Høste cellene fra kulturflasker ved å fjerne mediet og vasking av cellene to ganger med DPBS, etterfulgt av inkubasjon av cellene med 0,05% trypsin i 10 min. Tilsett 2 ml DMEM medium supplementert med 10% FBS til den resulterende celleløsning. Bland løsningen riktig å skille celleclustere inn singlets.
    2. Ta 100 ul av cellesuspensjonen og tilsett 900 ul DMEM medium supplementert med 10% FBS. Bland godt. Plassere 10 ul av denne suspensjonen på et hemocytometer. Tell cellene ved hjelp av hemocytometer og justere konsentrasjonen av cellesuspensjonen i 4.1.1 til 5 x 10 4 celler / ml.
    3. Ta 5 96-brønners plater merket som 0 time, 24 timerr, 48 timer, 72 timer og 96 timer. Tilsett 50 ul av de 5 x 10 4 celler / ml celle løsninger (TE og 71 A549) inn i brønnene, som vist i tabell 2, og dermed såing 2500 celler / brønn. Gjør det samme prosedyre for OVCAR3 og MDA-MB-231 cellelinjer.
    4. Etter 24 timer vaskes brønnene med 1x DPBS og tilsett 50 pl av økende konsentrasjoner av nanopartikler inn i de brønnene som vist i tabell 2. Klargjør forskjellige nanopartikkelkonsentrasjonen ved tilsetning av 20, 100, og 180 pl av nanopartikkelsuspensjonen fra 2.4.2 til DMEM til oppnå et sluttvolum på 2 ml, som gir nanopartikkelkonsentrasjon på 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, og 3,6 x 10 -4 mg / ml, henholdsvis. Hver cellelinje har tre paralleller for hver konsentrasjon av nanopartikler.
  2. Måling cellen levedyktighet i mørket
    1. Legg 10 mL MTT til 0 hr plate umiddelbart etter tilsetting nanopartikler. Inkuber platen i 4 timer for formazan krystals å danne. Tilsett 50 mL Oppløsningsløsningen i brønnene. Inkuber platen i 6 timer for å oppløse formazankrystaller.
    2. Måle cellelevedyktigheten til 0 hr platen ved registrering av absorbansen ved 570 nm med mikroplateleser.
    3. For 24-timers plate, vaske cellene med 1x DPBS og tilsett 50 mL media i hver brønn etter 24 timers inkubering med nanopartikler. Legg MTT og lese plate som forklart i 4.2.1 og 4.2.2.
    4. I 48 timer, 72 timer og 96 timer plater, vask cellene med 1x DPBS og tilsett 50 ul media inn i brønnene etter 24 timers inkubering med nanopartikler. Inkuber cellene i de gjenværende tidsperioder.
    5. 4.2.5) Mål cellen levedyktighet på bestemte tidspunkter som forklart i 4.2.1 og 4.2.2.
    6. Gjenta hele eksperimentet for 3 ganger (n = 3)

5. Måling Cell Livskraftig Etter PDT

  1. Telle celler og dyrking i 96-brønners plater.
    1. Merke et sett av 96-brønners plater som vist i tabell 3, både for TE 71 + A549 plater og OVCAR3 + MDA-MB-231 plater. Utformingen av platene vil være de samme som vist i 4.1.3.
    2. Seed 96-brønners plater som forklart i avsnitt 4.1 med samme layout som vist i Tabell 2 i pkt 4.1.2.
    3. Etter 24 timers legge nanopartikler til platene som forklart i 4.1.4.
    4. 24 timer etter tilsetning av nanopartikler vaskes cellene med 1x DPBS og tilsett 50 pl HBSS til hver brønn.
    5. Bestråle platene med de respektive lysdoser som beskrevet i 3.2.3.
    6. Sett på HBSS med 50 ul DMEM medium supplementert med 10% FBS og inkuberes platene i de respektive tidsperioder etter PDT.
    7. Etter hver tidsperiode måle cellelevedyktighet som beskrevet i 4.2.1 og 4.2.2.

6. Fluorescensmikroskopi

  1. Opptak av nanopartikler
    1. Slå på lampene av mikroskopet ennd laseren 30 min før avbildning. Sett petriskål som inneholder faste celler (som forklart i avsnitt 3.1) på scenen av mikroskopet.
    2. Samle fluorescens fra nanopartikler og DAPI ved å bruke filtre som vist i tabell 4. Overlegg fase kontrast, nanopartikler og DAPI bilder i ImageJ programvare.
  2. Påvisning av ROS
    1. Slå på lampene av mikroskopet 30 min før bildebehandling. Sett petriskål som inneholder celler (som forklart i kapittel 3.2) på scenen av mikroskopet.
    2. Samle fluorescens fra nanopartikler, DAPI, og ROS påvisende reagens ved hjelp av filtre som vist i tabell 4. Overlegg på fasekontrast, nanopartikler, DAPI og ROS påvisningsreagens bilder i ImageJ programvare.
  3. Apoptose og nekrose av PI og annexin V FITC
    1. Slå på lampene av mikroskopet 30 min før bildebehandling. Sett petriskål inneholdende cellene (som forklart iavsnitt 3.3) på scenen av mikroskopet.
    2. Samle fluorescens fra nanopartikler, DAPI, PI, og Annexin V FITC ved å bruke filtre som vist i tabell 4. Overlegg fase kontrast, nanopartikler, DAPI, PI og Annexin V FITC bilder i ImageJ programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opptak og egenverdi cytotoksisitet av nanopartikler

De 50 vekt-% blandede MEH-PPV / PCBM nanopartikler ble inkubert med TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinjer. Den PCBM blanding nivået ble valgt som 50 vekt% PCBM, noe som har vist seg å gi ideelle charge og energioverføringsegenskaper mellom konjugerte polymerer og fuller 14. Fluorescens bilder av nanopartikkelopptak er vist i figur 1B. Celler ble inkubert i 24 timer med nanopartikler for å sikre nanopartikkel-opptak. Cellene ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd før avbildning, og farvet med DAPI for å påvise celler og plassering av kjernen. For å avbilde tilstrekkelig separerte celler 40% konfluens ble opprettholdt. Fluorescens bilder med tilsvarende fasekontrastbilder viser at det er foretrukket opptak av nanopartikler ved A549 og OVCAR3 kreftcellelinjer. Ingen påvisbar fluorescens kan sees i TE 71 styreog MDA-MB-231 kreftcellelinjer, noe som indikerer begrenset opptak. På den annen side, A549 og OVCAR3 kreftcellelinjer oppviser betydelig nanopartikkel-opptak. Intrinsic cytotoksisitet (mørk toksisitet) ble evaluert ved inkubering av 50 vekt-% blandede MEH-PPV / PCBM nanopartikler med TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinjer og kvantifisering av cellelevedyktigheten ved MTT-assay. MTT data i figur 1C viser normal proliferasjon av cellelinjene.

Nanopartikler som kilde til ROS

For å sikre at nanopartiklene er kilden til ROS, og bare etter eksponering for lys, ble ROS dannelse evaluert med en ROS detektere reagenssett. Data for OVCAR3 er vist i Figur 2. Fravær av grønn emisjon i figur 2A -. C viser ROS dannes ikke for kontrollprøvene. Lys grønn emisjon fra ROS påvisningsreagens er observert for prøvene som er behandlet med nanopartikler og eksponerttil lys som vist i figurene 2D og E (umiddelbart etter PDT og 2 timer etter PDT), som bekrefter at ROS genereres ved PDT.

PDT

Ytelsen til MEH-PPV / PCBM nanopartikler i PDT ble kvantifisert ved MTT analyse umiddelbart etter PDT, og etter 4 og 12 timer etter inkubasjonsperioder. Dataene er vist i figur 3 for fire timer etter inkubasjonsperioden. De A549 og OVCAR3 kreftcellelinjer utvise betydelig celledød etter PDT behandling: opp til 60% for A549 og 100% for OVCAR-3. TE 71-kontroll og MDA-MB-231 kreftcellelinjer viser begrensede effekter. TE71 er en normal kontroll cellelinje og forventes ikke å internalisere nanopartikler. Bare lav ikke-spesifikt opptak av nanopartikler av TE-71 blir observert eksperimentelt. Lav nanopartikkelopptak er også observert for MDA-MB-231, som er i dette tilfelle på grunn av den lavere metabolske rate i forhold til de andre kreftcellelinjer. PDT data showetat MEH-PPV / PCBM nanopartikler er svært effektive PDT allergifremkallende, og at PDT effektiviteten skalerer med nanopartikkel-opptak. Forskjellene i PDT resultater mellom de kreftcellelinjer som anses her er på grunn av forskjellen i aggressivitet (metabolisme og frekvensen av endocytose) mellom disse cellelinjene.

Progresjon av PDT-indusert celledød

Levende / døde dobbel farging med PI og Annexin V FITC gir informasjon om nekrotiske og apoptotiske mekanismer for celledød. Dette farging ordningen ble brukt til cellelinjer studert her etter PDT for å lære mer om PDT-indusert celledød trasé. Figur 4 viser epiluminescence bilder av TE 71and OVCAR3 cellelinjer farget med Annexin V FITC, PI og DAPI. Dataene viser at det ikke er noen effekt av PDT i TE 71 kontrollcellelinje, i samsvar med ubetydelig opptak av nanopartikler. Den samme observasjon ble gjort for MDA-MB-231 (data ikke vist). Når OVCAR3 gikk PDT ved 60 og 120 J / cm 2 dual farging av PI (purpur) og Annexin V-FITC (grønt) ble observert. På 180 J / cm 2 bare PI flekken ble observert, noe som tyder på akutt nekrotisk celledød under denne betingelse.

Figur 1
Figur 1. (A) Fremstilling av nanopartikler ved gjenutfelling metode, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinjer inkubert med nanopartikler. Nanopartiklene er vist i grønn farge, er kjernen vist i blå farge. Fluorescens bildene er belagt med fasekontrastbildene, målestokk = 20 um, (C) Intrinsic cytotoksisitet av evaluert ved å måle cellenes levedyktighet for hver cellelinje opp til 96 timer nanopartikler. Celle viabilities er sammenlignet med kontroll dose av nanopartikler (0 mg / ml) ved å sette levedyktighet av kontrol prøver på 100% (ikke vist). Feilfelt er standardavvikene for resultater fra 3 separate eksperimenter (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Påvisning av ROS i OVCAR3 cellelinje med ROS påvisningsreagens. (A) ingen nanopartikler, ingen lys eksponering, (B) uten nanopartikler, utsatt for 180 J / cm 2 lys, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartikler, ingen lys eksponering, (D) med nanopartikler og eksponering for 180 J / cm2 lys, tatt umiddelbart etter behandling, (E) 2 timer etter PDT, (F) sammen med 100 pl H to O to som positiv kontroll. Den lyse grønne utslipp i DF jeg s fra ROS påvisningsreagens bekrefter ROS formasjon. Scale bar = 30 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Celle viabilities av TE 71, MDA-MB-231, A549, og OVCAR3 cellelinjer administrert med økende doser av nanopartikler og bestrålt med 120 J / cm2 lys dose. Den post-PDT inkubasjonstiden er 4 timer. De nanopartikkel doser i legenden er i 10 -4 mg / ml. Feilfelt er standardavvikene for resultater fra 3 separate eksperimenter (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

igur 4 "src =" / filer / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Figur 4. Levende / dead farging av TE 71 og OVCAR3 cellelinjer med annexin V FITC og PI. Grønn utslipp tilsvarer annexin V FITC tilsvarer lilla utslipp til PI (rød, blandet med blå DAPI utslipp) og blå utslipp tilsvarer DAPI kjernekraft flekken. Bildene er overlegget av fase kontrast og epiluminescence bilder. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Solar simulator oppsett for eksponering av celler med kalibrert lys. En referanse solcelle ble brukt for kalibrering, som vises i det innfelte registrering 0,5 sun lysintensitet (50 mW / cm 2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Negative kontroller Ingen NPs, ingen lys Ingen NPs, med lys Ingen lys, med NPs
Positiv kontroll 100 mL H 2 O 2 (Ingen NPs, ingen lys) --- ---
Eksperimentell 0 timer etter PDT (NPs og lys) 2 timer etter PDT (NPs og lys) ---

Tabell 1: Eksperimentell design for deteksjon av ROS.

0 hr plate Media TE 71 A549 Media
Ingen behandling
0 mg / ml
0,4 x 10 -4 mg / ml
2,0 x 10 -4 mg / ml
3,6 x 10 -4 mg / ml

Tabell 2: Oppsett av 96-brønns plate for inkubasjon av nanopartikler for å vurdere iboende cytotoksisitet av nanopartikler / PDT effekt

Plate no. Lysdose (J / cm2) Post PDT tid (t)
1 60 0
2 60 4
3 60 12
4 120 0
5 120 4
6 120 12
7 180 0
8 180 4
9 180 12

Tabell 3: Merking 96-brønners plater for PDT evaluering.

Fluorophore Eksitasjonsfilteret Dichroic speil Utslipp filter Mikroskopi Eksitasjon kilde
Nanopartikkel 488/10 500 LP 510 LP Confocal Ar-Kr ionelaser
DAPI 350/52 405 LP 450/20 Epiluminescence Kvikksølvlampe
PI 543/22 562 592/40 Epiluminescence Kvikksølvlampe
Annexin V FITC 483/30 505 LP 535/40 Epiluminescence Kvikksølvlampe
ROS påvisningsreagens 491/10 510 DCLP 525/50 Epiluminescence Kvikksølvlampe

Tabell 4. Mikros konfigurasjon for bildebehandling eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å oppnå nanopartikkel-opptaket var det nødvendig å opprettholde noen viktige tiltak mens fabrikasjon av nanopartikler. A 10 -6 M MEH-PPV-løsning (blandet med 50 vekt% PCBM) i THF ble forberedt på å injisere i DI-vann, som det ble observert at konsentrasjonen av denne oppløsning spiller en viktig rolle i å bestemme størrelsen av nanopartikler som dannes. Konsentrasjon ble undersøkt ved UV-vis spektroskopi. Merk at i trinn 2.1.3 protokollen det var nødvendig å fortynne den innledningsvis klare MEH-PPV-løsning (ufortynnet MEH-PPV stamoppløsning) først lot UV-vis spek siden denne løsningen har en absorbans mye større enn 1. Hastigheten for injeksjon spiller også en avgjørende rolle i å avgjøre størrelsen på nanopartikler, og har til å være så rask som mulig under kraftig omrøring av DI vann. Langsom injeksjon vil resultere i større nanopartikler. I tillegg bør omrøringen stoppes umiddelbart etter injeksjonen for å unngå videre aggregering. Mens injisereløsningen i vann, er det nødvendig å holde nålen nær den indre overflate av glasset mens innsetting av nålen helt inn i løsningen for å unngå blæredannelse, noe som vil påvirke størrelsen på nanopartikler. I våre forsøk nanopartikkelstørrelser som ble oppnådd var 61,5 ± 23,3 nm, målt ved DLS. DLS ble valgt i stedet for TEM som den er rask, billig, pålitelig for denne størrelse og lett tilgjengelig. Zeta potensialet på disse nanopartiklene ble funnet å være -9,66 ± 8,12 mV, dvs. litt negativ til nøytral overflateladning.

Det var viktig å telle cellene mens evaluere den iboende cytotoksisitet av nanopartikler og kvantifisere PDT resultater, da disse teknikkene er basert på MTT-analysen som gir en kvantitativ måling av celle-levedyktighet. Det er viktig å starte forsøket med det samme antall celler i hver brønn av 96-brønns plate, som muliggjør sammenligning av cellelevedyktighet med hensyn til dosen av nanoparticles og lys, så vel som kontrollforsøk.

En solfanger simulator ble anvendt for å bestråle prøvene. Oppsettet er vist i figur 5, og består av lyskilden, et UV-filter, og en referanse solcelle. Med denne belysning ordningen en høy grad av kontroll over de spektrale egenskaper, og intensiteten av lyskilden kan oppnås, noe som resulterte i meget reproduserbare resultater. Det er svært viktig å innse at de fleste lyskilder ikke gir en jevn intensitet profil. Solens simulator, men kan være justert for å oppnå nær jevn intensitet i området av belysning. Dette ble bekreftet av en referanse solcelle i forskjellige regioner av det belyste området. Vi tok også vare for alltid å plassere plater i samme region av lys flekk og i samme retning for å ytterligere redusere effekten av variasjon i intensitet. Lyskilden å sample avstanden indikert i figur 5 har gitt oss med 50mW / cm 2 (0,5 søn) av intensitet under en elektrisk lampe kraft av 218 W. For disse eksperimentene HBSS dye frie medier ble brukt for å unngå absorpsjon av lys ved indikatorfarger. Etter PDT ble cellene på nytt inkubert i visse tidsperioder ved 37 ° C (etter-PDT inkubasjon) for å observere utviklingen av PDT.

Farging av celler kreves en del prøving og feiling for å finne den riktige konsentrasjonen av den respektive fargestoff. Dette oppnås ved å gjenta eksperimentet og samtidig øke fargestoffkonsentrasjonen jevnt frem til egnede resultater ble oppnådd.

Fremgangsmåten har også et par av begrensninger, særlig med hensyn til nanopartikkel-systemet og PDT behandling. Siden nanopartikler fremstilles ved utfelling på nytt metode det er en viss variasjon i den oppnådde nanopartikkelstørrelse fra parti til parti, og en polydispersitet i nanopartikkelstørrelsen finnes som ikke kan kontrolleres. Det har heller ikke vært mulig å foreta nanoparticles mindre enn 20 nm i størrelse. Disse begrensningene kan være utfordringer i utviklings liten størrelse monodisperse nanopartikler som kan brukes in vivo. Videre krever in vitro eksperiment PDT cellene til å være utenfor inkubatoren i en lengre tidsperiode, noe som kan påføre en spenning på cellene.

Fremgangsmåten som her er omtalt for PDT er av vesentlig betydning for aktuelle innfallsvinkler. PDT ved hjelp av små molekyler sensibilisatorer og sensitive dopet nanopartikler har hatt begrenset klinisk anvendelse på grunn av betydelige problemer med mørk toksisitet av de sensitiveringsmidler, pasientens følsomhet overfor lys (på grunn av ikke-selektiv fordeling av sensibilisator), og hydrofobitet av sensibilisatorer (som fører til redusert biotilgjengelighet og potensiell akutt giftighet). I operasjon, selv om tumor er fjernet fra kroppen, et par kreftceller forblir og kan resultere i remisjon. I strålebehandling og kjemoterapi normalt vev påvirkes også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) Sigma Aidrich 536512-1G average Mn 150,000-250,000
[6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) Sigma Aidrich 684449-500MG >99.5%
Tetrahydrofuran (THF) EMD TX0284-6 Drisolv
1 ml syringe National Scientific Company 37510-1 For filtration of MEH-PPV solution
Syringe filter VWR 28145-495 25 mm, 0.2 µm, PTFE
1 ml syringe Hamilton Company 81320 For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) Corning (VWR) 45000-350
Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) Quality Biological (VWR) 10128-740
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) Corning (VWR) 45000-436
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) Corning (VWR) 45000-736
Trypsin EDTA 1x 0.25% Corning (VWR) 45000-664 Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences  15710 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS
DAPI  Biotium VWR 89139-054 Nuclear stain
5 ml pipettes VWR 82050-478
75 cm2 culture flask VWR 82050-856 for culturing cells
96-well plates VWR 82050-771 for MTT assays
Tissue Culture Dishes with Vents Greiner Bio-One (VWR) 82050-538
Propidium iodide Molecular probes P3566
Annexin V FITC Invitrogen A13199 dye for apoptosis
Celltiter 96 non-R 1000 assays Promega (VWR) PAG4000 MTT
CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection Invitrogen C10444 For ROS detection
UV-vis spectrometer Agilent 8453
Fluorescence spectrometer NanoLog HoribaJobin Yvon
Dynamic light scattering PD2000DLS, Precision detector
Incubator NuAir DH Autoflow
Confocal microscope Zeiss Axioskop2 63X oil immersion objective lens
Epiluminescence microscope Olympus IX71 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera
Solar Simulator Newport 67005 Oriel Instruments
Reference solar cell Oriel  VLSI Standards Incorporated
Microplate reader BioTek Ex808
Hemocytometer Hausser Scientific Partnership 3200 For counting cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, (5), 380-387 (2003).
  2. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90, (12), 889-905 (1998).
  3. Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5, (3), 161-171 (2005).
  4. Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1, (1), 1-21 (2002).
  5. Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6, (3), 817-840 (2013).
  6. Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85, (6), 443-456 (1993).
  7. Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258, (5087), 1474-1476 (1992).
  8. Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9, (4), 570-579 (2013).
  9. Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9, (4), 613-621 (2013).
  10. Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44, (2-3), 139-143 (2013).
  11. Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49, (31), 3224-3226 (2013).
  12. Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86, (12), 1809-1827 (2012).
  13. Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2, (3), 238-250 (2012).
  14. Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3, (5), 297-302 (2009).
Fotodynamisk terapi med Blended ledende polymer / Fullenanopartikkel fotosensibilisatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).More

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter