Introduction
In Photodynamische Therapie (PDT) Photosensitizer verabreicht, um Zielgewebe und bei der Belichtung, um den Photosensibilisator Licht erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS Spezies wie Singulett-Sauerstoff und Superoxid oxidativen Stress und nachfolgende strukturelle Schäden an Zellen und Gewebe 1-4 induzieren. Aufgrund seiner Einfachheit der Anwendung dieser Methode hat sich aktiv untersucht und klinische Studien haben statt 5,6 gemacht. Jedoch erhebliche Probleme wie Dunkeltoxizität der Sensibilisatoren, Patientenlichtempfindlichkeit (aufgrund nicht-selektiven Verteilung des Sensibilisators) und Hydrophobie der Sensibilisatoren (was zu einer verminderten Bioverfügbarkeit und potentielle akute Toxizität führt) bleibt.
Hier berichten wir ein Verfahren für die Herstellung und in-vitro-Bewertung aus leitendem Polymer-Nanopartikel mit Fulleren gemischt als die nächste Generation Photosensibilisatoren für die PDT. Die Nanopartikel durch Selbstaggregation gebildetdas halbleitende Polymer MEH-PPV (Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenvinylen]) mit dem Fulleren PCBM (Phenyl-C 61 -buttersäuremethylester), wenn diese Materialien in einem kompatiblen gelösten Lösungsmittel rasch in einem nicht kompatiblen Lösungsmittel (1A) injiziert. Die Wahl der MEH-PPV als Wirtspolymer durch seine hohe Extinktionskoeffizienten, die hohe Triplettbildung führt motiviert und effizient und ultra Ladungs- und Energieübertragung auf das Fulleren PCBM 7. Diese Eigenschaften sind ideal für die Sensibilisierung von Singulett-Sauerstoff und Bildung von Superoxid in PDT.
Fullerene hat in der Tat in der PDT sowohl in molekularen und Nanopartikel-Form 13.08 angewandt. Allerdings hat schwere Zytotoxizität Weiterentwicklung 12 behindert. Hier zeigen wir, dass das Einkapseln der Fulleren in einer Host-Matrix von MEH-PPV, um zusammengesetzte MEH-PPV / PCBM-Nanopartikel zu einer PDT sensibilisierende Material zu ergeben, dass ichs nicht eigen zytotoxische, zeigt Spezifität gegenüber Krebszellen aufgrund von Nanopartikelgröße und Oberflächenladung, und die Renditen sehr effektive PDT-Behandlung bei niedriger Lichtdosen aufgrund der genannten photophysikalischen Eigenschaften.
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Protocol
1. Die Kultivierung Zelllinien
- Thaw TE 71 (Mouse Thymusepithelzellen), MDA-MB-231 (Human-Brustkrebszellen), A549 (Human Lungenkrebszellen) und OVCAR3 (Human Eierstocktumorzellen), indem die kryogene Fläschchen in warmem Wasser für weniger als 2 min . 10 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu jeder Zelllinie und zentrifugieren für 6 min bei 106 x g ergänzt.
- Saugen Sie die Aufhängung und fügen Sie 3 ml Medium dem Pellet. Mischen Sie die Zellen richtig durch Pipettieren mehrmals. In diese Zelle Lösung vorgewärmt 7 ml DMEM-Medium mit 10% FBS in T75-Flaschen ergänzt und halten Sie die Flaschen in feuchten Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO 2 bei 37 ° C. Beschriften Sie diese Kolben, wie Passage 0.
- Wenn die Konfluenz der Zellen erreicht 80%, Ernte der Zellen durch Inkubation mit 0,05% Trypsin für 10 min. Neutralisieren die Trypsin durch Zugabe der gleichen Menge von Medien. Zentrifuge diese Lösung für 6 min bei 106 x g. Entfernen Sie die Suspension und 3 ml frisches Medium zu. Mischen Sie well und übertragen kleine Menge (100 ul) in eine Kulturflasche, enthaltend 7 ml Medium. Die Kulturflasche im Brutschrank inkubiert. Beschriften Sie die Kolben, wie Passage 1.
- Kultur die Zelllinien bis zum Durchgang 11 oder 12.
2. Herstellung von Nanopartikeln
- Herstellung von ~ 10 -6 M (bereinigt) unverwässert MEH-PPV-Stammlösung
- In einer Phiole hinzuzufügen 1mg Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenvinylen] (MEH-PPV) mit einem Molekulargewicht (durchschnittliches Mn) 150.000-250.000 g / mol und 3 ml Tetrahydrofuran (THF) . Das Gemisch wird für 2 Stunden unter Erhitzen bei 80 ° C auf einer heißen Platte.
- Filtern der obigen Lösung in ein neues Fläschchen unter Verwendung eines 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert. Beschriften Sie diese Lösung als "unverdünnte MEH-PPV-Stammlösung". Diese Lösung wird in Nanopartikel-Herstellung nach der Feinabstimmung der Konzentration wie in den Schritten 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben, einbezogen werden.
- In 50 ul der unverdünnten MEH-PPV-Stammlösung in 3 ml THF. Beschriften Sie diese Lösung als "verdünnt MEH-PPV-Stammlösung". Transfer zu einem 1 cm Quarzküvette und Messung der Absorption bei 495 nm durch UV-Vis-Spektroskopie.
- Wenn die Absorption der verdünnten MEH-PPV-Stammlösung höher ist als 0,17, verdünnt das unverdünnte MEH-PPV-Stammlösung durch Zugabe von mehr THF 1 ml zu einer Zeit, solange nach 2.1.3 bis die gemessene Absorption bei 495 nm ist in der reichen von 0,13 bis 0,17.
- Berechnen Sie die Molarität des verdünnten MEH-PPV-Stammlösung unter Verwendung von Lambert-Beer-Gesetz, wie unten dargestellt. Hier 0,15 Extinktion wird als Beispiel für den Rest der Protokolle (dh., Bezogen auf beobachtete Extinktion einzustellen alle folgenden Berechnungen) ist die MEH-PPV Extinktionskoeffizienten verwendet 10 7 M -1 cm -1 und der Pfadlänge verwendet wird, ist 1 cm.
A = ε xbxc (Gleichung 1)
(ε - der molare Extinktionskoeffizient, A - Absorption, b - Weglänge c - Konzentration der Lösung)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm x c (Gleichung 2)
c = 1,5 x 10 -8 M (Gleichung 3)
Verwenden Sie diese Konzentration, die Konzentration der unverdünnten MEH-PPV-Stammlösung zu finden, wie folgt:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (Gleichung 4)
0,15 x 10 -7 M x 3050 ul = M 2 x 50 ul (Gleichung 5)
M 2 = 9,15 × 10 -7 M (Gleichung 6)
Dies ist die Konzentration des "eingestellt unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung".
- Berechnung der Masse von MEH-PPV in der eingestellten unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung
- Berechnen Sie die Masse von MEH-PPV in 1 ml des unverdünnten eingestellt Stammlösung, wie unten mit dem im Abschnitt 2.1.4 erhalten Molarität und das Molekulargewicht (M w) von MEH-PPV, die 10 6 g / mol ist gezeigt.
M = n / V (n - Nr. Der Mole, V - Volumen in L) (Gleichung 7)
Somit kann die Masse von MEH-PPV in 1 ml eingestellt undiluted Stammlösung ist 9,15 x 10 -4 g.
- Berechnen Sie die Masse von MEH-PPV in 1 ml des unverdünnten eingestellt Stammlösung, wie unten mit dem im Abschnitt 2.1.4 erhalten Molarität und das Molekulargewicht (M w) von MEH-PPV, die 10 6 g / mol ist gezeigt.
- Mischen PCBM in MEH-PPV
- Berechnung der Masse des Phenyl-C 61 -buttersäuremethylester (PCBM) in das Lager MEH-PPV-Lösung zugegeben werden, um 50 Gew% PCBM dotierten MEH-PPV-Lösung, bei 50 Gew% PCBM ist mit Bezug auf die Masse festgelegt machen von MEH-PPV (dh die Hälfte der Masse von MEH-PPV). Durch Verwendung des Gewichts des MEH-PPV in Abschnitt 2.2 erhalten.
Masse von PCBM / 9,15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 Gew% PCBM (Gleichung 8)
Masse von PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Gleichung 9) - Wiegen Sie 1 mg PCBM in einem Fläschchen und fügen Sie 500 ul THF. Berechnung der Konzentration von PCBM in dieser Lösung mit dem Molekulargewicht von PCBM als 910,88 g / mol
Molarität der PCBM-Lösung = 0.001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (Gleichung 10)
Molarität der PCBM-Lösung = 2,19 x 10 -9 mol / ul (Gleichung 11) - Berechnen Sie das Volumen der PCBM-Lösung benötigt wird, um an die angepasst fügen unverdünnt MEH-PPV-Stammlösung, die 50 Gew% PCBM dotierten MEH-PPV-Lösung in THF unter Verwendung der Molarität in Schritt 2.3.2, berechnet zu erhalten
4,57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (Gleichung 12)
Fügen Sie 229 ul der PCBM-Lösung in 1 ml eingestellt unverwässerte MEH-PPV-Stammlösung und gut mischen.
- Berechnung der Masse des Phenyl-C 61 -buttersäuremethylester (PCBM) in das Lager MEH-PPV-Lösung zugegeben werden, um 50 Gew% PCBM dotierten MEH-PPV-Lösung, bei 50 Gew% PCBM ist mit Bezug auf die Masse festgelegt machen von MEH-PPV (dh die Hälfte der Masse von MEH-PPV). Durch Verwendung des Gewichts des MEH-PPV in Abschnitt 2.2 erhalten.
- Herstellung von Nanopartikeln durch Umfällungsverfahren
- 1 ml der gemischten MEH-PPV / PCBM Lösung in die 1 ml Spritze mit der Nadel daran befestigt.
- Schnell spritzen 1 ml des gemischten MEH-PPV / PCBM-Lösung in 4 ml VE-Wasser unter Rühren bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. Sofort anhalten Rühren nach der Injektion. Verwenden Sie diese Nanopartikel ohne weitere Verarbeitung.
3. Inkubation von Zelllinien mit Nanopartikel für Imaging
HINWEIS: Alle Imaging Experimente wurden in 35 mm Petrischalen abgeschlossen
- Aufnahme von nanopartiCles in Zelllinien
- Kulturzelllinien bis zu dem 12. Durchgang. An den 12. Durchgang Kulturzellen in 35 mm Petrischalen. Einstellen Konzentration der Zellen auf 35 mm-Petrischalen solche zugesetzt, dass nach 24 Stunden sind die Zellen 40% konfluent.
- Zu diesem Zeitpunkt entfernen Sie die DMEM-Medium mit 10% FBS aus den Petrischalen ergänzt, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS zweimal, und fügen Sie 100 ul der Nanopartikel-Suspension in 2 ml DMEM in die Petrischalen.
- Nach 24 Stunden entfernen Sie das DMEM / Nanopartikel-Suspension aus den Petrischalen und waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS 3 mal. Befestigen Sie dann die Zellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen zweimal mit DPBS. Färben die Zellen mit 300 nM DAPI durch Inkubation mit dem Farbstoff für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung.
- Detektion von ROS
- Kultur A549 und OVCAR3 Zelllinien in Petrischalen, 6 pro Zelllinie, wie in Abschnitt 3.1.1 erläutert. Beschriften Sie diePetrischalen, wie in der Tabelle 1 gezeigt.
- 100 l der Nanopartikel-Suspension in 2 ml DMEM bis drei der Petrischalen, wie in der Tabelle 1 dargestellt und Inkubation für 24 Stunden. Für die Petrischalen, die Lichtdosen erhalten werden, waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden, und die Zellen zu suspendieren in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) färben freien Medien.
- Aufwärmen der Lampe des Sonnensimulators für 15 min. Stellen UV-Filter vor der Lampe herausfiltern UV-Licht. Kalibrieren der Lampe mit einer Referenzsolarzelle durch Einstellen der Lampenleistung auf 0,5 Sonne (50 mW / cm 2) Intensität an der Oberfläche der Petrischale erhalten. In diesem speziellen Aufbau wurde diese Bedingung mit 218 W Leistung an die Lampe geliefert erreicht.
- Legen die Petrischalen unter der Lampe (Deckel offen) für 60 min, die in einer Lichtdosis von 180 J / cm 2, wie in den Berechnungen unten dargestellten Ergebnisse:
50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm 2 - Entfernen HBSS und ohne Waschen weitere 2 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu den Petrischalen ergänzt hinzuzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 2 Std.
- Für die positive Kontrolle Inkubieren der Zellen mit 100 uM Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) für 30 min.
- Färben die Zellen in allen Petrischalen mit einer Endkonzentration von 5 & mgr; M des ROS Nachweisreagens durch Inkubation der Zellen mit dem Farbstoff für 30 Minuten bei 37 ° C.
- Befestigen Sie die Zellen durch Inkubation mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen zweimal mit DPBS. Färben die Zellen mit 300 nM DAPI durch Inkubation mit dem Farbstoff für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung.
- Apoptose und Nekrose von PI und Annexin V FITC
- Kultur jede Zelllinie in 5 Petrischalen. Drei dieser Petrischalen werden für den Versuch, während die übrigen 2 Petrischalen werden Kontrollproben sein. Die 3 Petrischalen für Experiment mit Nanopartikeln als E inkubierenin Abschnitt 3.1.2 Xplained. Die Kontrollproben werden nicht mit Nanopartikeln inkubiert.
- Nach 24 Stunden Inkubation folgen Sie den Schritt 3.2.3.
- Legen Sie die 3 Versuchspetrischalen unter der Lampe (Deckel offen) und nehmen Sie ein zu 20 min, einer bei 40 min und eine bei 60 min. Dies ergibt drei Proben, die Lichtdosen von 60, 120 und 180 J / cm 2, bzw. (Berechnung in Abschnitt 3.2.4) ausgesetzt waren. Als nächstes zu verwalten eine 180 J / cm 2 Lichtdosis zu einer der Kontrollpetrischalen. Dies ist die Steuerung mit Lichtdosis in Abwesenheit von Nanopartikeln angewandt. Sie Lichtdosis zu der verbleibenden Kontrollprobe (keine Nanopartikel und kein Licht Dosis angewendet) gelten nicht.
- Ersetzen Sie die HBSS mit DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt und halten Sie die Petrischalen in den Inkubator für 4 Stunden.
- Färben die Zellen in der experimentellen und der Kontrollpetrischalen mit 20 ul Annexin V FITC durch Inkubation der Zellen mit dem Farbstoff für 15 min. Waschen zweimal mit DPBS. Flecken auf der cEllen mit 300 nM DAPI, sowie 300 nm PI (Propidiumiodid) durch Inkubation mit den Farbstoffen für 2 min. Waschen zweimal mit DPBS. Dann halten Sie die Zellen in DPBS für die Bildgebung.
4. Eigen Zytotoxizität von Nanoteilchen
- Zählen der Zellen und Kultivierung in 96-Well-Platten
- Ernte der Zellen aus Kulturflaschen durch Entfernen von Medien und Waschen der Zellen zweimal mit DPBS, gefolgt von der Inkubation der Zellen mit 0,05% Trypsin für 10 min. 2 ml DMEM-Medium mit 10% FBS zu dem resultierenden Zelllösung ergänzt. Mischen Sie die Lösung richtig an Zellclustern in Singuletts zu trennen.
- Nehmen Sie 100 ul der Zellsuspension und fügen Sie 900 ul DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt. Gut mischen. Zeigen 10 ul dieser Suspension auf einem Hämocytometer. Zähle die Zellen unter Verwendung der Zählkammer und Einstellen der Konzentration der Zellsuspension in 4.1.1 bis 5 x 10 4 Zellen / ml.
- Take 5 Platten mit 96 Vertiefungen als 0 h, 24 h markiertr, 48 h, 72 h und 96 h. Dann werden 50 ul der 5 × 10 4 Zellen / ml Zelllösungen (TE 71 und A549) in die Vertiefungen, wie in Tabelle 2 gezeigt, wodurch der Aussaat 2500 Zellen / Well. Machen Sie dasselbe Verfahren für OVCAR3 und MDA-MB-231 Zelllinien.
- Nach 24 Stunden Waschen der Vertiefungen mit 1x DPBS und 50 ul von steigenden Konzentrationen von Nanopartikeln in die Vertiefungen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Bereiten verschiedenen Nanopartikelkonzentrationen durch Zugabe von 20, 100 und 180 ul der Nanopartikel-Suspension aus 2.4.2 DMEM erhalten ein Endvolumen von 2 ml, die Nanopartikelkonzentration von 0,4 × 10 -4 mg / ml ergibt, 2,0 × 10 -4 mg / ml und 3,6 × 10 -4 mg / ml. Jede Zelllinie Triplikaten für jede Konzentration der Nanopartikel.
- Messung der Zelllebensfähigkeit in dunklen
- In 10 ul MTT zu der 0 h Platte unmittelbar nach der Zugabe von Nanopartikeln. Die Platte 4 Stunden für Formazan crystals zu bilden. In 50 ul Solubilisierungslösung in die Vertiefungen. Die Platte 6 Stunden, um die Formazan Kristalle aufzulösen.
- Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen der 0 h Platte durch Aufzeichnen der Extinktion bei 570 nm mit Mikroplatten-Reader.
- 24 h Platte, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul Medium in jeder Vertiefung nach 24 Stunden Inkubation mit Nanopartikeln. In MTT und lesen Sie das, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 erläutert Platte.
- 48 h, 72 h und 96 h Platten, waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul Medium in die Vertiefungen nach 24 Stunden Inkubation mit Nanopartikeln. Inkubieren der Zellen für die restlichen Zeitperioden.
- 4.2.5) Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen an den jeweiligen Zeitpunkten, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben.
- Wiederholen Sie das vollständige Experiment für 3-mal (n = 3)
5. Messzelle Lebensfähigkeit nach PDT
- Zählen der Zellen und Kultivierung in 96-Well-Platten.
- Beschriften Sie eine Reihe von 96-Well-Platten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist, sowohl für die TE 71 + A549 Platten und OVCAR3 + MDA-MB-231-Platten. Die Anordnung der Platten wird die gleiche sein, wie in 4.1.3 gezeigt.
- Samen der 96-Well-Platten, wie in Abschnitt 4.1 mit dem gleichen Layout erläutert, wie in Tabelle 2 in Abschnitt 4.1.2 dargestellt.
- Nach 24 Stunden Nanopartikel in den Platten, wie in 4.1.4 beschrieben.
- 24 Stunden nach der Zugabe von Nanopartikeln waschen Sie die Zellen mit 1x DPBS und fügen Sie 50 ul HBSS in jede Vertiefung.
- Bestrahlen der Platten mit den jeweiligen Lichtdosen, wie in 3.2.3 beschrieben.
- Ersetzen Sie die HBSS mit 50 ul DMEM-Medium mit 10% FBS ergänzt und Inkubation der Platten für die jeweiligen Zeiträume nach PDT.
- Nach jeder Zeitperiode zu messen, die die Lebensfähigkeit der Zellen, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2 beschrieben.
6. Fluoreszenzmikroskopie
- Aufnahme von Nanopartikeln
- Schalten Sie die Lampen des Mikroskops einnd der Laser 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Setzen die Petrischale mit der fixierten Zellen auf dem Objekttisch des Mikroskops (wie in Abschnitt 3.1 beschrieben).
- Sammeln Sie die Fluoreszenz von Nanopartikeln und DAPI mit Hilfe von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern der Phasenkontrast, Nanopartikel und DAPI Bilder in ImageJ Software.
- Detektion von ROS
- Schalten die Lampen des Mikroskops 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Legen Sie die Petrischale mit der Zellen auf der Bühne des Mikroskops (wie in Abschnitt 3.2 beschrieben).
- Sammeln der Fluoreszenz von Nanopartikeln, DAPI und den ROS Nachweisreagenz mit Hilfe von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern des Phasenkontrastes, Nanopartikel, DAPI und ROS Nachweisreagenz Bilder in ImageJ Software.
- Apoptose und Nekrose von PI und Annexin V FITC
- Schalten die Lampen des Mikroskops 30 Minuten vor der Bilderzeugung. Legen Sie die Petrischale mit den Zellen (wie unterAbschnitt 3.3) auf dem Tisch des Mikroskops.
- Sammeln der Fluoreszenz von Nanopartikeln, DAPI, PI und Annexin V FITC unter Verwendung von Filtern, wie in Tabelle 4 gezeigt. Überlagern des Phasenkontrastes, Nanopartikel, DAPI, PI und Annexin V FITC Bilder in ImageJ Software.
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Representative Results
Aufnahme und intrinsische Zytotoxizität von Nanoteilchen
Die 50 Gew% blended MEH-PPV / PCBM-Nanopartikel wurden mit TE-71 inkubiert, MDA-MB-231, A549 und OVCAR3 Zelllinien. Die PCBM Mischstufe wurde als 50 Gew% PCBM, das gezeigt worden ist, um ideale Ladung und Energie Übertragungseigenschaften zwischen konjugierten Polymeren und Fullerenen 14 bereitzustellen entschieden. Fluoreszenzbilder der Funktion gestört werden in 1B gezeigt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Nanopartikeln inkubiert, um Nanopartikel-Aufnahme zu gewährleisten. Zellen wurden dann mit 4% Paraformaldehyd vor der Bilderzeugung fixiert und mit DAPI gefärbt, um die Zellen und die Position des Kerns zu erfassen. Um Bild ausreichend getrennt Zellen 40% Konfluenz gehalten. Fluoreszenzbilder mit entsprechenden Phasenkontrastbilder zeigen, dass es bevorzugt ist die Aufnahme von Nanopartikeln durch A549 und OVCAR3 Krebszelllinien. Keine nachweisbare Fluoreszenz kann in TE 71 Steuer gesehen werdenund MDA-MB-231-Zelllinien, was anzeigt begrenzten Aufnahme. Auf der anderen Seite, A549 und OVCAR3-Zelllinien eine signifikante Funktion gestört. Intrinsische Zytotoxizität (Dunkeltoxizität) wurde durch Inkubation der 50 Gew% vermischt MEH-PPV / PCBM Nanopartikel mit TE 71 ausgewertet, MDA-MB-231, A549 und OVCAR3-Zelllinien und die Quantifizierung der Lebensfähigkeit der Zellen durch einen MTT-Assay. MTT Daten in 1C zeigen normale Proliferation der Zelllinien.
Nanopartikel als Quelle der ROS
Um sicherzustellen, dass die Nanoteilchen sind die Quelle von ROS, und erst nach der Belichtung wurde ROS Bildung mit einer ROS-Erfassungs Reagenzienkit ausgewertet. . Daten für OVCAR3 sind in 2 Fehlen der grünen Emission in 2A gezeigt - C zeigt ROS sind nicht für die Kontrollproben gebildet. Leuchtend grüne Emission von der ROS Nachweisreagenz wird für Proben mit Nanopartikeln behandelten Patienten beobachtet und ausgesetztans Licht, wie in den 2D- und E (unmittelbar nach der PDT und 2 h nach PDT) dargestellt ist, die bestätigt, dass ROS während PDT erzeugt.
PDT
Die Leistung von MEH-PPV / PCBM Nanopartikel in PDT wurde durch MTT-Assay unmittelbar nach PDT quantifiziert und nach 4 und 12 h nach der Inkubationszeit. Die Daten sind in Figur 3 für die 4 h nach der Inkubation gezeigt. Die A549 und OVCAR3 Krebszelllinien eine signifikante Zelltod nach der PDT-Behandlung: bis zu 60% für die A549 und 100% für OVCAR-3. Die TE-71-Steuerung und MDA-MB-231-Zelllinien zeigen begrenzte Auswirkungen. TE71 ist eine normale Kontrollzelllinie und wird nicht erwartet, Nanopartikel zu verinnerlichen. Nur geringe unspezifische Aufnahme von Nanopartikeln durch TE-71 wird experimentell beobachtet. Low Funktion gestört wird auch für MDA-MB-231, die in diesem Fall aufgrund der geringeren Stoffwechselrate im Vergleich zu anderen Krebszelllinien beobachtet. Die PDT Daten zeigendass die MEH-PPV / PCBM Nanopartikel sind hochwirksame PDT-Sensitizer, und dass die PDT Wirksamkeit skaliert mit der Nanopartikel-Aufnahme. Die Unterschiede in der PDT Ergebnisse zwischen den Krebszelllinien hier betrachteten aufgrund des Unterschieds in Aggressivität (Metabolismus und die Geschwindigkeit der Endozytose) zwischen diesen Zelllinien.
Progression der PDT-induzierten Zelltod
Live / Dead-Doppelfärbung mit PI und Annexin V FITC bietet Informationen über nekrotischen und apoptotischen Mechanismen des Zelltods. Diese Färbung Regelung wurde auf die Zelllinien untersucht hier nach PDT, um mehr über PDT-induzierten Zelltod Wege lernen aufgetragen. Abbildung 4 zeigt Epilumineszenz Bildern von TE 71 und OVCAR3 Zelllinien mit Annexin V FITC, PI und DAPI gefärbt. Die Daten zeigen, dass es keine Wirkung von PDT auf der TE 71 Kontrollzelllinie, die mit der vernachlässigbaren Aufnahme von Nanopartikeln. Dieselbe Beobachtung wurde für die MDA-MB-231 hergestellt wurde (Daten nicht gezeigt). Wenn OVCar3 unterzog PDT bei 60 und 120 J / cm 2 Doppelfärbung von PI (lila) und Annexin V FITC (grün) zu beobachten war. Bei 180 J / cm 2 nur die PI-Färbung wurde beobachtet, was darauf hindeutet akuten nekrotischen Zelltod unter dieser Bedingung.
Figur 1 (A) Herstellung von Nanopartikeln durch Umfällungsverfahren, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 und OVCAR3-Zelllinien mit Nanopartikeln inkubiert. Die Nanopartikel werden in grüner Farbe dargestellt ist, wird der Kern in blauer Farbe dargestellt. Die Fluoreszenzbilder werden mit den Phasenkontrast-Aufnahmen überlagert, Maßstab = 20 & mgr; m, (C) Die intrinsische Zytotoxizität von Nanoteilchen durch Messung der Lebensfähigkeit der Zellen für jede Zelllinie von bis zu 96 Stunden ausgewertet. Die Zelllebensfähigkeiten werden mit Steuer Dosis von Nanopartikeln (0 mg / ml), indem Sie die Lebensfähigkeit der contr Vergleichol Proben bei 100% (nicht gezeigt). Fehlerbalken sind die Standardabweichungen für Ergebnisse aus 3 verschiedenen Experimenten (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Nachweis von ROS in OVCAR3 Zelllinie mit ROS Nachweisreagenz. (A) keine Nanopartikel, keine Belichtung, (B) keine Nanopartikel, bis 180 J / cm 2 belichtet, (C) 2 x 10 -4 mg / ml Nanopartikel, keine Belichtung, (D) mit Nanopartikeln und die Exposition gegenüber 180 J / cm 2 Licht, unmittelbar nach der Behandlung entnommen, (E) 2 h nach PDT, (F) mit 100 ul H 2 O 2 als Positivkontrolle. Das helle grüne Emission in DF i s aus dem ROS Nachweisreagenz Bestätigung ROS-Bildung. Maßstabsbalken = 30 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Zelllebensfähigkeiten von TE 71, MDA-MB-231, A549 und OVCAR3 Zelllinien mit steigenden Dosen von Nanopartikeln verabreicht und mit 120 J / cm 2 Lichtdosis. Die post-PDT Inkubationszeit beträgt 4 Stunden bestrahlt. Die Nanopartikel Dosen in der Legende in 10 -4 mg / ml. Fehlerbalken sind die Standardabweichungen für Ergebnisse aus 3 verschiedenen Experimenten (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. lebend / tot-Färbung von TE 71 und OVCAR3 Zelllinien mit Annexin V-FITC und PI. Grüne Emission entspricht Annexin V FITC entspricht lila Emissions PI (rot, vermischt mit blauer DAPI Emission) und blaue Emission entspricht DAPI Kernfärbung. Bilder sind die Überlagerung von Phasenkontrast und Epilumineszenz Bilder. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Sonnensimulator Setup für die Exposition von Zellen mit kalibrierten Licht. Eine Referenzsolarzelle wurde für die Kalibrierung verwendet, in dem Einsatz Registrierung 0.5 Sonnenlichtintensität (50 mW / cm 2) gezeigt./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Negativkontrollen | Keine NPs, kein Licht | Keine NPs, mit Licht | Kein Licht, mit Nanopartikeln |
| Positivkontrolle | 100 & mgr; l H 2 O 2 (keine Nanopartikel, kein Licht) | --- | --- |
| Experimental | 0 h nach PDT (NPs und Licht) | 2 h nach PDT (NPs und Licht) | --- |
Tabelle 1: Versuchsplan für die Detektion von ROS.
| 0 hr Platte | Medien | TE 71 | A549 | Medien | ||||||||
| Keine Behandlung | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 · 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 · 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabelle 2: Layout der Platte mit 96 Vertiefungen für die Inkubation von Nanopartikeln, um intrinsische Zytotoxizität von Nanoteilchen zu bewerten / PDT-Effekt
| Plattennummer. | Lichtdosis (J / cm 2) | Beitrag PDT Zeit (hr) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabelle 3: Beschriftung der Platten mit 96 Vertiefungen für die PDT Auswertung.
| Fluorophor | Anregungsfilter | Dichroitischen Spiegel | Emissionsfilter | Mikroskopie | Anregungsquelle |
| Nanopartikel | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Konfokale | Ar-Kr-Ionenlaser |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epilumineszenz | Quecksilberlampe |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epilumineszenz | Quecksilberlampe |
| Annexin V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epilumineszenz | Quecksilberlampe |
| ROS Nachweisreagenz | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epilumineszenz | Quecksilberlampe |
Tabelle 4. Mikroskopie-Konfiguration für die Bildgebung Experimente.
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Discussion
Um Nanopartikel-Aufnahme zu erreichen war es notwendig, einige kritische Maßnahmen aufrechtzuerhalten, während der Herstellung der Nanopartikel. A 10 -6 M MEH-PPV-Lösung in THF (50 Gew% gemischt PCBM) hergestellt, in DI-Wasser zu injizieren, wie es beobachtet wurde, dass die Konzentration der Lösung spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Größe von Nanopartikeln gebildet wird. Konzentration wurde durch UV-vis-Spektroskopie überprüft. Man beachte, dass in Schritt 2.1.3 Protokoll war es notwendig, anfangs hergestellten MEH-PPV-Lösung (unverdünnt MEH-PPV-Vorratslösung) verdünnt, bevor unter UV-vis-Spektren, da diese Lösung eine Extinktion viel größer als 1. Die Injektionsgeschwindigkeit spielt auch eine kritische Rolle bei der Entscheidung über die Größe der Nanopartikel, und muss so schnell wie möglich unter kräftigem Rühren das DI-Wasser. Langsame Injektion wird in größeren Nanopartikel führen. Auch sollte das Rühren unmittelbar nach der Injektion beendet werden, um weitere Aggregation zu vermeiden. Während der InjektionDie Lösung in Wasser ist es notwendig, um die Nadel in der Nähe der Innenoberfläche der Ampulle zu halten, während die Nadel vollständig in die Lösung, um die Blasenbildung, was die Größe der Nanopartikel beeinflussen zu vermeiden. In unseren Experimenten erhaltenen Nanopartikelgrößen betrugen 61,5 ± 23,3 nm, wie durch DLS gemessen. DLS anstelle von TEM ausgewählt, da es schnell ist, kostengünstig, zuverlässig zu dieser Größe und leicht erhältlich. Das Zeta-Potential auf dieser Nanopartikel wurde festgestellt, -9,66 ± 8,12 mV, dh leicht negativ bis neutral Oberflächenladung sein.
Es war notwendig, um die Zellen zu zählen, während die Bewertung der intrinsische Zytotoxizität von Nanopartikeln und PDT Ergebnisse zu quantifizieren, da diese Techniken sind auf dem MTT-Assay, der eine quantitative Messung der Lebensfähigkeit der Zellen vorsieht. Es ist wesentlich, den Versuch mit der gleichen Anzahl von Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte, die zum Vergleich der Lebensfähigkeit der Zellen in Bezug auf die Dosis der nan ermöglicht startenoparticles und Licht sowie die Kontrollversuche.
Ein Solarsimulator wurde verwendet, um die Proben zu bestrahlen. Der Aufbau ist in Figur 5 gezeigt, und besteht aus der Lichtquelle, einem UV-Filter, und einer Referenzsolarzelle. Mit dieser Beleuchtungsschema ein hohes Maß an Kontrolle der spektralen Eigenschaften und die Intensität der Lichtquelle erreicht werden könnte, die in hohem Maße reproduzierbare Ergebnisse geführt. Es ist sehr wichtig zu erkennen, dass die meisten Lichtquellen keine gleichmäßige Intensitätsprofil bereitzustellen. Sonnensimulator, jedoch ausgerichtet werden können, um nahezu gleichmäßige Intensität in dem Beleuchtungsbereich durchzuführen. Dies wurde durch einen Referenzsolarzelle in verschiedenen Regionen der beleuchteten Fläche verifiziert. Wir haben auch darauf, immer Platz Platten in dem gleichen Bereich des Lichtflecks und in der gleichen Orientierung zur weiteren Minimierung von Effekten der Änderung in der Intensität. Die Lichtquelle, um Abstand in 5 angezeigt Probe hat uns mit 50mW / cm 2 (0,5 Sonne) der Intensität unter einer elektrischen Lampenleistung von 218 W. Für diese Experimente HBSS Farbstoff freien Medien als zur Absorption von Licht durch Indikatorfarbstoffe zu vermeiden. Nach der PDT, die Zellen erneut für bestimmte Zeiträume bei 37 ° C (Post-PDT Inkubation) inkubiert, um den Fortschritt der PDT zu beobachten.
Färben von Zellen benötigt einige Versuch und Irrtum, um die richtige Konzentration des jeweiligen Farbstoffes zu finden. Dies wird durch Wiederholung des Experiments, während die Erhöhung der Farbstoffkonzentration stetig, bis entsprechende Ergebnisse erzielt wurden erreicht.
Das Verfahren hat auch eine Reihe von Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf die Nanopartikelsystems und PDT-Behandlung. Da Nanopartikel werden durch die Umfällungsverfahren hergestellt, dass eine Variabilität bei der gewonnene Nanopartikelgröße von Charge zu Charge, und einige Polydispersität in Nanopartikelgröße besteht, daß nicht kontrolliert werden kann. Es ist auch nicht möglich, Nanoteil machenRZEUGE weniger als 20 nm in der Größe. Diese Einschränkungen könnten Herausforderungen bei der Entwicklung kleiner Größe monodisperse Nanopartikel, die in vivo angewendet werden kann, sein. Außerdem entsprechen die in-vitro-Experiment die PDT Zellen erfordert, um außerhalb des Inkubators für eine längere Zeitdauer, was eine gewisse Belastung für die Zellen auferlegen könnte.
Die hier für die PDT diskutierten Verfahren ist signifikant in Bezug auf aktuelle Ansätze. PDT mit kleinen Molekülen Sensibilisierungsmittel und Sensibilisator dotierten Nanopartikel hat begrenzte klinische Anwendung wegen erheblicher Probleme mit dunklen Toxizität der Sensibilisierungsmittel, Patientenlichtempfindlichkeit (aufgrund von nicht-selektiven Verteilung der Sensibilisator) und Hydrophobie der Sensibilisierungsmitteln (die führt gesehen reduzierte die Bioverfügbarkeit und potenzielle akute Toxizität). In der Chirurgie, auch wenn der Tumor aus dem Körper entfernt, wenige Krebszellen verbleiben und in Remission führen. In Strahlentherapie und Chemotherapie Normalgewebe ist ebenfalls betroffen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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