Introduction
In Terapia fotodinamica (PDT) fotosensibilizzanti vengono somministrati al tessuto bersaglio, e in seguito all'esposizione alla luce il fotosensibilizzante genera specie reattive dell'ossigeno (ROS). Specie ROS come l'ossigeno singoletto e superossido possono indurre lo stress ossidativo e la conseguente danno strutturale alle cellule e tessuti 1-4. Grazie alla sua facilità di applicazione questo metodo è stato attivamente indagato e gli studi clinici hanno avuto luogo 5,6. Tuttavia, le questioni rilevanti quali la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva della sensibilizzante), e idrofobicità dei sensibilizzanti (che porta a ridurre la biodisponibilità e la potenziale tossicità acuta) rimangono.
Qui riportiamo un metodo per la fabbricazione e la valutazione in vitro di condurre nanoparticelle polimeriche miscelati con fullerene come fotosensibilizzatori prossima generazione per PDT. Le nanoparticelle sono formate da auto-aggregazione diil polimero semiconduttore MEH-PPV (poli [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene]) con il PCBM fullerene (fenil-C 61 -butyric metil estere) quando questi materiali sciolti in un compatibile solvente stanno rapidamente iniettati in un solvente non compatibile (Figura 1A). La scelta di MEH-PPV come il polimero host è motivata dal suo elevato coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione tripletta, e sia efficiente e ultraveloce carica e trasferimento di energia al PCBM fullerene 7. Queste proprietà sono ideali per la sensibilizzazione di ossigeno singoletto e formazione superossido in PDT.
Fullerene è stato infatti applicato nel PDT sia in forma molecolare e nanoparticelle 8-13. Tuttavia, una grave citotossicità ha ostacolato un ulteriore sviluppo 12. Qui mostriamo che incapsulando il fullerene in una matrice serie di MEH-PPV cedere compositi nanoparticelle MEH-PPV / PCBM risultati in un materiale sensibilizzare PDT che hoNon è citotossico intrinsecamente, mostra specificità verso le cellule tumorali a causa delle dimensioni delle nanoparticelle e carica di superficie, e le rese di trattamento altamente efficace PDT a dosi di luce scarsa a causa delle proprietà fotofisiche di cui sopra.
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Protocol
1. la coltura linee cellulari
- Disgelo TE 71 (cellule epiteliali del timo del mouse), MDA-MB-231 (le cellule del cancro al seno umano), A549 (le cellule tumorali del polmone umano) e OVCAR3 (cellule tumorali ovariche umane) tenendo le fiale criogeni in acqua tiepida per meno di 2 minuti . Aggiungere 10 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS per ciascuna linea cellulare e centrifugare per 6 min a 106 x g.
- Aspirare la sospensione e aggiungere dei media da 3 ml al pellet. Mescolare le cellule correttamente pipettando più volte. Aggiungi questa soluzione cella per preriscaldata 7 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS in fiaschi T75 e tenere i flaconi in atmosfera umidificata al 95% di aria / 5% di CO 2 a 37 ° C. Etichettare questo fiasco come Passage 0.
- Quando la confluenza delle celle raggiunge il 80%, raccogliere le cellule da essi incubazione con tripsina 0,05% per 10 min. Neutralizzare la tripsina aggiungendo uguali quantità di materiale. Centrifugare questa soluzione per 6 min a 106 x g. Togliere la sospensione e aggiungere 3 ml mezzi freschi per esso. Mescolare well e trasferire piccola quantità (100 l) per un pallone di coltura contenente 7 ml di mezzi di comunicazione. Incubare il pallone di coltura in incubatrice. Etichettare il pallone come passaggio 1.
- Cultura linee cellulari fino passo 11 o 12.
2. Realizzazione di nanoparticelle
- Preparazione del ~ 10 -6 M (rettificato) non diluito soluzione madre MEH-PPV
- In una fiala aggiungere 1mg Poly [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) con peso molecolare (Mn medio) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml di tetraidrofurano (THF) . Mescolare la miscela per 2 ore durante il riscaldamento a 80 ° C su una piastra calda.
- Filtrare la soluzione di cui sopra in una nuova fiala usando un filtro a siringa da 0,2 micron. Etichettare questa soluzione come 'MEH-PPV soluzione madre diluita'. Questa soluzione sarà coinvolto nella preparazione di nanoparticelle dopo la messa a punto della concentrazione come descritto nei punti 2.1.3 e 2.1.4.
- Aggiungere 50 ml di soluzione madre MEH-PPV non diluito in 3 ml di THF. Etichettare questa soluzione come 'soluzione madre diluita MEH-PPV'. Trasferimento a una cuvetta di quarzo 1 cm e misurare l'assorbanza a 495 nm mediante spettroscopia UV-vis.
- Se l'assorbanza della soluzione madre MEH-PPV diluita è superiore a 0,17, diluire la soluzione madre MEH-PPV non diluito con l'aggiunta di più THF 1 ml alla volta, e ripetere il punto 2.1.3 fino a quando l'assorbanza misurata a 495 nm è nella gamma ,13-0,17.
- Calcolare la molarità della soluzione madre MEH-PPV diluita utilizzando legge di Lambert-Beer, come illustrato di seguito. Qui 0,15 assorbanza viene utilizzato come esempio per il resto del protocollo (es., Regolare tutte le seguenti calcoli basati su assorbanza osservato), il coefficiente di estinzione MEH-PPV utilizzato è 10 7 M -1 cm -1 e la lunghezza del percorso utilizzato è 1 cm.
A = ε xbxc (Eqn 1)
(ε - il coefficiente di estinzione molare, A - assorbanza, b - lunghezza del percorso, c - concentrazione della soluzione)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Eqn 2)
c = 1.5 x 10 -8 M (Eqn 3)
Utilizzare questa concentrazione per trovare la concentrazione della soluzione madre MEH-PPV non diluito nel modo seguente:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (Eqn 4)
0,15 x 10 -7 M x 3050 ml = M 2 x 50 microlitri (Eqn 5)
M 2 = 9.15 x 10 -7 M (Eqn 6)
Questa è la concentrazione del 'rettificato diluito MEH-PPV soluzione madre'.
- Calcolo di massa di MEH-PPV nella soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito
- Calcolare la massa di MEH-PPV in 1 ml di soluzione madre diluita rettificato come indicato di seguito utilizzando la molarità ottenuto nella sezione 2.1.4 e il peso molecolare (M w) di MEH-PPV, che è 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. No di talpe, V - volume in L) (Eqn 7)
Così, la massa di MEH-PPV in 1 ml di adeguati undiluted soluzione madre è 9,15 x 10 -4 g.
- Calcolare la massa di MEH-PPV in 1 ml di soluzione madre diluita rettificato come indicato di seguito utilizzando la molarità ottenuto nella sezione 2.1.4 e il peso molecolare (M w) di MEH-PPV, che è 10 6 g / mol.
- Unendo PCBM in MEH-PPV
- Calcolare la massa di Fenil-C 61 -butyric estere metilico (PCBM) da aggiungere nella soluzione di riserva MEH-PPV di fare il 50% in peso PCBM soluzione MEH-PPV drogato, dove il 50% in peso PCBM è definito rispetto alla massa di MEH-PPV (vale a dire, la metà della massa di MEH-PPV). Usando il peso di MEH-PPV ottenuto nella sezione 2.2.
Messa di PCBM / 9,15 x 10 -4 g di MEH-PPV x 100% = 50% in peso PCBM (Eqn 8)
Messa di PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) - Pesare 1 mg PCBM in un flaconcino e aggiungere 500 microlitri THF. Calcolare la concentrazione di PCBM in questa soluzione con il peso molecolare del PCBM come 910,88 g / mol
Molarità di soluzione PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 microlitri) (Eqn 10)
Molarità di soluzione PCBM = 2.19 x 10 -9 mol / ml (Eqn 11) - Calcolare il volume di soluzione PCBM bisogno di aggiungere alla regolare ME non diluitoH-PPV soluzione madre per ottenere la soluzione di PCBM drogato MEH-PPV del 50% in peso in THF utilizzando la molarità calcolata al punto 2.3.2
4,57 x 10 -4 g di PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ml / 2.19 x 10 -9 mol = 229 microlitri (Eqn 12)
Aggiungere 229 ml di soluzione PCBM in 1 ml di soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito e mescolare bene.
- Calcolare la massa di Fenil-C 61 -butyric estere metilico (PCBM) da aggiungere nella soluzione di riserva MEH-PPV di fare il 50% in peso PCBM soluzione MEH-PPV drogato, dove il 50% in peso PCBM è definito rispetto alla massa di MEH-PPV (vale a dire, la metà della massa di MEH-PPV). Usando il peso di MEH-PPV ottenuto nella sezione 2.2.
- Preparazione di nanoparticelle con il metodo riprecipitazione
- Trasferimento 1 ml della soluzione MEH-PPV / PCBM mescolati nella siringa da 1 ml con l'ago collegato ad esso.
- Iniettare rapidamente 1 ml di soluzione MEH-PPV / PCBM miscelato in 4 ml di acqua deionizzata agitazione a 1.200 giri al minuto. Arrestare mescolando immediatamente dopo l'iniezione. Utilizzare queste nanoparticelle come tali.
3. Incubazione di linee cellulari con nanoparticelle di Imaging
NOTA: Tutte le esperimenti di imaging sono stati completati nel 35 mm capsule di Petri
- Assorbimento di nanopartiCles in linee cellulari
- Linee cellulari Cultura fino al 12 ° passaggio. Al 12 ° passaggio cellule di coltura in 35 mm piastre di Petri. Regolare la concentrazione di cellule aggiunte ai 35 mm, piastre di Petri tali che, dopo 24 ore le cellule sono il 40% confluenti.
- A questo punto rimuovere il supporto DMEM supplementato con il 10% FBS dalle capsule di Petri, lavare le cellule con 1x DPBS due volte, e aggiungere 100 ml di sospensione nanoparticelle in 2 ml di DMEM alle piastre di Petri.
- Dopo 24 ore rimuovere il DMEM / nanoparticelle sospensione dalle piastre di Petri e lavare le cellule con 1x DPBS 3 volte. Poi fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l'imaging.
- Rilevamento di ROS
- Cultura A549 e linee cellulari OVCAR3 in piastre di Petri, 6 per la linea cellulare, come spiegato nella sezione 3.1.1. Etichettare ilPiastre Petri come mostrato nella Tabella 1.
- Aggiungere 100 microlitri della sospensione nanoparticelle in 2 ml DMEM a tre delle capsule di Petri come mostrato nella Tabella 1 e incubare per 24 ore. Per le piastre di Petri che riceveranno le dosi di luce, lavare le cellule dopo 24 ore e sospendere le cellule in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Dye media liberi.
- Riscaldare la lampada del simulatore solare per 15 minuti. Posizionare filtro UV davanti alla lampada per filtrare la luce UV. Calibrare la lampada con una cella solare di riferimento regolando la potenza della lampada per ottenere 0,5 sole (50 mW / cm 2) intensità sulla superficie della capsula di Petri. In questa particolare configurazione che condizione è stata raggiunta con 218 W di alimentazione in dotazione alla lampada.
- Porre le capsule petri sotto la lampada (coperchio aperto) per 60 min, che si traduce in un dosaggio di 180 J luce / cm 2 come mostrato nei calcoli indicati
50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm 2 - Rimuovere HBSS e senza lavaggio aggiungere ulteriori 2 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS alle piastre di Petri. Incubare le cellule per altri 2 ore.
- Per il controllo positivo incubare le cellule con 100 mM di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per 30 min.
- Macchiare le cellule in tutte le capsule di Petri con una concentrazione finale di 5 mM di reagente rilevare ROS incubando le cellule con il colorante per 30 min a 37 ° C.
- Fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l'imaging.
- Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC
- Cultura ciascuna linea cellulare in 5 piastre di Petri. Tre di queste piastre di Petri saranno per l'esperimento, mentre i restanti 2 capsule di Petri saranno campioni di controllo. Incubare le 3 capsule di Petri per sperimentare l'e nanoparticelleXplained nella sezione 3.1.2. I campioni di controllo non vengono incubati con nanoparticelle.
- Dopo 24 ore di incubazione seguire il passo 3.2.3.
- Posizionare i 3 piatti sperimentali Petri sotto la lampada (coperchio aperto) e rimuovere uno a 20 minuti, uno a 40 minuti e uno a 60 min. Questo produce tre campioni che sono stati esposti a dosi di luce di 60, 120 e 180 J / cm 2, rispettivamente (calcolo nella sezione 3.2.4). Successivamente, somministrare una 180 J / cm 2 dosaggio luce per uno dei piatti Petri di controllo. Questo è il controllo con dose di luce applicata in assenza di nanoparticelle. Non applicare una quantità di luce per il campione di controllo rimanente (senza nanoparticelle e nessuna dose di luce applicato).
- Sostituire il HBSS con i media DMEM supplementato con il 10% FBS e mantenere le capsule di Petri nell'incubatrice per 4 ore.
- Macchiare le cellule nel sperimentale e le piastre di Petri di controllo con 20 ml di annessina V FITC incubando le cellule con il colorante per 15 min. Lavare due volte con DPBS. Colorare il cells con 300 Nm DAPI nonché 300 nm PI (ioduro di propidio) incubando con i coloranti per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l'imaging.
4. intrinseca citotossicità di nanoparticelle
- Il conteggio delle cellule e di coltura in piastre da 96 pozzetti
- Raccogliere le cellule dalla cultura palloni rimuovendo media e lavare le cellule due volte con DPBS seguita da incubazione delle cellule con 0,05% tripsina per 10 min. Aggiungere 2 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS alla soluzione cellulare risultante. Mescolare la soluzione corretta per separare gruppi di cellule in canottiere.
- Prendete 100 ml di sospensione cellulare e aggiungere 900 microlitri per i media DMEM supplementato con il 10% FBS. Mescolare bene. Trasferire 10 ml di questa sospensione su un emocitometro. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e regolare la concentrazione della sospensione di cellule in 4.1.1 a 5 x 10 4 cellule / ml.
- Take 5 piastre a 96 pozzetti etichettati come 0 h, 24 hR, 48 ore, 72 ore e 96 ore. Aggiungere 50 ml di i 5 x 10 4 cellule / ml soluzioni cellulari (TE 71 e A549) nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2, la semina così 2.500 cellule / pozzetto. Fate lo stesso procedimento per linee cellulari OVCAR3 e MDA-MB-231.
- Dopo 24 ore lavare i pozzetti con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri di concentrazioni crescenti di nanoparticelle nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2. Preparare diverse concentrazioni di nanoparticelle aggiungendo 20, 100, e 180 microlitri di sospensione nanoparticelle da 2.4.2 a DMEM a ottenere un volume finale di 2 ml, che produce concentrazioni di nanoparticelle di 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml e 3,6 x 10 -4 mg / ml, rispettivamente. Ogni linea cellulare è triplicato per ciascuna concentrazione di nanoparticelle.
- Misurazione della vitalità cellulare nel buio
- Aggiungere 10 microlitri MTT alla piastra 0 ore subito dopo l'aggiunta di nanoparticelle. Incubare la piastra per 4 ore per cryst formazanoals per formare. Aggiungere la soluzione solubilizzazione 50 microlitri nei pozzetti. Incubare la piastra per 6 ore per sciogliere i cristalli di formazano.
- Misurare la vitalità cellulare della piastra 0 ora registrando l'assorbanza a 570 nm con lettore di piastre.
- Per 24 ore piatto, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri dei media in ogni incubazione bene dopo 24 ore con le nanoparticelle. Aggiungere MTT e leggere il piatto come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2.
- Per 48 ore, 72 ore, e 96 lastre hr, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri supporti nei pozzetti dopo 24 ore di incubazione con le nanoparticelle. Incubare le cellule per i periodi di tempo rimanenti.
- 4.2.5) Misurare la vitalità cellulare in particolari momenti come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2.
- Ripetere l'esperimento completo per 3 volte (n = 3)
5. misurare la vitalità cellulare dopo PDT
- Contare le cellule e coltura in piastre da 96 pozzetti.
- Etichettare una serie di 96 pozzetti come indicato nella tabella 3, sia per i TE 71 piastre + A549 e OVCAR3 + MDA-MB-231 piatti. La disposizione delle piastre sarà uguale a quello mostrato in 4.1.3.
- Seme le piastre a 96 pozzetti come spiegato nel paragrafo 4.1 con lo stesso layout come mostrato nella tabella 2 alla sezione 4.1.2.
- Dopo 24 ore aggiungere nanoparticelle alle piastre come spiegato in 4.1.4.
- 24 ore dopo l'aggiunta di nanoparticelle lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri HBSS in ciascun pozzetto.
- Irradiare le piastre con le rispettive dosi di luce come spiegato in 3.2.3.
- Sostituire il HBSS con 50 microlitri i media DMEM supplementato con il 10% FBS e incubare le piastre per i rispettivi periodi di tempo dopo la PDT.
- Dopo ogni periodo di tempo misurare la vitalità cellulare come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2.
6. microscopia a fluorescenza
- Assorbimento di nanoparticelle
- Accendere le luci del microscopio unnd laser 30 minuti prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule fisse (come spiegato nella sezione 3.1) sul palco del microscopio.
- Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle e DAPI utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre la fase di contrasto, nanoparticelle e le immagini DAPI nel software ImageJ.
- Rilevamento di ROS
- Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule (come spiegato nella sezione 3.2) sul palco del microscopio.
- Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, e il ROS rilevamento reattivo utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI e ROS rilevamento immagini reagenti nel software ImageJ.
- Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC
- Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la piastra di Petri contenente le cellule (come spiegato insezione 3.3) sul palco del microscopio.
- Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, PI, e annessina V FITC utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI, PI e immagini annessina V FITC nel software ImageJ.
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Representative Results
Assorbimento e citotossicità intrinseca di nanoparticelle
Il 50% in peso di blended nanoparticelle MEH-PPV / PCBM sono state incubate con TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3. Il livello PCBM fusione è stato scelto come il 50% in peso PCBM, che ha dimostrato di fornire carica e trasferimento di energia proprietà ideali tra polimeri coniugati e fullereni 14. Immagini di fluorescenza di nanoparticelle assorbimento sono mostrati in figura 1B. Le cellule sono state incubate per 24 ore con le nanoparticelle per garantire l'assorbimento delle nanoparticelle. Le cellule sono state quindi fissate con paraformaldeide al 4% prima di imaging, e colorati con DAPI per rilevare le cellule e la posizione del nucleo. Per celle sufficientemente separati immagine 40% di confluenza è stata mantenuta. Immagini a fluorescenza con immagini a contrasto di fase corrispondente mostrano che vi è captazione preferenziale di nanoparticelle da parte della A549 e OVCAR3 linee cellulari di cancro. Nessuna fluorescenza rilevabile può essere visto in TE 71 Controlloe MDA-MB-231 linee cellulari di cancro, che indica l'assorbimento limitata. D'altra parte, linee cellulari tumorali A549 e OVCAR3 mostrano significativo assorbimento delle nanoparticelle. Citotossicità intrinseca (tossicità scuro) è stata valutata mediante incubazione delle 50% in peso di blended nanoparticelle MEH-PPV / PCBM con TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3 e quantificare la vitalità cellulare mediante test MTT. Dati MTT in Figura 1C mostrano normale proliferazione delle linee cellulari.
Nanoparticelle come fonte di ROS
Per garantire che le nanoparticelle sono la fonte di ROS, e solo dopo l'esposizione alla luce, formazione di ROS è stata valutata con un rilevamento di kit di reagenti ROS. I dati per OVCAR3 sono mostrati nella Figura 2 assenza di emissione verde in Figura 2A -. C indica ROS non sono formati per i campioni di controllo. Brillante emissione verde dal reagente rilevare ROS è osservata per i campioni trattati con nanoparticelle ed espostaalla luce come mostrato nelle figure 2D e E (immediatamente dopo PDT e 2 ore dopo PDT), confermando che i ROS sono generati durante la PDT.
PDT
Le prestazioni di MEH-PPV / nanoparticelle PCBM a PDT è stato quantificato mediante saggio MTT subito dopo PDT, e dopo 4 e 12 hr periodi post-incubazione. I dati sono mostrati in Figura 3 per il periodo post-incubazione di 4 ore. Le linee A549 e di cellule di cancro OVCAR3 presentare una significativa morte cellulare dopo il trattamento PDT: fino al 60% per la A549 e 100% per OVCAR-3. Il controllo TE 71 e MDA-MB-231 linee di cellule tumorali mostrano effetti limitati. TE71 è una normale linea cellulare di controllo e non si prevede che interiorizzare nanoparticelle. Solo scarsa diffusione non specifico di nanoparticelle da TE-71 si osserva sperimentalmente. Basso assorbimento di nanoparticelle è anche osservato per MDA-MB-231, che è in questo caso a causa del basso tasso metabolico rispetto alle altre linee di cellule di cancro. I dati mostrano PDTche le nanoparticelle MEH-PPV / PCBM sono altamente efficaci sensibilizzanti PDT, e che l'efficacia PDT scale con nanoparticelle assorbimento. Le differenze nei risultati PDT tra le linee di cellule di cancro qui considerati sono dovute alla differenza di aggressività (metabolismo e tasso di endocitosi) tra queste linee cellulari.
Progressione di morte cellulare indotta da PDT
Vivo morto doppia colorazione / con PI e annessina V FITC fornisce informazioni sui meccanismi necrotiche e apoptosi di morte cellulare. Questo schema di colorazione è stato applicato alla cella linee studiate qui dopo PDT per saperne di più su PDT-indotta vie di morte cellulare. Figura 4 mostra epiluminescenza immagini di TE 71and OVCAR3 linee di cellule colorate con annessina V FITC, PI e DAPI. I dati mostrano che non vi è alcun effetto della PDT sulla linea cellulare di controllo TE 71, coerente con l'assorbimento trascurabile di nanoparticelle. La stessa osservazione è stata fatta per MDA-MB-231 (dati non mostrati). Quando OVCar3 subito PDT a 60 ed è stato osservato a 120 J / cm2 duplice colorazione di PI (viola) e annessina V FITC (verde). A 180 J / cm 2 solo la macchia PI è stato osservato, suggerendo la morte cellulare acuta necrotica sotto tale condizione.
Figura 1. (A) Realizzazione di nanoparticelle con il metodo riprecipitazione, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3 incubato con nanoparticelle. Le nanoparticelle sono mostrati in colore verde, il nucleo è mostrato in colore blu. Le immagini di fluorescenza si sovrappongono con le immagini contrasto di fase, scala bar = 20 micron, (C) citotossicità intrinseca di nanoparticelle valutati misurando la vitalità cellulare per ogni linea cellulare fino a 96 ore. I vitalità cellulare vengono confrontati con la dose di controllo di nanoparticelle (0 mg / ml) impostando la vitalità di contrcampioni olo al 100% (non mostrato). Le barre di errore sono le deviazioni standard per i risultati di 3 esperimenti separati (n = 3). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rilevamento dei ROS nella linea cellulare OVCAR3 con ROS rilevamento reagente. (A) non nanoparticelle, senza l'esposizione alla luce, (B) senza nanoparticelle, esposte a 180 J / cm2 di luce, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanoparticelle, non esposizione alla luce, (D) con nanoparticelle e l'esposizione a 180 J / cm 2 luce, presi immediatamente dopo il trattamento, (E) 2 ore post-PDT, (F) con 100 ml di H 2 O 2 come controllo positivo. L'emissione verde brillante a DF i s dal rilevamento reagente ROS confermando formazione di ROS. Barra di scala = 30 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Viabilità cellulari di TE 71, MDA-MB-231, linee cellulari A549, e OVCAR3 somministrati con dosi crescenti di nanoparticelle e irradiate con 120 J / cm2 dose di luce. Il tempo di incubazione post-PDT è di 4 ore. Le dosi nanoparticelle nella legenda sono in 10 -4 mg / ml. Le barre di errore sono le deviazioni standard per i risultati di 3 esperimenti separati (n = 3). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
IGURA 4 "src =" / files / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Figura 4. vivo colorazione / morti di TE 71 e OVCAR3 linee cellulari con annessina V FITC e PI. Emissione verde corrisponde a annessina V FITC, emissione viola corrisponde a PI (rosso, mescolato con blu di emissione DAPI), e blu di emissione corrisponde a DAPI macchia nucleare. Le immagini sono la sovrapposizione di contrasto di fase e le immagini epiluminescenza. Barra della scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. configurazione simulatore solare per l'esposizione delle cellule con la luce calibrata. Una cella solare di riferimento è stato utilizzato per la calibrazione, mostrato nel riquadro registrazione 0.5 intensità della luce del sole (50 mW / cm 2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Controlli Negativi | Nessun NP, nessuna luce | Nessun NP, con luce | Nessuna luce, con NP |
| Controllo positivo | 100 ml H 2 O 2 (No NP, nessuna luce) | --- | --- |
| Sperimentale | 0 ore dopo PDT (NP e luce) | 2 ore dopo PDT (NP e luce) | --- |
Tabella 1: Disegno sperimentale per il rilevamento di ROS.
| Zolla 0 h | Media | TE 71 | A549 | Media | ||||||||
| Nessun trattamento | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabella 2: Struttura della piastra a 96 pozzetti per l'incubazione di nanoparticelle per valutare citotossicità intrinseca di nanoparticelle effetto / PDT
| Piatto no. | Dose di luce (J / cm 2) | Messaggio PDT tempo (h) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabella 3: Etichettatura le piastre a 96 pozzetti per la valutazione PDT.
| Fluoroforo | Filtro di eccitazione | Specchio dicroico | Filtro per le emissioni | Microscopia | Sorgente di eccitazione |
| Nanoparticelle | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocale | Laser ioni Ar-Kr |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescenza | Lampada al mercurio |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescenza | Lampada al mercurio |
| Annessina V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescenza | Lampada al mercurio |
| ROS reagente di rilevamento | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescenza | Lampada al mercurio |
Tabella 4. Configurazione Microscopia per esperimenti di imaging.
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Discussion
Per ottenere nanoparticelle assorbimento era necessario mantenere alcune misure critiche mentre fabbricare nanoparticelle. A 10 -6 M soluzione MEH-PPV (miscelato con il 50% in peso PCBM) in THF era disposto per iniettare in acqua DI, come è stato osservato che la concentrazione di questa soluzione ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di nanoparticelle in formazione. Concentrazione è stata verificata mediante spettroscopia UV-vis. Si noti che nel passaggio 2.1.3 protocollo era necessario diluire la soluzione MEH-PPV inizialmente preparato (soluzione MEH-PPV non diluito) prima di prendere spettri UV-vis poiché questa soluzione ha un'assorbanza maggiore di 1. La velocità di iniezione svolge un ruolo critico nel decidere le dimensioni delle nanoparticelle, e deve essere il più velocemente possibile, vigorosamente mescolando l'acqua DI. Iniezione lenta si tradurrà in nanoparticelle più grandi. Inoltre, l'agitazione deve essere interrotta immediatamente dopo l'iniezione per evitare ulteriore aggregazione. Mentre l'iniezionela soluzione in acqua è necessario tenere l'ago vicino alla superficie interna del flaconcino mentre inserisce l'ago completamente nella soluzione per evitare la formazione di bolle, che influenzerà le dimensioni delle nanoparticelle. Nei nostri esperimenti dimensioni delle nanoparticelle ottenute erano 61,5 ± 23,3 nm come misurato da DLS. DLS è stato scelto al posto di TEM come è veloce, economico, affidabile per queste dimensioni e facilmente disponibili. Il potenziale zeta nelle nanoparticelle è risultato essere -9,66 ± 8,12 mV, cioè leggermente negativa a carica superficiale neutra.
Era essenziale per contare le cellule durante la valutazione della citotossicità intrinseca di nanoparticelle e quantificare risultati PDT, come queste tecniche si basano sul test MTT che fornisce una misurazione quantitativa della vitalità cellulare. E 'essenziale per iniziare l'esperimento con lo stesso numero di cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, che permette la comparazione di vitalità cellulare rispetto alla dose di nanoparticles e luce, nonché gli esperimenti di controllo.
Un simulatore solare è stato utilizzato per irradiare i campioni. La configurazione è illustrata nella Figura 5, e consiste della sorgente luminosa, un filtro UV, e una cella solare di riferimento. Con questo schema illuminazione un alto grado di controllo delle proprietà spettrali e l'intensità della fonte di luce potrebbe essere ottenuto, che ha portato risultati altamente riproducibili. E 'molto importante rendersi conto che la maggior parte di sorgenti luminose non forniscono un profilo di intensità uniforme. Il simulatore solare, tuttavia, può essere allineato per raggiungere intensità vicino uniforme nella zona di illuminazione. Questo è stato verificato da una cella solare di riferimento in diverse regioni dell'area illuminata. Abbiamo anche preso cura di posizionare sempre piastre nella stessa regione del punto luminoso e nello stesso orientamento per ridurre ulteriormente gli effetti di variazione di intensità. La sorgente di luce di campionare distanza indicata in figura 5 ci ha fornito 50mW / cm 2 (0,5 sole) di intensità sotto una lampada di potenza elettrica di 218 W. Per questi esperimenti HBSS colorante media liberi è stato usato per evitare l'assorbimento della luce da indicatori coloranti. Dopo PDT, le cellule sono state nuovamente incubate per determinati periodi di tempo a 37 ° C (post-incubazione PDT) per osservare il progresso della PDT.
La colorazione di cellule richiesto alcuni tentativi ed errori per trovare la giusta concentrazione del rispettivo tintura. Ciò si ottiene ripetendo l'esperimento aumentando la concentrazione di colorante costantemente fino stati raggiunti risultati appropriati.
Il metodo ha anche un paio di limiti, in particolare per quanto riguarda il sistema di nanoparticelle e il trattamento PDT. Le nanoparticelle sono preparate con il metodo riprecipitazione c'è una certa variabilità nelle dimensioni delle nanoparticelle ottenute da lotto a lotto, e alcuni polidispersità dimensioni nanoparticella esiste che non possono essere controllati. Non è anche stato possibile fare nanoparticles meno di 20 nm in dimensioni. Queste limitazioni potrebbero essere sfide nello sviluppo di piccola taglia nanoparticelle monodisperse che possono essere applicati in vivo. Inoltre, l'esperimento in vitro PDT richiede le celle essere fuori incubatrice per un lungo periodo di tempo, che può imporre qualche stress sulle cellule.
Il metodo descritto nel presente documento per PDT è significativo rispetto agli approcci attuali. PDT utilizzando piccoli sensibilizzanti molecole e sensibilizzante drogati nanoparticelle ha visto l'applicazione clinica limitata a causa di problemi significativi con la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva della sensibilizzante), e idrofobicità dei sensibilizzanti (che porta a ridotta biodisponibilità e potenziale tossicità acuta). In chirurgia, anche se il tumore viene rimosso dal corpo, alcune cellule tumorali rimangono e possono risultare in remissione. In radioterapia e la chemioterapia tessuto sano è influenzato anche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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