Introduction
En la terapia fotodinámica (PDT) fotosensibilizadores se administran a un tejido diana, y tras la exposición a la luz el fotosensibilizador genera especies reactivas del oxígeno (ROS). Especies ROS como el oxígeno singlete y superóxido pueden inducir estrés oxidativo y el daño estructural posterior a las células y tejidos 1.4. Debido a su facilidad de aplicación de este método se ha investigado activamente y los ensayos clínicos se han producido 5,6. Sin embargo, las cuestiones importantes, tales como toxicidad en la oscuridad de los sensibilizadores, la sensibilidad del paciente a la luz (debido a la distribución no selectiva del sensibilizador), y la hidrofobicidad de los sensibilizadores (que conduce a la reducción de la biodisponibilidad y el potencial de toxicidad aguda) permanecen.
Aquí se presenta un método para la fabricación e in vitro de evaluación de la realización de las nanopartículas de polímeros mezclados con fullereno como los fotosensibilizadores de próxima generación para PDT. Las nanopartículas se forman por agregación de auto-el polímero semiconductor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-etilhexiloxi) -1,4-fenilenvinileno]) con el PCBM fullereno (fenil-C 61 butírico metil éster de ácido), cuando estos materiales se disolvieron en una compatible disolvente se inyectan rápidamente en un solvente no compatible (Figura 1A). La elección del MEH-PPV como el polímero anfitrión está motivada por su alto coeficiente de extinción que conduce a altas tasas de formación de trío, y tanto la carga y transferencia de energía eficiente y ultrarrápido a la PCBM fullereno 7. Estas propiedades son ideales para la sensibilización de oxígeno singlete y la formación de superóxido en PDT.
Fullerene de hecho se ha aplicado en PDT, tanto en forma molecular y nanopartículas 08.13. Sin embargo, la citotoxicidad severa ha dificultado aún más el desarrollo 12. Aquí mostramos que encapsula el fullereno en una matriz anfitrión MEH-PPV de rendimiento compuesto de nanopartículas MEH-PPV / PCBM resultados en un material de sensibilización de PDT que iNo es citotóxico intrínsecamente, muestra especificidad hacia las células cancerosas debido al tamaño de nanopartículas y la carga superficial, y los rendimientos de tratamiento altamente eficaz PDT a dosis bajas de luz debido a las propiedades fotofísicas antes mencionados.
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Protocol
1. El cultivo de líneas celulares
- Descongele TE 71 (células epiteliales del timo mouse), MDA-MB-231 (células de cáncer de mama humano), A549 (células de cáncer de pulmón humano) y OVCAR3 (células tumorales de ovario humanos) por la celebración de los viales de criógeno en agua tibia durante menos de 2 min . Añadir 10 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS a cada línea celular y centrifugar durante 6 min a 106 x g.
- Aspirar la suspensión y añadir medios de 3 ml al sedimento. Mezclar las células correctamente pipeteando varias veces. Añade esta solución de células pre-calentado 7 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS en matraces T75 y mantener los frascos en atmósfera húmeda de 95% de aire / 5% de CO 2 a 37 ° C. Etiquetar este frasco como Pasaje 0.
- Cuando la confluencia de las células alcanza el 80%, recoger las células mediante su incubación con 0,05% de tripsina durante 10 min. Neutralizar la tripsina mediante la adición de la misma cantidad de medios de comunicación. Centrifugar esta solución durante 6 min a 106 x g. Retire la suspensión y añadir 3 ml de medio fresco a la misma. Mezclar well y transferir pequeña cantidad (100 l) a un matraz de cultivo que contiene 7 ml de medio. Incubar el frasco de cultivo en la incubadora. Etiquetar el frasco como Paso 1.
- Cultura las líneas celulares hasta el paso 11 o 12.
2. Fabricación de nanopartículas
- Preparación de ~ 10 -6 M (ajustada) solución madre sin diluir MEH-PPV
- En un vial de añadir 1 mg de poli [2-metoxi-5- (2-etilhexiloxi) -1,4-fenilenvinileno] (MEH-PPV) con un peso molecular (promedio Mn) 150,000-250,000 g / mol y 3 ml de tetrahidrofurano (THF) . Se agita la mezcla durante 2 horas mientras se calienta a 80 ° C en un plato caliente.
- Se filtra la solución anterior en un nuevo vial usando un filtro de jeringa de 0,2 micras. Etiquetar esta solución como 'MEH-PPV solución madre sin diluir. Esta solución estará involucrado en la preparación de nanopartículas después de puesta a punto de la concentración como se describe en los pasos 2.1.3 y 2.1.4.
- Añadir 50 l de la solución sin diluir MEH-PPV Stock en 3 ml de THF. Etiquetar esta solución como "solución madre diluida MEH-PPV '. Transferencia a una cubeta de cuarzo de 1 cm y medir la absorbancia a 495 nm mediante espectroscopia UV-VIS.
- Si la absorbancia de la solución madre MEH-PPV diluida es mayor que 0,17, se diluye la solución sin diluir MEH-PPV de stock mediante la adición de más THF 1 ml a la vez, y repetir el paso 2.1.3 hasta que la absorbancia medida a 495 nm está en el oscilar 0,13 a 0,17.
- Calcular la molaridad de la solución madre MEH-PPV diluida utilizando la ley de Lambert-Beer, como se muestra a continuación. Aquí 0,15 absorbancia se utiliza como un ejemplo para el resto del protocolo (es decir., Ajustar todos los siguientes cálculos basados en la absorbancia observado), el coeficiente de extinción MEH-PPV usado es 10 7 M -1 cm -1 y la longitud del camino es utilizado 1 cm.
A = ε xbxc (Ecuación 1)
(ε - el coeficiente de extinción molar, A - absorbancia, b - longitud de la trayectoria, c - concentración de la solución)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Ecuación 2)
c = 1,5 x 10 -8 M (Ecuación 3)
Utilice esta concentración para encontrar la concentración de la solución sin diluir MEH-PPV de la forma siguiente:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (Ecuación 4)
0,15 x 10 -7 M x 3050 l = M 2 x 50 l (Ecuación 5)
M = 2 9,15 x 10 -7 M (Ecuación 6)
Esta es la concentración de la 'MEH-PPV solución madre sin diluir ajustado'.
- Cálculo de la masa de MEH-PPV en la solución no diluida ajustada Stock MEH-PPV
- Calcular la masa de MEH-PPV en 1 ml de la solución madre sin diluir ajustado como se muestra a continuación utilizando la molaridad obtenida en el apartado 2.1.4 y el peso molecular (M w) MEH-PPV de, que es 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. No de moles, V - volumen en L) (Ecuación 7)
Por lo tanto, la masa de MEH-PPV en 1 ml de ajustado undsolución madre iluted es 9,15 x 10 -4 g.
- Calcular la masa de MEH-PPV en 1 ml de la solución madre sin diluir ajustado como se muestra a continuación utilizando la molaridad obtenida en el apartado 2.1.4 y el peso molecular (M w) MEH-PPV de, que es 10 6 g / mol.
- Combinando PCBM en MEH-PPV
- Calcular la masa de Fenil-C 61 butírico éster metílico del ácido (PCBM) que se añaden a la solución madre MEH-PPV para hacer dopado MEH-PPV solución de 50% en peso PCBM, donde el 50% en peso PCBM se define con respecto a la masa del MEH-PPV (es decir, la mitad de la masa del MEH-PPV). Al utilizar el peso del MEH-PPV obtenido en el apartado 2.2.
Misa de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% en peso PCBM (ecuación 8)
Misa de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (ecuación 9) - Pesar 1 mg PCBM en un vial y añadir 500 l de THF. Calcular la concentración de PCBM en esta solución utilizando el peso molecular de PCBM como 910.88 g / mol
Molaridad de la solución PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 l) (Ecuación 10)
La molaridad de la solución de PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / l (Ecuación 11) - Calcular el volumen de solución PCBM necesaria para agregar a la ajustada sin diluir MESolución de H-PPV de stock para obtener la solución MEH-PPV PCBM dopado 50% en peso en THF mediante el uso de la molaridad calculado en el paso 2.3.2
4,57 x 10 -4 g de PCBM x 1 mol / 910.88 gx 1 l / 2,19 x 10 -9 moles = 229 l (Ecuación 12)
Añadir 229 l de la solución PCBM en 1 ml de solución madre MEH-PPV sin diluir y mezclar bien ajustado.
- Calcular la masa de Fenil-C 61 butírico éster metílico del ácido (PCBM) que se añaden a la solución madre MEH-PPV para hacer dopado MEH-PPV solución de 50% en peso PCBM, donde el 50% en peso PCBM se define con respecto a la masa del MEH-PPV (es decir, la mitad de la masa del MEH-PPV). Al utilizar el peso del MEH-PPV obtenido en el apartado 2.2.
- Preparación de nanopartículas mediante el método de reprecipitación
- Transferir 1 ml de la solución de MEH-PPV / PCBM mezclado en la jeringa 1 ml con la aguja unida a ella.
- Rápidamente inyectar 1 ml de la solución de MEH-PPV / PCBM mezclado en 4 ml de agua DI agitación a 1200 rpm. Deja de agitar inmediatamente después de la inyección. Utilice estas nanopartículas sin transformar.
3. Incubación de líneas celulares con nanopartículas de Imagen
NOTA: Todos los experimentos de imagen se completaron en placas de Petri de 35 mm
- La captación de nanoparticulos en líneas celulares
- Líneas celulares de Cultura hasta el 12 º paso. A las 12 células de cultivo pasaje th en 35 mm placas de Petri. Ajuste concentración de células añadidas a los 35 mm placas de Petri tal que después de 24 hr las células son 40% de confluencia.
- En esta etapa eliminar los medios de comunicación DMEM suplementado con 10% FBS de las placas de Petri, se lavan las células con DPBS 1x dos veces, y añadir 100 l de la suspensión de nanopartículas en 2 ml de DMEM a las placas de Petri.
- Después de 24 hr quitar el DMEM / nanopartículas suspensión de las placas de Petri y se lavan las células con DPBS 1x 3 veces. A continuación, fijar las células mediante incubación con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Lavar dos veces con DPBS. Teñir las células con 300 nM DAPI mediante la incubación con el colorante durante 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes.
- La detección de ROS
- A549 cultura y líneas celulares OVCAR3 en placas de Petri, 6 por cada línea celular, tal como se explica en la sección 3.1.1. Etiquetar elPlacas de Petri como se muestra en la Tabla 1.
- Añadir 100 l de la suspensión de nanopartículas en 2 ml de DMEM a tres de los platos de petri como se muestra en la Tabla 1 y se incuba durante 24 hr. Para las cajas de Petri que recibirán dosis de luz, lavar las células después de 24 horas y suspender las células en HBSS (solución salina equilibrada de Hank) Dye medios de comunicación libres.
- Calentar la lámpara del simulador solar durante 15 min. Coloque el filtro UV en frente de la lámpara para filtrar la luz ultravioleta. Calibre la lámpara con una célula solar de referencia mediante el ajuste de la potencia de la lámpara para obtener 0,5 dom (50 mW / cm 2) la intensidad en la superficie de la placa de Petri. En esta configuración particular que la condición se logró con 218 W de potencia suministrada a la lámpara.
- Colocar las placas de Petri bajo la lámpara (tapa abierta) durante 60 min, lo que se traduce en una dosis de luz de 180 J / cm 2 como se muestra en los cálculos siguientes:
50 mW / cm 2 x 3600 seg / 1000 = 180 J / cm 2 - Retirar HBSS y sin lavar añadir más 2 ml de medio DMEM suplementado con 10% de FBS a las placas de Petri. Se incuban las células durante otras 2 h.
- Para el control positivo se incuban las células con 100 mM de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) durante 30 min.
- Teñir las células en todas las placas de Petri con una concentración final de 5 mM del reactivo de detección de ROS mediante la incubación de las células con el colorante durante 30 min a 37 ° C.
- Fijar las células mediante incubación con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Lavar dos veces con DPBS. Teñir las células con 300 nM DAPI mediante la incubación con el colorante durante 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes.
- La apoptosis y necrosis por PI y anexina V FITC
- Cultura cada línea celular en 5 placas de Petri. Tres de estas placas de Petri habrá para el experimento, mientras que los restantes 2 placas de Petri serán muestras de control. Incubar las 3 placas de Petri para experimentar con nanopartículas como el correoXplained en la sección 3.1.2. Las muestras de control no se incubaron con nanopartículas.
- Después de 24 horas de incubación seguir el paso 3.2.3.
- Colocar las 3 placas de Petri experimentales bajo la lámpara (tapa abierta) y extraer uno a 20 min, 40 min de uno en uno y uno en 60 min. Esto produce tres muestras que fueron expuestos a dosis de luz de 60, 120 y 180 J / cm2, respectivamente (de cálculo en la sección 3.2.4). A continuación, administrar un 180 J / cm 2 dosis de la luz a una de las placas de Petri de control. Este es el control con la dosis de luz aplicada en la ausencia de nanopartículas. No aplicar dosis de luz de la muestra de control restante (no hay nanopartículas y sin dosis de luz aplicada).
- Sustituir el HBSS con los medios DMEM suplementado con 10% de FBS y mantener las placas de Petri en la incubadora durante 4 hr.
- Teñir las células en el grupo experimental y de control de las placas de Petri con 20 l de anexina V FITC incubando las células con el colorante durante 15 min. Lavar dos veces con DPBS. Manchar la cells con 300 nM DAPI así como 300 nM PI (yoduro de propidio) mediante la incubación con los colorantes para 2 min. Lavar dos veces con DPBS. A continuación, mantener las células en DPBS para imágenes.
4. intrínseca citotoxicidad de nanopartículas
- Contar las células y el cultivo en placas de 96 pocillos
- Recoger las células de los matraces de cultivo mediante la eliminación de los medios y lavado de las células dos veces con DPBS seguido de incubación de las células con 0,05% de tripsina durante 10 min. Añadir 2 ml de medio DMEM suplementado con 10% FBS a la solución de células resultante. Mezclar la solución adecuada para separar grupos de células en interiores.
- Tomar 100 l de la suspensión celular y añadir a 900 mu l de medios DMEM suplementado con 10% FBS. Mezclar bien. Coloque 10 l de esta suspensión en un hemocitómetro. Contar las células utilizando el hemocitómetro y ajustar la concentración de la suspensión celular en 4.1.1 a 5 x 10 4 células / ml.
- Tome 5 placas de 96 pocillos etiquetados como 0 h, 24 hr, 48 h, 72 hy 96 h. Añadir 50 l de las 5 x 10 4 células / ml de células soluciones (TE 71 y A549) en los pocillos como se muestra en la Tabla 2, la siembra de este modo 2.500 células / pocillo. Realice el mismo procedimiento para las líneas celulares OVCAR3 y MDA-MB-231.
- Después de 24 hr lavar los pocillos con 1x DPBS y añadir 50 l de concentraciones crecientes de nanopartículas en los pocillos como se muestra en la Tabla 2. Preparar diferentes concentraciones de nanopartículas mediante la adición de 20, 100, y 180 l de suspensión de nanopartículas a partir de 2.4.2 a DMEM a obtener un volumen final de 2 ml, que produce concentraciones de nanopartículas de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, y 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivamente. Cada línea celular tiene por triplicado para cada concentración de nanopartículas.
- La medición de la viabilidad celular en la oscuridad
- Añadir 10 l de MTT a la placa 0 horas inmediatamente después de la adición de nanopartículas. Incubar la placa durante 4 horas para cri formazánALS a la forma. Añadir solución de solubilización 50 l en los pocillos. Incubar la placa durante 6 horas para disolver los cristales de formazán.
- Medir la viabilidad de las células de la placa de 0 hr mediante el registro de la absorbancia a 570 nm con un lector de microplacas.
- Por 24 horas la placa, se lavan las células con 1x DPBS y añadir 50 l medios de comunicación en cada incubación bien después de 24 horas con nanopartículas. Añadir MTT y leer la placa como se explica en 4.2.1 y 4.2.2.
- Por 48 horas, 72 horas y 96 placas hr, se lavan las células con 1x DPBS y añadir 50 l de medios en los pocillos después de 24 horas de incubación con nanopartículas. Se incuban las células durante los períodos restantes.
- 4.2.5) Medir la viabilidad celular en los puntos de tiempo particulares como se explica en 4.2.1 y 4.2.2.
- Repite el experimento completo para 3 veces (n = 3)
5. medir la viabilidad celular después de PDT
- Contar las células y cultivando en placas de 96 pocillos.
- Etiquetar un conjunto de 9Placas de 6 pocillos como se muestra en la Tabla 3, tanto para los TE 71 placas + A549 y OVCAR3 + MDA-MB-231 placas. La disposición de las placas será la misma como se muestra en 4.1.3.
- Semilla las placas de 96 pocillos como se explica en la sección 4.1 con el mismo diseño que se muestra en la Tabla 2 en la sección 4.1.2.
- Después de 24 horas añadir nanopartículas a las placas como se explica en 4.1.4.
- 24 hr después de la adición de nanopartículas de lavar las células con 1x DPBS y añadir 50 l de HBSS a cada pocillo.
- Irradiar las placas con las respectivas dosis de luz como se explica en 3.2.3.
- Vuelva a colocar la HBSS con 50 l medio DMEM suplementado con 10% de SFB y se incuban las placas durante los períodos de tiempo respectivos después de la TFD.
- Después de cada período de tiempo medir la viabilidad celular como se explica en 4.2.1 y 4.2.2.
6. microscopía de fluorescencia
- La adopción de las nanopartículas
- Encienda las luces de un microscopiond el láser 30 minutos antes de la proyección de imagen. Coloque la placa de Petri que contiene las células fijas (como se explica en la sección 3.1) en la platina del microscopio.
- Recoger la fluorescencia de nanopartículas y DAPI por el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superposición de la fase de contraste, nanopartículas y las imágenes DAPI en software ImageJ.
- La detección de ROS
- Encienda las luces del microscopio 30 minutos antes de la proyección de imagen. Coloque la placa de Petri que contiene las células (como se explica en la sección 3.2) en la platina del microscopio.
- Recoger la fluorescencia de nanopartículas, DAPI, y el reactivo de detección de ROS mediante el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superponer la de contraste de fase, nanopartícula, DAPI y la detección de ROS imágenes de reactivos en el software ImageJ.
- La apoptosis y necrosis por PI y anexina V FITC
- Encienda las luces del microscopio 30 minutos antes de la proyección de imagen. Poner la placa de Petri que contiene las células (como se explica ensección 3.3) en la platina del microscopio.
- Recoger la fluorescencia de nanopartículas, DAPI, PI y Anexina V FITC mediante el uso de filtros como se muestra en la Tabla 4. Superponer la de contraste de fase, nanopartícula, DAPI, PI y Anexina V FITC imágenes en el software ImageJ.
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Representative Results
La captación y la citotoxicidad intrínseca de nanopartículas
Los 50% en peso de nanopartículas mezclados MEH-PPV / PCBM se incubaron con TE 71, MDA-MB-231, A549 y líneas de células OVCAR3. El nivel de mezcla PCBM fue elegido como 50% en peso de PCBM, que se ha demostrado para proporcionar propiedades de carga y de transferencia de energía ideales entre polímeros conjugados y fullerenos 14. Las imágenes de fluorescencia de la captación de nanopartículas se muestran en la Figura 1B. Las células se incubaron durante 24 h con nanopartículas para asegurar la captación de nanopartículas. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% antes de formación de imágenes, y se tiñeron con DAPI con el fin de detectar las células y la localización del núcleo. Con el fin de imagen células suficientemente separadas se mantuvo 40% de confluencia. Las imágenes de fluorescencia con imágenes de contraste de fase correspondiente muestran que existe absorción preferencial de las nanopartículas por el A549 y líneas celulares de cáncer OVCAR3. No fluorescencia detectable se puede ver en TE 71 de controly MDA-MB-231 líneas celulares de cáncer, lo que indica la absorción limitada. Por otro lado, líneas celulares de cáncer A549 y OVCAR3 exhiben absorción de nanopartículas significativo. Citotoxicidad intrínseca (toxicidad en la oscuridad) se evaluó por incubación de los 50% en peso de nanopartículas mezclados MEH-PPV / PCBM con TE 71, MDA-MB-231, A549 y líneas de células OVCAR3 y cuantificar la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. Los datos de MTT en la Figura 1C muestran la proliferación normal de las líneas celulares.
Las nanopartículas como la fuente de ROS
Para asegurarse de que las nanopartículas son la fuente de ROS, y sólo después de la exposición a la luz, la formación de ROS se evaluó con un kit de reactivo de detección ROS. Los datos para OVCAR3 se muestran en la Figura 2 Ausencia de emisión verde en la Figura 2A -. C indica ROS no se forman para las muestras de control. Bright emisión verde a partir del reactivo de detección de ROS se observa para las muestras tratadas con nanopartículas y se exponea la luz como se muestra en las Figuras 2D y E (inmediatamente después de PDT y 2 h después de la PDT), confirmando que ROS se generan durante la TFD.
PDT
El rendimiento del MEH-PPV / nanopartículas PCBM en PDT se cuantificó por ensayo MTT inmediatamente después de la TFD, y después de períodos post-incubación 4 y 12 hr. Los datos se muestran en la Figura 3 para el período posterior a la incubación de 4 horas. Los A549 y líneas celulares de cáncer de OVCAR3 exhiben muerte celular significativa después del tratamiento PDT: hasta 60% para A549 y 100% para OVCAR-3. El control de TE y 71 líneas celulares de cáncer MDA-MB-231 muestran efectos limitados. TE71 es una línea celular de control normal y no se espera que internalizar nanopartículas. Sólo baja absorción no específica de las nanopartículas por TE-71 se observa experimentalmente. Bajo la captación de nanopartículas se observa también para MDA-MB-231, que es en este caso debido a la menor tasa metabólica en comparación con las otras líneas celulares de cáncer. Los datos muestran PDTque las nanopartículas MEH-PPV / PCBM son altamente efectivos sensibilizadores de PDT, y que la eficacia PDT escalas con la absorción de nanopartículas. Las diferencias en los resultados PDT entre las líneas celulares de cáncer considerados aquí son debido a la diferencia en la agresividad (metabolismo y la tasa de endocitosis) entre estas líneas celulares.
La progresión de la muerte celular inducida por PDT
Tinción doble en vivo / muerto con PI y Anexina V FITC ofrece información sobre los mecanismos de necrosis y apoptosis de la muerte celular. Este esquema de tinción se aplicó a la célula líneas estudiadas aquí después de PDT para aprender más sobre las vías de muerte celular inducida por la TFD. La figura 4 muestra epiluminiscencia imágenes de TE 71and OVCAR3 líneas de células teñidas con anexina V FITC, PI y DAPI. Los datos muestran que no hay ningún efecto de la TFD en la línea celular de control TE 71, en consonancia con la absorción insignificante de nanopartículas. La misma observación se hizo para MDA-MB-231 (datos no mostrados). Cuando OVCAR3 sufrió PDT a 60 y se observó 120 J / cm 2 de doble tinción de PI (púrpura) y Anexina V FITC (verde). A 180 J / cm 2 se observó solamente la mancha PI, lo que sugiere la muerte celular necrótica aguda bajo esa condición.
Figura 1. (A) Fabricación de nanopartículas mediante el método de reprecipitación, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 y células OVCAR3 líneas incubó con nanopartículas. Las nanopartículas se muestran en color verde, el núcleo se muestra en color azul. Las imágenes de fluorescencia se superponen con las imágenes de contraste de fase, barra de escala = 20 m, (C) citotoxicidad intrínseca de nanopartículas evaluados por la medición de la viabilidad celular para cada línea celular hasta 96 hr. Las viabilidades de células se comparan con el control de la dosis de nanopartículas (0 mg / ml) mediante el establecimiento de la viabilidad de contrmuestras ol en 100% (no se muestra). Las barras de error son las desviaciones estándar para los resultados de 3 experimentos independientes (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La detección de ROS en la línea celular OVCAR3 con ROS detectar reactivo. (A) no hay nanopartículas, sin exposición a la luz, (B) no hay nanopartículas, expuestos a 180 J / cm2 de luz, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartículas, sin exposición a la luz, (D) con nanopartículas y la exposición a 180 J / cm2 de luz, tomada inmediatamente después del tratamiento, (E) 2 horas después de la PDT, (F) con 100 l de H 2 O 2 como control positivo. La emisión de color verde brillante en el DF i s del reactivo de detección de ROS confirmando la formación de ROS. La barra de escala = 30 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. viabilidades celulares de TE 71, MDA-MB-231, las líneas celulares A549 y OVCAR3 administrados con dosis crecientes de nanopartículas y irradiados con 120 J / cm 2 dosis de luz. El tiempo de incubación post-TFD es de 4 horas. Las dosis de nanopartículas en la leyenda están en 10 -4 mg / ml. Las barras de error son las desviaciones estándar para los resultados de 3 experimentos independientes (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. tinción Live / muerto de TE 71 y OVCAR3 líneas celulares con anexina V FITC y PI. Emisión verde corresponde a la anexina V FITC, emisión púrpura corresponde a PI (rojo, mezclado con azul de emisión DAPI), y azul de emisión corresponde a DAPI tinción nuclear. Las imágenes son la superposición de contraste de fase y las imágenes epiluminiscencia. La barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. configuración simulador solar para la exposición de las células con la luz calibrada. Una célula solar de referencia se utilizó para la calibración, se muestra en el recuadro 0.5 registrarse intensidad de la luz solar (50 mW / cm2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Controles Negativos | No hay PN, no hay luz | No hay PN, con luz | Sin luz, con PN |
| Control positivo | 100 l H 2 O 2 (No PN, no hay luz) | --- | --- |
| Experimental | 0 horas después PDT (PN y la luz) | 2 puestos PDT hr (PN y la luz) | --- |
Tabla 1: Diseño experimental para la detección de ROS.
| Placa 0 horas | Medios | TE 71 | A549 | Medios | ||||||||
| Ningún tratamiento | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabla 2: Diseño de la placa de 96 pocillos para la incubación de las nanopartículas para evaluar la citotoxicidad intrínseca de nanopartículas / efecto de la PDT
| Placa no. | Dosis de luz (J / cm 2) | Publicar PDT tiempo (hr) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabla 3: Etiquetado de las placas de 96 pocillos para la evaluación PDT.
| Fluoróforo | Filtro de excitación | Espejo dicroico | Filtro de emisión | Microscopía | Fuente de excitación |
| Nanopartículas | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocal | Láser de iones de Ar-Kr |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminiscencia | Lámpara de mercurio |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminiscencia | Lámpara de mercurio |
| Anexina V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminiscencia | Lámpara de mercurio |
| Reactivo de detección ROS | 491 décimas | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminiscencia | Lámpara de mercurio |
Tabla 4. Configuración de Microscopía de experimentos de imagen.
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Discussion
Para lograr la captación de nanopartículas que era necesario mantener algunas medidas críticas, mientras que la fabricación de las nanopartículas. Una solución MEH-PPV M 10 -6 (mezclado con 50% en peso PCBM) en THF estaba preparado para inyectar en agua DI, ya que se observó que la concentración de esta solución juega un papel importante en la determinación del tamaño de las nanopartículas se está formando. Concentración se comprobó mediante espectroscopía de UV-vis. Tenga en cuenta que en el paso 2.1.3 protocolo fue necesario diluir la solución MEH-PPV inicialmente preparada (solución sin diluir de stock MEH-PPV) primero antes de tomar los espectros UV-vis ya que esta solución tiene una absorbancia mucho mayor que 1. La velocidad de inyección también desempeña un papel crítico en decidir el tamaño de las nanopartículas, y tiene que ser tan rápido como sea posible mientras se agitaba vigorosamente el agua DI. Inyección lenta resultará en nanopartículas más grandes. Además, la agitación debe ser detenido inmediatamente después de la inyección para evitar una mayor agregación. Si bien la inyecciónLa disolución en agua es necesario para mantener la aguja cerca de la superficie interna del vial mientras se inserta la aguja completamente en la solución para evitar la formación de burbujas, lo que afectará el tamaño de las nanopartículas. En nuestros experimentos tamaños de nanopartículas obtenidas fueron 61,5 ± 23,3 nm medido por DLS. DLS fue elegido en lugar de TEM ya que es rápido, barato y fiable para este tamaño y fácilmente disponible. El potencial zeta de estas nanopartículas se encontró que era -9,66 ± 8,12 mV, es decir, ligeramente negativa a la carga superficial neutral.
Era esencial contar las células, mientras que la evaluación de la citotoxicidad intrínseca de nanopartículas y cuantificar los resultados de PDT, ya que estas técnicas se basan en el ensayo de MTT que proporciona una medición cuantitativa de la viabilidad celular. Es esencial para iniciar el experimento con el mismo número de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos, que permite la comparación de la viabilidad celular con respecto a la dosis de NaNoparticles y luz, así como los experimentos de control.
Un simulador solar fue utilizado para irradiar las muestras. La configuración se muestra en la Figura 5, y se compone de la fuente de luz, un filtro UV, y una célula solar de referencia. Con este esquema de iluminación un alto grado de control de las propiedades espectrales y la intensidad de la fuente de luz se puede lograr, lo que dio lugar a resultados altamente reproducibles. Es muy importante darse cuenta de que la mayoría de las fuentes de luz no proporcionan un perfil de intensidad uniforme. El simulador solar, sin embargo, se puede alinear para llevar a cabo la intensidad casi uniforme en la zona de iluminación. Esto fue verificado por una célula solar de referencia en diferentes regiones de la zona iluminada. También nos ocupamos de colocar siempre las placas en la misma región del punto de luz y en la misma orientación para minimizar aún más los efectos de la variación en la intensidad. La fuente de luz a la muestra distancia indicada en la Figura 5 nos proporcionó 50mW / cm 2 (0,5 dom) de intensidad bajo una potencia de la lámpara eléctrica de 218 W. Para estos experimentos HBSS colorante medios libres se utilizó como para evitar la absorción de la luz por colorantes indicadores. Después de PDT, las células se incubaron de nuevo durante ciertos períodos de tiempo a 37 ° C (incubación post-PDT) para observar el progreso de la PDT.
La tinción de las células requiere un poco de ensayo y error para encontrar la concentración correcta del respectivo colorante. Esto se consigue repitiendo el experimento al tiempo que aumenta la concentración de colorante de manera constante hasta que se alcancen los resultados apropiados.
El método también tiene un par de limitaciones, específicamente en relación con el sistema de nanopartículas y el tratamiento PDT. Dado que las nanopartículas se preparan por el método de reprecipitación existe cierta variabilidad en el tamaño de las nanopartículas obtenido a partir de un lote a otro, y existe algo de polidispersidad de tamaño de nanopartículas que no pueden ser controlados. Asimismo, no ha sido posible hacer nanopartIcles menos de 20 nm de tamaño. Estas limitaciones pueden ser retos en el desarrollo de pequeñas nanopartículas monodispersas de tamaño que se pueden aplicar in vivo. Además, la PDT experimento in vitro las células requiere estar fuera de la incubadora durante una cantidad de tiempo prolongado, lo que podría imponer una cierta tensión sobre las células.
El método discutido en este documento para PDT es significativa con respecto a los enfoques actuales. PDT utilizando pequeñas sensibilizadores molécula y sensibilizador dopado con nanopartículas ha visto la aplicación clínica limitada debido a problemas significativos con toxicidad en la oscuridad de los sensibilizadores, la sensibilidad del paciente a la luz (debido a la distribución no selectiva del sensibilizador), y la hidrofobicidad de los sensibilizadores (que conduce a reducida biodisponibilidad y potencial de toxicidad aguda). En la cirugía, incluso si se retira el tumor del cuerpo, unas pocas células cancerosas permanecen y pueden dar lugar a la remisión. En la radioterapia y la quimioterapia tejido normal se ve afectada también.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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