Introduction
Bij fotodynamische therapie (PDT) fotosensibilisatoren worden toegediend aan doelweefsel en na blootstelling aan het fotosensibiliserende licht genereert Reactive Oxygen Species (ROS). ROS soorten zoals singlet zuurstof en superoxide kan oxidatieve stress en daaropvolgende structurele schade aan cellen en weefsels 1-4 induceren. Vanwege het gemak van de toepassing van deze methode is actief onderzoek en klinische studies hebben plaats 5,6 genomen. Echter, belangrijke zaken als donkere toxiciteit van de sensibilisatoren, patiënt gevoeligheid voor licht (door niet-selectieve distributie van de sensibilisator) en hydrofobiciteit van de sensibilisatoren (wat leidt tot verminderde biologische beschikbaarheid en de potentiële acute toxiciteit) blijven.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het vervaardigen en in-vitro evaluatie van geleidend polymeer nanodeeltjes gemengd met fullereen als de volgende generatie fotosensibiliserende voor PDT. De nanodeeltjes worden gevormd door zelf-aggregatie vanhet halfgeleidende polymeer MEH-PPV (poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenyleenvinyleen]) met het fullereen PCBM (fenyl-C 61 -boterzuur methylester) wanneer deze materialen opgelost in een compatibele oplosmiddel snel geïnjecteerd in een niet-compatibele solvent (Figuur 1A). De keuze van MEH-PPV als de gastheer polymeer wordt gemotiveerd door zijn hoge extinctiecoëfficiënt die leidt tot hoge prijzen van triplet formatie en efficiënt en ultrasnel lading en energieoverdracht aan de fullereen PCBM 7. Deze eigenschappen zijn ideaal voor sensibilisering van singlet zuurstof en superoxide formatie in PDT.
Fullereen is in feite is toegepast in PDT in zowel de moleculaire en nanodeeltjes vorm 8-13. Echter, heeft ernstige cytotoxiciteit verdere ontwikkeling 12 belemmerd. Hier laten we zien dat het inkapselen van het fullereen in een gastheer matrix van MEH-PPV om composiet MEH-PPV / PCBM nanodeeltjes resultaten op in een PDT sensibiliserend materiaal dat iis niet intrinsiek cytotoxische, toont specificiteit voor kankercellen te wijten aan nanodeeltjes grootte en oppervlakte lading, en de opbrengsten zeer effectieve PDT behandeling bij weinig licht doses als gevolg van de eerder genoemde fotofysische eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het kweken cellijnen
- Dooi TE 71 (muis thymus epitheelcellen), MDA-MB-231 (menselijke borstkankercellen), A549 (menselijke longkankercellen) en OVCAR3 (humaan ovarium tumorcellen) vast aan de cryogene flesjes in warm water minder dan 2 min . Voeg 10 ml DMEM medium aangevuld met 10% FBS aan elke cellijn en centrifugeer gedurende 6 min bij 106 x g.
- Zuig de schorsing en voeg 3 ml media om de pellet. Meng de cellen goed door meerdere malen pipetteren. Voeg deze cel oplossing voorverwarmd 7 ml DMEM medium aangevuld met 10% FBS in T75 flessen en houden de kolven bevochtigde atmosfeer van 95% lucht / 5% CO2 bij 37 ° C. Label deze kolf als Passage 0.
- Toen de samenvloeiing van de cellen 80% bereikt, oogsten van de cellen door incuberen met 0,05% trypsine gedurende 10 minuten. Neutraliseren van de trypsine door het toevoegen gelijke hoeveelheid media. Centrifugeer de oplossing gedurende 6 min bij 106 x g. Verwijder de schorsing en voeg 3 ml vers medium aan. Meng well en overdracht kleine hoeveelheid (100 ui) van een cultuur kolf met 7 ml medium. Incubeer de cultuur kolf in incubator. Het etiket van de fles als Passage 1.
- De cultuur van de cellijnen tot passage 11 of 12.
2. Fabricage van nanodeeltjes
- Voorbereiding van ~ 10 -6 M (aangepaste) onverdund MEH-PPV stockoplossing
- In een flesje toe 1mg Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenyleenvinyleen] (MEH-PPV) met een molecuulgewicht (gemiddeld Mn) 150,000-250,000 g / mol en 3 ml tetrahydrofuran (THF) . Roer het mengsel gedurende 2 uur onder verwarming bij 80 ° C op een hete plaat.
- Filtreer de bovenstaande oplossing in een nieuw flesje met een 0,2 urn spuitfilter. Label deze oplossing als 'onverdund MEH-PPV voorraad oplossing'. Deze oplossing zal worden betrokken bij de voorbereiding van nanodeeltjes na de fijnafstelling van de concentratie, zoals beschreven in de stappen 2.1.3 en 2.1.4.
- Voeg 50 ul van de onverdunde MEH-PPV voorraad oplossing in 3 ml THF. Label deze oplossing als 'verdund MEH-PPV voorraad oplossing'. Breng een 1 cm kwarts cuvet en meet de absorptie bij 495 nm met UV-vis spectroscopie.
- Indien de absorptie van het verdunde MEH-PPV voorraadoplossing groter is dan 0,17, verdunnen onverdunde MEH-PPV voorraadoplossing door meer THF 1 ml per keer, en herhaal stap 2.1.3 totdat de gemeten absorptie bij 495 nm in de variëren 0,13-0,17.
- Bereken de molariteit van de verdunde MEH-PPV voorraadoplossing door Lambert-Beer wet zoals hieronder aangegeven. Hier 0,15 extinctie wordt als voorbeeld voor de rest van het protocol (bijv., Pas alle onderstaande berekeningen gebaseerd op waargenomen absorptie), de MEH-PPV extinctiecoëfficiënt gebruikte 10 7 M -1 cm -1 en de padlengte gebruikte 1 cm.
A = ε xbxc (Vergelijking 1)
(ε - de molaire extinctiecoëfficiënt, A - absorptie, b - weglengte, c - concentratie van de oplossing)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm XC (Vergelijking 2)
c = 1,5 x 10 -8 M (Eqn 3)
Met deze concentratie de concentratie van het onverdunde MEH-PPV stock oplossing als volgt:
M 1 M V 1 = 2 V 2 (Vergelijking 4)
0.15 x 10 -7 M x 3050 pi = M 2 x 50 pi (Eqn 5)
M 2 = 9,15 x 10 -7 M (Eqn 6)
Dit is de concentratie van het "aangepaste onverdunde MEH-PPV voorraadoplossing.
- Het berekenen van de massa van MEH-PPV in de aangepaste onverdunde MEH-PPV stockoplossing
- Bereken de massa van MEH-PPV in 1 ml van de aangepaste onverdunde voorraadoplossing zoals hieronder gebruik makend van verkregen in punt 2.1.4 molariteit en het molecuulgewicht (Mw) van MEH-PPV, dat 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. Geen van mollen, V - volume in L) (Vergelijking 7)
Aldus wordt de massa van MEH-PPV in 1 ml und aangepastiluted voorraad oplossing is 9,15 x 10 -4 g.
- Bereken de massa van MEH-PPV in 1 ml van de aangepaste onverdunde voorraadoplossing zoals hieronder gebruik makend van verkregen in punt 2.1.4 molariteit en het molecuulgewicht (Mw) van MEH-PPV, dat 10 6 g / mol.
- Mengen PCBM in MEH-PPV
- Bereken de massa van Fenyl-C 61 boterzuur methylester (PCBM) worden toegevoegd aan de voorraad MEH-PPV oplossing van 50 gew% PCBM gedoteerd MEH-PPV oplossing, waarbij 50 gew% PCBM gedefinieerd met betrekking tot de massa te van MEH-PPV (dat wil zeggen, de helft van de massa van MEH-PPV). Door gebruik te maken van het gewicht van MEH-PPV verkregen in paragraaf 2.2.
Massa van PCBM / 9.15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 gew% PCBM (Eqn 8)
Massa van PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) - Weeg 1 mg PCBM in een flacon en voeg 500 ul THF. Bereken de concentratie van PCBM in deze oplossing wordt met het molecuulgewicht van PCBM als 910,88 g / mol
Molariteit van PCBM oplossing = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 pl) (Vergelijking 10)
Molariteit van PCBM oplossing = 2,19 x 10 -9 mol / ul (Eqn 11) - Bereken het volume van PCBM oplossing die nodig is om toe te voegen aan de aangepaste onverdund MEH PPV-voorraadoplossing om de 50 gew% PCBM gedoteerd MEH-PPV oplossing in THF verkrijgen via de molariteit berekende stap 2.3.2
4.57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 GX 1 pl / 2.19 x 10 -9 mol = 229 pi (Eqn 12)
Voeg 229 ul van de PCBM oplossing in 1 ml onverdunde aangepast MEH-PPV voorraadoplossing en meng.
- Bereken de massa van Fenyl-C 61 boterzuur methylester (PCBM) worden toegevoegd aan de voorraad MEH-PPV oplossing van 50 gew% PCBM gedoteerd MEH-PPV oplossing, waarbij 50 gew% PCBM gedefinieerd met betrekking tot de massa te van MEH-PPV (dat wil zeggen, de helft van de massa van MEH-PPV). Door gebruik te maken van het gewicht van MEH-PPV verkregen in paragraaf 2.2.
- Voorbereiding van nanodeeltjes door herprecipitatie methode
- Breng 1 ml van het gemengde MEH-PPV / PCBM oplossing in de 1 ml spuit met de naald eraan verbonden zijn.
- Snel Injecteer 1 ml van het gemengde MEH-PPV / PCBM oplossing in 4 ml gedeïoniseerd water onder roeren bij 1200 rpm. Stop onmiddellijk met roeren na de injectie. Met deze nanodeeltjes ongewijzigde.
3. Incubatie van cellijnen met nanopartikels voor Imaging
LET OP: Alle imaging experimenten werden in 35 mm petrischaaltjes afgerond
- Opname van nanopartikelen in cellijnen
- Cultuur cellijnen tot de 12 e passage. Op de 12 e passage cultuur cellen in 35 mm petrischaaltjes. Pas concentratie van cellen toegevoegd aan de 35 mm petrischaaltjes zodat na 24 uur de cellen 40% confluent.
- In dit stadium verwijderen DMEM medium aangevuld met 10% FBS uit de petrischalen, was de cellen tweemaal met 1x DPBS en voeg 100 ul van de nanodeeltjes suspensie in 2 ml DMEM aan de petrischalen.
- Na 24 uur verwijdert de DMEM / nanodeeltjes schorsing van de petrischaaltjes en was de cellen met 1x DPBS 3 keer. Bevestig de cellen door incubatie met 4% paraformaldehyde gedurende 10 min. Twee keer wassen met DPBS. Vlekken op de cellen met 300 nM DAPI door incubatie met de kleurstof gedurende 2 min. Twee keer wassen met DPBS. Dan houden de cellen in DPBS voor de beeldvorming.
- Detectie van ROS
- Cultuur A549 en OVCAR3 cellijnen in petrischaaltjes, 6 per cellijn, zoals beschreven in paragraaf 3.1.1. Label dePetrischalen zoals weergegeven in tabel 1.
- Voeg 100 ul van de nanodeeltjes suspensie in 2 ml DMEM drie van de petrischalen zoals aangegeven in tabel 1 en incubeer gedurende 24 uur. Voor de petrischaaltjes dat licht doses ontvangen, was de cellen na 24 uur op te schorten en de cellen in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) kleurstof vrije media.
- Warmen de lamp van de zonne-simulator voor 15 min. Plaats UV filter voor de lamp te filteren UV licht. Kalibreer de lamp met verwijzing zonnecel door aanpassing van de lamp bevoegdheid 0,5 zondag (50 mW / cm 2) intensiteit verkregen op het oppervlak van de petrischaal. In dit specifieke opstelling werd die voorwaarde bereikt met 218 aan de lamp geleverde W vermogen.
- Plaats de petrischalen onder de lamp (deksel open) gedurende 60 min, wat resulteert in een lichte dosering van 180 J / cm2 zoals aangegeven in de onderstaande berekeningen:
50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1000 = 180 J / cm 2 - Verwijder HBSS zonder verdere wassen voeg 2 ml DMEM medium aangevuld met 10% FBS aan de petrischalen. Incubeer de cellen gedurende nog 2 uur.
- Voor de positieve controle incuberen van de cellen met 100 uM waterstofperoxide (H 2 O 2) gedurende 30 min.
- Vlekken op de cellen in de petrischaaltjes met een uiteindelijke concentratie van 5 uM van de ROS detectiereagens door incuberen van de cellen met de kleurstof gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Fixeer de cellen door incubatie met 4% paraformaldehyde gedurende 10 min. Twee keer wassen met DPBS. Vlekken op de cellen met 300 nM DAPI door incubatie met de kleurstof gedurende 2 min. Twee keer wassen met DPBS. Dan houden de cellen in DPBS voor de beeldvorming.
- Apoptose en necrose van PI en annexine V FITC
- Cultuur elke cellijn in 5 petrischaaltjes. Drie van deze petrischalen zal zijn voor experiment terwijl de overige 2 petrischalen wordt controlemonsters. Incubeer de 3 Petrischalen voor experiment met nanodeeltjes als explained in paragraaf 3.1.2. De controlemonsters zijn niet geïncubeerd met nanodeeltjes.
- Na 24 uur incubatie volgen de stap 3.2.3.
- Plaats de 3 experimentele petrischalen onder de lamp (deksel open) en verwijder een op 20 min, een voor 40 min en een op 60 min. Dit levert drie monsters die werden blootgesteld aan licht doses van 60, 120 en 180 J / cm 2, respectievelijk (berekening in paragraaf 3.2.4). Vervolgens dienen een 180 J / cm2 licht dosering één van de controle petrischalen. Besturingskanaal met lichtdosis toegepast zonder nanodeeltjes. Heeft lichte dosis om de resterende controle monster (geen nanodeeltjes en geen licht dosis toegepast) niet van toepassing.
- Vervang HBSS DMEM medium aangevuld met 10% FBS en houd de petrischalen in de incubator gedurende 4 uur.
- Vlekken op de cellen in de experimentele en controle petrischaaltjes met 20 ul van annexine V FITC door incuberen van de cellen met de kleurstof gedurende 15 min. Twee keer wassen met DPBS. Vlekken op de cells met 300 nM DAPI en 300 nM PI (propidiumjodide) door incubatie met de kleurstoffen voor 2 min. Twee keer wassen met DPBS. Dan houden de cellen in DPBS voor de beeldvorming.
4. intrinsieke cytotoxiciteit van nanodeeltjes
- Tellen cellen en kweken in 96-putjesplaten
- Oogst de cellen van kweekflessen door verwijdering van media en wassen van de cellen tweemaal met DPBS, gevolgd door incubatie van de cellen met 0,05% trypsine gedurende 10 minuten. Voeg 2 ml DMEM medium aangevuld met 10% FBS aan de resulterende celoplossing. Meng de oplossing goed naar cel clusters scheiden in singlets.
- Neem 100 pi van de celsuspensie en voeg 900 ul DMEM medium aangevuld met 10% FBS. Goed mengen. Plaats 10 ul van deze suspensie op een hemocytometer. Tel de cellen met de hemocytometer en de concentratie van de celsuspensie aanpassen 4.1.1 tot 5 x 10 4 cellen / ml.
- Neem 5 96-well platen bestempeld als 0 uur, 24 uurr, 48 uur, 72 uur en 96 uur. Voeg 50 ul van het 5 x 10 4 cellen / ml cell oplossingen (TE 71 en A549) in de putjes zoals getoond in tabel 2, waardoor zaaien 2500 cellen / putje. Doe dezelfde procedure voor OVCAR3 en MDA-MB-231-cellijnen.
- Na 24 uur was de putjes met 1x DPBS en voeg 50 ul van toenemende concentraties van nanodeeltjes in de putjes zoals weergegeven in tabel 2. Bereid verschillende concentraties nanodeeltjes door toevoeging van 20, 100 en 180 ui suspensie van nanodeeltjes 2.4.2 naar DMEM met het verkrijgen van een eindvolume van 2 ml, die nanodeeltjes concentraties oplevert van 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml en 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectievelijk. Elke cel lijn heeft drie exemplaren voor elke concentratie van nanodeeltjes.
- Het meten van de levensvatbaarheid van de cellen in dark
- Voeg 10 ul MTT naar de 0 hr plaat onmiddellijk na het toevoegen van nanodeeltjes. Incubeer de plaat gedurende 4 uur voor formazanproduct crystALS te vormen. Voeg 50 ul oplossing oplosbaar in de putten. Incubeer de plaat gedurende 6 uur aan de formazankristallen ontbinden.
- Meet de cellevensvatbaarheid van de 0 hr plaat door registratie van de absorptie bij 570 nm met microplaatlezer.
- 24 hr plaat, was de cellen met 1x DPBS en voeg 50 ul media in elk putje na 24 uur incubatie met nanodeeltjes. Voeg MTT en lees de plaat zoals beschreven in 4.2.1 en 4.2.2.
- 48 uur, 72 uur en 96 uur platen, was de cellen met 1x DPBS en voeg 50 ul media in de putten na 24 uur incubatie met nanodeeltjes. Incubeer de cellen van de resterende perioden.
- 4.2.5) Meet de levensvatbaarheid van de cellen op het bepaalde tijdstippen, zoals uitgelegd in 4.2.1 en 4.2.2.
- Herhaal het volledige experiment 3 keer (n = 3)
5. Het meten van de cel levensvatbaarheid Na PDT
- Tellen cellen en kweken in 96-wells platen.
- Label een set van 96-well platen zoals getoond in Tabel 3, zowel de TE 71 + A549 borden en OVCAR3 + MDA-MB-231 platen. De indeling van de platen zal hetzelfde zijn zoals in 4.1.3.
- Zaad van de 96-well platen zoals beschreven in paragraaf 4.1 met dezelfde opstelling als weergegeven in tabel 2 in punt 4.1.2.
- Na 24 uur nanodeeltjes toe te voegen aan de platen zoals uitgelegd in 4.1.4.
- 24 uur na toevoeging van nanodeeltjes was de cellen met 1x DPBS en voeg 50 ul aan elk putje HBSS.
- Bestralen van de platen met de respectieve lichte doses zoals uitgelegd in 3.2.3.
- Vervang HBSS met 50 pi DMEM medium aangevuld met 10% FBS en incubeer de platen voor de respectievelijke tijdsperioden na PDT.
- Na elke periode meten van de levensvatbaarheid van de cellen, zoals uitgelegd in 4.2.1 en 4.2.2.
6. Fluorescentie Microscopie
- Opname van nanodeeltjes
- Schakel de lampen van de microscoop eennd de laser 30 min voor de beeldvorming. Plaats de petrischaal die de gefixeerde cellen (zoals beschreven in paragraaf 3.1) op het podium van de microscoop.
- Verzamel de fluorescentie van nanodeeltjes en DAPI met filters zoals weergegeven in Tabel 4. Overlay fase contrast, nanodeeltjes en DAPI beelden in ImageJ software.
- Detectie van ROS
- Schakel de lampen van de microscoop 30 min voor de beeldvorming. Zet de petrischaal met daarin de cellen (zoals beschreven in paragraaf 3.2) op het podium van de microscoop.
- Verzamel de fluorescentie van nanodeeltjes, DAPI en de ROS detectiereagens met filters zoals weergegeven in Tabel 4. Overlay fase contrast, nanodeeltjes, DAPI en ROS detectiereagens beelden in ImageJ software.
- Apoptose en necrose van PI en annexine V FITC
- Schakel de lampen van de microscoop 30 min voor de beeldvorming. Plaats de petrischaal met de cellen (zoals inparagraaf 3.3) op het podium van de microscoop.
- Verzamel de fluorescentie van nanodeeltjes, DAPI, PI en annexine V FITC met filters zoals weergegeven in Tabel 4. Overlay fase contrast, nanodeeltjes, DAPI, PI en annexine V FITC beelden in ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opname en intrinsieke cytotoxiciteit van nanodeeltjes
De 50 wt% blended MEH-PPV / PCBM nanopartikels werden geïncubeerd met TE 71, MDA-MB-231, A549 en OVCAR3 cellijnen. Het PCBM mengen niveau werd gekozen als 50 wt% PCBM, waarvan is aangetoond dat ideaal laden en energieoverdracht tussen geconjugeerde polymeren en fullerenen 14 verschaffen. Fluorescentiebeelden van nanodeeltjes opname wordt getoond in figuur 1B. De cellen werden gedurende 24 uur met nanodeeltjes nanodeeltjes opname zorgen. De cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde voor beeldvorming, en gekleurd met DAPI om cellen en de plaats van de kern te detecteren. Om het voldoende gescheiden cellen werd 40% confluentie gehandhaafd. Fluorescentie beelden met bijbehorende fasecontrast beelden tonen dat er bijzondere opname van nanodeeltjes door A549 en OVCAR3 kankercellijnen. Geen detecteerbare fluorescentie te zien in TE 71 controlen MDA-MB-231 kankercellijnen, aangeeft beperkte opname. Anderzijds, A549 en OVCAR3 kankercellijnen vertonen significant nanodeeltjes opname. Intrinsieke cytotoxiciteit (donkere toxiciteit) werd beoordeeld door incubatie van de 50 gew% blended MEH-PPV / PCBM nanodeeltjes met TE 71, MDA-MB-231, A549 en OVCAR3 cellijnen en kwantificeren van de cellevensvatbaarheid door MTT assay. MTT gegevens in Figuur 1C normale proliferatie van de cellijnen.
Nanodeeltjes als de bron van ROS
Om de nanodeeltjes zijn de bron van ROS en enkel na blootstelling aan licht, werd ROS vorming geëvalueerd met ROS detectie reagens kit. Gegevens voor OVCAR3 worden getoond in Figuur 2 afwezigheid van groene emissie in Figuur 2A -. C geeft ROS niet gevormd voor de controlemonsters. Helder groen emissie van de ROS detecteren reagens wordt waargenomen voor monsters behandeld met nanodeeltjes en blootlicht zoals getoond in figuren 2D en E (direct na PDT en 2 uur na PDT) bevestigt dat ROS ontstaan tijdens PDT.
PDT
De prestaties van MEH-PPV / PCBM nanodeeltjes in PDT werd gekwantificeerd door MTT-test direct na PDT, en na 4 en 12 uur na incubatie periode. De gegevens worden getoond in figuur 3 voor 4 uur na incubatieperiode. De A549 en OVCAR3 kankercellijnen vertonen significante celdood na PDT behandeling: tot 60% voor A549 en 100% van OVCAR-3. De TE 71 controle en MDA-MB-231 kankercellijnen vertonen beperkte effecten. TE71 is een normale controle cellijn en zal naar verwachting geen nanodeeltjes internaliseren. Alleen lage niet-specifieke opname van nanodeeltjes door TE-71 is experimenteel waargenomen. Low nanodeeltjes opname wordt ook waargenomen voor MDA-MB-231, die in dit geval door de lagere stofwisseling in vergelijking met de andere kankercellijnen. De PDT gegevens tonende MEH-PPV / PCBM nanodeeltjes zeer effectief PDT sensibilisatoren, en dat de effectiviteit PDT schalen met nanodeeltjes opname. De verschillen in resultaten tussen de PDT kankercellijnen hier beschouwd worden vanwege het verschil in agressiviteit (metabolisme en snelheid van endocytose) tussen deze cellijnen.
Progressie van PDT-geïnduceerde celdood
Live / dead dubbele kleuring met PI en annexine V FITC geeft informatie over necrotische en apoptotische mechanismen van celdood. Deze kleuring regeling werd op de bestudeerde cellijnen hier na PDT meer over PDT geïnduceerde celdood routes te leren. Figuur 4 toont epiluminescence afbeeldingen TE 71and OVCAR3 cellijnen gekleurd met Annexine V FITC, PI en DAPI. De gegevens tonen aan dat er geen effect van PDT de TE 71 controlecellijn, in overeenstemming met verwaarloosbare opname van nanodeeltjes. Hetzelfde werd gedaan voor MDA-MB-231 (gegevens niet getoond). Wanneer OVCAR3 onderging PDT op 60 en 120 J / cm 2 dual kleuring van PI (paars) en Annexine V-FITC (groen) werd waargenomen. 180 J / cm2 alleen de PI vlek waargenomen, wat suggereert acute necrotische celdood onder die voorwaarde.
Figuur 1. (A) Vervaardiging van nanodeeltjes door herprecipitatie werkwijze (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 en OVCAR3 cellijnen geïncubeerd met nanodeeltjes. De nanodeeltjes worden in groene kleur, is de kern weergegeven in blauwe kleur. De fluorescentie beelden worden bedekt met de fase contrast beelden, schaal bar = 20 urn, (C) Intrinsieke cytotoxiciteit van nanodeeltjes geëvalueerd door het meten van de levensvatbaarheid van de cellen voor elke cellijn tot 96 uur. De levensvatbaarheid van de cellen vergeleken met controle dosis van nanodeeltjes (0 mg / ml) door de levensvatbaarheid van control monsters bij 100% (niet getoond). Error bars zijn de standaard afwijkingen voor de resultaten van 3 afzonderlijke experimenten (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Detectie van ROS in OVCAR3 cellijn met ROS detecteren reagens. (A) zonder nanodeeltjes, geen blootstelling aan licht, (B) zonder nanodeeltjes blootgesteld aan 180 J / cm2 licht, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanodeeltjes, geen blootstelling aan licht, (D) met nanodeeltjes en blootstelling aan 180 J / cm2 licht, genomen onmiddellijk na de behandeling, (E) 2 uur na PDT, (F) met 100 gl H 2 O 2 als positieve controle. De heldere groene emissie in DF i s vanaf de ROS detectiereagens bevestiging ROS vorming. Schaal bar = 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Cel levensvatbaarheid van TE-71, MDA-MB-231, A549, en OVCAR3 cellijnen toegediend met toenemende doses van nanodeeltjes en bestraald met 120 J / cm 2 lichte dosis. De post-PDT incubatietijd is 4 uur. De nanodeeltjes doses in de legenda in 10 -4 mg / ml. Error bars zijn de standaard afwijkingen voor de resultaten van 3 afzonderlijke experimenten (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
IGUUR 4 "src =" / files / ftp_upload / 53.038 / 53038fig4.jpg "/>
Figuur 4. Levend / dood kleuring TE 71 en OVCAR3 cellijnen met annexine V FITC en PI. Green emissie komt overeen met annexine V FITC, paars emissie komt overeen met PI (rood, blauw gemengd met DAPI emissie) en blauwemissieverhouding overeenkomt met DAPI nucleaire vlek. Beelden zijn de overlay van de fase contrast en epiluminescence beelden. Schaal bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. zonnesimulator opstelling voor blootstelling van cellen met gekalibreerde licht. Verwijzing zonnecel werd gebruikt voor de kalibratie, getoond in de inzet registreren 0,5 lichtintensiteit zondag (50 mW / cm 2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Negatieve controles | Geen NP, geen licht | Geen NP, met licht | Geen licht, met NP |
| Positieve controle | 100 ul H 2 O 2 (Nee NP, geen licht) | --- | --- |
| Experimenteel | 0 uur na PDT (NP en licht) | 2 uur na PDT (NP en licht) | --- |
Tabel 1: Experimenteel ontwerp voor de detectie van ROS.
| 0 hr plaat | Media | TE 71 | A549 | Media | ||||||||
| Geen behandeling | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tabel 2: Opbouw van de 96-well plaat voor incubatie van nanodeeltjes intrinsieke cytotoxiciteit van nanodeeltjes evalueren / PDT effect
| Plate geen. | Lichtdosis (J / cm 2) | Bericht PDT tijd (uur) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tabel 3: Labelen de 96-well platen voor PDT evalueren.
| Fluorofoor | Excitatiefilter | Dichroïsche spiegel | Emissie-filter | Microscopie | Excitatiebron |
| Nanodeeltjes | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocale | Ar-Kr ionlaser |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescence | Kwiklamp |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | Kwiklamp |
| Annexine V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescence | Kwiklamp |
| ROS detectiereagens | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | Kwiklamp |
Tabel 4. Microscopy configuratie voor plaatsbepalingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om nanodeeltjes opname te bereiken is het noodzakelijk om een aantal cruciale maatregelen te handhaven was, terwijl het vervaardigen van de nanodeeltjes. Een 10 -6 M MEH-PPV oplossing (gemengd met 50 gew% PCBM) in THF werd bereid injecteren in DI water, zoals werd waargenomen dat de concentratie van deze oplossing speelt een belangrijke rol bij het bepalen van de grootte van nanodeeltjes gevormd. Concentratie werd gecontroleerd met UV-vis spectroscopie. Merk op dat in stap 2.1.3 protocol diende de oorspronkelijk bereide MEH-PPV oplossing (onverdund MEH-PPV voorraadoplossing) eerst verdunnen alvorens UV-vis spectra omdat deze oplossing een absorptie veel groter dan 1. De snelheid van de injectie speelt ook een cruciale rol in het bepalen van de grootte van de nanodeeltjes, en moet zo snel mogelijk worden onder krachtig roeren DI water. Langzame injectie leidt tot grotere nanodeeltjes. Ook moet het roeren onmiddellijk gestopt na injectie verdere aggregatie te voorkomen. Terwijl het injecterende oplossing in water moet de naald nabij het binnenoppervlak van de flacon houden terwijl de naald volledig in de oplossing voor belvorming, die de grootte van de nanodeeltjes invloed voorkomen. In onze experimenten nanodeeltjes afmetingen verkregen waren 61,5 ± 23,3 nm zoals gemeten door DLS. DLS werd gekozen in plaats van TEM omdat het snel, goedkoop, betrouwbaar voor deze omvang en gemakkelijk beschikbaar. De zeta potentiaal van deze nanodeeltjes bleek -9,66 ± 8,12 mV, dat wil zeggen, licht negatief neutraal oppervlaktelading.
Het was essentieel om de cellen te tellen terwijl het evalueren van de intrinsieke cytotoxiciteit van nanodeeltjes en kwantificeren PDT resultaat, omdat deze technieken zijn gebaseerd op de MTT assay die een kwantitatieve meting van levensvatbaarheid van de cellen verschaft. Het is essentieel om het experiment met hetzelfde aantal cellen in elk putje van de 96-well plaat, waardoor voor de vergelijking van cellevensvatbaarheid ten opzichte van de dosis nan beginnenoparticles en lichte alsook de controle-experimenten.
Een zonnesimulator werd gebruikt om de monsters te bestralen. De opstelling is weergegeven in figuur 5, en omvat de lichtbron een UV-filter, en een referentie zonnecel. Hiermee verlichting regeling een hoge mate van controle over de spectrale eigenschappen en de intensiteit van de lichtbron kan worden bereikt, waardoor zeer reproduceerbare resultaten. Het is belangrijk te beseffen dat de meeste lichtbronnen geen uniform intensiteitsprofiel. De zonnesimulator kan echter worden afgestemd op vrijwel uniforme intensiteit bereiken in het gebied van verlichting. Dit werd geverifieerd door verwijzing zonnecel in verschillende gebieden van het verlichte oppervlak. We namen ook de zorg om platen altijd in dezelfde regio van de lichtvlek en in dezelfde oriëntatie effecten van variaties in intensiteit verder te minimaliseren. De lichtbron te proeven afstand aangegeven in Figuur 5 gaf ons 50mW / cm2 (0,5 zon) van de intensiteit onder een elektrische lamp vermogen van 218 W. Voor deze experimenten HBSS kleurstof vrije media werd gebruikt om de absorptie van licht vermijden door indicator kleurstoffen. Na PDT, werden de cellen opnieuw gedurende bepaalde tijdsperioden bij 37 ° C (na PDT incubatie) om de voortgang van PDT te observeren.
Kleuring van cellen vereist wat trial and error om de juiste concentratie van de kleurstof te vinden. Dit wordt bereikt door het experiment te herhalen terwijl het verhogen van de kleurstofconcentratie geleidelijk tot passende resultaten behaald.
De methode heeft een aantal beperkingen, met name betreffende de nanodeeltjes systeem en PDT behandeling. Aangezien nanodeeltjes worden bereid door neerslaan methode bestaat er enige variabiliteit in het verkregen nanodeeltjes grootte van partij tot partij, en sommige polydispersiteit in nanodeeltjes formaat bestaat dat niet kan worden gecontroleerd. Het is ook niet mogelijk geweest om nanopart makenicles minder dan 20 nm in grootte. Deze beperkingen kunnen worden uitdagingen in de ontwikkeling klein formaat monodisperse nanodeeltjes die in vivo kunnen worden toegepast. Bovendien is de in-vitro experiment PDT vereist de cellen buiten de incubator voor een langere tijd, waarvan sommige nadruk te leggen op de cellen.
De werkwijze hierin besproken voor PDT significant ten opzichte van de huidige aanpak. PDT gebruik van kleine moleculen sensitiserende en sensibilisator gedoteerde nanodeeltjes beperkte klinische toepassing gezien vanwege aanzienlijke problemen met donkere toxiciteit van de sensibilisatoren, patiënt gevoeligheid voor licht (door niet-selectieve distributie van de sensibilisator) en hydrofobiciteit van de sensibilisatoren (wat leidt tot verminderde de biologische beschikbaarheid en de potentiële acute toxiciteit). In operatie, zelfs wanneer de tumor is verwijderd uit het lichaam, wat kankercellen blijven en kunnen leiden tot remissie. In de radiotherapie en chemotherapie normaal weefsel wordt ook beïnvloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
