Introduction
En thérapie photodynamique (PDT) photosensibilisants sont administrés à un tissu cible, et lors de l'exposition à la lumière du photosensibilisant génère Reactive Oxygen Species (ROS). ROS espèces tels que l'oxygène singlet et superoxyde peuvent induire un stress oxydatif et les dommages structurels à la suite de cellules et de tissus 1-4. En raison de sa facilité d'application de cette méthode a été activement étudiée et des essais cliniques ont eu lieu de 5,6. Cependant, des problèmes importants tels que la toxicité dans l'obscurité des sensibilisateurs, la sensibilité du patient à la lumière (en raison de la distribution non-sélective de l'agent de sensibilisation), et le caractère hydrophobe des sensibilisateurs (ce qui conduit à une biodisponibilité réduite et le potentiel de toxicité aiguë) restent.
Nous rapportons ici un procédé pour la fabrication et l'évaluation in vitro de la conduite nanoparticules de polymère mélangé avec les photosensibilisateurs fullerène en tant que nouvelle génération de PDT. Les nanoparticules sont formées par auto-agrégation desle polymère semi-conductrice MEH-PPV (poly [2-méthoxy-5- (2-éthylhexyloxy) -1,4-phénylènevinylène]) avec le PCBM de fullerène (C 61 phényl-butyrique ester méthylique d'acide) lorsque ces matériaux dissous dans un compatible solvant sont rapidement injectés dans un solvant non compatible (figure 1A). Le choix de MEH-PPV que le polymère hôte est motivé par son coefficient d'extinction élevé qui conduit à des taux élevés de formation de triplet, et à la fois la charge et le transfert d'énergie efficace et ultrarapide pour le fullerène PCBM 7. Ces propriétés sont idéales pour la sensibilisation de l'oxygène singulet et la formation de superoxyde dans la PDT.
Fullerène a en fait été appliquée dans la PDT dans la forme moléculaire et nanoparticule 8-13. Cependant, la cytotoxicité sévère a entravé le développement 12. Ici, nous montrons que l'encapsulation du fullerène dans une matrice hôte de MEH-PPV donné composites nanoparticules MEH-PPV / PCBM résultats dans un matériau sensibiliser PDT que jeest pas cytotoxique intrinsèque, montre spécificité envers les cellules cancéreuses en raison de la taille des nanoparticules et de la charge de surface, et les rendements de traitement PDT très efficace à des doses de faible luminosité due aux propriétés photophysiques susmentionnés.
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Protocol
1. Lignes de culture de cellules
- (Cellules humaines ovariennes tumorales) en maintenant les flacons de cryogène dans l'eau chaude pour les moins de 2 min Thaw TE 71 (cellules épithéliales thymiques Souris), MDA-MB-231 (cellules de cancer du sein humain), de A549 (cellules de cancer du poumon humain) et OVCAR3 . Ajouter 10 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS à chaque lignée cellulaire et centrifuger pendant 6 min à 106 x g.
- Aspirer la suspension et ajouter des médias 3ml au culot. Mélanger les cellules correctement par pipetage à plusieurs reprises. Ajouter cette solution à la cellule préchauffé 7 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS dans des flacons T75 et maintenir des flacons en atmosphère humidifiée de 95% d'air / 5% de CO2 à 37 ° C. Étiqueter ce flacon comme Passage 0.
- Lorsque la confluence des cellules atteint 80%, de récolter les cellules par incubation avec de la trypsine 0,05% pendant 10 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant quantité égale de médias. Centrifugeuse cette solution pendant 6 minutes à 106 x g. Retirer la suspension et ajouter 3 ml de milieu frais à elle. Mélanger well et transférer petite quantité (100 ul) dans un flacon de culture contenant 7 ml de milieu. Incuber le flacon de culture dans un incubateur. Etiqueter le flacon comme Passage 1.
- Culture des lignées cellulaires jusqu'au passage 11 ou 12.
2. Fabrication de nanoparticules
- Préparation de ~ 10 -6 M (ajusté) non dilué solution stock MEH-PPV
- Dans un flacon de 1 mg ajouter Poly [2-méthoxy-5- (2-éthylhexyloxy) -1,4-phénylènevinylène] (MEH-PPV) ayant une masse moléculaire (moyenne en nombre Mn) 150,000-250,000 g / mol et 3 ml de tétrahydrofuranne (THF) . On agite le mélange pendant 2 heures tout en chauffant à 80 ° C sur une plaque chaude.
- Filtrer la solution ci-dessus dans un nouveau flacon en utilisant un filtre à seringue de 0,2 pm. Étiqueter cette solution comme «MEH-PPV solution stock non dilué. Cette solution sera impliqué dans la préparation de nanoparticules après un réglage fin de la concentration comme décrit dans les étapes 2.1.3 et 2.1.4.
- Ajouter 50 pi de la solution stock de MEH-PPV non dilué dans 3 ml de THF. Étiqueter cette solution comme «stock solution diluée MEH-PPV. Transférer dans une cuvette en quartz de 1 cm et mesurer l'absorbance à 495 nm par spectroscopie UV-vis.
- Si l'absorbance de la solution stock de MEH-PPV diluée est supérieure à 0,17, diluer la solution stock de MEH-PPV non dilué en ajoutant plus de THF 1 ml à la fois, et répétez l'étape 2.1.3 jusqu'à ce que l'absorbance mesurée à 495 nm est dans le aller 0,13 à 0,17.
- Calculer la molarité de la solution stock de MEH-PPV diluée en utilisant la loi de Beer-Lambert, comme indiqué ci-dessous. Ici 0,15 absorbance est utilisée, par exemple, pour le reste du protocole (par exemple., D'ajuster tous les calculs suivants sur la base de l'absorbance observée), le coefficient d'extinction MEH-PPV utilisé est de 10 7 M -1 cm -1 et la longueur de chemin d'accès utilisé est 1 cm.
A = ε xbxc (équation 1)
(ε - le coefficient d'extinction molaire, A - absorbance, b - longueur du trajet, c - concentration de la solution)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (équation 2)
c = 1,5 x 10 -8 M (équation 3)
Utilisez cette concentration pour trouver la concentration de la solution mère de MEH-PPV non dilué comme suit:
M 1 V 1 = V 2 M 2 (équation 4)
0,15 x 10 -7 M x M = 3050 pi 2 x 50 pi (équation 5)
M 2 = 9,15 x 10 -7 M (équation 6)
Ceci est la concentration de la 'MEH-PPV solution stock non dilué ajusté ».
- Calcul de masse de MEH-PPV dans la solution stock de MEH-PPV non dilué rajusté
- Calculer la masse de MEH-PPV dans 1 ml de la solution mère non dilué ajusté comme indiqué ci-dessous en utilisant la molarité obtenue dans la section 2.1.4 et le poids moléculaire (Mw) de MEH-PPV, qui est de 10 6 g / mol.
M = n / V (n -. Pas de moles, V - le volume en L) (équation 7)
Ainsi, la masse du MEH-PPV dans 1 ml de und ajustésolution stock iluted est 9,15 x 10 -4 g.
- Calculer la masse de MEH-PPV dans 1 ml de la solution mère non dilué ajusté comme indiqué ci-dessous en utilisant la molarité obtenue dans la section 2.1.4 et le poids moléculaire (Mw) de MEH-PPV, qui est de 10 6 g / mol.
- Alliant PCBM dans MEH-PPV
- Calculer la masse de Phenyl-C 61 butyrique ester méthylique d'acide (PCBM) pour être ajouté dans la solution mère de MEH-PPV de faire dopé solution MEH-PPV 50% en poids PCBM, où 50% PCBM est définie par rapport à la masse de MEH-PPV (par exemple, la moitié de la masse de MEH-PPV). En utilisant le poids de MEH-PPV obtenue dans la section 2.2.
Messe de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% en poids PCBM (équation 8)
Messe de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (équation 9) - Peser 1 mg PCBM dans une fiole et ajouter 500 ul de THF. Calculer la concentration de cette solution en PCBM en utilisant le poids moléculaire du PCBM comme 910,88 g / mol
Molarité de solution de PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 pi) (équation 10)
Molarité de la solution de PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / ul (équation 11) - Calculer le volume de solution de PCBM nécessaire d'ajouter à la ME non dilué ajustéSolution H-PPV de stock pour obtenir le PCBM dopé solution à 50% en poids de MEH-PPV dans le THF en utilisant la molarité calculé à l'étape 2.3.2
4,57 x 10 -4 g du PCBM x 1 mol / 1 910,88 gx ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (équation 12)
Ajouter 229 pi de la solution de PCBM dans 1 ml de solution stock ajusté MEH-PPV non dilué et bien mélanger.
- Calculer la masse de Phenyl-C 61 butyrique ester méthylique d'acide (PCBM) pour être ajouté dans la solution mère de MEH-PPV de faire dopé solution MEH-PPV 50% en poids PCBM, où 50% PCBM est définie par rapport à la masse de MEH-PPV (par exemple, la moitié de la masse de MEH-PPV). En utilisant le poids de MEH-PPV obtenue dans la section 2.2.
- Préparation de nanoparticules par un procédé de reprécipitation
- Transférer 1 ml de la solution MEH-PPV / PCBM mélangé dans la seringue de 1 ml avec l'aiguille attachée à elle.
- Injecter rapidement 1 ml de la solution MEH-PPV / PCBM mélangé dans 4 ml d'eau DI agitation à 1200 rpm. Arrêtez de remuer immédiatement après l'injection. Utilisez ces nanoparticules sans autre traitement.
3. Incubation de lignées cellulaires avec des nanoparticules pour l'imagerie
NOTE: Toutes les expériences d'imagerie ont été achevés en boîtes de Pétri de 35 mm
- L'absorption de nanoparticles dans des lignées cellulaires
- Des lignées cellulaires de culture jusqu'à la 12 ème passage. À la 12 e des cellules de culture de passage à 35 mm boîtes de Pétri. Ajuster la concentration de cellules ajoutées aux 35 mm boîtes de Pétri de telle sorte qu'après 24 h les cellules sont 40% de confluence.
- A ce stade, retirer le support du DMEM supplémenté avec 10% de FBS à partir des boîtes de Pétri, laver les cellules deux fois avec du DPBS 1x, et ajouter 100 ul de la suspension de nanoparticules dans 2 ml de DMEM pour les boîtes de Pétri.
- Après 24 heures enlever le DMEM / nanoparticules suspension des boîtes de Pétri et laver les cellules avec 1x DPBS 3 fois. Ensuite, fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde à 4% pendant 10 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer les cellules avec 300 nM DAPI par incubation avec le colorant pendant 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l'imagerie.
- Détection de ROS
- A549 de la Culture et des lignées cellulaires OVCAR3 dans des boîtes de Pétri, 6 pour la lignée cellulaire, comme expliqué dans la section 3.1.1. Etiqueter leDes boîtes de Pétri comme indiqué dans le Tableau 1.
- Ajouter 100 ul de la suspension de nanoparticules dans 2 ml de DMEM à trois des boîtes de Pétri comme indiqué dans le tableau 1 et incuber pendant 24 heures. Pour les boîtes de Pétri qui recevront des doses de lumière, laver les cellules après 24 h et les cellules en suspension dans HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Dye médias libres.
- Réchauffez la lampe du simulateur solaire pour 15 min. Placez filtre UV en avant de la lampe à filtrer les rayons UV. Calibrer la lampe avec une cellule solaire de référence en ajustant la puissance de la lampe pour obtenir 0,5 soleil (50 mW / cm 2) intensité à la surface de la boîte de Pétri. Dans cette configuration particulière que la condition a été réalisée avec 218 W de puissance fournie à la lampe.
- Placer les boîtes de Pétri sous la lampe (couvercle ouvert) pendant 60 min, ce qui résulte en un dosage de lumière 180 J / cm 2 tel que représenté dans les calculs ci-dessous:
50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1,000 = 180 J / cm 2 - Retirer HBSS sans lavage et ajouter en outre de 2 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS pour les boîtes de Pétri. Incuber les cellules pendant encore 2 heures.
- Pour le contrôle positif incuber les cellules avec 100 pM de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) pendant 30 min.
- Colorer les cellules dans toutes les boîtes de Pétri avec une concentration finale de 5 uM du réactif de détection ROS en incubant les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 ° C.
- Fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde à 4% pendant 10 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer les cellules avec 300 nM DAPI par incubation avec le colorant pendant 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l'imagerie.
- Apoptose et la nécrose par PI et l'annexine V FITC
- Culture de chaque lignée cellulaire dans 5 boîtes de Pétri. Trois de ces boîtes de Petri aura pour l'expérience 2, tandis que les boîtes de Pétri restants seront échantillons témoins. Incuber les 3 boîtes de Pétri pour expérimenter avec des nanoparticules que l'eXplained à la section 3.1.2. Les échantillons de contrôle ne sont pas incubées avec des nanoparticules.
- Après 24 heures d'incubation suivre l'étape 3.2.3.
- Placez les 3 boîtes de Pétri expérimentales sous la lampe (couvercle ouvert) et supprimer l'un à 20 min, l'un à 40 min et l'autre à 60 min. Cela donne trois échantillons qui ont été exposés à des doses de lumière de 60, 120 et 180 J / cm 2, respectivement (calcul à la section 3.2.4). Ensuite, administrer un 180 J / cm 2 dosage de la lumière à l'un des plats contrôle de Pétri. Ceci est la dose de lumière de contrôle appliqué en l'absence de nanoparticules. Ne pas appliquer la dose de lumière à l'échantillon de contrôle restant (pas de nanoparticules et aucune dose de lumière appliquée).
- Remplacez le HBSS avec les médias DMEM supplémenté avec 10% de FBS et garder les boîtes de Pétri dans l'incubateur pendant 4 heures.
- Colorer les cellules dans le dispositif expérimental et les boîtes de Pétri de contrôle avec 20 pi d'annexine V FITC en incubant les cellules avec le colorant pendant 15 min. Laver deux fois avec du DPBS. Colorer le caunes avec 300 nM DAPI ainsi que 300 nM PI (iodure de propidium) par incubation avec les colorants pour 2 min. Laver deux fois avec du DPBS. Puis maintenir les cellules dans du DPBS pour l'imagerie.
4. La cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules
- Le comptage des cellules et mise en culture dans des plaques à 96 puits
- Récolter les cellules provenant des flacons de culture en supprimant médias et lavage des cellules deux fois avec du DPBS puis par incubation des cellules avec de la trypsine 0,05% pendant 10 min. Ajouter 2 ml de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS à la solution de cellules résultante. Mélanger la solution appropriée pour séparer les amas de cellules en maillots.
- Prendre 100 ul de la suspension de cellules et ajouter 900 ul de milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Bien mélanger. Placez 10 pi de cette suspension sur un hémocytomètre. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la régler la concentration de la suspension de cellules dans 4.1.1 à 5 x 10 4 cellules / ml.
- Prenez 5 plaques à 96 puits étiquetés comme 0 h, 24 hr, 48 h, 72 h et 96 h. Ajouter 50 pi de 5 x 10 4 cellules / ml des solutions de cellules (TE 71 et A549) dans les puits comme indiqué dans le tableau 2, l'ensemencement ainsi 2500 cellules / puits. Faites la même procédure pour les lignées cellulaires OVCAR3 et MDA-MB-231.
- Après 24 h laver les puits avec du DPBS 1x et ajouter 50 ul de concentrations croissantes de nanoparticules dans les puits comme indiqué dans le tableau 2. Préparer différentes concentrations de nanoparticules par addition de 20, 100, et 180 ul de suspension de nanoparticules à 2.4.2 DMEM à obtenir un volume final de 2 ml, ce qui donne des concentrations de nanoparticules de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, et 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivement. Chaque lignée cellulaire a triple pour chaque concentration de nanoparticules.
- Mesure de la viabilité cellulaire dans l'obscurité
- Ajouter 10 ul MTT à la plaque 0 h immédiatement après l'ajout de nanoparticules. Incuber la plaque pendant 4 heures pour cryst formazanals pour former. Ajouter la solution de solubilisation de 50 ul dans les puits. Incuber la plaque pendant 6 heures pour dissoudre les cristaux de formazan.
- Mesure de la viabilité cellulaire de la plaque de 0 h en enregistrant l'absorbance à 570 nm avec un lecteur de microplaque.
- Pour une plaque à 24 h, laver les cellules avec 1x DPBS et ajouter 50 médias ul dans chaque puits d'incubation après 24 h avec des nanoparticules. Ajouter MTT et de lire la plaque, comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2.
- Pour 48 h, 72 h et 96 h plaques, laver les cellules avec 1x DPBS et ajouter 50 médias ul dans les puits après 24 heures d'incubation avec des nanoparticules. Incuber les cellules pendant les périodes restantes.
- 4.2.5) Mesurer la viabilité cellulaire à des points de temps particuliers comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2.
- Recommencer l'expérience complète de 3 fois (n = 3)
5. Mesure de la viabilité cellulaire Après PDT
- Le comptage des cellules et la mise en culture dans des plaques à 96 puits.
- Étiqueter un ensemble de 9Plaques de 6 puits comme indiqué dans le tableau 3, à la fois pour les plaques TE 71 + A549 et OVCAR3 + MDA-MB-231 plaques. La disposition des plaques sera le même, comme indiqué dans 4.1.3.
- Ensemencer les plaques à 96 puits comme expliqué dans la section 4.1 avec la même disposition, comme indiqué dans le tableau 2 dans la section 4.1.2.
- Après 24 h ajouter des nanoparticules pour les plaques comme expliqué dans la section 4.1.4.
- 24 h après l'addition de nanoparticules laver les cellules avec du DPBS 1x et ajouter 50 ul de HBSS à chaque puits.
- Irradier les plaques avec les doses de lumière respectifs, comme expliqué au paragraphe 3.2.3.
- Remplacer la HBSS avec 50 ul du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et on incube les plaques pendant les périodes de temps respectives après la PDT.
- Après chaque période de temps de mesurer la viabilité cellulaire comme expliqué en 4.2.1 et 4.2.2.
6. microscopie à fluorescence
- L'absorption de nanoparticules
- Allumer les lampes du microscope une le laser 30 min avant l'imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules fixes (comme expliqué dans la section 3.1) sur la scène du microscope.
- Recueillir la fluorescence de nanoparticules et DAPI en utilisant des filtres comme indiqué dans le tableau 4. Superposez le contraste de phase, nanoparticules et images DAPI dans le logiciel ImageJ.
- Détection de ROS
- Allumer les lampes du microscope 30 minutes avant l'imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules (comme expliqué dans la section 3.2) sur la scène du microscope.
- Recueillir la fluorescence de nanoparticules, DAPI et le réactif de détection ROS en utilisant des filtres comme indiqué au tableau 4. Superposer le contraste de phase, nanoparticule, DAPI et les images ROS de réactif de détection dans le logiciel ImageJ.
- Apoptose et la nécrose par PI et l'annexine V FITC
- Allumer les lampes du microscope 30 minutes avant l'imagerie. Mettez la boîte de Pétri contenant les cellules (comme expliqué danssection 3.3) sur la scène du microscope.
- Recueillir la fluorescence de nanoparticules, DAPI, PI, et Annexin V FITC en utilisant des filtres comme indiqué dans le tableau 4. Superposez le contraste de phase, nanoparticule, DAPI, PI et les images Annexin V FITC dans le logiciel ImageJ.
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Representative Results
L'absorption et la cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules
Les 50% en poids de nanoparticules mélangées MEH-PPV / PCBM ont été incubées avec TE 71, MDA-MB-231, A549 et des lignées cellulaires OVCAR3. Le niveau PCBM de mélange a été choisi comme 50% PCBM, qui a été montré pour fournir des propriétés de charge et de transfert d'énergie idéale entre les polymères et les fullerènes 14 conjugués. Images de fluorescence de nanoparticules absorption sont présentés dans la figure 1B. Les cellules sont incubées pendant 24 heures avec des nanoparticules d'assurer l'absorption des nanoparticules. Les cellules sont ensuite fixées avec du paraformaldehyde à 4% avant l'imagerie, et colorées avec du DAPI afin de détecter des cellules et la localisation du noyau. Pour l'image des cellules suffisamment séparés 40% de confluence a été maintenue. Images de fluorescence avec des images de contraste de phase correspondant montrent qu'il existe une absorption préférentielle des nanoparticules par la A549 et OVCAR3 lignées cellulaires de cancer. Aucune fluorescence détectable peut être vu dans 71 TE contrôleet MDA-MB-231 lignées cellulaires de cancer, ce qui indique l'absorption limitée. D'autre part, les lignées cellulaires de cancer A549 et OVCAR3 présentent l'absorption de nanoparticules significative. Cytotoxicité intrinsèque (toxicité dans l'obscurité) a été évaluée par incubation des 50% en poids de mélanges de nanoparticules MEH-PPV / PCBM avec TE 71, MDA-MB-231, A549 et des lignées cellulaires OVCAR3 et quantifier la viabilité cellulaire par le test MTT. MTT données de la figure 1C montre la prolifération normale des lignées cellulaires.
Les nanoparticules en tant que source de ROS
Pour veiller à ce que les nanoparticules sont la source de ROS, et seulement après exposition à la lumière, la formation de ROS a été évaluée avec un kit de réactifs de détection ROS. Les données pour OVCAR3 sont présentés sur la figure 2 Absence d'émission verte sur la figure 2A -. C indique ROS sont pas formés pour les échantillons témoins. Lumineux émission verte à partir du réactif de détection ROS est observée pour les échantillons traités avec des nanoparticules et exposéà la lumière, comme indiqué dans les figures 2D et E (immédiatement après PDT et 2 heures après PDT), confirmant que les ROS sont générés pendant la PDT.
PDT
La performance de MEH-PPV / nanoparticules de PCBM en PDT a été quantifiée par un dosage MTT immédiatement après PDT, et après les périodes post-incubation de 4 à 12 h. Les données sont présentées à la figure 3 pour la période de post-incubation de 4 heures. Les lignées A549 et cellules cancéreuses présentent OVCAR3 mort cellulaire significative après traitement PDT: jusqu'à 60% de A549 et 100% pour OVCAR-3. Le contrôle TE 71 et MDA-MB-231 lignées cellulaires de cancer montrent des effets limités. TE71 est une lignée cellulaire de contrôle normal et ne devrait pas internaliser nanoparticules. Seule une faible absorption non spécifique des nanoparticules par TE-71 est observée expérimentalement. Faible absorption de nanoparticules est également observée pour les cellules MDA-MB-231, qui est dans ce cas en raison de la baisse du taux métabolique par rapport aux autres lignées cellulaires de cancer. Le spectacle de données PDTque les nanoparticules MEH-PPV / PCBM sont très efficaces sensibilisateurs PDT, et que l'efficacité PDT échelles avec l'absorption des nanoparticules. Les différences de résultats entre les PDT lignées cellulaires de cancer considérés ici sont dues à la différence de l'agressivité (taux de métabolisme et l'endocytose) entre ces lignées cellulaires.
Progression de la mort cellulaire induite par PDT
Morts vivent double coloration / avec PI et Annexin V FITC fournit des informations sur les mécanismes nécrotiques et apoptotiques de la mort cellulaire. Ce schéma de coloration a été appliquée à la cellule lignes étudiées ici après PDT en savoir plus sur PDT-induites voies de la mort cellulaire. La figure 4 montre épiluminescence images de TE 71 et OVCAR3 Les lignées de cellules colorées avec l'annexine V FITC, PI et DAPI. Les données montrent qu'il n'y a pas d'effet de PDT sur la lignée cellulaire de contrôle TE 71, conformément à l'absorption négligeable de nanoparticules. La même observation a été faite pour MDA-MB-231 (données non présentées). Lorsque OVCAR3 subi PDT à 60 et 120 J / cm 2 à double coloration de PI (violet) et Annexin V FITC (vert) a été observée. À 180 J / cm 2, seule la tache de PI a été observée, suggérant aiguë mort cellulaire nécrotique sous cette condition.
Figure 1. (A) Fabrication de nanoparticules par un procédé de reprécipitation, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 et cellules OVCAR3 lignes incubées avec des nanoparticules. Les nanoparticules sont représentés en couleur vert, le noyau est représenté en bleu. Les images de fluorescence sont superposées avec les images à contraste de phase, barre d'échelle = 20 um, (C) de cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules évaluée par la mesure de la viabilité cellulaire pour chaque lignée cellulaire jusqu'à 96 h. Les viabilités cellulaires sont comparées avec la dose de commande de nanoparticules (0 mg / ml) en éditant la viabilité de contrDes échantillons de LO à 100% (non représenté). Les barres d'erreur sont les écarts types pour les résultats de 3 expériences distinctes (n = 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Détection de ROS dans la lignée cellulaire OVCAR3 avec ROS réactif de détection. (A) aucun nanoparticules, aucune exposition à la lumière, (B) aucun nanoparticules, exposés à 180 J / cm 2 de lumière, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanoparticules, aucune exposition à la lumière, (D) avec des nanoparticules et l'exposition à 180 J / cm 2 de lumière, prises immédiatement après le traitement, (E) 2 h post-PDT, (F) avec 100 pl H 2 O 2 de contrôle positif. L'émission vert vif DF i s à partir du réactif de détection qui confirme la formation de ROS ROS. La barre d'échelle = 30 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. viabilités cellulaires de TE 71, MDA-MB-231, les lignées cellulaires A549, et OVCAR3 administrés avec des doses croissantes de nanoparticules et irradiés avec 120 J / cm dose de lumière 2. Le temps d'incubation post-PDT est 4 h. Les doses de nanoparticules dans la légende sont en 10 -4 mg / ml. Les barres d'erreur sont les écarts types pour les résultats de 3 expériences distinctes (n = 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. Live coloration / morts de TE 71 et OVCAR3 lignées cellulaires avec l'annexine V FITC et PI. Émission verte correspond à l'annexine V FITC, l'émission violet correspond à PI (rouge, mélangé avec du bleu DAPI émission), et l'émission bleue correspond à DAPI colorant nucléaire. Les images sont la superposition de contraste de phase et images épiluminescence. La barre d'échelle = 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. configuration de simulateur solaire pour l'exposition de cellules à la lumière calibrée. Une cellule solaire de référence a été utilisé pour l'étalonnage, montré dans l'encart enregistrant 0,5 intensité de la lumière du soleil (50 mW / cm 2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Contrôles négatifs | Aucun IP, pas de lumière | Aucun IP, avec la lumière | Pas de lumière, avec des IP |
| Contrôle positif | 100 pi H 2 O 2 (Aucun IP, pas de lumière) | --- | --- |
| Expérimental | 0 heures après PDT (IP et de la lumière) | 2 heures après PDT (IP et de la lumière) | --- |
Tableau 1: Dispositif expérimental pour la détection de ROS.
| Plaque 0 h | Médias | TE 71 | A549 | Médiatique | ||||||||
| Aucun traitement | ||||||||||||
| 0 mg / ml | ||||||||||||
| 0,4 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 2,0 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
| 3,6 x 10 -4 mg / ml | ||||||||||||
Tableau 2: Présentation de la plaque de 96 puits pour l'incubation de nanoparticules pour évaluer la cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules / effet PDT
| Plate pas. | Dose de lumière (J / cm 2) | Poster PDT temps (hr) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
Tableau 3: Repérage des plaques à 96 puits pour l'évaluation PDT.
| Fluorophore | Filtre d'excitation | Le miroir dichroïque | Filtre d'émission | Microscopie | Source d'excitation |
| Nanoparticule | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocale | Ar-Kr laser à ions |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Épiluminescence | Lampe Mercury |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Épiluminescence | Lampe Mercury |
| Annexine V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Épiluminescence | Lampe Mercury |
| ROS réactif de détection | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Épiluminescence | Lampe Mercury |
Tableau 4. Microscopie configuration pour des expériences d'imagerie.
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Discussion
Pour atteindre nanoparticule absorption, il était nécessaire de maintenir certaines mesures critiques tout en fabrication des nanoparticules. Une solution IM 10 -6 MEH-PPV (mélangé avec 50% en poids PCBM) dans du THF a été préparé pour l'injection dans de l'eau DI, comme il a été observé que la concentration de cette solution joue un rôle important dans la détermination de la taille des nanoparticules est formée. La concentration a été vérifiée par spectroscopie UV-vis. Notez que dans l'étape de protocole 2.1.3 Il était nécessaire de diluer la solution MEH-PPV initialement préparé (non dilué solution stock MEH-PPV) avant de prendre spectres UV-vis puisque cette solution a une absorbance beaucoup plus grand que 1. La vitesse d'injection joue également un rôle critique dans le choix de la taille des nanoparticules, et doit être aussi rapide que possible tout en agitant vigoureusement de l'eau DI. Injection lente se traduira dans les grandes nanoparticules. En outre, l'agitation doit être arrêté immédiatement après l'injection pour éviter une nouvelle agrégation. Tout en injectantla solution dans l'eau, il est nécessaire de maintenir l'aiguille à proximité de la surface intérieure de la fiole tout en insérant l'aiguille complètement dans la solution pour éviter la formation de bulles, ce qui affectera la taille des nanoparticules. Dans nos expériences tailles de nanoparticules obtenues étaient de 61,5 ± 23,3 nm telle que mesurée par DLS. DLS a été choisi à la place de TEM comme il est rapide, peu coûteuse et fiable pour cette taille et facilement disponibles. Le potentiel zêta sur ces nanoparticules a été jugée -9,66 ± 8,12 mV, soit légèrement négatif à la charge de surface neutre.
Il est essentiel de compter les cellules lors de l'évaluation de la cytotoxicité intrinsèque de nanoparticules et de quantifier les résultats PDT, car ces techniques sont basées sur le test MTT qui fournit une mesure quantitative de la viabilité cellulaire. Il est essentiel de commencer l'expérience avec le même nombre de cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits, ce qui permet une comparaison de la viabilité cellulaire par rapport à la dose de nanoparticles et de la lumière ainsi que les expériences de contrôle.
Un simulateur solaire a été utilisé pour irradier les échantillons. La configuration est représentée sur la figure 5, et se compose de la source de lumière, un filtre UV, et une cellule solaire de référence. Avec ce système d'éclairage d'un degré élevé de contrôle des propriétés spectrales et l'intensité de la source de lumière pourrait être réalisé, qui a abouti à des résultats très reproductibles. Il est très important de réaliser que la plupart des sources lumineuses ne permettent pas de profil d'intensité uniforme. Le simulateur solaire, cependant, peut être alignée à accomplir intensité uniforme à proximité de l'endroit de l'illumination. Ceci a été vérifié par une cellule solaire de référence dans les différentes régions de la zone éclairée. Nous avons également pris soin de placer toujours plaques dans la même région de la tache de lumière et dans la même orientation afin de réduire davantage les effets de la variation de l'intensité. La source de lumière à la distance indiquée dans la Figure 5 échantillon nous ont remis 50mW / cm 2 (0,5 soleil) d'intensité sous une puissance de la lampe électrique de 218 W. Pour ces expériences HBSS colorant médias libres a été utilisé pour éviter l'absorption de la lumière par des colorants indicateurs. Après PDT, les cellules ont été à nouveau incubées pendant certaines périodes de temps à 37 ° C (post-PDT incubation) d'observer les progrès de la PDT.
Coloration des cellules nécessaire quelques essais et erreurs pour trouver la bonne concentration du colorant respectif. Ceci est obtenu en répétant l'expérience, tout en augmentant la concentration de colorant de façon constante jusqu'à ce que les résultats appropriés ont été obtenus.
La méthode a aussi un couple de limitations, en particulier en ce qui concerne le système de nanoparticules et de traitement par PDT. Etant donné que les nanoparticules sont préparées par le procédé de reprécipitation existe une certaine variabilité de la taille des nanoparticules obtenues à partir de lot à l'autre, et une certaine polydispersité en taille des nanoparticules qui existe ne peut être contrôlée. Il n'a pas non plus été possible de faire nanoparticles inférieure à 20 nm. Ces limitations pourraient être défis dans le développement de petites nanoparticules monodispersées de taille qui peuvent être appliqués in vivo. En outre, l'expérience in vitro PDT nécessite les cellules à l'extérieur de l'incubateur pour un montant de temps prolongée, qui pourrait imposer un peu de stress sur les cellules.
La méthode décrite ici pour la PDT est significative par rapport aux approches actuelles. PDT en utilisant de petites sensibilisateurs de molécules et de sensibilisateur dopé nanoparticules a vu l'application clinique limitée en raison de problèmes significatifs avec toxicité dans l'obscurité des sensibilisateurs, la sensibilité du patient à la lumière (en raison de la distribution non-sélective de l'agent de sensibilisation), et le caractère hydrophobe des sensibilisateurs (ce qui conduit à biodisponibilité réduite et la toxicité aiguë potentielle). En chirurgie, même si la tumeur est retirée du corps, quelques cellules cancéreuses restent et peuvent conduire à une rémission. En radiothérapie et la chimiothérapie tissu normal est affecté aussi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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