Introduction
בפוטודינמי תרפים פוטוסנסיטייסרים (PDT) מנוהלים למקד רקמות, ובחשיפה לאור הפוטוסנסיטייזר יוצר מינים תגובתי חמצן (ROS). מיני ROS כגון חמצן וסופראוקסיד גופייה יכולים לגרום ללחץ חמצוני ונזק מבני לאחר תאים ורקמות 1-4. בשל קלויות יישום שיטה זו נחקרה באופן פעיל וניסויים קליניים התרחשו 5,6. עם זאת, סוגיות מהותיות כגון רעילות אפלה של הרגישות ל, רגישות מטופל לאור (עקב החלוקה הלא סלקטיבי של sensitizer), והידרופוביות של הרגישות ל( מה שמוביל לזמינות ביולוגית מופחתת ורעילות אקוטית פוטנציאלית) יישארו.
כאן אנו מדווחים על שיטה לייצור וב- המבחנה הערכה של ניהול חלקיקי פולימר מעורבב עם פולרן כפוטוסנסיטייסרים הדור הבא לPDT. חלקיקים נוצרים על ידי צבירה עצמית שלהפולימר מוליכים למחצה MEH-PPV (פולי [2-methoxy-5 (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene]) עם PCBM פולרן (פניל-C 61 תיל אסטר חומצת -butyric) כאשר חומרים אלה מומסים בתואמים ממס מוזרקים במהירות לתוך ממס שאינו תואם (איור 1 א). הבחירה של MEH-PPV כפולימר המארח מונעת על ידי מקדם ההכחדה הגבוהה שלה שמוביל לשיעורים גבוהים של היווצרות שלישייה, וגם העברת מטען ואנרגיה יעילה וultrafast לPCBM פולרן 7. מאפיינים אלה הם אידיאליים עבור רגישות של חמצן גופייה והיווצרות סופראוקסיד בPDT.
פולרן יש למעשה יושם בPDT בשתי הצורה המולקולרית וננו-חלקיקים 8-13. עם זאת, רעיל חמור שהקשה על התפתחות נוספת 12. כאן אנו מראים כי מתמצתים את פולרן במטריצת שורה של MEH-PPV להניב תוצאות חלקיקי MEH-PPV / PCBM מרוכבים בחומר רגיש PDT שזה לא רעיל לתאים באופן מהותי, תערוכות סגוליות לתאי סרטן בשל גודל ננו-חלקיקים ותשלום פני השטח, ותשואות טיפול PDT יעיל במינונים נמוכים אור בשל מאפייני photophysical האמורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שורות תאי Culturing
- (תאים אנושיים השחלות גידול) ההפשרה TE 71 (תאי האפיתל הרתי עכבר), מד"א MB-231 (תאי סרטן השד אנושי), A549 (תאי סרטן ריאות אנושיות) וOVCAR3 ידי החזקת בקבוקוני cryogen במים חמים בפחות מ 2 דקות . הוסף 10 מיליליטר תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS לכל שורת תא צנטריפוגות במשך 6 דקות ב106 x גרם.
- לשאוב את ההשעיה ולהוסיף מדיה 3ml לגלולה. מערבבים את התאים כראוי על ידי pipetting מספר פעמים. להוסיף פתרון תא זה למחומם מראש 7 מיליליטר תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS בצלוחיות T75 ולשמור על צלוחיות באווירת humidified של 95% CO אוויר / 5% 2 על 37 מעלות צלזיוס. תווית הבקבוק הזה כמעבר 0.
- כאשר confluency של התאים מגיע 80%, לקצור את התאים על ידי דוגריהם עם טריפסין 0.05% למשך 10 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת כמות שווה של תקשורת. צנטריפוגה פתרון זה במשך 6 דקות ב106 x גרם. הסר את ההשעיה ולהוסיף 3 מיליליטר תקשורת טרי לזה. מערבבים well ולהעביר כמות קטנה (100 μl) לבקבוק תרבות המכיל 7 מיליליטר תקשורת. דגירה בקבוק התרבות בחממה. תווית הבקבוק כמעבר 1.
- תרבות שורות תאים עד מעבר 11 או 12.
2. ייצור של חלקיקים
- הכנת ~ 10 -6 פתרון M (מתואם) חי MEH-PPV מניות
- בבקבוקון להוסיף פוליפוני 1mg [2-methoxy-5 (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) עם משקל מולקולרי (ממוצע Mn) 150,000-250,000 g / mol ו -3 מיליליטר tetrahydrofuran (THF) . מערבבים את התערובת לשעה 2 בזמן חימום על 80 מעלות צלזיוס בצלחת חמה.
- סנן את הפתרון לעיל בבקבוקון חדש באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. תווית פתרון זה כ'פתרון מניות MEH-PPV חי '. פתרון זה יהיה מעורב בהכנת ננו-חלקיקים לאחר כוונון עדין של הריכוז כפי שמתוארים בצעדים 2.1.3 ו2.1.4.
- הוסף 50 μl של פתרון מניות MEH-PPV חי ל 3 מיליליטר THF. תווית פתרון זה כ'פתרון מניות בדילול MEH-PPV '. מעבירים לקובט קוורץ 1 סנטימטר ולמדוד את הספיגה ב 495 ננומטר ידי ספקטרוסקופיה UV מול.
- אם את הספיגה של פתרון מניות MEH-PPV בדילול גבוהה מ0.17, לדלל את פתרון מניות MEH-PPV חי על ידי הוספה יותר THF 1 מיליליטר בכל פעם, וחזור על שלב 2.1.3 עד הספיגה נמדדה בננומטר 495 היא ב נע 0.13-.17.
- לחשב את molarity של פתרון מניות MEH-PPV המדולל באמצעות חוק למברט-באר כפי שמוצג להלן. הנה 0.15 הספיגה משמשת כדוגמא לשארית הפרוטוקול (כלומר., להתאים את כל החישובים הבאים מבוססים על הספיגה נצפתה), מקדם הכחדת MEH-PPV משמש הוא 10 7 M -1 סנטימטר -1 ואת אורך הדרך בשימוש 1 סנטימטר.
= Ε xbxc (Eqn 1)
(Ε - מקדם הכחדה טוחנת, - ספיגה, ב - אורך הדרך, ג - ריכוז של הפתרון)
0.15 = 10 7 M -1 סנטימטר -1 x xc 1 סנטימטר (Eqn 2)
c = 1.5 x 10 -8 M (Eqn 3)
השתמש בריכוז זה כדי למצוא את הריכוז של פתרון מניות MEH-PPV חי כדלקמן:
M 1 V 1 = M 2 V 2 (Eqn 4)
0.15 x 10 -7 M x 3050 μl = M 2 x 50 μl (Eqn 5)
M 2 = 9.15 x 10 -7 M (Eqn 6)
זהו הריכוז של 'הפתרון המותאם חי MEH-PPV המניה ".
- חישוב מסה של MEH-PPV בפתרון המניות המתואם חי MEH-PPV
- לחשב את המסה של MEH-PPV ב 1 מיליליטר של פתרון המניות חי המותאם כפי שמוצג להלן באמצעות molarity שהתקבל בסעיף 2.1.4 והמשקל המולקולרי (w M) של MEH-PPV, שהוא 10 6 g / mol.
= N / V M (n -. לא של שומות, V - נפח בL) (7 Eqn)
כך, המסה של MEH-PPV ב 1 מיליליטר של הותאם undפתרון מניות iluted הוא 9.15 x 10 -4 G.
- לחשב את המסה של MEH-PPV ב 1 מיליליטר של פתרון המניות חי המותאם כפי שמוצג להלן באמצעות molarity שהתקבל בסעיף 2.1.4 והמשקל המולקולרי (w M) של MEH-PPV, שהוא 10 6 g / mol.
- PCBM מיזוג בMEH-PPV
- לחשב את המסה של 61 תיל אסטר חומצת -butyric פניל-C (PCBM) שיתווסף לפתרון המניות MEH-PPV לעשות פתרון PCBM 50% WT מסומם MEH-PPV, שבי PCBM 50% WT מוגדר ביחס למסה של MEH-PPV (כלומר, מחצית המסה של MEH-PPV). על ידי שימוש במשקל של MEH-PPV שהתקבל בסעיף 2.2.
מסה של PCBM / 9.15 x 10 -4 גרם של MEH-PPV x 100% PCBM% = 50 WT (Eqn 8)
מסה של PCBM = 4.57 x 10 -4 G (Eqn 9) - לשקול PCBM 1 מ"ג בבקבוקון ולהוסיף 500 THF μl. חשב את הריכוז של PCBM בפתרון זה באמצעות המשקל המולקולרי של PCBM כ910.88 g / mol
Molarity של פתרון PCBM = 0.001 g / (910.88 g / mol * 500 μl) (Eqn 10)
Molarity של פתרון PCBM = 2.19 x 10 -9 mol / μl (Eqn 11) - חשב את הנפח של פתרון PCBM צורך להוסיף להותאם נמהל MEפתרון מניות H-PPV להשיג 50% WT פתרון MEH-PPV PCBM מסומם בTHF באמצעות molarity מחושב בשלב 2.3.2
4.57 x 10 -4 גרם של PCBM x 1 mol / 910.88 μl 1 / 2.19 x 10 -9 mol = 229 μl GX (Eqn 12)
להוסיף 229 μl של פתרון PCBM לתוך 1 מיליליטר של פתרון מניות יותאם חי MEH-PPV ומערבבים היטב.
- לחשב את המסה של 61 תיל אסטר חומצת -butyric פניל-C (PCBM) שיתווסף לפתרון המניות MEH-PPV לעשות פתרון PCBM 50% WT מסומם MEH-PPV, שבי PCBM 50% WT מוגדר ביחס למסה של MEH-PPV (כלומר, מחצית המסה של MEH-PPV). על ידי שימוש במשקל של MEH-PPV שהתקבל בסעיף 2.2.
- הכנה של ננו-חלקיקים בשיטת reprecipitation
- העברה 1 מיליליטר של פתרון MEH-PPV / PCBM מעורבב לתוך מזרק 1 מיליליטר עם המחט מחוברת אליו.
- מהירות להזריק 1 מיליליטר של פתרון MEH-PPV / PCBM התמזג 4 מיליליטר של המים DI ערבוב ב1,200 סל"ד. להפסיק ערבוב מייד לאחר הזרקה. השתמש בחלקיקים אלה ללא עיבוד נוסף.
3. דגירה של שורות תאים עם חלקיקי הדמיה
הערה: כל ניסויי ההדמיה הושלמו בצלחות פטרי 35 מ"מ
- ספיגה של nanopartiמלקקים בשורות תאים
- שורות תאי תרבות עד המעבר ה -12. בתאי 12 תרבות מעבר ה 35 מ"מ צלחות פטרי. התאם ריכוז של תאים נוספים ל35 מ"מ צלחות פטרי כך שלאחר 24 שעות התאים ומחוברות 40%.
- בשלב זה להסיר את המדיה DMEM בתוספת 10% FBS מצלחות פטרי, לשטוף את התאים עם 1x DPBS פעמיים, ולהוסיף את ההשעיה חלקיקי 100 μl לתוך 2 מיליליטר DMEM לצלחות פטרי.
- לאחר 24 שעות להסיר את DMEM / חלקיקי ההשעיה מצלחות פטרי ולשטוף את התאים עם 1x DPBS 3 פעמים. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי דוגרים עם paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. כתם התאים עם 300 ננומטר DAPI ידי דוגרים עם הצבע למשך 2 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. אז לשמור על התאים בDPBS להדמיה.
- איתור של ROS
- A549 תרבות ושורות תאי OVCAR3 בצלחות פטרי, 6 בכל שורת תא, כפי שמוסברים בסעיף 3.1.1. תוויתצלחות פטרי כפי שמוצגות בטבלה 1.
- להוסיף ההשעיה ננו-חלקיקי 100 μl לתוך 2 מיליליטר DMEM לשלוש צלחות פטרי כפי שמוצג בטבלת 1 ודגירה של 24 שעות. לצלחות פטרי שיקבלו מינוני אור, לשטוף את התאים לאחר 24 שעות ולהשעות את תאי HBSS (מאוזן מלח הפתרון של האנק) לצבוע תקשורת חופשית.
- לחמם את המנורה של סימולטור השמש במשך 15 דקות. מניחים מסנן UV מול המנורה לסנן אור UV. כייל את המנורה עם תאים סולריים התייחסות ידי התאמת כוח המנורה להשיג 0.5 שמש עוצמה (50 mW / 2 סנטימטר) על פני השטח של צלחת פטרי. בהתקנה מסוימת זה מצב שהושג עם 218 כוח W מסופק למנורה.
- מניחים את צלחות פטרי מתחת לפנס (המכסה הפתוח) במשך 60 דקות, מה שגורם במינון אור של 180 J / 2 סנטימטר כפי שמוצג בחישובים להלן:
50 mW / 2 סנטימטר x 3,600 שניות / 1000 = 180 J / 2 סנטימטר - הסר HBSS וללא שטיפה להוסיף עוד 2 מיליליטר תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS לצלחות פטרי. דגירה התאים לעוד 2 שעות.
- לביקורת החיובית דגירה התאים עם 100 מיקרומטר מי מימן (H 2 O 2) למשך 30 דקות.
- כתם התאים בכל צלחות פטרי עם ריכוז סופי של 5 מיקרומטר של מגיב גילוי ROS על ידי דוגרים התאים עם הצבע למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- תקן את התאים על ידי דוגרים עם paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. כתם התאים עם 300 ננומטר DAPI ידי דוגרים עם הצבע למשך 2 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. אז לשמור על התאים בDPBS להדמיה.
- אפופטוזיס ונמק על ידי הצרכן וAnnexin V FITC
- תרבות קו תא כל 5 צלחות פטרי. שלוש צלחות פטרי אלה יהיו לניסוי תוך 2 צלחות פטרי שנותרו תהיה דגימות בקרה. דגירה 3 צלחות פטרי לניסוי עם חלקיקים כדוארxplained בסעיף 3.1.2. דגימות הבקרה לא מודגרות עם חלקיקים.
- אחרי 24 שעות דגירה אחרי הצעד 3.2.3.
- מניחים את 3 צלחות פטרי ניסיוניות תחת המנורה (מכסה פתוח) ולהסיר אחת ב 20 דקות, אחד ב 40 דקות ואחד ב 60 דקות. זה מניב שלוש דגימות שנחשפו למינונים אור 60, 120 ו -180 J / 2 סנטימטר, בהתאמה (חישוב בסעיף 3.2.4). בשלב הבא, לנהל מינון 2 אור 180 J / סנטימטר לאחד צלחות פטרי שליטה. זה השליטה במינון האור מיושם בהעדר חלקיקים. אין ליישם מינון אור למדגם שליטה שנותר (לא חלקיקים ולא במינון אור מיושם).
- החלף את HBSS עם תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור על צלחות פטרי בחממה במשך 4 שעות.
- כתם התאים בניסוי וצלחות פטרי שליטה עם 20 μl של FITC V Annexin ידי דוגרים התאים עם הצבע במשך 15 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. כתם גאמות עם 300 DAPI ננומטר, כמו גם 300 PI ננומטר (יודיד propidium) על ידי דוגרים עם הצבעים למשך 2 דקות. לשטוף פעמיים עם DPBS. אז לשמור על התאים בDPBS להדמיה.
4. פנימי Cytotoxicity של חלקיקים
- ספירת תאים וculturing ב96-גם צלחות
- קציר התאים מתרבות צלוחיות על ידי הסרת תקשורת ושטיפת התאים פעמיים עם DPBS ואחרי דגירה של התאים עם טריפסין 0.05% למשך 10 דקות. הוסף 2 מיליליטר תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS לפתרון תא וכתוצאה מכך. מערבבים את הפתרון כראוי להפריד צבירי תאים לsinglets.
- קח של ההשעיה התא 100 μl ולהוסיף 900 DMEM תקשורת μl בתוספת 10% FBS. מערבבים היטב. מקום 10 μl של השעיה זו על hemocytometer. ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז של ההשעיה התא ב4.1.1 x 5 10 4 תאים / מיליליטר.
- קחו 5 96-גם צלחות שכותרתו 0 שעות, 24 שעותr, 48 שעות, 72 שעות ו -96 שעות. הוסף 50 μl של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר הפתרונות הסלולריים (TE 71 וA549) לתוך הבארות כפי שמוצג בטבלה 2, ובכך זריעת 2,500 תאים / היטב. לעשות את אותו הדבר להליך שורות תאי OVCAR3 ומד"א MB-231.
- לאחר 24 שעות לשטוף את הבארות עם 1x DPBS ולהוסיף 50 μl של הגדלת ריכוזים של חלקיקים לתוך הבארות כפי שמוצג בטבלה 2. הכינו ריכוזי ננו-חלקיקים שונים על ידי הוספת 20, 100, 180 וμl של ההשעיה ננו-חלקיקים מ2.4.2 לDMEM ל להשיג נפח סופי של 2 מיליליטר, אשר מניב ריכוזי ננו-חלקיקים של 0.4 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר, 2.0 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר, ו -3.6 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה. יש שורת תאים כל triplicates עבור כל ריכוז של חלקיקים.
- מדידת כדאיות התא בחושך
- הוסף 10 MTT μl לצלחת 0 שעה מייד לאחר הוספת חלקיקים. דגירה את הצלחת במשך 4 שעות לcryst formazanals ליצירת. להוסיף פתרון solubilization 50 μl לתוך הבארות. דגירה את הצלחת למשך 6 שעות לפזר גבישי formazan.
- מדוד את כדאיות התא של צלחת 0 שעות על ידי הקלטת הספיגה ב ננומטר 570 עם microplate קורא.
- במשך 24 שעות צלחת, לשטוף את התאים עם 1x DPBS ולהוסיף 50 תקשורת μl בכל דגירה גם אחרי 24 שעות עם חלקיקים. להוסיף MTT ולקרוא את הצלחת כפי שמוסברת ב4.2.1 ו4.2.2.
- במשך 48 שעות, 72 שעות, ו -96 שעות צלחות, לשטוף את התאים עם 1x DPBS ולהוסיף 50 תקשורת μl לתוך הבארות לאחר דגירה שעה 24 עם חלקיקים. דגירה התאים לתקופות הזמן שנותרו.
- 4.2.5) מדוד את כדאיות תא בנקודות הזמן מסוימות כפי שמוסבר ב4.2.1 ו4.2.2.
- חזור על הניסוי המלא במשך 3 פעמים (n = 3)
5. מדידת כדאיויות תא לאחר PDT
- ספירת תאים וculturing ב96-גם צלחות.
- תווית סט של 96-גם צלחות כפי שמוצג בטבלה 3, הן עבור TE 71 הצלחות + A549 וOVCAR3 + מד"א MB-231 צלחות. הפריסה של הצלחות תהיה זהה כפי שמוצגת ב4.1.3.
- זרע 96-גם הצלחות כמוסבר בסעיף 4.1 באותה הפריסה כפי שמוצג בטבלה 2 בסעיף 4.1.2.
- לאחר 24 שעות להוסיף חלקיקים לצלחות כפי שמוסבר ב4.1.4.
- 24 שעות לאחר תוספת של חלקיקים לשטוף את התאים עם 1x DPBS ולהוסיף 50 μl HBSS היטב כל אחד.
- מכשיר את הצלחות עם מנות האור המתאימות, כמוסבר ב3.2.3.
- החלף את HBSS עם 50 μl תקשורת DMEM בתוספת 10% FBS ודגירת הצלחות לתקופות הזמן המתאימים לאחר PDT.
- לאחר כל פרק זמן למדוד את כדאיות התא כפי שמוסבר ב4.2.1 ו4.2.2.
6. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
- ספיגה של חלקיקים
- הפעל את המנורות של מיקרוסקופND דקות לייזר 30 לפני ההדמיה. שים את צלחת פטרי המכילה את התאים הקבועים (כמוסבר בסעיף 3.1) על הבמה של מיקרוסקופ.
- לאסוף את הקרינה מחלקיקים וDAPI באמצעות מסננים כפי שמוצג בלוח 4. Overlay השלב לעומת זאת, ננו-חלקיקים ותמונות DAPI בתוכנת ImageJ.
- איתור של ROS
- הפעל את המנורות של דקות מיקרוסקופ 30 לפני ההדמיה. שים את צלחת פטרי המכילה תאים (כמוסבר בסעיף 3.2) על הבמה של מיקרוסקופ.
- לאסוף את הקרינה מחלקיקים, DAPI, וROS איתור מגיב באמצעות מסננים כפי שמוצג בלוח 4. Overlay ניגוד שלב, ננו-חלקיקים, DAPI ותמונות מגיב גילוי ROS בתוכנת ImageJ.
- אפופטוזיס ונמק על ידי הצרכן וAnnexin V FITC
- הפעל את המנורות של דקות מיקרוסקופ 30 לפני ההדמיה. שים את צלחת פטרי המכילה תאים (כמוסבר בסעיף 3.3) על הבמה של מיקרוסקופ.
- לאסוף את הקרינה מחלקיקים, DAPI, PI, וAnnexin V FITC באמצעות מסננים כפי שמוצג בלוח 4. Overlay ניגוד שלב, ננו-חלקיקים, DAPI, PI ותמונות Annexin V FITC בתוכנת ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ספיגה ורעילה פנימי של חלקיקים
חלקיקי MEH-PPV / PCBM מעורבב 50% WT הודגרו עם TE 71, מד"א MB-231, A549 ושורות תאי OVCAR3. רמת מיזוג PCBM נבחרה כPCBM% 50 WT, אשר הוכח לספק תכונות תשלום והעברת אנרגיה אידיאלית בין פולימרים ופולרנים 14 מצומדות. תמונות הקרינה של ספיגת ננו-חלקיקים מוצגות באיור 1. תאים הודגרו במשך 24 שעות עם חלקיקים על מנת להבטיח ספיגת ננו-חלקיקים. תאים אז תוקנו עם paraformaldehyde 4% לפני ההדמיה, ומוכתם עם DAPI כדי לזהות תאים ואת מיקומו של הגרעין. כדי תאים מופרדים מספיק תמונת confluency 40% נשמר. תמונות הקרינה עם תמונות בניגוד שלב מקביל להראות שיש ספיגה מועדפת של חלקיקים על ידי A549 ושורות תאי סרטן OVCAR3. אין הקרינה לזיהוי שניתן לראות בשליטת TE 71ושורות תאי סרטן מד"א MB-231, המצביע על ספיגה מוגבלת. מצד השני, שורות תאי סרטן A549 וOVCAR3 להפגין ספיגת ננו-חלקיקים משמעותיים. רעיל פנימי (רעילות כהה) הוערך על ידי דגירה של חלקיקי MEH-PPV / PCBM מעורבבים 50% WT עם TE 71, מד"א MB-231, A549 ושורות תאי OVCAR3 וכימותי כדאיות התא על ידי assay MTT. נתונים MTT באיור 1C להראות התפשטות נורמלית של שורות התאים.
חלקיקים כמקור של ROS
כדי להבטיח שהחלקיקים הם המקור של ROS, ורק לאחר חשיפה לאור, היווצרות ROS הוערכה עם ערכה מגיב גילוי ROS. נתונים לOVCAR3 מוצגים באיור 2 היעדרות של פליטה ירוקה באיור 2 א -. ג מציין ROS לא יצר עבור דגימות השליטה. פליטה ירוקה בהירה ממגיב גילוי ROS הוא ציין לדגימות שטופלו בננו-חלקיקים ונחשפהלאור כפי שמוצג ב2D דמויות ו- E (מייד לאחר PDT ושעה 2 לאחר PDT), המאשר כי ROS נוצרים במהלך PDT.
PDT
הביצועים של MEH-PPV / חלקיקי PCBM בPDT היה לכמת ידי assay MTT מייד לאחר PDT, ואחרי תקופות שלאחר דגירה-4 ו -12 שעות. הנתונים מוצגים באיור 3 לתקופה שלאחר הדגירה-4 שעות. קווי A549 והתאים סרטניים OVCAR3 תערוכה מוות של תאים משמעותיים לאחר טיפול PDT: עד 60% לA549 ו -100% עבור OVCAR-3. שליטת TE 71 ושורות תאי סרטן מד"א MB-231 להראות השפעות מוגבלות. TE71 הוא קו תא שליטה רגיל ולא צפוי להפנים חלקיקים. רק ספיגה שאינה ספציפית נמוכה של חלקיקים על ידי TE-71 נצפתה בניסוי. ספיגת ננו-חלקיקים נמוכים הוא ציין גם למד"א MB-231, שהוא במקרה זה בשל קצב חילוף חומרים נמוך יותר בהשוואה לשורות תאי סרטן האחרות. הנתונים מראה PDTשחלקיקי MEH-PPV / PCBM הם יעילים מאוד רגישות לPDT, וכי אפקטיבי PDT מאזניים עם ספיגת ננו-חלקיקים. ההבדלים בתוצאות בין PDT שורות תאי הסרטן נחשבות כאן הם בשל ההבדל בתוקפנות (חילוף חומרים ושיעור של אנדוציטוזה) בין שורות תאים אלה.
התקדמות של מוות של תאים הנגרם PDT
צביעה חי / מת כפולה עם PI וAnnexin V FITC מספקת מידע על מנגנוני נמקים ואפופטוטיים של מוות של תאים. ערכת צביעה זה הייתה מוחלת על תא קווים למדו כאן לאחר PDT כדי ללמוד עוד על מסלולי מוות של תאים הנגרמים PDT. איור 4 מראה epiluminescence תמונות של TE 71and OVCAR3 שורות תאים מוכתמות Annexin V FITC, PI וDAPI. הנתונים מראים כי אין השפעה של PDT על קו תא שליטת TE 71, עולה בקנה אחד עם הספיגה זניחה של חלקיקים. אותו התצפית נעשתה למד"א MB-231 (מידע לא מוצג). כאשר OVCAR3 עבר PDT ב -60 ו -120 J / 2 סנטימטר צביעה כפולה של PI (סגול) וAnnexin V FITC (ירוק) נצפה. ב 180 J / 2 סנטימטר בלבד כתם PI נצפה, המצביע על מוות של תאי נמקים חריפים בתנאי ש.
איור 1. ייצור () של חלקיקים בשיטת reprecipitation, (ב) TE 71, מד"א MB-231, קווי A549 ותא OVCAR3 מודגרות עם חלקיקים. חלקיקים מוצגים בצבע ירוק, הגרעין מוצג בצבע כחול. תמונות הקרינה הם כיסו עם התמונות בניגוד שלב, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר, רעיל פנימית של חלקיקים הוערכו על ידי מדידה עד 96 שעות כדאיות תא עבור כל קו תא (C). Viabilities התא לעומת מינון שליטה של חלקיקים (0 מ"ג / מיליליטר) על ידי קביעת הכדאיות של contrדגימות ol ב 100% (לא מוצג). ברים שגיאה הם סטיות תקן לתוצאות מניסויים נפרדים 3 (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. איתור של ROS בשורת תאי OVCAR3 עם ROS איתור מגיב. (א) לא חלקיקים, אין חשיפה לאור, (ב) אין חלקיקים, נחשפו 180 J / 2 סנטימטר אור, (ג) 2 x 10 מ"ג -4 / חלקיקי מיליליטר, אין חשיפה לאור, (ד) עם חלקיקים וחשיפה ל 180 J / 2 סנטימטר אור, נלקח מייד לאחר טיפול, (E) 2 שעות שלאחר PDT, (F) עם 100 μl H 2 O 2 שליטה חיובית. הפליטה הירוקה בהירה שבDF ים ממגיב גילוי ROS מאשרים היווצרות ROS. בר סולם = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. viabilities הסלולרי איור של TE 71, מד"א MB-231, שורות תאי A549, וOVCAR3 מנוהלות עם הגדלת מינון של חלקיקים וקרינה עם 120 J / 2 סנטימטר מינון אור. זמן הדגירה לאחר PDT הוא 4 שעות. מינוני ננו-חלקיקים באגדה הם ב-4 10 מ"ג / מיליליטר. ברים שגיאה הם סטיות תקן לתוצאות מניסויים נפרדים 3 (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
igure 4 "src =" / קבצים / ftp_upload / 53,038 / 53038fig4.jpg "/>
קווי איור 4. מכתים חי / מת של TE 71 וOVCAR3 תא עם FITC V Annexin ולצרכן. פליטה ירוקה מתאימה לAnnexin V FITC, פליטה סגולה מתאים לצרכן (אדום, מעורב עם פליטת DAPI כחולה), ופליטה כחולה מתאימה לDAPI כתם גרעיני. תמונות הכיסוי של ניגוד שלב ותמונות epiluminescence. בר סולם = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. התקנת סימולטור שמש לחשיפה של תאים עם אור מכויל. תאים סולריים התייחסות שימשו לכיול, מוצגים בהבלעת רישום 0.5 עוצמת אור שמש (50 mW / 2 סנטימטר)."Target =" _ /53038/53038fig5large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| בקרה שלילית | אין צירופים ו, אין אור | אין צירופים ו, עם אור | אין אור, עם צירופים ו |
| ביקורת חיובית | 100 μl H 2 O 2 (אין צירופים ו, אין אור) | --- | --- |
| ניסויי | 0 ההודעה PDT HR (NPS ואור) | 2 ההודעה PDT HR (NPS ואור) | --- |
טבלה 1: עיצוב ניסיוני לגילוי של ROS.
| צלחת 0 שעה | תקשורת | TE 71 | A549 | תקשורת | ||||||||
| אין טיפול | ||||||||||||
| 0 מ"ג / מיליליטר | ||||||||||||
| 0.4 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר | ||||||||||||
| 2.0 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר | ||||||||||||
| 3.6 x 10 -4 מ"ג / מיליליטר | ||||||||||||
טבלה 2: פריסה של הצלחת 96-היטב לדגירה של חלקיקים להעריך רעיל פנימית של חלקיקים / השפעת PDT
| פלייט לא. | מנה קלה (J / 2 סנטימטר) | ההודעה PDT זמן (שעות) |
| 1 | 60 | 0 |
| 2 | 60 | 4 |
| 3 | 60 | 12 |
| 4 | 120 | 0 |
| 5 | 120 | 4 |
| 6 | 120 | 12 |
| 7 | 180 | 0 |
| 8 | 180 | 4 |
| 9 | 180 | 12 |
טבלה 3: תיוג 96-גם הצלחות להערכת PDT.
| Fluorophore | מסנן עירור | מראה dichroic | מסנן פליטה | מיקרוסקופית | מקור עירור |
| ננו-חלקיקים | 488/10 | 500 LP | 510 LP | Confocal | לייזר יון Ar-Kr |
| DAPI | 350/52 | 405 LP | 450/20 | Epiluminescence | מנורת מרקורי |
| PI | 543/22 | 562 | 592/40 | Epiluminescence | מנורת מרקורי |
| Annexin V FITC | 483/30 | 505 LP | 535/40 | Epiluminescence | מנורת מרקורי |
| מגיב גילוי ROS | 491/10 | 510 DCLP | 525/50 | Epiluminescence | מנורת מרקורי |
לוח 4. תצורה מיקרוסקופית לניסויי הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להשיג ספיגת ננו-חלקיקים היה צורך לשמור על כמה צעדים קריטיים בזמן בודה חלקיקים. פתרון 10 -6 M MEH-PPV (מעורבב עם PCBM% 50 WT) בTHF היה מוכן להזריק לתוך המים DI, כפי שציין כי הריכוז של פתרון זה משחק תפקיד חשוב בקביעת הגודל של חלקיקים שנוצר. ריכוז נבדק על ידי ספקטרוסקופיה UV מול. שים לב כי בשלב פרוטוקול 2.1.3 היה צורך לדלל את פתרון MEH-PPV תחילה מוכן (פתרון מניות MEH-PPV חי) הראשון לפני נטילת UV מול ספקטרה מאז הפתרון הזה יש הספיגה גדולה בהרבה מ1. המהירות של הזרקה גם משחק תפקיד קריטי בקביעת הגודל של חלקיקים, וצריך להיות מהר ככל האפשר תוך ערבוב המים די במרץ. הזרקה איטית תגרום חלקיקים גדולים יותר. כמו כן, ערבוב יש להפסיק מייד לאחר הזרקה כדי למנוע צבירה נוספת. בעוד הזרקההפתרון במים יש צורך לשמור את המחט ליד המשטח הפנימי של הבקבוקון תוך שהוא מחדיר את המחט לחלוטין לפתרון, כדי למנוע היווצרות בועה, אשר תשפיע על הגודל של חלקיקים. בגדלים ננו-חלקיקי ניסויים שלנו הושגו היו 61.5 ± 23.3 ננומטר, כפי שנמדד על ידי DLS. DLS נבחר במקום TEM כפי שהוא מהיר, זול, אמין לגודל זה וזמין בקלות. פוטנציאל זטה בחלקיקים אלה נמצא -9.66 ± 8.12 mV, כלומר, מעט שלילי לתשלום פני השטח ניטראלי.
זה היה חיוני כדי לספור את התאים תוך הערכה רעילה הפנימית של חלקיקים ולכמת תוצאות PDT, כמו טכניקות אלה מבוססות על assay MTT המספק מדידת כמותית של כדאיות תא. זה חיוני כדי להתחיל את הניסוי עם אותו מספר התאים בכל טוב של צלחת 96-היטב, המאפשר להשוואה של כדאיות תא ביחס למינון של נאןoparticles והאור, כמו גם ניסויי השליטה.
סימולטור שמש היה בשימוש כדי להקרין את הדגימות. ההתקנה מוצגת באיור 5, והוא מורכב ממקור האור, מסנן UV, ותאים סולריים התייחסות. עם תכנית זו תאורה ברמה גבוהה של שליטה בנכסי הרפאים ועוצמת מקור האור יכול להיות מושגת, אשר הביאה תוצאות מאוד לשחזור. חשוב מאוד להבין שרוב מקורות אור לא מספקים פרופיל עוצמה אחיד. סימולטור השמש, לעומת זאת, יכול להיות מיושר כדי להשיג עוצמה אחידה קרובה באזור של תאורה. זה אומת על ידי תאים סולריים התייחסות באזורים שונים של האזור המואר. גם אנחנו טיפלנו תמיד למקם צלחות באותו האזור של נקודת האור ובאותו הכיוון כדי למזער השפעות של וריאציה נוספת בעוצמה. מקור האור כדי לטעום מרחק שצוין באיור 5 סיפק לנו 50 עםmW / 2 סנטימטר (0.5 שמש) של עוצמת תחת כוח מנורה חשמלי של 218 W. בניסויים אלה תקשורת חופשית צבע HBSS שימשה כדי למנוע ספיגה של אור על ידי צבעי מחוון. לאחר PDT, התאים הודגרו שוב לפרקי זמן מסוימים על 37 מעלות צלזיוס (דגירה לאחר PDT) כדי לבחון את ההתקדמות של PDT.
צביעת תאים נדרשת קצת ניסוי וטעייה כדי למצוא את הריכוז הנכון של הצבע המתאים. זו מושגת על ידי חזרה על הניסוי תוך הגדלת ריכוז הצבע בהתמדה עד התוצאות מתאימות הושגו.
השיטה יש גם כמה מגבלות, בנוגע למערכת ננו-חלקיקים וטיפול PDT במיוחד. מאז חלקיקים שהוכנו על ידי שיטת reprecipitation יש כמה השתנות בגודל ננו-חלקיקים המתקבלים מתצוו אצווה, וחלק polydispersity בגודל ננו-חלקיקים קיים שלא ניתן לשלוט. גם זה כבר לא אפשרי לעשות nanopart icles פחות מ -20 ננומטר בגודל. מגבלות אלה יכולים להיות אתגרים בפיתוח ננו-חלקיקים בגודל קטן monodisperse שניתן ליישם בvivo. יתר על כן, ניסוי PDT חוץ גופייה דורש תאים להיות מחוץ לחממה עבור כמות זמן ממושכת, שיכול להטיל כמה לחץ על התאים.
השיטה דנה בזאת לPDT היא משמעותית ביחס לגישות הנוכחיות. PDT באמצעות רגישות למולקולה קטנה וחלקיקים sensitizer מסוממים ראה יישום קליני מוגבל בשל בעיות משמעותיות עם רעילות אפלה של הרגישות ל, רגישות מטופל לאור (עקב החלוקה הלא סלקטיבי של sensitizer), והידרופוביות של הרגישות ל( מה שמוביל ל זמינות ביולוגית מופחת ורעילות אקוטית פוטנציאלית). בניתוח, גם אם הגידול הוסר מהגוף, כמה תאים סרטניים יישארו ויכולים לגרום למצב של הפוגה. ברקמות נורמליות הקרנות וכימותרפיה מושפעת גם.
ילדה = "jove_content"> לסיכום, יש לנו הראה כי הפוטוסנסיטייזר דור הבא המבוסס על ביצוע חלקיקי פולימר הוא עיצוב מבטיח עבור יישומי PDT בשל העדר רעילות כהה, דור ROS יעיל, הסלקטיביות סבירה של ספיגה, ויכולתו להשפיע על מוות של תאים בשפע. בעתיד הקרוב חלקיקים אלה יהיו שונה נוספים למיקוד של קולטני תא שטח על מנת להשיג ספיגה וסלקטיביות משופרות. פולימרים מוליכים המכילים אטומים כבדים או מרכזי מתכת ייחשבו כמו גם לשיעורי המעבר שלהם משופרים intersystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).
- Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).
- Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6 (3), 817-840 (2013).
- Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
- Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).
- Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).
- Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9 (4), 613-621 (2013).
- Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).
- Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).
- Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).
- Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).
- Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).
