Introduction
광 역학 요법 (PDT) 감광제는 조직을 대상으로 투여하고, 감광제를 노광시에 활성 산소 종 (ROS)를 생성한다. 이러한 중항 산소와 슈퍼 옥사이드 등의 활성 산소 종은 산화 스트레스 및 세포 및 조직 1-4 이후에 구조적 손상을 유도 할 수 있습니다. 때문에 응용 프로그램의 용이성이 방법을 적극적으로 조사되었으며, 임상 시험 장소 5,6를 촬영했다. 그러나, (감소 생체 이용률 및 잠재적 인 급성 독성에 이르게) 증감의 어두운 증감의 독성, 빛 (으로 인한 증감의 비 선택적 분포) 환자 감도 및 소수성과 같은 중요한 문제가 남아있다.
여기에서 우리는 제작과 시험관 PDT의 차세대 감광제로 풀러렌과 혼합 고분자 나노 입자를 실시하고 평가하는 방법을보고합니다. 나노 입자의자가 응집에 의해 형성된다반도체 성 중합체 MEH-PPV (폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌])이 물질에 용해 호환 플러렌 PCBM (C-61 페닐 - 부티르산 메틸 에스터)와 용매를 신속하게 호환되지 않는 용매 (그림 1A)에 주입된다. 호스트 중합체로서 MEH-PPV의 선택은 삼중 형성 높은 속도에 이르게 높은 흡광 계수에 의해 동기 및 플러렌 PCBM 7 효율적인 초고속 충전 및 에너지 전달을 모두한다. 이러한 속성은 단일 산소와 PDT의 과산화물 형성의 증감에 이상적입니다.
플러렌은 실제로 두 분자 및 나노 입자 형태로 8-13 PDT에 적용되어왔다. 그러나 심각한 독성은 추가 개발 (12) 방해했다. 여기에서 우리는 MEH-PPV의 호스트 매트릭스에 풀러렌을 캡슐화하는 PDT 증감 재료 복합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자의 결과를 얻을 것을 보여 그 전본질적으로 세포 독성이 아니다 인해 상기 광 물리 특성에 암 나노 입자의 크기 및 표면 전하에 의한 세포 및 낮은 조명 용량에서 수율이 매우 효과적인 PDT 치료 대한 특이성을 보여줍니다.
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Protocol
1. 배양 세포주
- 이하의 2 분 동안 온수에 냉각제 튜브를 보유함으로써 해동 TE 71 (마우스 흉선 상피 세포), MDA-MB-231 (인간 유방암 세포), A549 (인간 폐암 세포) 및 OVCAR3 (인간 난소 종양 세포) . 106 × g으로 6 분 동안 각각의 세포주를 원심 분리하고, 10 % FBS가 보충 된 10 mL의 DMEM 배지를 추가한다.
- 서스펜션을 기음과 펠렛에 3 ㎖ 미디어를 추가 할 수 있습니다. 적절 수회 피펫 팅하여 세포를 섞는다. 이 용액을 셀 T75 플라스크에 10 % FBS가 보충 된 DMEM 7 mL의 배지를 예열 사전에 추가하고, 37 ℃에서 95 % 공기 / 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 플라스크를 유지한다. 통로 0으로이 플라스크 레이블.
- 세포의 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 10 분 동안 0.05 % 트립신 이들을 배양하여 세포를 수확. 미디어의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 중성화. 원심 분리기 106 X g에서 6 분 동안이 솔루션입니다. 서스펜션을 제거하고 여기에 3 ㎖에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 아 믹스L 7 ml의 미디어를 포함하는 배양 플라스크에 소량 (100 μL)를 전송합니다. 인큐베이터에서 배양 플라스크를 품어. 항로 1과 플라스크 레이블.
- 통로 11 또는 12까지 문화 세포주.
나노 입자의 2 제작
- ~ 10 -6 M (조정) 희석 MEH-PPV 원액의 조제
- 바이알 1 ㎎ 분자량 폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌 비닐 렌] (MEH-PPV) (평균 Mn)는 150,000-250,000 g / 몰, 3 ml의 테트라 히드로 푸란 (THF)을 첨가 . 핫 플레이트상에서 80 ℃에서 가열하면서 2 시간 동안 교반한다.
- 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 새로운 바이알에 상기 용액을 필터. '희석 MEH-PPV 원액'으로이 솔루션을 레이블. 단계 2.1.3과 2.1.4에 설명 된대로이 솔루션은 농도의 미세 조정 후 나노 입자 준비에 참여한다.
- 3의 용액으로 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 50 μl를 추가. '희석 MEH-PPV 원액'으로이 솔루션을 레이블. 자외선 - 마주 분광에 의해 495 nm에서 흡광도를 1cm 석영 큐벳에 전송하고 측정한다.
- 희석 MEH-PPV 원액의 흡광도가 0.17보다 높은 경우, 한 번에 THF 1 mL를 첨가하여 희석 MEH-PPV 스톡 용액을 희석하고, 495 nm에서의 흡광도가 될 때까지 단계 2.1.3을 반복 0.13-0.17의 범위.
- 아래 그림과 같이 램버트 - 비어 법칙을 사용하여 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 몰 농도를 계산합니다. 여기에 0.15 흡광도 프로토콜의 나머지 예로서 사용된다 (예., 관측 흡광도 모든 다음 계산을 조정), 사용 MEH-PPV의 흡광 계수가 107 M -1 cm 사용 경로 길이가 -1이다 1cm.
= ε xbxc (는 식 1)
(ε - 몰 흡광 계수, A - 흡광도, B - 경로 길이, C - 용액의 농도)
0.15 = 10 7 M -1 cm -1 X 1cm의 XC (는 식 2)
C = 1.5 × 10 -8 M (는 식 3)
다음과 같이 희석 MEH-PPV 원액의 농도를 찾기 위해 상기 농도를 사용
M 1 V 1 = M 2 V 2 (는 식 4)
0.15 × 10-7 M X 3050 μL = M 2 × 50 μL (는 식 5)
M 2 = 9.15 × 10 -7 M (는 식 6)
이것은 '조정 희석 MEH-PPV 원액'의 농도이다.
- 조정 희석 MEH-PPV 원액에 MEH-PPV의 질량을 계산
- 섹션 2.1.4에서 얻어진 몰 농도 10 6g / 몰이다 MEH-PPV의 분자량 (M w)를 사용하여 다음과 같이 조정 원액 원액 1 ml의 MEH-PPV의 질량을 계산한다.
M = N / V (N -. 더 몰, V - L의 볼륨 ()는 식 7)
따라서, 1 ㎖ 중의 MEH-PPV의 질량의 조절 싶게iluted 원액 9.15 X 10-4 g이다.
- 섹션 2.1.4에서 얻어진 몰 농도 10 6g / 몰이다 MEH-PPV의 분자량 (M w)를 사용하여 다음과 같이 조정 원액 원액 1 ml의 MEH-PPV의 질량을 계산한다.
- MEH-PPV의 혼합 PCBM
- 페닐 C 61 - 뷰티 르산 메틸 에스터 (PCBM)의 질량을 계산하는 것은 50 중량 % PCBM은 질량에 대해 정의 된 50 중량 % PCBM 도핑 MEH-PPV 용액을 만들기 위해 콘텐츠 MEH-PPV 용액에 첨가되는 MEH-PPV의 (즉, MEH-PPV의 절반 질량). 2.2 절에서 얻은 MEH-PPV의 무게를 사용하여.
MEH-PPV × 100 % = 50 중량 % PCBM의 PCBM / 9.15 × 10 -4 G의 질량 (는 식 8)
PCBM = 4.57 × 10 -4 G의 질량 (는 식 9) - 유리 병에 1 mg을 PCBM의 무게를 500 μL의 THF를 추가합니다. 910.88 g / 몰로서 PCBM의 분자량을 사용하여이 용액에 PCBM의 농도를 계산할
PCBM 솔루션 = 0.001 g / (910.88 g / 몰 * 500 μL)의 몰 농도 (는 식 10)
PCBM 용액의 몰 농도 = 2.19 × 10 -9 몰 / μL (는 식 (11)) - PCBM 용액의 부피를 계산하는 조정에 추가 할 필요 ME를 희석하지H-PPV 스톡 용액을 단계 2.3.2에서 산출 몰 농도를 사용하여 THF의 50 중량 % 도핑 PCBM MEH-PPV 용액을 얻었다
4.57 X PCBM X 1 몰 / 910.88 GX 1 μL / 2.19 × 10 -9 몰 = 229 μL의 10 -4 G (는 식 (12))
조정 희석 MEH-PPV 원액 1 ㎖로 PCBM 용액 229 μl를 넣고 잘 섞는다.
- 페닐 C 61 - 뷰티 르산 메틸 에스터 (PCBM)의 질량을 계산하는 것은 50 중량 % PCBM은 질량에 대해 정의 된 50 중량 % PCBM 도핑 MEH-PPV 용액을 만들기 위해 콘텐츠 MEH-PPV 용액에 첨가되는 MEH-PPV의 (즉, MEH-PPV의 절반 질량). 2.2 절에서 얻은 MEH-PPV의 무게를 사용하여.
- 재 침전 방법에 의한 나노 입자의 제조
- 전송에 연결된 바늘로 1 ML의 주사기에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1ml를.
- 급속 1,200 rpm으로 교반 DI 물 4 ㎖ 중에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1 ㎖을 주입. 주사 후 즉시 교반 중지합니다. 추가 처리없이 이러한 나노 입자를 사용합니다.
이미징을위한 나노 입자와 세포 라인의 3 배양
참고 : 모든 영상 실험은 35mm 페트리 접시에 완성되었다
- nanoparti의 통풍 관세포주에서 사이클 사용
- 12 번째 통로까지 배양 세포주. 35mm 배양 접시에서 12 일 통과 배양 세포에서. 24 시간 후 세포가 40 %의 합류이되도록 35mm 배양 접시에 추가 세포의 농도를 조정합니다.
- 이 단계에서, 배양 접시에서 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 미디어를 제거 두 번 1X DPBS로 세포를 씻어하고 페트리 접시에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다.
- 24 시간 후 배양 접시에서 DMEM / 나노 입자 현탁액을 제거하고 1X DPBS 3 회와 세포를 씻으십시오. 그런 다음 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다.
- ROS의 탐지
- 문화 A549 및 섹션 3.1.1에 설명 된대로 페트리 접시, 세포주 당 6에서 OVCAR3 세포 라인. 레이블페트리 접시는 표 1에 도시.
- 표 1과 24 시간 동안 배양으로 배양 접시의 세에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다. 빛 복용량을받을 24 시간 후 세포를 씻어 HBSS (행크의 균형 소금 용액)의 셀을 중단 무료 미디어를 염색 할 배양 접시하십시오.
- 15 분의 솔라 시뮬레이터의 램프를 따뜻하게. 자외선을 걸러 램프의 전면에 UV 필터를 놓습니다. 페트리 접시의 표면에서 0.5 일 (50 mW의 / cm 2)의 강도를 얻기 램프 전력을 조정함으로써 기준 태양 전지와 램프를 보정. 이 특정 설정에서 해당 조건 램프에 공급되는 218 W의 전력을 얻을 수 있었다.
- 180 J 아래의 계산과 같이 / ㎠의 빛 복용량 결과 60 분 동안 램프 (뚜껑 오픈)에서 배양 접시를 놓고 :
50 mW의 / cm 2 × 3,600 초 / 1,000 = 180 J / ㎠ - HBSS를 제거하고 세척하지 않고 더 배양 접시에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 또 다른 2 시간 동안 세포를 배양한다.
- 양성 대조군을 30 분 동안 100 μM 과산화수소 (H 2 O 2)와 함께 세포를 배양한다.
- 37 ° C에서 30 분 동안 염색을 가진 세포를 배양하여 ROS 검출 시약 5 μM의 최종 농도로 모든 배양 접시에 세포를 염색.
- 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다.
- PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사
- 문화 5 페트리 접시에 각각의 세포주. 나머지 2 페트리 접시 제어 샘플 될 것이지만이 배양 접시의 세 가지 실험이 될 것입니다. 전자와 같은 나노 입자 실험 3 페트리 접시를 품어섹션 3.1.2에 xplained. 제어 샘플을 나노 입자로 배양되지 않습니다.
- 24 시간 배양 후 단계 3.2.3을 따르십시오.
- 램프 (뚜껑 오픈)에서 3 실험 배양 접시를 놓고 20 분, 40 분에 한 60 분에서 하나에 하나를 제거합니다. 이 60, 120, 180의 가벼운 용량 J / ㎠, 각각 (섹션 3.2.4에서 계산)에 노출 된 세 개의 샘플을 얻을 수 있습니다. 다음에, 제어 배양 접시 중 하나에 180 J / cm 2 광 투여를 관리. 이는 나노 입자의 부재 하에서인가 광 복용량 제어이다. 빛 나머지 제어 샘플 용량 (NO 나노 입자 및 적용 등 없음 용량)를 적용하지 마십시오.
- 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 4 시간 동안 인큐베이터에서 배양 접시를 유지한다.
- 15 분 동안 염색하여 세포를 배양하여 실험 및 아 넥신 V의 FITC 20 μL와 제어 배양 접시에 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. C를 얼룩2 분 동안 염료로 배양 300 나노 DAPI뿐만 아니라 300 나노 PI (요오드화 프로피 듐)와 ELL 학생. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다.
나노 입자 4. 내장 세포 독성
- 96 웰 플레이트에 세포 배양을 계산
- 미디어를 제거하고 10 분 동안 0.05 % 트립신으로 세포를 인큐베이션 DPBS로 두 번 세포를 세척하여 배양 플라스크로부터 세포를 수확. 그 결과 세포 용액에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가합니다. 단봉으로 세포 클러스터를 분리하는 제대로 솔루션을 섞는다.
- 세포 현탁액 100 ㎕을 취하여 10 % FBS가 보충 된 900 ㎕의 DMEM 배지에 추가. 잘 섞는다. 혈구에이 서스펜션의 10 μl를 놓습니다. 혈구를 사용하여 세포를 세어 4.1.1 4 × 10 5 세포 / ml의 세포 현탁액의 농도를 조절한다.
- 5 96 웰 플레이트는 0 시간, 24 시간으로 표시 가지고 가십시오R, 48 시간, 72 시간, 96 시간. 따라서 / 웰의 세포를 파종 2500, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 5 × 104 세포 / ㎖의 세포 용액 50 ㎕의 TE (71, A549)를 추가한다. OVCAR3 및 MDA-MB-231 세포주에 대해 동일한 절차를 수행합니다.
- 24 시간 후 1X DPBS 가진 웰을 세척하고, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 나노 입자의 농도가 증가하는 50 μL를 추가한다., 20 (100)를 추가하여 다양한 나노 입자의 농도를 준비하고, DMEM 2.4.2로부터의 나노 입자 현탁액을 180 μL에 각각 최종 0.4 × 10-4 ㎎ / ㎖ 농도의 나노 입자를 얻을 수 2 ㎖의 부피, 2.0 × 10 -4 ㎎ / ㎖, 3.6 X 10-4 ㎎ / ㎖를 얻었다. 각 셀 라인은 나노 입자의 각 농도 삼중있다.
- 어둠 속에서 세포 생존 능력을 측정
- 바로 나노 입자를 추가 한 후 0 시간 플레이트에 10 μL의 MTT를 추가합니다. 포르 마잔 크리스 í 4 시간 동안 접시를 품어루게릭 병은 형성한다. 우물에 50 μL의 가용화 솔루션을 추가합니다. 포르 마잔 결정을 용해 6 시간 동안 접시를 품어.
- 마이크로 플레이트 리더와 570 nm에서 흡광도를 기록하여 0 시간 플레이트의 세포 생존율을 측정한다.
- 24 시간 플레이트를 들어, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 각 웰 후 24 시간 배양에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. MTT를 추가하고 4.2.1과 4.2.2에서 설명 판을 읽어 보시기 바랍니다.
- 48 시간, 72 시간, 96 시간 플레이트, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 24 시간 배양 한 후 우물에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. 남은 시간 동안 세포를 품어.
- 4.2.1 4.2.2 4.2.5에서 설명 된 바와 같이) 특정 시점에서 세포 생존 능력을 측정한다.
- (N = 3) 3 회 반복 실험을 완료
5. PDT 후 세포 생존 능력을 측정
- 세포를 계산하고 96 웰 플레이트에서 배양.
- 9 세트 레이블TE A549 71 + 판 OVCAR3 + 및 MDA-MB-231 플레이트 모두 표 3에 나타낸 바와 같이 6 웰 플레이트. 4.1.3에 도시 된 바와 같이 판의 배치는 동일하다.
- 섹션 4.1.2에서 표 2에 나타낸 바와 같이 동일한 레이아웃 4.1 절에서 설명한 바와 같이 96 웰 플레이트 종자.
- 24 시간이 판에 나노 입자를 추가 한 후 4.1.4에 설명 된대로.
- 나노 입자의 첨가 한 후 24 시간이 1X DPBS로 세포를 씻어 각 웰에 50 μl의 HBSS를 추가합니다.
- 3.2.3에서 설명한 바와 같이 각각의 빛의 용량을 가진 판을 조사.
- 10 % FBS가 첨가 된 50 μL DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 PDT 후 각각의 기간에 대한 번호판을 품어.
- 4.2.1과 4.2.2에서 설명한 바와 같이 각각의 시간 후 세포 생존율을 측정한다.
6. 형광 현미경
- 나노 입자의 통풍 관
- 현미경의 램프를 켜십시오차 영상 전에 레이저 30 분. 현미경의 무대에 (3.1 절에서 설명) 고정 된 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어.
- . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자 및 DAPI에서 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자 및 DAPI 이미지를 오버레이.
- ROS의 탐지
- 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 현미경의 무대에 (3.2 절에서 설명) 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어.
- . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자를 검출 시약, DAPI 및 형광 ROS로부터 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, 및 DAPI ROS 검출 시약 이미지를 오버레이.
- PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사
- 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 에서 설명한 바와 같이 (세포를 포함하는 페트리 접시를 넣어현미경의 무대에 3.3 절).
- . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V에서 FITC 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V FITC 이미지를 오버레이.
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Representative Results
통풍 및 나노 입자의 고유 세포 독성
50 중량 % 혼합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자 TE (71)와 함께 배양하고, MDA-MB-231, A549 및 OVCAR3 세포주. PCBM 혼합 수준은 공액 폴리머 및 풀러렌 (14) 사이의 최적의 충전 및 에너지 전달 특성을 제공하는 것으로 나타났다 50 중량 % PCBM로서 선택되었다. 나노 입자의 흡수 형광 이미지는도 1b에 도시되어있다. 나노 입자는 세포 흡수를 보장하기 위해 나노 입자로 24 시간 동안 배양 하였다. 세포를 촬상 전에 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고, 세포 및 핵의 위치를 검출하기 위해 DAPI로 염색 하였다. 화상 충분히 분리하기 위해 세포 40 % 컨 플루 유지 하였다. 해당 위상차 이미지 형광 이미지 A549 및 OVCAR3 암 세포주에 의한 나노 입자의 우선적 인 흡수가 있다는 것을 보여준다. 검출 가능한 형광 TE (71) 제어에서 볼 수 없습니다및 MDA-MB-231 암세포 제한 흡수를 나타낸다. 한편, A549 및 OVCAR3 암세포 상당한 나노 입자의 흡수를 나타낸다. 극한 독성 (어두운 독성) TE 71 50 중량 % 혼합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자의 배양에 의해 평가 하였다, MDA-MB-231, A549 및 OVCAR3 세포주 및 MTT 분석으로 세포 생존율을 정량화. 도 1C에서 MTT 데이터 세포주 정상 증식을 나타낸다.
활성 산소의 소스로 나노 입자
나노 입자는 활성 산소의 원인, 그리고 유일한 빛에 노출 된 후, ROS 형성이 활성 산소 검출 시약 키트로 평가되었는지 확인합니다. . OVCAR3 데이터는도 2a에 녹색 발광의 결핍도 2에 도시된다 - C는 대조 시료에 대해 형성되지 ROS를 나타낸다. ROS 검출 시약에서 밝은 녹색 발광 나노 입자로 처리 된 샘플에 대해 관찰 노출됨도 2D와 E (즉시 PDT 후 PDT 후 2 시간)과 같이 빛을, ROS는 PDT 중에 생성되는 것을 확인.
PDT
MEH-PPV의 성능은 / PDT에 PCBM 나노 입자는 바로 PDT 후 MTT 분석에 의해 정량화 한 후 4, 12 시간 후 배양 기간되었다. 데이터는 4 시간 후 배양 기간 동안도 3에 도시되어있다. A549 및 OVCAR3 암 세포주는 PDT 처리 후에 현저한 세포 사멸을 나타내지 : A549, 60 %에서 100 %까지를 OVCAR-3. TE (71) 제어 및 MDA-MB-231 암세포가 제한된 효과를 나타낸다. TE71은 정상 세포 라인과 나노 입자를 내면화 할 것으로 예상되지 않는다. TE-71에 의한 나노 입자의 단지 낮은 비특이적 흡수는 실험적으로 관찰된다. 나노 입자의 낮은 흡수도 인하여 다른 암세포에 비해 더 낮은 대사율이 경우에 MDA-MB-231에 대해 관찰된다. PDT 데이터가 나타난다MEH-PPV / PCBM 나노 입자는 PDT의 효과는 나노 입자의 흡수로 확장 PDT 증감, 그리고 매우 효과적인 것을. 여기서 고려 암세포 PDT 결과 사이의 차이는 이러한 세포주 공격성 사이의 차이 (대사 및 세포 내 이입의 비율)에 기인한다.
PDT에 의한 세포 사멸의 진행
PI와 넥신 V FITC와 라이브 / 죽은 이중 염색은 세포 사멸의 괴사와 세포 사멸 메커니즘에 대한 정보를 제공합니다. 이 염색 방식이 라인은 PDT에 의한 세포 사멸 경로에 대한 자세한 내용 PDT 후 여기에 연구 셀에 적용했다. 4는이 넥신 V FITC, PI 및 DAPI로 염색 TE 71and OVCAR3 세포 라인의 이미지를 epiluminescence 그림. 데이터는 나노 입자의 흡수를 무시할 수있는 일관된 제어 TE 71 세포주 PDT에 전혀 효과가없는 것으로 나타났다. 동일한 관찰 (데이타 미기재) MDA-MB-231에 대해 이루어졌다. 때 OVCAR3는 60 PDT를 시행 한 120 J / ㎠ (보라색), PI 및 넥신 V FITC (녹색) 2 듀얼 염색이 관찰되었다. 180에서 J / cm 2 만 PI 염색 조건은 급성 괴사 성 세포 사멸을 시사 관찰되었다.
도 재 침전 방법에 의한 나노 입자의 1 (A)의 제작, (B) TE 71 MDA-MB-231, A549 및 OVCAR3 세포 라인은 나노 입자와 함께 배양 하였다. 나노 입자가 녹색으로 표시됩니다, 핵은 파란색으로 표시됩니다. 형광 이미지는 위상차 이미지를 스케일 바 = 20 ㎛의 (C) 96 시간까지의 각 세포주에 대한 세포 생존율을 측정함으로써 평가하는 나노 입자의 세포 독성을 극한 겹쳐. 세포 생존율은 제어 방식의 생존 능력을 설정하여 나노 입자의 제어 도즈 (0 ㎎ / ㎖)과 비교된다100 % 올 샘플 (미도시). 오차 막대는 3 별도의 실험 결과에 대한 표준 편차이다 (N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ROS는 시약을 검출와 OVCAR3 세포주에서 ROS 2. 탐지 그림. 나노 입자 노출에와 (A) 180 J / ㎠ 빛에 노출없는 나노 입자, 아니 빛 노출, (B)없는 나노 입자, (C) 2 × 10-4 ㎎ / ㎖ 나노 입자, 아니 빛 노출, (D) 즉시 치료 후 촬영 180 J / ㎠ 빛, (E) 100 μL의 H 2 O 2와 양성 대조군으로 2 시간 후 PDT, (F). DF의 난에 밝은 녹색 방출 활성 산소의 형성을 확인하는 활성 산소 검출 시약에서의. 스케일 바 = 30 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TE (71)의 그림 3. 세포 생존율, MDA-MB-231, 나노 입자의 용량 증가와 함께 관리 120 J / ㎠ 빛 복용량. 후 PDT의 배양 시간이 4 시간 인 조사 A549 및 OVCAR3 세포 라인. 전설의 나노 입자 량은 10-4 ㎎ / ㎖에 있습니다. 오차 막대는 3 별도의 실험 결과에 대한 표준 편차이다 (N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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아 넥신 V의 FITC와 PI 그림 4. TE 71 OVCAR3의 라이브 / 죽은 얼룩 세포 라인. 녹색 방출 넥신 V FITC에 해당 보라색 방출 PI (빨강, 파랑 DAPI 방출 혼합)에 해당하고, 청색 발광 DAPI에 해당 핵 얼룩. 이미지를 위상 콘트라스트 및 epiluminescence 이미지 오버레이이다. 스케일 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 교정 빛 세포의 노출 5. 태양 광 시뮬레이터 설치. 기준 태양 전지 0.5 태양 빛의 강도 (50 mW의 / ㎠)를 등록 삽입에 표시, 교정을 위해 사용되었다./53038/53038fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 음성 대조군 | 어떤 NP에, 아니 빛 | 어떤 NP에 없습니다, 빛 | NP에와 등 없음, |
| 긍정적 인 제어 | 100 μL H 2 O 2 (없음 NP에, 없음) | --- | --- |
| 실험 | 0 시간 게시물 PDT NPS (빛) | 2 시간 게시물 PDT NPS (빛) | --- |
표 1 : ROS의 검출을위한 실험 설계.
| 0 시간 판 | 미디어 | TE (71) | A549 | 미디어 | ||||||||
| 어떤 치료하지 | ||||||||||||
| 0 ㎎ / ㎖ | ||||||||||||
| 0.4 × 10-4 ㎎ / ㎖ | ||||||||||||
| 2.0 X 10-4 ㎎ / ㎖ | ||||||||||||
| 3.6 × 10 -4 ㎎ / ㎖ | ||||||||||||
표 2 : 나노 입자의 배양을위한 96 웰 플레이트의 레이아웃 나노 입자의 고유 세포 독성을 평가하기 / PDT 효과
| 더 플레이트. | 가벼운 용량 (J / ㎠) | 포스트 PDT 시간 (시간) |
| 1 | (60) | 0 |
| (2) | (60) | 4 |
| 3 | (60) | (12) |
| 4 | (120) | 0 |
| (5) | (120) | 4 |
| (6) | (120) | (12) |
| 7 | (180) | 0 |
| 8 | (180) | 4 |
| 9 | (180) | (12) |
표 3 : PDT 평가를 위해 96 웰 플레이트에 라벨.
| 형광 | 여기 필터 | 다이크로 익 미러 | 배출 필터 | 현미경 사용 | 여기 원 |
| 나노 입자 | 10분의 488 | 500 LP | (510) LP | 공 초점 | AR-의 Kr 이온 레이저 |
| DAPI | 52분의 350 | (405) LP | 20분의 450 | Epiluminescence | 수은 램프 |
| PI | 22분의 543 | (562) | 40분의 592 | Epiluminescence | 수은 램프 |
| 넥신 V FITC | 30분의 483 | (505) LP | 40분의 535 | Epiluminescence | 수은 램프 |
| ROS 검출 시약 | 10분의 491 | 510 DCLP | 50분의 525 | Epiluminescence | 수은 램프 |
이미징 실험 표 4. 현미경 구성.
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Discussion
나노 입자를 제조하는 동안 나노 입자의 흡수를 달성하기 위해 그것은 몇 가지 중요한 조치를 유지하기 위해 필요한이었다. 이 용액의 농도가 형성되는 나노 입자의 크기를 결정하는데 중요한 역할을하는 것으로 관찰되었다로 THF에 (50 중량 % PCBM 혼합) × 10-6 M MEH-PPV 용액을 DI 물 내로 주입하도록 준비 하였다. 농도는 자외선 - 마주 분광에 의해 확인되었다. 프로토콜 단계에서 그 처음이 솔루션 때문에 자외선 - 마주 스펙트럼을 복용하기 전에 초기에 준비 MEH-PPV 용액 (원액 MEH-PPV 원액)을 희석 할 필요가 있었다 2.1.3 참고 1. 주입의 속도보다 훨씬 더 흡광도를 가지고 또한, 나노 입자의 크기를 결정하는데 중요한 역할을하고, 격렬히 DI 물을 교반하면서 가능한 한 빨리한다. 천천히 주입은 더 큰 나노 입자가 발생합니다. 또한, 교반을 추가로 응집을 방지하기 위해 주입 후 즉시 중단되어야한다. 주입하는 동안용액을 물에 나노 입자의 크기에 영향을 미칠 것이다 기포 형성을 방지하기 위해 용액에 완전히 니들을 삽입 할 때 바이 얼의 내측 표면 근처에 바늘을 유지하는 것이 필요하다. 얻어진 실험 나노 크기의 DLS에 의해 측정되는 ± 61.5 내지 23.3이었다. DLS는이 저렴하고, 빠른이 크기에 대한 안정적이고 쉽게 사용할 수 있습니다로 대신 TEM의 선택되었다. 이러한 나노 입자의 제타 전위는 즉 -9.66 ± 8.12 MV, 중성 표면 전하에 약간 부정적인 것으로 밝혀졌다.
이러한 기술은 세포 생존 능력의 정량적 측정을 제공 MTT 분석에 기초로는, 나노 입자의 고유 독성을 평가하는 동안 세포를 세고 PDT 결과를 수치화하는 것이 필수적이었다. 그것은 유모의 용량에 대하여 세포 생존율의 비교를 허용 96- 웰 플레이트의 각 웰에 동일한 수의 셀을 가진 실험을 시작하기 위해 필수적oparticles 빛뿐만 아니라 대조 실험.
솔라 시뮬레이터가 샘플을 조사하는데 사용되었다. 셋업은도 5에 도시 한 광원, UV 필터, 및 기준 태양 전지로 구성된다. 고도로 재현 가능한 결과 결과 분광 특성의 제어 및 광원의 강도의 높은 수준을 달성 할 수있는이 조명 방식과. 그것은 대부분의 광원은 일정한 세기 프로파일을 제공하지 않는다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 솔라 시뮬레이터 그러나, 조명의 균일 영역에 가까운 강도를 달성하기 위해 정렬 될 수있다. 이것은 조명 영역의 다른 지역에 참조 태양 전지에 의해 확인되었다. 우리는 또한 항상 더 강도의 변화의 영향을 최소화하기 위해 광 스폿의 같은 지역에서 같은 방향으로 판을 배치 처리했다. 광원은 그림 5에 표시된 거리를 샘플링하는 것은 50을 우리에게 제공HBSS 염료 무료 미디어가 표시 염료가 빛의 흡수를 방지하기 위해 사용 하였다 실험의 경우 218 (W)의 전기 램프 전력에서 강도 mW의 / ㎠ (0.5 일). PDT 후에, 세포를 다시 PDT의 진행을 관찰하기 위해 37 ° C (POST-PDT 배양)에서 일정 시간 동안 배양 하였다.
세포의 염색는 각각의 염료의 정확한 농도를 찾기 위해 몇 가지 시행 착오가 필요했다. 이는 적절한 결과가 달성 될 때까지 지속적으로 염료 농도를 증가시키면서 실험을 반복함으로써 달성된다.
또한,이 방법은 특히 나노 입자 시스템 및 PDT 치료에 대해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 나노 입자는 재 침전 방법에 의해 제조되기 때문에,이 생산 로트로 얻어진 나노 입자의 크기에 약간의 변화가 있으며, 나노 입자의 크기에 약간의 분산은 제어가 불가능 존재한다. 또한 nanopart을 만드는 것이 가능하지 않았다크기가 20nm 이하를 icles. 이러한 제한은, 생체 내에서 적용 할 수있는 작은 크기의 단 분산 나노 입자의 개발에 어려움이 될 수있다. 또한, 체외 PDT 실험 세포에 일부 스트레스를 부과 할 수 장시간 양 동안 인큐베이터 외부로 세포를 필요로한다.
PDT 위해 본원에서 논의 된 방법은 현재의 방법과 관련하여 중요하다. 작은 분자 증감 및 증감 도핑 된 나노 입자를 사용하여 PDT 인해 리드 증감의 어두운 증감의 독성, 빛 환자 감도 (때문에 증감의 비 선택적 분포)과 소수성 (와 중요한 문제에 국한 임상 응용 프로그램을 볼 수있다 감소 생체 이용률 및 잠재적 급성 독성). 수술, 종양이 신체로부터 제거되는 경우에도, 약간의 암세포가 남아 사함 초래할 수있다. 방사선 치료와 화학 요법 정상 조직에도 영향을 받는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | >99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1x 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
References
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