Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Karma Polimer / Fulleren Nanopartikül photosensitizers Şefliği ile Fotodinamik Tedavi

doi: 10.3791/53038 Published: October 28, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotodinamik Terapi (PDT) photosensitizers hedef dokuya uygulanır ve foto ışığa maruz kaldığında reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşturur. Böyle tekli oksijen ve süperoksit olarak ROS türleri oksidatif stres, hücre ve dokuların 1-4 sonraki yapısal hasara neden olabilir. Nedeniyle uygulama kolaylığı için bu yöntem etkin incelenmiş ve klinik çalışmalar yer 5,6 almış. Bununla birlikte, bu (azalmış biyolojik ve potansiyel akut toksisite yol açar) hassaslaştırıcı karanlık hassaslaştırıcıların toksisitesi, gün ışığına (nedeniyle hassasiyetini seçici olmayan dağılıma), hastanın duyarlılığı ve hidrofobiklik kadar önemli sorunlar devam ediyor.

Burada fabrikasyon ve in-vitro PDT için yeni nesil ışığa olarak fullerenin ile harmanlanmış polimer nanopartiküller yapma değerlendirilmesi bir yöntem sunduk. Nanopartiküllerin kendiliğinden agregasyon oluşturulmaktadıriletken polimerin MEH-PPV (poli [2-metoksi-5- (2-etilheksiloksi) -1,4-fenilenvinilen]) bu malzemelerin uyumlu içinde çözüldü fulleren PCBM (fenil-Cı-61 -bütirik asit metil ester) ile Çözücü hızlı olmayan bir uygun bir solvent (Şekil 1A) içine enjekte edilir. Ev sahibi polimer olarak MEH-PPV seçimi üçlü oluşumu yüksek oranda neden yüksek sönme katsayısı ile motive ve fulleren PCBM 7 verimli ve ultra hızlı şarj ve enerji transferi hem edilir. Bu özellikler tekli oksijen ve FDT süperoksit oluşumunun duyarlılık için idealdir.

Fulleren aslında hem moleküler ve nanoparçacık formunda 8-13 yılında PDT uygulanmıştır. Ancak, şiddetli sitotoksisite daha da geliştirilmesi 12 engelliyordu. Burada MEH-PPV bir dizi matrisi içinde fulleren kapsülleme bir PDT hassaslaştırıcı malzemesi kompozit MEH-PPV / PCBM nanopartiküller sonuçlar bu gösteriyor ki iözünde sitotoksik değil nedeniyle yukarıda belirtilen Fotofiziksel özelliklerine kanser nanoparçacık büyüklüğüne ve yüzey yükü nedeniyle hücreler ve düşük ışık dozlarda verimleri oldukça etkili PDT tedavisi doğru özgüllük gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kültürleme Hücre Soyları

  1. En az 2 dakika süreyle sıcak su içinde soğutucu şişeleri tutarak çözülme TE 71 (fare timik epitelial hücreler), MDA-MB-231 (insan meme kanseri hücreleri), A549 (insan akciğer kanseri hücreleri) ve OVCAR3 (insan yumurtalık tümörü hücreleri) . 106 x g'de 6 dakika boyunca, her bir hücre hattı ve santrifüj uygulanıp% 10 FBS ile takviye edilmiş 10 ml DMEM ortamı.
  2. Süspansiyon aspire ve pelet 3ml medya ekleyebilirsiniz. Düzgün bir kaç kez pipetleme hücreleri karıştırın. Bu hücre çözeltisi T75 balonlarına içinde% 10 FBS ile takviye 7 mi DMEM ortamı ısıtılmış ön ekleyin ve 37 ° C'de% 95 hava /% 5 CO2 nemli bir atmosferde şişeler tutun. Passage 0 olarak bu şişeyi etiketleyin.
  3. Hücrelerin hücre birleşmesi% 80 ulaştığında, 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin ile inkübe edilerek hücreler hasat edilir. Medya eşit miktarda ekleyerek tripsin nötralize eder. Santrifüj 106 x g'de 6 dakika boyunca bu çözelti. Süspansiyon çıkarın ve buna 3 ml taze medya ekleyin. Wel Mixl, 7 mi ortam içeren bir kültür şişesine az miktarda (100 ul) aktarın. Inkübatörde kültür şişesi inkübe edin. Passage 1 olarak şişeyi etiketleyin.
  4. Geçit 11 veya 12 kadar, kültür hücre hatları.

Nanopartiküller 2. Fabrikasyon

  1. ~ 10 -6 M (düzeltilmiş) seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözeltisi hazırlanması
    1. Bir şişe içinde 1 mg Poly molekül ağırlığına sahip [2-metoksi-5- (2-etilheksiloksi) -1,4-fenilenvinilen] (MEH-PPV) (ortalama Mn) 150,000-250,000 g / mol ve 3 ml tetrahidrofuran (THF) ekleyin . Sıcak bir plaka üzerinde 80 ° C'de ısıtılırken 2 saat boyunca karıştırın.
    2. 0.2 um'lik bir şırınga filtresi kullanılarak yeni bir şişe içinde, yukarıda çözelti filtre. 'Sulandırılmamış MEH-PPV stok solüsyonu' olarak bu çözüm etiketleyin. Adımlarla 2.1.3 ve 2.1.4 de açıklandığı gibi bu çözüm konsantrasyon ince ayar sonra nanoparçacık hazırlık dahil olacak.
    3. 3 ml THF içinde seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözeltisi 50 ul ekle. 'Seyreltilmiş MEH-PPV stok solüsyonu' olarak bu çözüm etiketleyin. UV-vis spektroskopi ile 495 nm'de absorbansı, bir 1 cm'lik kuartz bir küvete transfer ve ölçün.
    4. Seyreltilmiş MEH-PPV stok çözeltisinin absorbansı 0.17 daha yüksek ise, bir seferde birden THF 1 ml ekleyerek seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözelti seyreltik ve 495 nm 'de ölçülen absorbans gelene kadar adım 2.1.3 tekrar 0.13-0.17 arasında değişmektedir.
    5. Aşağıda gösterildiği gibi Lambert-Beer yasası kullanılarak seyreltilmiş MEH-PPV stok solüsyonu molaritesini hesaplayın. Burada, 0.15 emme protokolü geri kalanı için bir örnek olarak kullanılmıştır (örneğin., Gözlenen absorbansa göre aşağıdaki hesaplamalar ayarlayın), kullanılan MEH-PPV tükenme katsayısı 10 7 M-1 cm yol uzunluğu kullanılan -1 olduğu 1 cm.
      A = ε xbxc (Denklem 1)
      (ε - molar tükenme katsayısı, A - absorbans, b - yol uzunluğu, c - solüsyonun konsantrasyonu)
      0.15 = 10 7 M-1 cm-1 x 1 cm XC (Denklem 2)
      c = 1.5 x 10 8 M (Denklem 3)
      Aşağıdaki gibi sulandırılmamış MEH-PPV stok solüsyonu konsantrasyonu bulmak için bu konsantrasyon kullanın:
      M 1 V = 1 M 2 V 2 (Denklem 4)
      0.15 x 10 -7 M x 3050 ul = M 2 x 50 ul (Denklem 5)
      M = 2 9,15 x 10 7 M (Denklem 6)
      Bu 'arındırılmış sulandırılmamış MEH-PPV stok solüsyonu' yoğunlaşmasıdır.
  2. Düzeltilmiş seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözeltisi içinde MEH-PPV kitle hesaplanması
    1. Bölüm 2.1.4 'de elde edilen molaritesi ve 10 6 g / mol olan MEH-PPV moleküler ağırlığı (Mw), kullanılarak, aşağıda gösterildiği gibi ayarlanır seyreltilmemiş stok çözeltisi 1 ml MEH-PPV'nin kütlesi hesaplanır.
      M = n / V (n -. No mol, V - L hacim) (Denklem 7)
      Bu durumda, 1 ml MEH-PPV kütlesi und ayarlandı veiluted stok çözeltisi 9.15 x 10 -4 gr olduğunu.
  3. MEH-PPV içinde Karıştırma PCBM
    1. Fenil-Cı 61 -bütirik asit metil ester (PCBM) kütlesini hesaplanır ağırlıkça% 50 PCBM kütlesine göre tanımlanan ağırlıkça% 50 PCBM katkılı MEH-PPV çözelti yapmak için hazır MEH-PPV çözeltisi içine eklenecek MEH-PPV (yani, MEH-PPV yarısı kütle). Bölüm 2.2 elde MEH-PPV ağırlığını kullanarak.
      MEH-PPV x% 100 = ağırlıkça% 50 PCBM arasında PCBM / 9.15 x 10 -4 gr Kütle (Denklem 8)
      PCBM = 4.57 x 10 -4 gr kütlesi (Denklem 9)
    2. Bir şişe içinde, 1 mg PCBM tartılır ve 500 ul THF ilave edin. 910,88 g / mol olarak PCBM moleküler ağırlığı kullanılarak bu çözelti içinde PCBM konsantrasyonunu hesaplamak
      PCBM çözeltisi = 0,001 g / l (910,88 g / Mol x 500 ul), molaritesi (Denklem 10)
      PCBM çözeltisinin molaritesi = 2.19 x 10 -9 mol / ul (Denklem 11)
    3. PCBM çözeltisinin hacmini hesaplayın arındırılmış eklemek için gerekli ME sulandırılmadan'H-PPV stok solüsyonu, basamak 2.3.2 hesaplanan molarite ile THF içinde ağırlıkça% 50 PCBM katkılı MEH-PPV çözelti elde etmek için
      4,57 x PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ul / 2.19 x 10 -9 mol = 229 ul 10 -4 gr (Denklem 12)
      Arındırılmış seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözeltisi 1 ml PCBM çözeltisi 229 ul ilave edin ve iyice karıştırın.
  4. Çökeltme yöntemi ile nanopartiküllerin hazırlanması
    1. Aktarım, kendisine bağlı bir iğne ile 1 ml şırınga içine karıştırılır MEH-PPV / PCBM çözeltisi 1 mi.
    2. Hızla 1200 rpm'de karıştırıldıktan DI 4 ml su içine karıştırılır MEH-PPV / PCBM çözeltisi 1 ml enjekte edilir. Enjeksiyondan hemen sonra karıştırarak durdurun. Daha fazla işlem olmadan bu nanopartiküller kullanın.

Görüntüleme için Nanopartiküller ile Hücre Hatları 3. Kuluçka

NOT: Tüm görüntüleme deneyleri 35 mm petri tamamlandı

  1. Nanoparti ve Alımhücre hatlarında kartılması
    1. 12. geçişine kadar Kültür hücre hatları. 35 mm Petri tabaklarda 12. geçiş kültürü hücreleri de. 24 saat sonra hücreler,% 40 konfluent olacak şekilde, 35 mm Petri kaplarına eklenir hücreleri konsantrasyonunu ayarlayın.
    2. Bu aşamada, petri kaplarında% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ortamı kaldırma iki kez 1 x DPBS hücreleri yıkayın ve Petri tabaklarına 2 ml DMEM içinde nanopartiküller süspansiyon 100 ul ilave edin.
    3. 24 saat sonra petri gelen DMEM / nanopartiküller süspansiyon kaldırmak ve 1x DPBS 3 kez hücreleri yıkayın. Daha sonra 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile inkübe edilerek hücrelerin tespit. DPBS ile iki kez yıkanır. 2 dakika için boya ile inkübe edilerek 300 nM DAPI ile hücrelerin Leke. DPBS ile iki kez yıkanır. Ardından görüntüleme için DPBS hücreleri tutun.
  2. ROS Algılama
    1. Kültür A549 ve bölüm 3.1.1 açıklandığı üzere Petri, hücre satır başına 6'da OVCAR3 hücre hatları. EtiketPetri kapları olarak, Tablo 1 'de gösterilen.
    2. Tablo 1 'de gösterilmiş ve 24 saat süreyle inkübe olarak petri kutularının üç 2 ml DMEM içinde nanopartikül süspansiyon 100 ul ekle. Hafif dozda almak 24 saat sonra hücrelerin yıkayın ve HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) hücreleri askıya ücretsiz medya boya olacak Petri kapları için.
    3. 15 dakika boyunca güneş simülatörü lambayı Isınma. UV ışığı süzmek için lambanın önünde UV filtresi yerleştirin. Petri yüzeyinde 0,5 güneş (50 mW / cm 2) yoğunluğu elde etmek için lamba gücünü ayarlayarak bir referans güneş pili ile lamba kalibre edin. Bu özel kurulumda bu durum lambası verilen 218 W güç ile elde edilmiştir.
    4. 180 J aşağıdaki hesaplamalar gösterildiği gibi / cm2 bir hafif doz sonuçlanır 60 dakika boyunca lambası (kapağın açık) altında petri kaplarına yerleştirin:
      50 mW / cm2 x 3.600 saniye / 1.000 = 180 J / cm2
    5. HBSS çıkarın ve yıkanmadan daha petri kaplarına,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ortamı 2 mi ekleyin. 2 saat daha inkübe hücreleri.
    6. Pozitif kontrol için 30 dakika boyunca 100 uM hidrojen peroksit (H2O 2) ile hücrelerin inkübe edin.
    7. 37 ° C'de 30 dakika boyunca boya ile inkübe edilmesi ile ROS tespit reajanı 5 uM değerinde bir nihai konsantrasyona sahip her petri hücreleri Leke.
    8. 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile inkübe edilerek hücreleri saptamak. DPBS ile iki kez yıkanır. 2 dakika için boya ile inkübe edilerek 300 nM DAPI ile hücrelerin Leke. DPBS ile iki kez yıkanır. Ardından görüntüleme için DPBS hücreleri tutun.
  3. PI ve Aneksin V FITC tarafından apoptoz ve nekroz
    1. Kültür 5. Petri kapları her hücre hattı. Kalan 2 petri kontrol numuneleri olacak ise bu Petri üçü deney için olacaktır. E kadar nanopartiküller ile deney için 3 Petri kapları inkübebölüm 3.1.2 xplained. Kontrol numuneleri nanopartiküller ile inkübe değildir.
    2. 24 saat inkübasyondan sonra adım 3.2.3 izleyin.
    3. Lamba (kapağı açık) altında 3 deney petri kaplarına yerleştirilir ve 20 dakikada, 40 dakikada bir ve 60 dakikada bir bir tane çıkarın. Bu 60, 120 ve 180 ışık dozlarda J / cm2, sırasıyla (bölüm 3.2.4 hesaplama) maruz bırakıldı üç numune verir. Daha sonra, kontrol petri kutularının birine 180 J / cm2 ışık dozajını. Bu nanopartiküllerin yokluğunda tutulan ışık dozu ile kontrol edilmesidir. Işık kalan kontrol numunesine doz (hayır nanopartiküller ve uygulanan ışık dozu) uygulama yapmayınız.
    4. % 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ortamı ile HBSS takın ve 4 saat boyunca inkübatör petri kapları tutmak.
    5. 15 dakika için boya ile inkübe edilmesi ile deneysel ve annexin V FITC 20 ul kontrol petri hücreleri Leke. DPBS ile iki kez yıkanır. C Leke2 dakika boyunca boyalarla inkübe edilerek 300 nM DAPI olarak 300 nM PI (propidyum iyodür) ile arşın. DPBS ile iki kez yıkanır. Ardından görüntüleme için DPBS hücreleri tutun.

Nanopartiküller 4. İçsel Sitotoksisite

  1. 96-çukurlu levhalarda yer alan hücreler ve kültürü Sayım
    1. Ortamı çıkarmayı ve 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin ile hücrelerin inkübasyonu takiben DPBS hücreler iki kez yıkayarak Kültür şişelerinden alınan hücreler hasat. Elde edilen hücre çözeltisine,% 10 FBS ile takviye 2 mi DMEM ortamı. Gömleklere hücre kümeleri ayırmak için düzgün bir çözüm karıştırın.
    2. Hücre süspansiyonu 100 ul almak ve% 10 FCS ile takviye edilmiş 900 ul DMEM ortamına ilave edin. İyice karıştır. Bir hemasitometre üzerine bu süspansiyonu 10 ul yerleştirin. Hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 4.1.1 4 10 x 5 hücre / ml hücre süspansiyonu konsantrasyonunu ayarlamak.
    3. 5 96 oyuklu plakalar 0 saat, 24 saat olarak etiketlenmiş çıkarınızr, 48 saat, 72 saat ve 96 saat. Bu şekilde / oyuk 2500 tohum hücreleri Tablo 2 'de gösterildiği gibi kuyu içine 5 x 10 4 hücre / ml hücre çözeltilerinin 50 ul (TE 71 ve A549) ekleyin. OVCAR3 ve MDA-MB-231 hücre hatları için aynı prosedürü yapın.
    4. 24 saat sonra 1 x DPBS ile kuyu yıkama ve Tablo 2 'de gösterildiği gibi kuyu içine nanopartiküllerin artan konsantrasyonlarda 50 ul ilave edin., 20 100 eklenerek, farklı nanopartikül konsantrasyonları hazırlayın ve DMEM 2.4.2 den nanopartikül süspansiyonu 180 ul kadar sırasıyla nihai 0.4 x 10 -4 mg / ml'lik konsantrasyonlar elde nanopartikül 2 ml hacim, 2.0 x 10 -4 mg / ml ve 3.6 x 10 -4 mg / ml elde etmek. Her bir hücre hattı nanopartiküller her bir konsantrasyonu için üçlü yer alır.
  2. Karanlıkta, hücre canlılığını ölçen
    1. Hemen nanopartiküller ekledikten sonra 0 saat plakasına 10 ul MTT ekleyin. Formazan kristalleştirme için 4 saat süre ile plaka inkübeals oluşturulur. Kuyulara 50 ul çözünme çözeltisi ekleyin. Formazan kristalleri çözmek üzere, 6 saat boyunca plaka inkübe edin.
    2. Mikro levha okuyucusu ile 570 nm'de absorbans kaydederek 0 saat plakanın hücre canlılığı ölçülür.
    3. 24 saat plaka için, 1x DPBS hücreleri yıkayın ve nanopartiküller ile her bir kuyu sonra 24 saat inkübasyon 50 ul medya ekleyebilirsiniz. MTT ekleyin ve aynı 4.2.1 ve 4.2.2 açıklanan plaka okuyun.
    4. 48 saat, 72 saat ve 96 saat için plakalar, 1 kez DPBS hücreleri yıkayın ve nanopartiküller ile 24 saat inkübasyondan sonra kuyulara 50 ul ortamı eklenir. Kalan sürelerde inkübe hücreleri.
    5. 4.2.1 ve 4.2.2 de açıklandığı gibi 4.2.5) belirli zaman noktalarında hücre canlılığı ölçün.
    6. (N = 3) 3 kez tam bir deney tekrarlayın

5. PDT sonra Hücre Canlılık Ölçme

  1. Hücrelerin sayılması ve 96 oyuklu plakalar içinde kültürlenmesi.
    1. 9 bir dizi EtiketTE 71 + A549 plakaları ve OVCAR3 + MDA-MB-231 plakaları hem Tablo 3 'de gösterildiği gibi 6 oyuklu plakalar. 4.1.3 gösterilen plakaların düzeni aynı olacaktır.
    2. 4.1.2 Tablo 2 'de gösterildiği gibi, aynı düzeni ile Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi 96-yuvalı plakalar Seed.
    3. 24 saat plakalarına nanopartiküller ekledikten sonra, 4.1.4'de açıklandığı gibi.
    4. Nanopartiküllerin ilave edildikten sonra 24 saat 1x DPBS hücreleri yıkayın ve her bir oyuğa 50 ul HBSS ekleyin.
    5. 3.2.3 açıklandığı üzere, ilgili ışık dozlarla plakaları ışın tedavisi.
    6. % 10 FBS ile takviye edilmiş 50 ul DMEM ortamı ile HBSS değiştirin ve PDT sonra ilgili süreler boyunca inkübe edin.
    7. 4.2.1 ve 4.2.2 açıklandığı gibi, her bir zaman süresinden sonra, hücre canlılığı ölçülür.

6. Floresan Mikroskopi

  1. Nanopartiküllerin Uptake
    1. Mikroskop a lambaları açınnd görüntüleme önce lazer 30 dakika. Mikroskop sahnede (bölüm 3.1 açıklandığı gibi) sabit hücreleri içeren petri koyun.
    2. . Tablo 4 de gösterildiği gibi filtre kullanarak nanopartiküller ve DAPI floresans toplamak ImageJ yazılım faz kontrastı, nanoparçacık ve DAPI görüntü Yerleşimi.
  2. ROS Algılama
    1. Görüntüleme önce mikroskop 30 dakika lambaların açın. Mikroskop sahnede (bölüm 3.2'de açıklandığı gibi) hücreleri içeren petri koyun.
    2. . Tablo 4 de gösterildiği gibi filtre kullanarak saptama reaktif maddesi nanopartiküller, DAPI ve ROS floresans toplamak ImageJ yazılım faz kontrastı, nanoparçacık, DAPI ve ROS tespit reajanı görüntü Yerleşimi.
  3. PI ve Aneksin V FITC tarafından apoptoz ve nekroz
    1. Görüntüleme önce mikroskop 30 dakika lambaların açın. Açıklandığı gibi (hücreleri içeren Petri kabı koyunmikroskop sahnede bölüm 3.3).
    2. . Tablo 4'te gösterildiği gibi filtreler kullanılarak nanopartiküller, DAPI, PI ve Annexin V FITC gelen floresan toplayın ImageJ yazılım faz kontrast, nanoparçacık, DAPI, PI ve Annexin V FITC görüntüleri Yerleşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alım ve nanopartiküllerin içsel sitotoksisite

Ağırlıkça% 50 harmanlanmış MEH-PPV / PCBM nanopartiküller TE 71 ile inkübe edilmiştir, MDA-MB-231, A549 ve OVCAR3 hücre çizgileri. PCBM karıştırma seviyesi konjuge polimerler ve fullerenler 14 arasında ideal bir yük ve enerji transferi özellikleri temin ettiği gösterilmiştir ağırlıkça% 50 PCBM olarak seçildi. Nanoparçacık alımının Floresan görüntüleri Şekil 1B'de gösterilmiştir. Hücreler nanoparçacık alımını sağlamak için nanopartiküller ile 24 saat inkübe edildi. Hücreler daha sonra, görüntüleme önce% 4 paraformaldehid ile sabitlenmiş ve hücreler ve çekirdeğin yerini tespit etmek için DAPI ile boyanmıştır. Görüntü yeterli uzaklıkta hücreleri için% 40 konflüansa muhafaza edilmiştir. Karşılık gelen faz kontrast görüntüleri ile Floresan görüntüleri A549 ve OVCAR3 kanseri hücre çizgileri tarafından nanopartiküllerin tercihe bağlı olarak alınması olduğunu göstermektedir. Resim saptanabilir flüoresans TE 71 kontrol görülebilirve MDA-MB-231, kanser hücre çizgileri, sınırlı alımını göstermektedir. Öte yandan, A549 ve OVCAR3 kanseri hücre çizgileri belirgin nanopartikül alımını sergilerler. İçsel sitotoksisite (koyu toksisite) TE 71 ile ağırlıkça% 50 harmanlanmış MEH-PPV / PCBM nanopartiküllerin kuluçkalama ile değerlendirildi, MDA-MB-231, A549 ve OVCAR3 hücre soyları ve MTT testi ile hücre canlılığı kapsayacaktır. Şekil 1C'de MTT veriler hücre hatları normal çoğalmasını gösterir.

ROS kaynağı olarak Nanopartiküller

Nanopartiküller ROS kaynağıdır ve yalnızca ışığa maruz kaldıktan sonra, ROS formasyonu ROS tespit reajanı kiti ile değerlendirildi sağlamak. . OVCAR3 verileri Şekil 2A yeşil emisyon Şekil 2 Yokluğunda gösterilmiştir - C kontrol numuneleri için oluşturulmuş değildir ROS gösterir. ROS tespit reaktifinden parlak yeşil emisyon nanopartiküller ile muamele edilmiş örnekler ile ve açıkta kalan birŞekiller 2B ve E (hemen PDT sonra PDT sonra 2 saat) 'de gösterildiği gibi, ışığa, ROS PDT esnasında üretilen doğrular.

Pasifik yaz saati

MEH-PPV performans / PDT PCBM nanopartiküller hemen PDT sonra MTT testi ile ölçülebilir ve sonrasında 4 ve 12 saat sonrası inkübasyon süreleri oldu. Veri 4 saat sonra kuluçka dönemi için Şekil 3'te de gösterilmiştir. A549 ve OVCAR3 kanseri hücre çizgileri PDT tedaviden sonra çok hücre ölümü gösterirler: A549% 60 ve% 100 kadar, OVCAR-3. TE 71 kontrolü ve MDA-MB-231, kanser hücre çizgileri, sınırlı etkileri vardır. TE71 normal bir kontrol hücre hattıdır ve nano-parçacıkları içselleştirme beklenmemektedir. TE-71 nanopartiküller sadece spesifik olmayan alım deneysel görülmektedir. Düşük nanopartikül alımı nedeniyle de diğer kanser hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında daha düşük metabolik oranı, bu durumda, MDA-MB-231, gözlenmektedir. PDT data showMEH-PPV / PCBM nanopartiküller PDT etkinliği nanoparçacık alımı ile terazi PDT duyarlılaştırıcılar ve son derece etkili olduğu. Burada sözü edilen kanser hücre hatları arasında PDT sonuçları farklılıkların bu hücre hatları arasında saldırganlık fark (metabolizması ve endositoz oranı) kaynaklanmaktadır.

PDT ile indüklenen hücre ölümü ilerlemesi

PI ve Annexin V FITC Canlı / ölü çift boyama hücre ölümünün nekrotik ve apoptotik mekanizmalar hakkında bilgi sağlar. Bu boyama şeması hatları PDT kaynaklı hücre ölümü yollarının hakkında daha fazla bilgi için PDT sonra burada okudu hücreye uygulandı. Şekil 4 Annexin V FITC, PI ve DAPI ile boyandı TE 71and OVCAR3 hücre hatları görüntüleri epilüminesans Şekil. Veri nanopartiküllerin ihmal alımı ile tutarlı TE 71 kontrol hücre hattında PDT hiçbir etkisi yoktur göstermektedir. Aynı gözlem (veriler gösterilmemiştir), MDA-MB-231 için yapıldı. Ne zaman OVCAR3 60 ° PDT yapıldı ve 120 J / cm (Mor) PI ve Annexin V FITC (yeşil) 2 çift boyama gözlenmedi. 180 'de J / cm2, sadece PI leke koşuluyla akut nekrotik hücre ölümü işaret gözlenmemiştir.

figür 1
Şekil yeniden çökeltme yöntemi ile nanopartiküllerin 1. (A) imalatı, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 ve OVCAR3 hücre çizgileri nanopartiküller ile inkübe edildi. Nanopartiküller, yeşil renkte gösterilen çekirdek mavi renkte gösterilmiştir. Fluoresans görüntüleri, faz kontrast görüntüleri ile ölçek çubuğu = 20 um, (C) 96 saat olmak üzere her bir hücre hattı için, hücre canlılığını ölçen değerlendirilmiştir nanopartiküllerin intrinsik sitotoksisitesi üste. Hücre Yaşama kabiliyetleri Contr canlılığını ayarlayarak nanopartiküllerin kontrol dozu (0 mg / ml) ile karşılaştırılır% 100 ol örnekleri (gösterilmemiştir). Hata çubukları 3 ayrı deney sonuçlarının standart sapmaları (n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
ROS reaktifi tespit ile OVCAR3 hücre hattında ROS 2. Algılama Şekil. Nanopartiküller ve maruz kalma ile (A) 180 J / cm2 ışığa maruz herhangi nanopartiküller, herhangi bir ışığa maruz kalma, (B) herhangi bir nanopartiküller, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartiküller, herhangi bir ışığa maruz kalma, (D) tedaviden hemen sonra çekilen 180 J / cm2 ışık, (E) 100 ul H 2 O 2 olarak pozitif kontrol ile 2 saat sonrası PDT, (F). DF i parlak yeşil emisyon ROS oluşumu teyit ROS tespit reaktifinden s. Ölçek çubuğu = 30 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
TE 71 Şekil 3. Hücre canlılıkları, MDA-MB-231, nanopartiküllerin artan dozlarda ile uygulandığında ve 120 J / cm2 ışık dozu. Post-PDT inkübasyon süresi 4 saat olan ile ışınlanmış A549 ve OVCAR3 hücre hatları. Göstergede nanopartikül doz 10 -4 mg / ml bulunmaktadır. Hata çubukları 3 ayrı deney sonuçlarının standart sapmaları (n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ŞEKIL 4 "src =" / files / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Anneksin V FITC ve PI ile Şekil 4. TE 71 ve OVCAR3 Canlı / ölü boyama hücre hatları. Yeşil emisyon annexin V FITC karşılık, mor emisyon PI (kırmızı, mavi DAPI emisyonu ile karma) karşılık gelir ve mavi emisyon DAPI karşılık Nükleer leke. Görüntüler faz kontrast ve epilüminesans görüntüleri bindirme vardır. Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil kalibre ışık hücrelerin maruz kalma 5. Güneş simülatörü kurulumu. Bir referans güneş pili 0,5 güneş ışığı yoğunluğunu (50 mW / cm2) kayıt içerlek gösterilen, kalibrasyon için kullanıldı./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Negatif Kontroller Hiçbir NPS, ışık yok Resim NPler, ışıkla NP ile hiçbir ışık,
Pozitif kontrol 100 ul H 2 O 2 (Yok NPS, ışık yok) --- ---
Deneysel 0 saat sonrası PDT (NPS ve ışık) 2 saat sonrası PDT (NPS ve ışık) ---

Tablo 1: ROS saptanması için deney tasarımı.

0 saat plakası Basın TE 71 A549 Basın
Hiçbir tedavi
0 mg / ml
0.4 x 10 -4 mg / ml
2.0 x 10 -4 mg / ml
3.6 x 10 -4 mg / ml

Tablo 2: nanopartiküllerin inkübasyon için 96 oyuklu plaka Düzen nanopartiküllerinin içsel sitotoksisitesini değerlendirmek / PDT etkisi

Hayır Plate. Işık dozu (J / cm2) Mesaj PDT süresi (saat)
1 60 0
2 60 4
3 60 12
4 120 0
5 120 4
6 120 12
7 180 0
8 180 4
9 180 12

Tablo 3: PDT değerlendirme için, 96 gözlü levhalar etiketleme.

Fluorofor Uyarma filtresi Dikroik ayna Emisyon filtresi Mikroskopi Uyarma kaynağı
Nanoparçacık 488/10 500 LP 510 LP Konfokal Ar-Kr iyon lazer
DAPI 350/52 405 LP 450/20 Epilüminesans Merkür lamba
PI 543/22 562 592/40 Epilüminesans Merkür lamba
Annexin V FITC 483/30 505 LP 535/40 Epilüminesans Merkür lamba
ROS tespit reajanı 491/10 510 DCLP 525/50 Epilüminesans Merkür lamba

Görüntüleme deneyleri için Tablo 4. Mikroskopi yapılandırması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nanopartiküller imalatı sırasında nanoparçacık alımını sağlamak için bazı kritik önlemler korumak için gerekli oldu. Bu solüsyonun konsantrasyonu oluşturulmuştur nanopartiküllerin büyüklüğü belirlemede önemli bir rol oynadığı görülmüştür gibi THF (ağırlıkça% 50 PCBM ile harmanlanmış) bir 10 -6 M MEH-PPV çözelti DI su içine enjekte etmek için hazırlanmıştır. Konsantrasyon UV-vis spektroskopi ile kontrol edilmiştir. Protokol aşamasında olduğunu ilk bu çözümün beri UV-vis spektrumları almadan önce ilk olarak hazırlanmış MEH-PPV solüsyonu (seyreltilmemiş MEH-PPV stok çözelti) sulandırmak için gerekli olduğunu 2.1.3 Not 1. enjeksiyon hızı çok daha büyük bir emicili¤i Ayrıca nanopartiküller boyutunu karar önemli bir rol oynar ve şiddetle distile su karıştırılarak mümkün olduğunca hızlı olmak zorundadır. Yavaş enjeksiyon büyük nanopartiküller ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, karıştırma işlemi daha bir araya toplanmasının engellenmesi için enjeksiyondan hemen sonra durdurulmalıdır. Enjekte ederkenÇözelti su içinde bu nanopartiküller boyutunu etkileyecektir kabarcık oluşumunu önlemek için çözelti içine tamamen iğne sokulurken şişenin iç yüzeyine yakın iğne tutmak için gereklidir. Elde ettiğimiz deneyler nanoparçacık boyutlarda DLS ile ölçülen 61.5 ± 23.3 nm idi. DLS o, ucuz, hızlı, bu boyut için güvenilir ve kolay kullanılabilir şekilde yerine TEM seçildi. Bu nanopartiküller üzerine zeta potansiyeli, yani -9,66 ± 8.12 mV, nötr yüzey yükünün biraz negatif olarak bulunmuştur.

Bu teknikler, hücre canlılığı nicel bir ölçümünü sağlayan MTT deneyine dayanan gibi, nanopartiküllerin içsel sitotoksisite değerlendirirken hücreleri saymak ve FDT sonuçları ölçmek için gerekli oldu. Bu nan dozu ile ilgili olarak hücre canlılığının karşılaştırılmasına imkan verir 96 oyuklu plakanın her bir gözdeki hücrelerin, aynı sayıda ile deneyi başlatmak için gereklioparticles ve hafif yanı sıra kontrol deneyleri.

Bir güneş simülatörü örnekleri ışın tedavisi için kullanılmıştır. Kurulum, Şekil 5'te gösterildiği üzere, ve ışık kaynağı, bir UV filtresi ve bir referans güneş pili oluşur. Yüksek ölçüde tekrarlanabilir sonuçlar ile sonuçlanmıştır spektrum özelliklerinin kontrolü ve ışık kaynağının yoğunluğu yüksek derecede elde edilebilir Bu aydınlatma düzeni ile. En ışık kaynakları düzgün bir yoğunluk profili vermeyin gerçekleştirmek için çok önemlidir. Güneş simülatörü, ancak, aydınlatma alanında düzgün hale yoğunluğu gerçekleştirmek için hizalanabilir. Bu ışıklı alanda değişik bölgelerinde referans güneş pili ile doğrulanmıştır. Biz de her zaman daha yoğunluğunun değişim etkilerini en aza indirmek için hafif nokta aynı bölgede ve aynı yönde plakaları yerleştirmek için hallettim. Işık kaynağı Şekil 5'te gösterilen mesafeyi örnek 50 ile sağladıHBSS boya boş ortam göstergesi boyalar tarafından ışığın emilmesini önlemek için kullanılmıştır, bu deneyler için 218 W'lık bir elektrik lamba gücünün altında yoğunluğu mW / cm2 (0.5 güneş). PDT sonra, hücreler daha PDT ilerlemesini gözlemlemek için 37 ° C (PDT sonrası inkübasyon) belirli zaman aralıkları için kuluçkalanmıştır.

Hücrelerin boyanması ilgili boyanın doğru konsantrasyonunu bulmak için biraz deneme yanılma gerekli. Bu, uygun sonuçlar elde edilene kadar sürekli boya konsantrasyonu artırırken deney tekrarlanarak elde edilir.

Yöntem ayrıca özellikle nanoparçacık sistemi ve PDT tedavisi konusunda, sınırlamaların bir çift vardır. Nanopartiküller yeniden çökeltme yöntemi ile hazırlanmaktadır yana bulunmaktadır partiden partiye edilen nanopartikül boyut olarak bazı farklılıklar ve nanoparçacık boyutta bir polidispersite bu kontrol edilemez bulunmaktadır. Ayrıca nanopart yapmak mümkün olmamıştırdaha küçük boyutta 20 nm icles. Bu kısıtlamalar, in vivo olarak tatbik edilebilir küçük boyutlu tek dağılımlı nanopartikülleri geliştirme sorunlar olabilir. Bundan başka, in vitro olarak PDT Deney hücreleri üzerinde bazı stres empoze uzun bir zaman miktarı için inkübatör dışında olduğu hücrelerin gerektirir.

PDT için burada tarif edilen yöntem, mevcut yaklaşımlara göre önemlidir. Küçük molekül duyarlaştırıcılar ve hassasiyetini katkılı nanopartiküller kullanarak PDT nedeniyle yol açar duyarlandırıcıların karanlık duyarlandırıcılar toksisite, ışık hassasiyeti olan hastalar (nedeniyle hassasiyetini seçici olmayan dağılımı) ve hidrofobiklik (anlamlı konularla sınırlı klinik uygulamaya gördü azaltılmış biyoyararlanım ve potansiyel akut toksisite). Ameliyat, tümör vücuttan bile birkaç kanser hücrelerinin kalır ve remisyon neden olabilir. Radyoterapi ve kemoterapi normal doku da etkilenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) Sigma Aidrich 536512-1G average Mn 150,000-250,000
[6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) Sigma Aidrich 684449-500MG >99.5%
Tetrahydrofuran (THF) EMD TX0284-6 Drisolv
1 ml syringe National Scientific Company 37510-1 For filtration of MEH-PPV solution
Syringe filter VWR 28145-495 25 mm, 0.2 µm, PTFE
1 ml syringe Hamilton Company 81320 For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) Corning (VWR) 45000-350
Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) Quality Biological (VWR) 10128-740
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) Corning (VWR) 45000-436
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) Corning (VWR) 45000-736
Trypsin EDTA 1x 0.25% Corning (VWR) 45000-664 Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences  15710 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS
DAPI  Biotium VWR 89139-054 Nuclear stain
5 ml pipettes VWR 82050-478
75 cm2 culture flask VWR 82050-856 for culturing cells
96-well plates VWR 82050-771 for MTT assays
Tissue Culture Dishes with Vents Greiner Bio-One (VWR) 82050-538
Propidium iodide Molecular probes P3566
Annexin V FITC Invitrogen A13199 dye for apoptosis
Celltiter 96 non-R 1000 assays Promega (VWR) PAG4000 MTT
CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection Invitrogen C10444 For ROS detection
UV-vis spectrometer Agilent 8453
Fluorescence spectrometer NanoLog HoribaJobin Yvon
Dynamic light scattering PD2000DLS, Precision detector
Incubator NuAir DH Autoflow
Confocal microscope Zeiss Axioskop2 63X oil immersion objective lens
Epiluminescence microscope Olympus IX71 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera
Solar Simulator Newport 67005 Oriel Instruments
Reference solar cell Oriel  VLSI Standards Incorporated
Microplate reader BioTek Ex808
Hemocytometer Hausser Scientific Partnership 3200 For counting cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, (5), 380-387 (2003).
  2. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90, (12), 889-905 (1998).
  3. Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5, (3), 161-171 (2005).
  4. Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1, (1), 1-21 (2002).
  5. Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6, (3), 817-840 (2013).
  6. Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85, (6), 443-456 (1993).
  7. Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258, (5087), 1474-1476 (1992).
  8. Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9, (4), 570-579 (2013).
  9. Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9, (4), 613-621 (2013).
  10. Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44, (2-3), 139-143 (2013).
  11. Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49, (31), 3224-3226 (2013).
  12. Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86, (12), 1809-1827 (2012).
  13. Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2, (3), 238-250 (2012).
  14. Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3, (5), 297-302 (2009).
Karma Polimer / Fulleren Nanopartikül photosensitizers Şefliği ile Fotodinamik Tedavi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).More

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter