Abstract
Organiska föroreningar som adsorberats på ytan av titandioxid (TiOj 2) kan sönderdelas genom fotokatalys under ultraviolett (UV) ljus. Här beskriver vi ett nytt protokoll som använder TiOj 2 fotokatalys för att lokalt förändra cellaffinitet av substratytan. För detta experiment en tunn TiO 2 filmen var sputter-belagd på ett täckglas, och TiO 2 yta ändrades sedan med en organosilan monoskikt härlett från octadecyltrichlorosilane (OTS), vilket inhiberar celladhesion. Provet nedsänktes i ett cellodlingsmedium, och fokuserade UV-ljus bestrålades till en oktagonal regionen. När en neuronal cellinje PC12-celler ströks ut på provet, celler vidhäftade endast på UV-bestrålade området. Vi visar vidare att denna ytmodifiering kan också utföras in situ, dvs även när celler växer på substratet. Korrekt modifiering av ytan krävs en extracellulär matris protein kollagen för att vara närvarande i mediet vid tiden för UV-bestrålning. Tekniken som presenteras här kan potentiellt användas i mönstrings flera celltyper för att konstruera coculture system eller godtyckligt manipulera celler under odling.
Introduction
Halvledarlitografi processer och dess derivat - såsom fotolitografi 1,2, elektronstrålelitografi 3-6, och mikrokontakt utskrift 7-10 - har nu blivit en etablerad verktyg i cellbiologi att växa levande celler i en definierad position och geometri. Mönstringen metod förlitar sig på användningen av mikrofabricerade substrat, som består av mikro ön cell permissiv beläggning i en icke-permissiv bakgrund. Sådana substrat fungerar som en mall för att mönstra cellerna. Dessa tekniker har gett oss de nya metoderna för att modifiera celler och deras funktion vid en enkel- och multi-cellulär nivå, för att extrahera de inneboende egenskaperna hos celler, och för att öka genomströmningen av cellbaserade läkemedelsscreening 11.
Graden frihets i cell mönstring skulle i hög grad öka om att mallmönster geometri skulle kunna ändras på plats, det vill säga, medan celler odlas på Surface. De konventionella metoderna för mönsterbildning kan inte tillämpas direkt här, eftersom de behandlar samplen i atmosfär eller i vakuum. Därför olika nya ytmodifieringstekniker har föreslagits, som bygger, till exempel på fotoreaktiva föreningar 12,13 eller laserablation 5,14, bara för att nämna några. De föreslagna metoderna har varit snyggt granskats av Robertus et al. 15, och mer nyligen av et al. Choi 16 och Nakanishi 17.
Här i den här artikeln beskriver vi en ny protokoll in situ ytmodifieringen, som drar fördel av fotokatalytiska nedbrytning av organiska molekyler på en titandioxid (TiO 2) yta 18,19. I denna metod används en TiO 2 film införd mellan glassubstratet och den organiska filmen som samverkar cellerna, och den organiska filmen sönderdelas in situ genom lokalt bestrålning ultraviolett (UV)ljus till ett område av intresse (λ <388 nm). Vi visar att det nya protokollet kan användas för att skapa micropatterns av extracellulära matrixproteiner och levande celler både ex situ och in situ. TiO 2 är biokompatibla, kemiskt stabil och optiskt transparent, funktioner som gör det vänliga att införa i cellkulturförsök. Detta protokoll ger en materialvetenskap baserat alternativ för att modifiera cellkultur ställningar i cellkultur miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av TiO 2-belagda täckglas
- Antal täck med hjälp av en diamant ritsnål. Detta bidrar inte bara till att hålla koll på varje täck men också att se till att rätt sida av provet är vänd uppåt. Rengör täckglas, först under rinnande DDH 2 O, sedan genom att nedsänka dem i Piranha-lösning (H 2 SO 4: H2O 2 = 4: 1). Efter 10 minuter, skölj täck ordentligt, 8 gånger i DDH 2 O. Torka täck under N2-flöde.
- Set TiOj två mål i radiofrekvens (RF) förstoftningssystem. Fäst täck på en provhållare för sputtering utrustning med en polyimidtejp. Placera provhållaren i förstoftningskammaren. Evakuera kammaren tills trycket når 2,0 x 10 -4 Pa.
- Introducera Ar-gas in i kammaren och ställa avsättningstrycket till 4,0 mTorr. Medan du håller slutaren stängd, gradvis ökaRF-effekten till 70 W.
- Öppna slutaren och fräser under 15 minuter för att erhålla en film med en tjocklek av 120-150 nm (fig 1: Steg A). Tillväxthastigheten för filmen behöver härledas för varje maskin.
2. Surface Coating med Cell avvisande Film
- Hydrofilisera TiO 2 ytan genom att behandla provet med O 2 plasma, efter instruktioner från tillverkaren av plasmareaktom. Vi behandlar provet under 5 min vid 200 W med O 2 flöde av 100 sccm. Sänk provet i DDH 2 O och bekräfta att ytan är superhydrofil. Torka yta noggrant under N2-flöde.
- Förbered en mM octadecyltrichlorosilane (OTS) lösning genom att tillsätta 39,6 il OTS till 100 ml toluen. Sänk ned provet i lösningen under 1 h vid RT. Genomföra detta steg inuti en N2 -filled handskpåse (Figur 1: Steg B).
- För att ta bort physisorbed molekyler, sonicate provet i toluen, aceton, etanol och DDH 2 O i 5 min vardera, i den ordningen. Skölj provet fyra gånger i färskt DDH 2 O och torka ytan under N2-flöde. Ytan skall vara hydrofob med en kontaktvinkel av 100-110 °.
3. Ex-Situ Surface Mönstring
- Att arbeta i ett laminärt flöde huva, dra flera repor med en diamant ritsnål på ytan. Märkena bidra till att hålla koll på de bearbetade regionerna och även föra mikroskop i fokus. Sterilisera OTS belagda TiO 2 genom nedsänkning av provet i 70% etanol under 5 minuter. Skölj provet två gånger i steriliserat DDH 2 O.
- Placera provet i en 35-mm skål och tillsätt 2 ml av PC12 odlingsmedium (se steg 4.2). Inkubera i över 3 h i en CO2-inkubator (37 ° C). Förfarandet är avsett att låta serumalbuminer absorberar på ytan. Adsorberade albuminer inhiberar efterföljande adsorption av andra proteins och celler (Figur 1: steg c).
- Medan du väntar, ställa in inverterat fluorescensmikroskop.
- Slå på båglampan, sätt i UV-filter kuben och ställ objektiv till 20X.
- Mät ljusintensitet I (W cm -2) med en UV-intensitetsmätare, och beräkna bestrålningstid t (i sekunder) för en dos av d, (i J cm -2) som: t = d / I.
Exempelvis för att bestråla med en dos på 200 J cm -2 hjälp av en ljuskälla av 600 mW cm -2, krävs 333 sek av bestrålning. - Använd en stegmikrometer och stänga fältet membranet att ställa in storleken på det område som skall bestrålas, t.ex., 200 ^ m.
- Efter 3 h inkubation komplettera medium med 200 pl 3,0 mg ml -1 typ-IV kollagen (Col-IV, slutliga koncentration 300 pg ml -1).
- Överför 35-mm maträtt mikroskop scenen. Hitta scratch marken, fokusera mikroskopet på provets yta, och bestråla UV-ljus i en dos av 200 J cm -2 (Figur 1: Steg D). Området för UV-bestrålning kan ändras antingen genom att justera öppningen av fältet membran eller genom att ersätta fältbländare med en metallmask av skilje geometri.
- Ersätt mediet med ett färskt odlingsmedium (utan Col-IV), och placera provet tillbaka i inkubatorn.
4. Cell Culture
- Rutin kultur av PC12-celler utförs på en kollagenbelagd plastskål.
- Att belägga en 60-mm vävnadsodlingsskål med Col-IV, först väta ytan med DDH 2 O och aspirera alla DDH 2 O.
- Förbered 300 mikrogram ml -1 Col-IV genom att späda ut den ursprungliga lösningen (3 mg ml -1) 10x med DDH 2 O.
- Tillsätt 200 pl av 300 pg ml -1 Col-IV per 60-mm maträtt. Låt lösningen sprids genom ytan.
- Torr than skålen i en huv med laminärt flöde under ca 1 h.
- Skölj ytan två gånger med 4 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS). När du inte använder den belagda skålen omedelbart, skölj skålen en gång med 4 ml DDH 2 O. Efter aspire DDH 2 O, lagra skålen i inkubatorn. Försök att inte hålla det lagras i mer än två veckor.
- PC12-celler odlas i ett tillväxtmedium som består av: Dulbeccos modifierade Eagles medium (låg glukos) + 10% fetalt bovint serum + 5% hästserum + 1% penicillin-streptomycinlösning. Inkubera cellerna i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2), och ersätta hälften av mediet varannan dag. Passageceller innan de når sammanflödet.
- Aspirera tillväxtmediet, och tillsätt 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 bovint serumalbumin (BSA) + 10 mM EDTA) förvärmd till 37 ° C. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C. Knacka försiktigt skålen loss alla ceLLS.
- Samla cellerna i en 15 ml koniskt rör. Skölj skålen med 3 ml färskt D-PBS, förvärmd till 37 ° C.
- Centrifugera röret vid 150 x g under 4 minuter.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml av tillväxtmediet.
- För rutinmässig kultur, dela cellerna 1: 3 till 1: 5.
- Till tallrik celler på UV-modifierade OTS / TiO 2 prov, räkna celltäthet och tillsätt 3,0 x 10 5 celler i en 35 mm skålen (Figur 1: Steg E). Inkubera skålen i fuktad inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 1-2 dagar. Både naiv och nervtillväxtfaktor (NGF) -differentiated PC12-celler kan användas för de mönster experiment. För NGF-differentiering, 100 ng ml -1 av 7S-NGF sättes till tillväxtmediet flera dagar innan utstrykning av cellerna på provet. NGF-differentiering verkar öka adhesibility av PC12-celler och gör hanteringen enklare, speciellt i den in situ-mönstring experiments.
5. In-Situ Surface Mönstring
- Efter 1-2 dagars odling på ex-situ modifierad yta, bekräftar att cellerna fästa och bara växer på UV-bestrålade området. Ställ in mikroskopet, såsom beskrivits i Steg 3,4.
- Överför provet till en ny 35-mm vävnadsodlingsskål innehållande tillväxtmediet, 100 ng ml -1 NGF (i fallet med användning av NGF-differentierade celler), och 100 ^ g ml -1 Col-IV.
- Placera skålen på mikroskop scenen. Hitta lämpligt läge, och bestråla UV-ljus med en dos på 200 J cm -2 (Figur 1: Steg F, G). Den nyskapade tillåt region indikeras med en asterisk i figur 1: Steg G.
- Försöka slutföra behandlingen av ett enda prov inom 30 minuter. Efter bestrålning, överförs prov tillbaka in i mediet utan Col-IV.
- Var ytterst försiktig när du bär skålen med cultured celler och överföra provet från skålen skålen för att förhindra lösgör av de mönstrade cellerna.
Figur 1. Schematisk illustration av den övergripande processen. Se text för detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A visar en tvärsnittsvy svepelektronmikroskopi (SEM) bild av beläggningskällorna avsatta TiO 2-film. Från observation, var tjockleken hos filmen beräknas vara cirka 150 nm. Märkbar här är planhet av den avsatta TiO 2 film. Ytterligare analys av atomkraftsmikroskopi (AFM) avslöjade att root-mean-square (rms) ytans jämnhet var 0,2 nm (Figur 2B).
När TiO 2 yta är modifierad med OTS och nedsänktes därefter i ett seruminnehållande tillväxtmedium, serumalbuminer adsorberas på OTS ytan och inhiberar efterföljande proteinadsorption och cellvidhäftning 18,20. När sedan fokuserat UV-ljus bestrålas till ytan, är reaktiva syreföreningar (ROS) genereras vid TiO 2 yta 21, som sönder OTS självmonterat monoskikt (SAM) på TiO 2 och avlägsna SAM och den adsorberade enlbumins från ytan. Detta gör det bestrålade området hydrofila och tillåtande till protein adsorption. Direkt interaktion av ROS med albuminer kan förekomma samtidigt, men nedbrytningen av OTS bör vara huvudreaktionen, eftersom OTS SAM samverkar albumin och TiO 2. I det nuvarande protokollet är ett extracellulärt matrixprotein Col-IV kompletteras i mediet under bestrålning, och Col-IV adsorberar företrädesvis till UV-bestrålade område där albuminer tas bort (Figur 3A). Andra proteiner, såsom fibronektin kan mönstras i samma protokoll (figur 3B), vilket indikerar mångsidigheten hos detta tillvägagångssätt.
Serumalbuminer, som också är närvarande i mediet vid tiden för UV-bestrålning, bör också adsorbera på den bestrålade området, men resultaten tyder på att mängden inte är hög som den på den intakta OTS SAM. För att bekräfta detta undersökte vi skillnaden i affiniteten av BSAUV-bestrålade och intakta OTS SAM genom fluorescensmikroskopi av färgämnesmärkt BSA. För detta experiment, fokuserades UV-ljus bestrålas till OTS / TiO 2 prov som inte har nedsänkt i seruminnehållande medium, och därefter provet doppades i en lösning av fluoresceinmärkt BSA. Figur 3C visar adsorption mönstret BSA. Ljusare fluorescens i det intakta OTS SAM region än UV-bestrålade området visar att mängden adsorberat BSA är högre i den intakta regionen. Mekanismen för föredragen adsorption kan förstås av skillnaden i hydrofobicitet hos de två regionerna. Mängden av BSA adsorptionen är känd att vara högre på hydrofoba ytor 22, och den intakta OTS SAM regionen är mer hydrofob än det UV-bestrålade området 18.
Mönstret för Col-IV sålunda skapade tjänar som en byggnadsställning för celladhesion. Figur 4A visar NGF-differentierade PC12-celler odlade på en n ex-situ mönstrad region för en dag. Därefter tillsattes UV-ljus bestrålas till sidan av en micropattern, och cellerna odlades under ytterligare 5 dagar. Såsom visas i fig 4B-D, celler migrerade vidare till den modifierade regionen, vilket indikerar att cellaffinitet av ytan lyckades modifierad i cell-odlingsmiljö.
Figur 2. Karakterisering av TiO 2 film. (A) Tvärsnitts SEM bild av prov. (B) AFM bild av TiO 2 yta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
oad / 53045 / 53045fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 3. Ställes selektiv adsorption av proteiner på det UV-bestrålade regionen. (A) Fluorescein-märkt kollagen (200 | j, m oktagonal mönstret) och (B) rodaminmärkt fibronektin (100 | j, m kvadratiskt mönster). Föredragen adsorption av dessa proteiner förlitar sig på frånvaron av albuminer som blockerar proteinadsorption (C). Notera att i (C), fram OTS SAM inte nedsänkt i seruminnehållande medium före anbringandet av fluorescein-märkt BSA. Skala barer, 100 m (A) och 50 pm (B, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ex-situ och in situ mönstring av PC12-celler. (A) Adhesion av PC12-celler till en ex-situ mönstrad region. Prickad oktagon indikerar platsen för in situ UV-bestrålning. (B - D) Migration av PC12-celler till in-situ mönstrade regionen, 2 dagar (B), 3 dagar (C), och 5 dagar (D) efter bestrålning. Skal, 200 | j, m. Modifierad med tillstånd från et al. Yamamoto 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt nuvarande protokollet, var TiO 2 film bildad av RF-magnetronförstoftning. Vi föredrar denna metod för avsättning eftersom det ger oss möjlighet att reproducerbart framställa ett fotokatalytiskt TiO 2 film med en sub-nm råhet. Även sputtering processer är välkända för materialforskare och elektronikingenjörer, kan det inte vara helt tillgänglig för biologer. I så fall skulle spinnbelades TiO 2-film vara ett alternativt val 23. I denna metod, är TiO 2 nanopartiklar upplösta i ett lösningsmedel utspridda på en substratyta av centrifugalkraft. Speciell utrustning som krävs är en spinnbeläggare, som är mycket billigare än en förstoftningssystem. Vi har använt för oss en spin-belagd TiO 2 nanopartiklar film och har bekräftat att filmen också kan användas för att utföra liknande experiment (data visas ej). Ytan hos det spinnbelades TiO 2 filmen är jämförelsevis grov med ett effektiv grovhet på flera tios av nm, och det tar lite övning att likformigt belägga substratet reproducerbart speciellt när flera spin beläggningar behövs för att få tjocka filmer. Ändå kan metoden vara den första kandidaten för biologer.
Hittills har vi utnyttjat denna metod mönstring inte bara PC12-celler, men också en human pankreascancer cellinje ASPC-1 och primära neuroner erhållna från embryonala råtta hippocampi 19. Adhesibility av ASPC-1-celler är mycket starkare än PC12-celler eller hippocampus nervceller, och komplettering av byggnadsställningar molekyler, såsom kollagen, inte krävdes i mönstring dem. Vi har ännu notera att icke-specifik vidhäftning av cellerna till obestrålade regionen då och då observeras, vilket troligen beror på brister i OTS SAM.
Mönstring primära neuroner var mycket mer utmanande eftersom deras adhesibility är svag. I själva verket, det kritiska steget av den aktuella processen ligger i rätt adsorptionenav byggnadsställningar molekyler. En enkel komplettering av kollagen eller laminin var otillräckliga för att öka affiniteten hos den modifierade regionen för nervceller. Konventionell kultur av hippocampusneuroner åberopat positivt laddad peptid polylysin att belägga ytan av täckglas 24. I detta sammanhang är att inducera selektiv bindning av poly-lysin till UV-bestrålade området önskas, men var omöjligt eftersom poly-lysin adsorberat på den intakta OTS SAM regionen samt. Vi försökte andra ytbeläggningar, såsom polyetylenglykol-silan SAMs och perfluor-silan SAMs, för att finna att ingen av dessa var anti-fouling till poly-lysin. För att lösa det här problemet, helt nyligen visade vi att en tvärbindningsmolekyl kan användas för att framkalla aktiv adsorption av ställningsmolekylerna på UV-bestrålade området 19. Sådant val av byggnadsställningar molekyler och optimering av dess koncentration bör utföras för varje experiment.
UV-bestrålning dosbör också optimeras eftersom det starkt påverkar mängden proteinadsorption. I vårt fall var fluorescensintensitetsmätning används för att härleda en optimal UV-dos på 200 J cm -2 18. Värdet kan variera beroende på experimentella parametrar såsom tjockleken och kristalliniteten hos TiO 2 film.
Bland olika tekniker för in situ ytmodifiering utvecklats hittills, är den största fördelen med föreliggande förfarande att det inte kräver organisk syntes av specialiserade molekyler för ytbehandling. Den metod som presenteras här är i princip kompatibla med organiska filmer framställda från det stora bibliotek av kommersiellt tillgängliga polymerer, peptider och SAM prekursorer. Det är också fördelaktigt på ett sätt att den yta-modifieringsprocessen kan utföras med användning av konventionell laboratorieutrustning, såsom en brett fält fluorescensmikroskop utrustat med en kvicksilverbåglampa, såsom visas. Användaen UV-laser som ljuskälla, en subcellulär upplösning ner till ~ 3 | j, m kan uppnås (data ej visade).
Vissa begränsningar av den nuvarande metoden inkluderar oåterkallelig ytmodifieringen behöver för att komplettera byggnadsställningar molekyler i mediet, och generering av ROS. Processen som beskrivs här kan användas för icke-tillåtande till tillåtande omvandling av ytan, men konverteringen är enkelriktad och kan inte vändas. För experiment som kräver återföring omvandling av cell affinitet, andra metoder 15 måste beaktas. Dessutom kräver vår process ställningsmolekyler såsom kollagen som skall bad-appliceras till cellodlingsmediet. Eftersom befolkningen i förväg mönstrade celler oundvikligen skulle utsättas för molekylerna, kan detta begränsa vissa program av denna process. Photocatalyzed generation av ROS, såsom hydroxylradikaler, vid en UV-bestrålade regionen kan vara giftiga för närliggande celler, men, åtminstone, var inte denna effektobserverats i våra experiment. Även om det blir framträdande för andra tillämpningar, bör detta problem lösas genom att komplettera syreeliminerare i tillväxtmedium. Eftersom syre sophantering molekyler inte skulle ligga mellan TiO 2 och de icke-tillåtande molekyler på sin yta, förväntas de eliminera överdriven ROS utan att påverka mönstringsprocessen kinetik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
