Abstract
Organiske forurensninger som er adsorbert på overflaten av titandioksyd (TiO2) kan dekomponeres ved fotokata under ultrafiolett lys (UV). Her beskriver vi en roman protokoll ansette TiO 2 photocatalysis til lokalt endre celle affinitet av underlaget overflaten. For dette forsøk ble en tynn film var TiO 2 frese-belagt på et dekkglass, og TiO 2 flaten ble deretter modifisert med et organosilan monolag avledet fra octadecyltrichlorosilane (OTS), som hemmer celleadhesjon. Prøven ble neddykket i et cellekulturmedium, og fokusert UV-lys ble bestrålt til en åttekantet område. Når en neuronal cellelinje PC12-celler ble sådd ut på prøven, cellene klebet bare på den UV-bestrålte området. Vi viser videre at denne overflatemodifikasjon kan også utføres in situ, det vil si, selv når cellene vokser på substratet. Riktig modifisering av overflaten kreves en ekstracellulær matriks protein kollagen som kan være tilstede i mediet ved UV-bestråling. Teknikken som presenteres her kan potensielt benyttes i mønstrings flere celletyper for å konstruere coculture systemer eller å vilkårlig manipulere celler i henhold til kulturen.
Introduction
Semiconductor litografi prosesser og dets derivater - for eksempel fotolitografi 1,2, elektronstråle litografi 3-6, og mikro utskrift 7-10 - har nå blitt et etablert verktøy i cellebiologi å vokse levende celler i en definert posisjon og geometri. Mønstringen Metoden baserer seg på bruk av microfabricated substrater, bestående av mikro-øya celle ettergivende belegg i en ikke-permissive bakgrunn. Et slikt substrat tjener som en mal for å mønster cellene. Disse teknologier har gitt oss de nye metoder for å konstruere celler og deres funksjon ved et en- og flercellenivå, for å trekke ut de iboende egenskapene til cellene, og for å øke gjennomstrømningen av cellebasert medikament screening 11.
Graden-av-frihet i celle mønster ville øke hvis malen mønsteret geometrien kan bli endret in situ, dvs. mens cellene dyrkes på surface. De konvensjonelle metoder for mønsterdannelse kan ikke direkte brukes her, siden de behandle prøvene i atmosfære eller i vakuum. Derfor ulike nye overflate modifikasjon teknikker har blitt foreslått, som er basert på, for eksempel, på fotoreaktive forbindelser 12,13 eller laser ablasjon 5,14, bare for å nevne noen. De foreslåtte metoder har blitt pent anmeldt av Robertus et al. 15, og mer nylig av Choi et al. 16 og ved Nakanishi 17.
Her i denne artikkelen beskriver vi en ny protokoll av in-situ overflatemodifisering, som tar fordel av fotokatalytisk nedbrytning av organiske molekyler på en titandioksid (TiO 2) overflate 18,19. I denne fremgangsmåten blir et TiO 2 film lagt inn mellom glasset underlaget og den organiske film som grensesnitt cellene, og den organiske film brytes ned in situ ved lokal bestråling av ultrafiolett (UV)lys til en region av interesse (λ <388 nm). Vi viser at den nye protokoll kan benyttes for å lage micropatterns av ekstracellulære matriksproteiner og levende celler både ex situ og in situ. TiO 2 er biokompatible, kjemisk stabilt, og optisk transparent, egenskaper som gjør det vennlig å innføre i cellekultur eksperimenter. Denne protokollen gir en materialvitenskap-basert alternativ for å endre cellekultur stillasene i celle-kultur miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av TiO 2-belagte dekkglass
- Antall glassene med en diamant rissenål. Dette bidrar ikke bare til å holde styr på hver dekkglass, men også for å sikre at den riktige siden av prøven vender opp. Rengjør Dekk, først under rennende DDH 2 O, deretter ved å dyppe dem i piraja løsning (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Etter 10 minutter, skyll Dekk grundig, 8 ganger i DDH 2 O. Tørk Dekk under N2 flyt.
- Still TiO 2 mål i radiofrekvens (RF) sputtering system. Fest Dekk på en prøve innehaver av sputtering utstyr ved hjelp av polyamid tape. Plasserer prøveholderen i sprutekammeret. Evakuere kammeret inntil trykket når 2,0 x 10 -4 Pa.
- Ar innføre gass inn i kammeret og setter avsetningstrykket til 4,0 mTorr. Mens du holder lukkeren lukket, gradvis økeRF-effekten til 70 W.
- Åpne lukkeren og frese i 15 min for å oppnå en film med en tykkelse på 120-150 nm (Figur 1: Trinn A). Veksthastighet for filmen må utledes for hver enkelt maskin.
2. Surface Coating med Cell-avstøtende Film
- Hydrophilize den TiO 2 overflaten ved behandling av prøven med O 2 plasma, følger instruksjonene fra produsenten av plasma reaktoren. Vi behandler prøven i 5 min ved 200 W med O 2 gjennomstrømning på 100 sccm. Fordyp prøven i DDH 2 O og bekreft at overflaten er superhydrophilic. Tørk overflaten grundig under N2 flyt.
- Forberede en mM octadecyltrichlorosilane (OTS) løsning ved å legge til 39,6 mL OTS til 100 ml toluen. Fordyp prøven i løsningen i en time ved RT. Gjennomføre dette trinnet inne en N 2 -filled hanske bag (Figur 1: Trinn B).
- For å fjerne physisorbed molekyler, sonicate prøven i toluen, aceton, etanol og DDH 2 O i 5 minutter hver, i den rekkefølgen. Skyll prøven fire ganger i frisk DDH 2 O og tørk overflaten under N2 flyt. Overflaten må være hydrofob med en kontaktvinkel på 100 til 110 °.
3. Ex-Situ Surface Mønstring
- Arbeide i en laminær hette, trekke flere riper med en diamant rissenål på overflaten. Merkene hjelpe på å holde styr på de behandlede områdene og også bringe mikroskoper i fokus. Steriliser OTS-belagte TiO 2 ved neddykking av prøven i 70% etanol i 5 min. Skyll prøven to ganger i sterilisert DDH 2 O.
- Plasser prøven i en 35-mm fatet, og tilsett 2 ml PC12 vekstmedium (se trinn 4.2). Inkuber i løpet av 3 timer i en CO2-inkubator (37 ° C). Denne fremgangsmåten er ment å la serumalbuminer absorberer på overflaten. Adsorbert albuminer hemme påfølgende opptak av andre beskyttins og celler (Figur 1: Trinn C).
- Mens du venter, sette opp invertert fluorescens mikroskop.
- Slå på arc lampe, setter UV filter kuben, og sett objektiv til 20X.
- Måle lysintensiteten I (W cm-2) ved hjelp av en UV-intensitet meter, og beregne bestrålingstiden t (i sekunder) for en dose av d (J i cm-2) som: t = d / I.
For eksempel, å bestråle ved en dose på 200 J cm -2 ved hjelp av en lyskilde på 600 mW cm -2, er 333 sekunder for bestråling er nødvendig. - Bruk en scene mikrometer og lukke feltblenderen å angi størrelsen på området som skal bestråles, for eksempel 200 mikrometer.
- Etter 3 timers inkubasjon supplere medium med 200 ul 3,0 mg ml -1-type IV kollagen (Col-IV; sluttkonsentrasjon 300 ug ml -1).
- Overføre 35-mm fatet til mikroskopet scenen. Finn scratch mark, fokusere mikroskopet på prøvens overflate, og bestråle UV-lys i en dose på 200 J cm -2 (Figur 1: Trinn D). Arealet av UV-bestråling kan forandres enten ved å justere åpningen av feltet membran eller ved å erstatte felt membranen med en metallmaske doms geometri.
- Erstatte mediet med et nytt vekstmedium (uten Col-IV), og plasser prøven tilbake i inkubatoren.
4. Cell Culture
- Rutine kultur av PC12-celler blir utført på en kollagen-belagte plastskål.
- Å belegge en 60-mm vev-kultur tallerken med Col-IV, først fukte overflaten med DDH 2 O og aspirer alle DDH 2 O.
- Forbered 300 mikrogram ml -1 Col-IV ved å fortynne den opprinnelige løsningen (3 mg ml -1) 10x med DDH 2 O.
- Tilsett 200 ul av 300 mikrogram ml -1 Col-IV per 60-mm fatet. La løsningen spres gjennom overflaten.
- Dry than rett i en laminær hette for ca 1 time.
- Skyll overflaten to ganger med 4 ml av Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS). Når du ikke bruker belagt fatet umiddelbart, skyll fatet gang med 4 ml DDH 2 O. Etter å aspirere DDH 2 O, lagre fatet i inkubatoren. Prøv ikke å holde den lagret i mer enn to uker.
- PC12-celler blir dyrket i et vekstmedium som består av: Dulbeccos modifiserte Eagles medium (lav glukose) + 10% føtalt bovint serum + 5% hesteserum + 1% penicillin-streptomycin-løsning. Cellene inkuberes i en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2), og erstatte halvparten av mediet annenhver dag. Passage celler før de når samløpet.
- Aspirer vekstmedium, og tilsett 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg -1 ml bovint serumalbumin (BSA) + 10 mM EDTA) forvarmet til 37 ° C. Inkuber i 5 min ved 37 ° C. Forsiktig på fatet for å løsne all cells.
- Samle celler i et 15 ml konisk rør. Skyll formen med 3 ml fersk D-PBS, forvarmet til 37 ° C.
- Sentrifuger røret ved 150 x g i 4 minutter.
- Aspirer supernatanten, og tilsett 1 ml vekstmedium.
- For rutine kultur, splitte cellene 1: 3 til 1: 5.
- Til plate celler på UV-modifiserte OTS / TiO2 prøven, telle celletetthet og tilsett 3,0 × 10 5 celler i en 35-mm parabolen (Figur 1: Trinn E). Inkuber formen i fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 1-2 dager. Både naive og nervevekstfaktor (NGF) -differentiated PC12-celler kan benyttes for de mønster eksperimenter. For NGF differensiering, 100 ng ml -1 av 7S-NGF tilsettes til vekstmediet flere dager før utplating av cellene på prøven. NGF-differensiering ser ut til å øke adhesibility av PC12-celler og muliggjør håndtering lettere, spesielt i in-situ mønster experiments.
5. In-Situ Surface Mønstring
- Etter 1-2 dager med kultur på ex-situ modifisert overflate, bekrefter at cellene fester og vokser bare på UV-bestrålt regionen. Sett opp mikroskop, som beskrevet i trinn 3.4.
- Overføre prøven til en ny 35-mm vevskulturskål inneholdende vekstmedium, 100 ml ng -1 NGF (i tilfellet med anvendelse NGF-differensierte celler), og 100 ug ml -1 Col-IV.
- Sett fatet på mikroskopet scenen. Finner den riktige stilling, og bestråle UV-lys i en dose på 200 J cm -2 (Figur 1: Trinn F, G). Den nyopprettede givende regionen er merket med en stjerne i Figur 1: Trinn G.
- Prøve å fullføre behandlingen av en enkelt prøve i løpet av 30 min. Etter bestråling overføre prøven tilbake i medium uten Col-IV.
- Vær veldig forsiktig når du bærer fatet med cultured celler og overføring av prøven fra fatet å rett å hindre løsne av de mønstrede celler.
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av den totale prosessen. Se teksten for detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser et tverrsnitt scanning elektronmikroskopi (SEM) bilde av frese-avsatte TiO 2 film. Fra den observasjon, ble tykkelsen av filmen estimert til å være ca 150 nm. Merkbar her er flatheten av den avsatte TiO 2 film. Videre analyser av atomic force mikroskopi (AFM) avslørte at rot-middel-kvadrat (rms) jevn overflaten var 0,2 nm (figur 2B).
Da TiO 2 overflate er modifisert med OTS og deretter nedsenket i et serumholdig dyrkningsmedium, serumalbuminer adsorberes på overflaten OTS og inhiberer påfølgende protein adsorpsjon og celleadhesjon 18,20. Senere, når fokusert UV-lys bestråles til overflaten, er reaktive oksygenarter (ROS) generert ved TiO 2 flate 21, som dekomponerer den OTS selvmonterte monosjikt (SAM) på TiO 2 og fjern SAM og den adsorberte enlbumins fra overflaten. Dette gjør det bestrålte område hydrofile og ettergivende til protein adsorpsjon. Direkte interaksjon av ROS med albuminer kan være oppstår samtidig, men dekomponeringen av OTS bør være hovedreaksjonen, ettersom OTS SAM samvirking albumin og TiO 2. I den aktuelle protokoll, er en ekstracellulær matriks protein Col-IV supplert i mediet under bestrålingen, og Col-IV adsorberer fortrinnsvis til den UV-bestrålte område hvor albuminer er fjernet (figur 3A). Andre proteiner som fibronektin kan mønstres på samme protokoll (figur 3B), som indikerer den allsidigheten til denne tilnærmingen.
Serumalbuminer, som også er tilstede i mediet ved UV-bestråling, bør også adsorberes på det bestrålte område, men resultatene tyder på at mengden er ikke så høyt at det på den intakte OTS SAM. For å bekrefte dette, undersøkte vi forskjellen i affinitet for BSAfor UV-bestrålt og intakte OTS Sam av fluorescens mikroskopi av dye-merket BSA. For dette forsøk ble fokusert UV-lys bestråles til OTS / TiO 2 prøve som ikke er blitt nedsenket i serumholdig medium, og deretter ble prøven ble neddykket i en løsning av fluorescein- merket BSA. Figur 3C viser adsorpsjon mønsteret BSA. Lysere fluorescens i det intakte OTS SAM region enn den UV-bestrålte området viser at mengden av adsorbert BSA er høyere i den intakte regionen. Mekanismen for selektiv adsorpsjon kan forstås ved forskjellen i hydrofobisiteten til de to regionene. Mengden av BSA adsorpsjon er kjent for å være høyere på hydrofobe overflater 22, og den intakte OTS SAM-regionen er mer hydrofobt enn den UV-bestrålte området 18.
Mønsteret av Col-IV dermed skapt tjener som et stillas for celleadhesjon. Figur 4A viser NGF-differensierte PC12-celler dyrket på en n ex-situ mønstret regionen for en dag. Deretter ble UV-bestrålt lys til siden av en micropattern, og cellene ble dyrket i ytterligere 5 dager. Som vist i figur 4B-D, cellene ytterligere migrert til den modifiserte region, noe som indikerer at celle affinitet av overflaten var vellykket endret i cellekultur miljø.
Figur 2. Karakterisering av TiO 2 film. (A) Tverrsnitt SEM bilde av prøven. (B) AFM bilde av TiO 2 overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
oad / 53045 / 53045fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 3. Side-selektiv adsorpsjon av proteinene skje på UV-bestrålte området. (A) Fluorescein-merket kollagen (200 um åttekantet mønster) og (B) rhodamin-merket fibronektin (100 um kvadratisk mønster). Selektiv adsorpsjon av disse proteinene er avhengig av fravær av albuminer som blokkerer protein adsorpsjon (C). Merk at i (C), ble OTS SAM ikke nedsenket i serumholdig medium før anvendelse av fluorescein-merket BSA. Skala barer, 100 mikrometer (A) og 50 mikrometer (B, C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ex-situ og in-situ fordelingen av PC12-celler. (A) Klebe PC12 celler på en ex-situ mønstret regionen. Prikket oktogonen indikerer stedet for in-situ UV bestråling. (B - D) migrering av PC12-celler med in-situ mønstrede område, på 2 dager (B), 3 dager (C) og 5 dager (d) etter bestråling. Scale bar, 200 mikrometer. Modifisert med tillatelse fra Yamamoto et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår nåværende protokollen, ble TiO 2 film dannet av RF-magnetronsputring. Vi foretrekker denne metoden for deponering, siden det gjør det mulig å fremstille reproduserbart en fotokatalytisk TiO 2 film med en sub-nm ruhet. Selv frese deponering prosesser er kjent for materialer forskere og elektroniske ingeniører, kan det ikke være ganske tilgjengelig for biologer. I så fall ville spin-belagte TiO 2 film være et alternativt valg 23. I denne fremgangsmåten blir TiO 2 nanopartikler som er oppløst i et løsningsmiddel spres ut på en substratoverflate ved hjelp av sentrifugalkraft. Ekstra utstyr som kreves er en spinnbeleggeren, noe som er mye rimeligere enn en sputtering-system. Vi har brukt for selv en spinn-belagt TiO 2 nanopartikkel film og har bekreftet at filmen kan også anvendes for å utføre lignende eksperimenter (data ikke vist). Overflaten av spin-belagte TiO 2 filmen er forholdsvis grov med et rms ruhet på flere tis fra nm, og det tar litt øvelse for å jevnt pels underlaget reproduserbart spesielt når flere spin belegg er nødvendig for å oppnå tykke filmer. Likevel kan metoden være den første kandidaten for biologer.
Så langt har vi benyttet denne metoden i mønster, ikke bare de PC12 celler, men også en menneskelig kreft i bukspyttkjertelen cellelinje ASPC-en og primær nevroner hentet fra embryonale rotte hippocampi 19. Adhesibility av ASPC-1-celler er mye sterkere enn det som PC12-celler eller hippokampale neuroner, og tilskudd av stillas molekyler, slik som kollagen, ikke var nødvendig i mønstring av dem. Vi ennå oppmerksom på at uspesifikk adhesjon av cellene til ubestrålt regionen ble tidvis observert, noe som trolig skyldes defekter i OTS SAM.
Mønstrings primære nevroner var mye mer utfordrende siden deres adhesibility er svak. Faktisk er det kritiske trinn i den aktuelle prosessen ligger i riktig adsorpsjonav stillaser molekyler. En enkel supplering av kollagen eller laminin var utilstrekkelig til å øke affiniteten av det modifiserte område for nerveceller. Konvensjonell kultur av hippokampale neuroner avhenger av positivt ladet peptid poly-lysin for å belegge overflaten av dekkglass 24. I denne sammenheng er å indusere selektiv festing av poly-lysin til den UV-bestrålte område er ønskelig, men var umulig, siden poly-lysin adsorbert på den intakte OTS SAM-regionen i tillegg. Vi prøvde andre overflatebehandlinger, for eksempel polyetylenglykol-silan Sams og perfluor--silan Sams, for å finne at ingen av disse var bunnstoff til poly-lysin. For å løse dette problemet, vi nylig viste at en kryssbinding molekyl kan brukes til å fremkalle aktiv adsorpsjon av stillas molekyler på UV-bestrålt område 19. Slik seleksjon av stillas molekyler og optimalisering av dens konsentrasjon bør bli utført for hvert eksperiment.
UV-bestråling dosebør også være optimalisert fordi det i høy grad påvirke mengden av protein adsorpsjon. I vårt tilfelle ble fluorescensintensiteten måling brukes til å utlede en optimal UV-dose på 200 J -2 18 cm. Verdien vil sannsynligvis variere avhengig av eksperimentelle parametere som tykkelse og krystalliniteten av TiO 2 film.
Blant forskjellige teknikker for in-situ overflatemodifisering utviklet så langt, den store fordelen ved den foreliggende fremgangsmåte er at den ikke krever organisk syntese av spesialiserte molekyler for behandling av overflaten. Metoden som presenteres her er, i prinsippet, er kompatibel med organiske filmer fremstilt fra det store bibliotek av kommersielt tilgjengelige polymerer, peptider, og SAM-forløpere. Det er også fordelaktig på en måte som den overflatemodifikasjonsprosessen kan utføres ved bruk av konvensjonelt laboratorieutstyr, slik som en bred-felt fluorescens mikroskop utstyrt med en kvikksølv buelampe, som er vist her. Brukeen UV-laser som lyskilde, subcellulære oppløsning ned til ~ 3 um kan oppnås (data ikke vist).
Noen av begrensningene i nåværende fremgangsmåten omfatter irreversibilitet av overflatemodifikasjon, behov for å supplere stillas molekyler i mediet, og generering av ROS. Fremgangsmåten beskrevet her kan anvendes på ikke-permissive til ettergivende omdannelse av overflaten, men omdannelsen er enveis og kan ikke reverseres. For forsøk som krever tilbakeføring omdannelse av celle affinitet, andre metoder 15 som må vurderes. I tillegg krever foreliggende fremgangsmåte stillas molekyler som kollagen for å bli anvendt på bad-cellekulturmediet. Siden populasjon av pre-mønstrede celler uunngåelig ville bli utsatt for molekylene, kan dette begrense noen anvendelse av denne prosessen. Photocatalyzed generering av ROS, så som hydroksylradikaler, ved UV-bestrålte område kan være giftige for nærliggende celler, men i det minste denne effekten ikke varobservert i våre eksperimenter. Selv om dette blir fremtredende for andre programmer, bør dette problemet løses ved å supplere oksygenoppfangere i vekstmedium. Siden de oksygenfangende molekyler ikke ville være plassert mellom TiO 2 og de ikke-mottagelige molekyler på overflaten, er de forventet å eliminere overdreven ROS uten å påvirke kinetikken mønstringsprosess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
