Abstract
Organische Verunreinigungen auf der Oberfläche eines Titandioxid (TiO 2), adsorbiert durch Photokatalyse unter ultraviolettem Licht (UV) zerlegt werden. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll unter Verwendung des TiO 2 Photokatalyse zur Zellaffinität der Substratoberfläche lokal zu verändern. Für dieses Experiment wurde eine dünne TiO 2 -Schicht wurde durch Sputtern beschichtet auf einem Deckglas, und die TiO 2 -Oberfläche wurde anschließend mit einem Organosilan Monoschicht aus Octadecyltrichlorsilan (OTS) ableitet, die die Zelladhäsion hemmt modifiziert. Die Probe wurde in einem Zellkulturmedium eingetaucht ist, und konzentrierte UV-Licht wurde auf einem achteckigen Bereich bestrahlt. Wenn eine neuronale Zelllinie PC12-Zellen wurden auf der Probe überzogen, Zellen, die nur auf die UV-bestrahlte Fläche haftet. Wir zeigen weiter, daß diese Oberflächenmodifikation kann auch in situ erfolgen, das heißt, auch wenn die Zellen auf dem Substrat wächst. Korrekte Modifikation der Oberfläche benötigt eine extrazelluläre Matrix protein Kollagen in dem Medium zum Zeitpunkt der UV-Bestrahlung vorliegen. Die hier vorgestellte Methode kann potenziell in Strukturierung mehrere Zelltypen für den Bau von Co-Kultur-Systeme oder willkürlich zu manipulieren Zellen unter Kultur eingesetzt werden.
Introduction
Halbleiter-Lithographieverfahren und seine Derivate - wie Photolithographie 1,2, Elektronenstrahllithographie 3-6 und 7-10 Mikrokontaktdruck - sind mittlerweile ein etabliertes Werkzeug in der Zellbiologie, lebende Zellen in einer definierten Position und Geometrie wachsen. Die Musterungsverfahren beruht auf der Verwendung von mikro Substrate, bestehend aus Mikro-Insel Zelle permissive Beschichtung in einem nicht-permissiven Hintergrund. Ein solches Substrat dient als Vorlage, um Muster der Zellen. Diese Technologien haben uns zur Verfügung gestellt, die die neuen Methoden, um Zellen und ihre Funktion Ingenieur bei einem Ein- und Mehrzellebene, um die inhärenten Eigenschaften von Zellen zu extrahieren, und um den Durchsatz von zellbasierten Wirkstoff-Screening-11 zu erhöhen.
Der Grad Freiheits in Zellmusterungs würde erheblich zunehmen, wenn die Schablonenmustergeometrie in situ verändert werden, das heißt, während die Zellen auf den n kultivierturface. Die herkömmlichen Verfahren zur Musterbildung kann hier nicht direkt angewendet werden, da sie Verfahrensproben in der Atmosphäre oder im Vakuum. Deshalb werden verschiedene neue Oberflächenmodifikationstechniken sind vorgeschlagen worden, die basieren, zB auf photoreaktiven Verbindungen 12,13 oder Laserablation 5,14, um nur einige zu nennen. Die vorgeschlagenen Verfahren sind gut durch Robertus et al von Choi et al. 16 und Nakanishi 17 überprüft. 15, und in jüngerer Zeit.
Hier in diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode der in-situ-Oberflächenmodifizierung, die Vorteile der photokatalytischen Zersetzung von organischen Molekülen auf einem Titandioxid nimmt (TiO 2) Fläche 18,19. In diesem Verfahren wird ein TiO 2 -Film zwischen dem Glassubstrat und dem organischen Film, der die Zellen eine Schnittstelle eingeführt und der organische Film in situ durch lokales Bestrahlen mit ultravioletten (UV) zerlegtLicht in einem interessierenden Bereich (λ <388 nm). Wir zeigen, dass das neue Protokoll kann verwendet werden, um Mikrostrukturen der extrazellulären Matrixproteinen und lebenden Zellen sowohl ex situ und in situ zu erzeugen. TiO 2 ist biokompatibel, chemisch stabil und optisch transparente, Features, von denen macht es freundlich in Zellkulturexperimenten einzuführen. Dieses Protokoll stellt eine Materialwissenschaften basierte Alternative zur Modifizierung von Zellkultur-Gerüsten in Zellkulturumgebung.
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Protocol
1. Herstellung von TiO 2 beschichtetes Deckglas
- Anzahl die Deckgläser mit einem Diamantreißnadel. Dies trägt nicht nur zur Spur jedes Deckgläschen zu halten, sondern auch um sicherzustellen, dass die richtige Seite der Probe nach oben weist. Reinigen der Deck zunächst unter fließendem ddH 2 O, dann mit dem in Piranha-Lösung eingetaucht werden (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Nach 10 Minuten, spülen Sie die Deckgläser gründlich, 8-mal in ddH 2 O. Trocknen Sie die Deckgläser unter N 2 fließen.
- Eingestellt TiO 2 -Target in der Radiofrequenz (RF) Sputtersystem. Bringen Sie die Deckgläser auf einem Probenhalter der Sputteranlage mit einem Polyimid-Band. Setzen Sie den Probenhalter in der Sputterkammer. Kammer evakuieren bis der Druck 2,0 × 10 -4 Pa.
- Einzuführen Ar-Gas in die Kammer und den Abscheidungsdruck auf 4,0 mTorr. Während der Verschluss geschlossen ist, schrittweise zu erhöhendie HF-Leistung bis 70 W.
- Öffnen des Verschlusses und Sputter für 15 min, um eine Folie mit einer Dicke von 120-150 nm (Abbildung 1: Schritt A) zu erhalten. Wachstumsrate des Films muss für jede einzelne Maschine abgeleitet werden.
2. Oberflächenbeschichtung mit Handy abweisenden Film
- Hydrophilisierung der TiO 2 -Oberfläche durch Behandeln der Probe mit O 2 -Plasma, nach Anweisungen des Herstellers des Plasmareaktors bereitgestellt. Wir behandeln die Probe für 5 Minuten bei 200 W mit O 2 Fluß von 100 sccm. Tauchen Sie die Probe in ddH 2 O und bestätigen, dass die Oberfläche superhydrophil ist. Trocknen Sie die Oberfläche gründlich unter N 2 -Strom.
- Vorbereitung 1 mM Octadecyltrichlorsilan (OTS) Lösung durch Zugabe von 39,6 ul OTS zu 100 ml Toluol gegeben. Eintauchen der Probe in die Lösung für 1 h bei RT. Führen Sie diesen Schritt innerhalb einer N 2 -gefüllten Handschuhbeutel (Abbildung 1: Schritt B).
- Um physisorbierte Moleküle zu entfernen, sonicate die Probe in Toluol, Aceton, Ethanol und ddH 2 O für 5 Minuten jeden, in dieser Reihenfolge. Spülen Sie die Proben vier Mal in frischem ddH 2 O und trocknen Sie die Oberfläche unter einem N 2 -Strom. Sollte die Oberfläche hydrophob mit einem Kontaktwinkel von 100-110 ° betragen.
3. Ex-situ-Oberflächenstrukturierung
- Arbeiten in einer Sterilbank, zu ziehen mehrere Kratzspuren mit einer Diamant-Reißnadel auf der Oberfläche. Die Markierungen helfen bei der Verfolgung der bearbeiteten Regionen und bringt auch Mikroskope in den Fokus. Sterilisieren der OTS-beschichteten TiO 2 durch Eintauchen der Probe in 70% Ethanol für 5 min. Dann zweimal spülen Sie die Probe in sterilisierte ddH 2 O
- Legen Sie die Probe in einem 35-mm-Schale, und 2 ml PC12 Wachstumsmedium (siehe Schritt 4.2). Inkubation für mehr als 3 Stunden in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C). Diese Vorgehensweise soll Serumalbumine absorbiert auf der Oberfläche zu lassen. Adsorbiert Albumine hemmen anschließende Adsorption von anderen proteIns und Zellen (1: Schritt C).
- Während der Wartezeit, die Einrichtung des invertierten Fluoreszenzmikroskop.
- Schalten Sie die Bogenlampe, die UV-Filterwürfel einzufügen, und stellen Sie die Objektivlinse zu 20X.
- Messen der Lichtintensität I (W cm -2) unter Verwendung eines UV-Intensitätsmesser, und berechnen Bestrahlungszeit t (in Sekunden) für eine Dosis von d (in J cm -2) als: t = d / I.
Um zum Beispiel bei einer Dosis von 200 J cm -2 bestrahlt unter Verwendung einer Lichtquelle von 600 mW cm -2, beträgt 333 sec Bestrahlung erforderlich. - Verwenden Sie eine Objektmikrometer und schließen Sie die Feldblende zum Einstellen der Größe der Region zu bestrahlenden, beispielsweise 200 & mgr; m.
- Nach 3 Stunden Inkubation ergänzen das Medium mit 200 ul 3,0 mg ml-1-Typ-IV-Kollagen (Col-IV; Endkonzentration von 300 & mgr; g ml -1).
- Übertragen Sie die 35-mm-Schale auf den Mikroskoptisch. Finden Sie den Kratzer mLade Fokus des Mikroskops auf die Probenoberfläche und Bestrahlen mit UV-Licht bei einer Dosis von 200 J cm -2 (Abbildung 1: Schritt D). Der Bereich der UV-Bestrahlung kann entweder durch Einstellen der Öffnung der Leuchtfeldblende oder durch Ersetzen der Feldblende mit einer Metallmaske Schiedsgeometrie verändert werden.
- Ersetzen Sie das Medium mit frischem Wachstumsmedium (ohne Col-IV), und legen Sie die Probe wieder in den Inkubator.
4. Cell Culture
- Routinekultur von PC12-Zellen wird auf einem kollagenbeschichteten Plastikschale durchgeführt.
- Zur Beschichtung eines 60-mm-Gewebekulturschale mit Col-IV, zuerst die Oberfläche nass mit ddH 2 O und saugen alle ddH 2 O.
- Bereiten 300 & mgr; g ml -1 Col-IV durch Verdünnen der ursprünglichen Lösung (3 mg ml -1) 10x mit ddH 2 O.
- Fügen Sie 200 ul von 300 & mgr; g ml -1 Col-IV pro 60-mm-Schale. Lassen Sie die durch die Oberfläche verteilt Lösung.
- Dry-Ter in einer Laminarströmungshaube Teller für ca. 1 Std.
- Die Oberfläche zweimal gründlich mit 4 ml Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS). Bei Nichtgebrauch des beschichtete Schale sofort, spülen Sie die Teller einmal mit 4 ml ddH 2 O. Nach Absaugen ddH 2 O, speichern Sie die Schüssel in den Inkubator. Versuchen Sie nicht, halten Sie es für mehr als zwei Wochen gelagert.
- PC12-Zellen werden in einem Wachstumsmedium, das besteht aus gewachsen: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (low glucose) + 10% fötales Rinderserum + 5% Pferdeserum + 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen in einem CO 2 Inkubator (37 ° C, 5% CO 2), und ersetzen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Passage-Zellen, bevor sie zu erreichen Fluss.
- Saugen Sie das Wachstumsmedium, und fügen Sie 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 Rinderserumalbumin (BSA) + 10 mM EDTA) vorgewärmt auf 37 ° C. Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht das Gericht auf alle Produkte zu lösenlls.
- Sammeln Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Spülen Sie die Schale mit 3 ml frischem D-PBS, auf 37 ° C vorgewärmt.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 150 · g für 4 min.
- Den Überstand aspirieren, und fügen Sie 1 ml des Wachstumsmediums.
- Für Routinekultur, teilen Sie die Zellen 1: 3 bis 1: 5.
- Um Zellen Platte auf dem UV-modifizierte OTS / TiO 2 Probe zu zählen Zelldichte und fügen Sie 3,0 x 10 5 Zellen in einer 35-mm-Schale (Abbildung 1: Schritt E). Inkubiere die Schale in den befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1-2 Tage. Naiven und der Nervenwachstumsfaktor (NGF) -differentiated PC12-Zellen können für die Strukturierung Experimente eingesetzt werden. NGF Differenzierung werden 100 ng ml -1 von 7S-NGF in das Wachstumsmedium mehrere Tage vor Ausplattieren der Zellen auf die Probe gegeben. NGF-Differenzierung scheint die Haftfähigkeit der PC12-Zellen zu erhöhen und erleichtert die Handhabung, insbesondere bei der in-situ Strukturierungs eXperimente.
5. In-Situ Oberflächenstrukturierung
- Nach 1-2 Tagen Kultur auf die ex-situ modifizierten Oberfläche, zu bestätigen, dass die Zellen für die Befestigung und wächst nur auf dem UV-Bestrahlungsbereich. Richten Sie das Mikroskop, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
- Übertragung der Probe auf eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, die das Wachstumsmedium, 100 ng ml -1 NGF (in dem Fall der Verwendung NGF-differenzierten Zellen) und 100 & mgr; g ml -1 Col-IV.
- Die Schale auf dem Mikroskoptisch. Finden Sie die passende Position, und strahlen UV-Licht bei einer Dosis von 200 J cm -2 (Abbildung 1: Schritt F, G). Die neu erstellte permissive Bereich ist mit einem Sternchen in Figur 1 angegeben: Schritt G.
- Versuchen, die Verarbeitung einer einzelnen Probe innerhalb von 30 Minuten zu vervollständigen. Nach der Bestrahlung, übertragen Sie die Probe wieder in das Medium ohne Col-IV.
- Seien Sie besonders vorsichtig bei der Durchführung die Schale mit cultured Zellen und Überführung der Probe vom Gericht, austeilen Ablösen der strukturierten Zellen zu verhindern.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Siehe Text für Details. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
2A zeigt eine Querschnittsrasterelektronenmikroskopie (SEM) -Bild der durch Sputtern abgelagerten TiO 2 -Films. Aus der Beobachtung wurde Dicke des Films auf ungefähr 150 nm zu sein. Hier fällt auf, die Flachheit des abgeschiedenen TiO 2 -Films. Weiteren Analyse durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) ergab, dass die Wurzel aus dem mittleren quadratischen (RMS) Rauheit der Oberfläche betrug 0,2 nm (2B).
Wenn der TiO 2 -Oberfläche mit OTS modifiziert und dann in einem serumhaltigen Kulturmedium eingetaucht ist, Serumalbumine adsorbieren OTS Oberfläche und hemmen nachfolgenden Proteinadsorption und Zelladhäsion 18,20. Anschließend wird, wenn UV-Licht fokussiert wird auf die Oberfläche bestrahlt wird, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) an der TiO 2 -Oberfläche 21, die den OTS selbstorganisierten Monoschicht (SAM) auf TiO 2 zu zersetzen und zu entfernen und das SAM die adsorbierte eine generiertelbumins von der Oberfläche. Dadurch werden die bestrahlten Bereich philen und permissive Proteinadsorption. Direkte Interaktion des ROS mit Albuminen möglicherweise gleichzeitig auftretenden werden, aber die Zersetzung der OTS sollte die Hauptreaktion, da OTS SAM ein Zusammenwirken Albumin und TiO 2. Im aktuellen Protokoll wird ein extrazelluläres Matrixprotein Col-IV in dem Medium während der Bestrahlung ergänzt und Col-IV adsorbiert bevorzugt an die UV-bestrahlten Bereich, Albumine entfernt sind (3A). Andere Proteine wie Fibronectin kann in dem gleichen Protokoll (3B) strukturiert werden, was die Vielseitigkeit dieses Ansatzes.
Serumalbumine, die auch in das Medium zur Zeit der UV-Bestrahlung vorhanden sind, sollte auch auf dem bestrahlten Bereich zu adsorbieren, aber die Ergebnisse zeigen, dass die Menge nicht so hoch, dass auf der intakten OTS SAM. Um dies zu bestätigen, untersuchten wir den Unterschied in der Affinität von BSAmit UV-bestrahlten und intakte OTS SAM durch Fluoreszenzmikroskopie von Farbstoff-markierten BSA. Für dieses Experiment wurde fokussiert, UV-Licht auf die OTS / TiO 2 Probe, die nicht im Serum enthaltenden Medium eingetaucht wurde, bestrahlt, und dann wurde die Probe in einer Lösung von Fluorescein-markiertem BSA getaucht. 3C zeigt die Adsorption Muster BSA. Hellere Fluoreszenz im intakten OTS SAM Region als der UV-bestrahlten Bereich zeigt, dass die Menge an adsorbiertem BSA in dem intakten Bereich höher. Der Mechanismus der bevorzugten Adsorption kann durch den Unterschied in der Hydrophobie der beiden Regionen zu verstehen. Die Menge an BSA-Adsorption ist bekannt, höher auf hydrophoben Oberflächen 22 sein, und der intakten Bereich OTS SAM ist hydrophober als die UV-bestrahlten Bereich 18.
Das Muster der Col-IV so geschaffene dient als Gerüst für die Zelladhäsion. 4A zeigt NGF-differenzierten PC12-Zellen, die auf eine kultivierte n Ex-situ-strukturierten Gebiet für 1 Tag. Danach wurde UV-Licht auf der Seite eines Mikromuster bestrahlt, und die Zellen wurden weitere 5 Tage kultiviert. Wie in 4B-D gezeigt ist, Zellen weiter zu dem modifizierten Bereich migriert, was darauf hinweist, dass die Zell Affinität der Oberfläche wurde erfolgreich in Zellkulturumgebung modifiziert.
Abbildung 2. Charakterisierung der TiO 2 -Schicht. (A) Querschnitts REM-Aufnahme der Probe. (B) AFM-Bild der TiO 2 -Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3 ortsspezifische Adsorption von Proteinen auf der UV-Bestrahlungsbereich. (A) Fluorescein-markiertem Kollagen (200 & mgr; m achteckiges Muster) und (B) rhodaminmarkierten Fibronektin (100 um² Muster). Bevorzugte Adsorption dieser Proteine beruht auf der Abwesenheit von Albumin, der Proteinadsorption (C) blockieren. Man beachte, dass in (C), OTS SAM wurde in serumhaltigem Medium vor der Anwendung von Fluorescein-markiertem BSA getaucht. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m (A) und 50 & mgr; m (B, C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Ex-situ und in-situ Strukturieren von PC12-Zellen. (A) Die Haftung von PC12-Zellen auf eine ex-situ gemusterten Bereich. Gepunktete Achteck zeigt die Stelle des in-situ-UV-Bestrahlung. (B - D) Migration von PC12-Zellen zu der in situ gemusterten Bereich, um 2 Tage (B), 3 Tage (C) und 5 Tage (D) nach der Bestrahlung. Maßstabsbalken, 200 um. Verändert mit Genehmigung von Yamamoto et al. 18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In unserem aktuellen Protokoll wurde TiO 2 Film von RF-Magnetron-Sputtern gebildet. Wir bevorzugen diese Methode der Abscheidung, da es uns erlaubt, reproduzierbare Herstellung einer photokatalytischen TiO 2 -Schicht mit einer sub-nm Rauheit. Obwohl Sputter-Abscheidungsverfahren vertraut Materialwissenschaftler und Elektronik-Ingenieure sind, kann es nicht ganz zugänglich Biologen sein. In diesem Fall würde spinnbeschichteten TiO 2 -Films 23 eine Alternative sein. Bei diesem Verfahren wird TiO 2 -Nanoteilchen in einem Lösungsmittel gelöst wird auf einer Substratoberfläche durch Zentrifugalkraft verteilt. Besondere Ausrüstung erforderlich ist eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung, die sehr viel günstiger als ein Sputter-System ist. Wir haben für uns selbst eine schleuderbeschichtet TiO 2 Nanopartikel-Film verwendet und haben bestätigt, dass der Film kann auch zur Durchführung von ähnlichen Experimenten werden (Daten nicht gezeigt). Die Oberfläche des spinnbeschichteten TiO 2 -Schicht vergleichsweise rau mit einer RMS-Rauhigkeit von mehreren zehn ists von nm, und es braucht etwas Übung gleichmäßig beschichtet das Substrat reproduzierbar vor allem, wenn mehrere Spin-Beschichtungen sind erforderlich, um dicke Filme erhalten. Dennoch könnte die Methode der erste Kandidat für Biologen sein.
Bisher haben wir diese Methode bei der Musterbildung nicht nur die PC12-Zellen, sondern auch eine menschliche Pankreaskrebszelllinie AsPC-1 und primären Neuronen aus embryonalen Rattenhippokampi 19 erhalten verwendet. Haftfähigkeit des AsPC-1-Zellen sind viel stärker als die von PC12-Zellen oder Hippokampus-Neuronen und Ergänzung von Gerüstmoleküle, wie Kollagen, nicht in Mustern ihnen erforderlich. Wir stellen fest, dass noch nicht-spezifische Adhäsion der Zellen an dem unbestrahlten Region wurde gelegentlich beobachtet, was wahrscheinlich zu Fehlern in der OTS SAM.
Strukturierung primären Neuronen waren viel schwieriger, da ihre Haftfähigkeit ist schwach. In der Tat ist der kritische Schritt des laufenden Prozesses liegt in der richtigen Adsorptionvon Gerüsten Moleküle. Eine einfache Supplementierung von Kollagen oder Laminin nicht ausreichte, um die Affinität des modifizierten Bereichs für die Neuronen zu erhöhen. Herkömmliche Kultur von Hippokampus-Neuronen beruht auf positiv geladene Peptid Poly-Lysin, die Oberfläche des Deckglases 24. In diesem Zusammenhang wird Induzieren selektiver Anbringung von Polylysin an das UV-bestrahlte Fläche gewünscht, aber es war unmöglich, da Poly-Lysin adsorbiert auf dem intakten Bereich OTS SAM ebenso. Wir versuchten anderen Oberflächenbeschichtungen, wie Polyethylenglykol-Silan SAMs und Perfluor-Silan SAMs, um herauszufinden, dass keiner von ihnen waren Anti-Fouling zu Polylysin. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass ein vernetzendes Molekül verwendet werden, um aktive Adsorption der Gerüstmolekülen an die UV-Bestrahlungsbereich 19 zu induzieren. Eine solche Auswahl von Gerüsten Moleküle und Optimierung seiner Konzentration sollte für jedes Experiment durchgeführt werden.
UV-Bestrahlungsdosissollte optimiert werden, da sie stark beeinflußt die Menge der Proteinadsorption. In unserem Fall wurde die Fluoreszenzintensitätsmessung verwendet werden, um eine optimale UV-Dosis von 200 J cm -2 18 abzuleiten. Der Wert wird wahrscheinlich abhängig von Versuchsparametern, wie die Dicke und die Kristallinität der TiO 2 -Schicht zu variieren.
Unter den verschiedenen Techniken der In-situ-Oberflächenmodifizierung so weit entwickelt, ist der große Vorteil des vorliegenden Verfahrens, dass es organische Synthese spezieller Moleküle für die Oberflächenbearbeitung erforderlich. Das hier vorgestellte Verfahren ist prinzipiell mit organischen Filmen aus der umfangreichen Bibliothek von im Handel erhältlichen Polymeren, Peptiden und SAM Vorstufen kompatibel. Es ist auch in dem Sinne, dass die Oberflächenmodifikationsprozess kann unter Verwendung herkömmlicher Laborausrüstung, wie ein Weitfeldfluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberbogenlampe, ausgerüstet werden, wie es hier dargestellt günstig. Verwendungein UV-Laser als Lichtquelle, ein subzelluläres Auflösung von bis zu ca. 3 & mgr; m erreicht werden kann (Daten nicht gezeigt).
Einige Einschränkungen der aktuellen Methode umfassen die Irreversibilität der Oberflächenmodifizierung, müssen zur Ergänzung Gerüstmoleküle in dem Medium, und die Erzeugung von ROS. Das hier beschriebene Verfahren ist anwendbar auf nicht-permissiven um permissive Konversion der Oberfläche, aber die Umsetzung ist eine Einbahnstraße und kann nicht rückgängig gemacht werden. Für Experimente, die die Umkehrumwandlung von Zellaffinität erfordern andere Verfahren 15 berücksichtigt werden müssen. Darüber hinaus ist unser Prozess erfordert Gerüstmoleküle wie Kollagen zu werden, um das Zellkulturmedium Bade angewendet. Da die Bevölkerung von vorstrukturierten Zellen unweigerlich zu den Molekülen ausgesetzt werden, kann dies einige Anwendung dieses Verfahrens zu begrenzen. Photokatalysierten Erzeugung von ROS, wie Hydroxylradikale, an der UV-Bestrahlungsbereich toxisch für Zellen in der Nähe, aber zumindest war dieser Effekt nichtIn unseren Experimenten beobachtet. Auch wenn dies wird prominente für andere Anwendungen sollte dieses Problem durch Hinzu Sauerstoffänger in Wachstumsmedium gelöst werden. Da die Sauerstoff-einfangende Moleküle nicht zwischen dem TiO 2 und den nicht-permissiven Moleküle auf ihrer Oberfläche befinden, sollen sie übermäßige ROS ohne die Strukturierungsprozess Kinetik eliminieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
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