Abstract
Titanyum dioksit yüzeyi (TiO2) üzerinde adsorbe organik kirletici ultraviyole (UV) ışık altında fotokatalizle çürümüş olabilir. Burada yerel alt tabaka yüzeyinin hücre yakınlık değiştirmek için TiO2 fotokatalizden kullanan yeni bir protokol açıklar. Bu deney için, ince bir TiO2 Film püskürtme ile kaplanmış bir cam lamel, ve TiO2 yüzey, daha sonra hücre yapışmasını inhibe eden oktadesiltriklorosilandır (OTS) türetilen bir organosilan tek tabaka ile modifiye edildi. Örnek bir hücre kültürü ortamı içine daldırılır ve UV ışığı sekizgen bölgeye ışınlandı odaklanmıştır. Bir nöronal hücre çizgisi PC12 hücreleri numune üzerine kaplandı, hücreler sadece UV-radyasyona alana bağlı kalmıştır. Biz daha hücre alt-tabaka üzerinde büyüyen bile bu yüzey modifikasyonu, aynı zamanda örneğin, in situ gerçekleştirilebilir göstermektedir. Yüzeyin düzgün modifikasyonu bir hücre dışı matris p gereklikollajen rotein UV ışınlaması sırasında ortam içinde mevcut olması mümkündür. Burada sunulan tekniğin potansiyel kültürü altında hücreleri Coculture sistemlerini inşa veya keyfi işlemek için desenleme çoklu hücre tiplerinde kullanılabilir.
Introduction
Yarıiletken litografi süreçleri ve türevleri - Böyle fotolitografi 1,2, elektron ışını litografi 3-6 ve 7-10 yazdırma microcontact olarak - şimdi tanımlanmış bir konum ve geometri yaşayan hücrelerin büyümesini hücre biyolojisinde kurulmuş bir araç haline gelmiştir. Model verme yöntemi, permisif olmayan arka plan hücre permisif kaplamanın mikro ada oluşan mikrofabrike substratların kullanımına dayanır. Bu gibi alt-tabaka desen hücreleri için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Bu teknolojiler bize hücrelerinin içsel özelliklerinin ayıklamak ve hücre bazlı ilaç tarama 11 verimini artırmak için, bir tek ve çok hücresel düzeyde hücreleri ve bunların fonksiyonlarını mühendisi yeni yöntemler sağlamıştır.
Şablon desen geometrisi, yani yerinde değişmiş olabilir eğer hücreler s kültüre iken derecesi serbestlik hücre desenleme büyük ölçüde, artıracak, sert bir. Atmosferde veya vakumda örnekleri işleme sinyalinden oluşumu için olan klasik yöntemler, doğrudan, burada uygulanamamaktadır. Bu nedenle, çeşitli yeni yüzey modifikasyon teknikleri sadece birkaç isim için, fotoreaktif bileşikler 12,13 veya lazer ablasyon 5,14 tarihinde, örneğin, dayandığı öne sürülmüştür. Önerilen yöntemler güzel Choi ve ark., 16 ile ve Nakanishi'nin 17 tarafından daha yakın. Robertus ark 15 gözden ve oylandı.
İşte bu makalede, biz bir titanyum dioksit organik moleküllerin fotokatalitik ayrışma yararlanır in-situ yüzey modifikasyonu, (TiO2) yüzey 18,19 yeni bir protokol açıklar. Bu yöntemde, bir TiO2 filmi cam alt tabaka ve hücreleri arabirimleri, organik film arasında eklenir ve organik film yerel olarak ultraviyole (UV) ışınıma tabi tutulması işlemiyle in situ parçalanırÇevrede bir bölge (λ <388 nm) ışık. Yeni protokolü hücre dışı matris proteinleri ve canlı hücreler, hem ex situ ve in situ micropatterns oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. TiO2 hücre kültürü deneylerinde tanıtmak kolaylığına özellikleri olan, biyolojik olarak uyumlu, kimyasal olarak stabil, optik olarak saydamdır. Bu protokol, hücre kültürü ortamında hücre kültürü iskeleleri değiştirmek için bir malzeme bilimi tabanlı bir alternatif sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TiO2 hazırlanması 1. cam lamel -kaplı
- Sayı bir elmas Çizici kullanarak lamelleri. Bu, her lamelleri izlemek için değil, aynı zamanda numunenin doğru tarafı yukarı bakacak emin olmak için değil, sadece yardımcı olur. İlk pirana çözelti içine daldırılarak, sonra GKD 2 O akan, lamelleri temizleyin (H 2 SO 4: H2O 2 = 4: 1). 10 dakika sonra, GKD 2 O. iyice 8 kez lamelleri durulama N2 akışı altında lamelleri kurutun.
- Radyo frekans (RF) püskürtme sistemine TiO2 hedefi ayarlayın. Bir poliimid bant kullanarak püskürtme ekipmanı örnek tutucu üzerine lamelleri takın. Püskürtme hücresindeki numune tutucu yerleştirin. Basınç 2.0 × 10 ulaşana kadar odayı boşaltın -4 Pa.
- Odasına Ar gazı tanıtın ve 4.0 mTor için birikim basıncını ayarlamak. Deklanşör kapalı tutarken, yavaş yavaş artış70 W RF güç
- Deklanşör açın ve 120-150 nm'de (Şekil 1: Adım A) bir kalınlığa sahip bir film elde etmek üzere 15 dakika için püskürtmeyle çökeltilmesi. Filmin büyüme hızı, her bir makine için elde edilmesi gerekmektedir.
Hücre tutmayan Film ile 2. Yüzey Kaplama
- Plazma reaktörün üreticisi tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek, O 2 plazma ile numuneyi tedavi ederek TiO2 hidrofilleştirecek. Biz 100 sccm'lik O 2 akışı ile W 200 ° C'de 5 dakika boyunca numune davranın. GKD 2 O numune daldırın ve yüzey süperhidrofilik olduğunu doğrulayın. İyice N2 akışı altında yüzeyi kurulayın.
- 100 ml toluen 39,6 ul OTS ekleyerek 1 mM oktadesiltriklorosilandır (OTS) çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat için çözelti içinde numune bırakın. N 2 dolgulu eldiven torbası (: Adım B Şekil 1) içinde bu adımı gerçekleştirin.
- Physisorbed moleküllerini çıkartmak için, sonicate tolüen, aseton, etanol içinde örnek ve bu sırayla 5 dakika her biri için, GKD 2 O. Taze GKD 2 O örnek dört kez durulayın ve N2 akımı altında yüzeyi kurulayın. Yüzey 100-110 ° bir temas açısına sahip hidrofobik olmalıdır.
3. Eski Yerinde Yüzey Desenlendirme
- Laminer akış kaputu Çalışma, yüzeyde bir elmas Scriber birkaç çizik izleri çizin. Işaretleri işlenen bölgelerin kayıtlarını tutmak ve aynı zamanda odak noktası haline mikroskopları getirmekte yardımcı olur. 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde örnek daldırarak OTS kaplı TiO 2 sterilize edin. Daha sonra sterilize edilmiş GKD 2 O. iki kez numune durulama
- 35 mm çanak örnek yerleştirin ve PC12 büyüme ortamının 2 ml ekleyin (Adım 4.2). Bir CO2 kuluçka makinesi içinde 3 saat boyunca (37 ° C) inkübe edin. Bu prosedür, serum albüminler yüzeye absorbe izin amaçlanmıştır. Adsorplanan albüminler diğer prote sonraki adsorpsiyonu inhibein ve hücreleri (Şekil 1: Adım C).
- Beklerken, ters floresan mikroskop kurdu.
- Ark lambasını açmak UV filtresi küp yerleştirin ve 20X objektif merceği ayarlayın.
- Işık yoğunluğu I (W cm-2) kullanılarak, bir UV-gerilimi ölçü ölçmek ve benzeri gibi (J cm -2) ve d bir doz için (saniye olarak) ışınlama süresi t hesaplayın: t = d / I.
Örneğin, 200 J sm bir dozda radyasyon sağlanması için -2 600 mW cm -2 arasında bir ışık kaynağı kullanılarak, ışınlama 333 sn gereklidir. - Bir sahne mikrometre kullanın ve bölgenin büyüklüğü, örneğin, 200 mikron, ışınlanmış olması ayarlamak için alan diyafram kapatın.
- (Nihai konsantrasyon 300 ug ml -1 Col-IV) 3 saat inkübasyondan sonra, 3.0 mg ml-1 tür IV kolajen 200 ul ortam ek.
- Mikroskop sahneye 35 mm çanak aktarın. Karalama m bulark, örnek yüzeyi üzerine bir mikroskop odak ve 200 J cm -2 (Şekil 1: Basamak D) bir dozda UV ışığını ışın tedavisi. UV ışınlaması alanı alan diyafram açılmasını ayarlayarak ya da tahkim geometri metal maskesi alanında diyafram değiştirerek ya da değişmiş olabilir.
- (Col-IV olmadan) taze büyüme ortamı ile orta değiştirin ve inkübatör geri numuneyi yerleştirin.
4. Hücre Kültürü
- PC12 hücrelerinin rutin kültürü kollajen kaplı plastik tabak üzerinde gerçekleştirilmektedir.
- Kat Col-IV ile 60 mm doku kültürü çanak için önce GKD 2 O ile yüzey ıslak ve tüm GKD 2 O. aspire
- 300 ug ml hazırlayın -1 Col-IV GKD 2 O. ile (3 mg ml -1) 10x orijinal bir çözüm seyreltilmesi ile
- 300 ug ml -1 60 mm tabak başına Col-IV, 200 ul ekleyin. Yüzeyden yayılan bir çözüm olsun.
- Kuru to yaklaşık 1 saat boyunca, bir laminar akış başlığı içinde çanak.
- Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS) 4 ml ile iki kez yüzey durulayın. Hemen kaplı çanak kullanmadığınız zaman, GKD 2 O. 4 ml ile bir kez yıkayın çanak GKD 2 O aspire sonra, inkübatör çanak saklayın. Daha fazla iki hafta boyunca saklanan tutmaya çalışın.
- PC12 hücreleri oluşan bir büyüme ortamında büyütülür: Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (düşük glikoz) +% 10 cenin sığır serumu +% 5 at serumu +% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu. Bir CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2), ve her gün ortamın yarısı değiştirin. Passage hücreleri izdiham ulaşmadan.
- Aspire büyüme ortamı ve ek 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg mi -1 sığır serum albümini (BSA), 10 mM EDTA), 37 ° C'ye ön ısıtılmıştır. 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Yavaşça tüm ce ayırmak için çanak dokununlls.
- 15 ml konik tüp hücreleri toplayın. 37 ° C'ye ön ısıtılmıştır taze D-PBS 3 ml çanak yıkayın.
- 4 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj tüpü.
- Süpernatanı havalandırın, ve büyüme ortamı 1 ml.
- 1: 3: Rutin kültür için, hücreler 1 bölünmüş 5.
- UV-modifiye OTS / TiO2 numune üzerinde hücreleri plaka hücre yoğunluğu saymak ve 35 mm çanak (Şekil 1: Adım E) 3.0 × 10 5 hücre eklemek için. 1-2 gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatör çanak (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin. Hem saf ve sinir büyüme faktörü (NGF) -differentiated PC12 hücreleri desen deneyleri için de kullanılabilir. NGF farklılaşma için, 7S-NGF'nin 100 ng ml -1 numune üzerine hücreleri kaplama önce büyüme ortamı birkaç gün eklenmektedir. NGF farklılaşma PC12 hücrelerinin adhesibility artırmak gibi görünüyor ve özellikle situ desenlendirme e, kolay taşıma yaparxperiments.
5. Yerinde Yüzey Desenlendirme
- Ex-situ modifiye yüzey üzerinde kültür 1-2 gün sonra hücreler ekleyerek ve UV-ışınlanmış bölgeye sadece büyüyor onaylayın. Adım 3.4 anlatıldığı gibi, mikroskop ayarlayın.
- Büyüme ortamı içeren yeni bir 35 mm doku kültürü çanağı numune aktarın (NGF diferansiye hücrelerin kullanılması halinde) 100 ng ml -1 NGF ve 100 ug ml -1 Col-IV.
- Mikroskop sahnede çanak yerleştirin. Uygun yerini bulur ve 200 J cm -2 (Şekil 1: Adım F, G) bir dozda UV ışığını ışın tedavisi. Yeni oluşturulan hoşgörülü bölge Şekil 1'de bir yıldızla gösterilir: Adım G.
- 30 dakika içinde tek bir örnek işlenmesini tamamlamaya çalışın. Işınlama sonrası, Col-IV olmadan geri ortama örnek aktarmak.
- Cu ile çanak taşırken çok dikkatli olunltured hücreleri ve çanak numune transfer desenli hücrelerin ayırma engellemek için çanak.
Genel sürecin 1. şematik çizimi Şekil. Ayrıntılar için metne bakınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A, püskürtme ile tevdi TiO2 filmin bir kesit tarama elektron mikroskobu (SEM) görüntüsünü göstermektedir. Gözlemlerden sonra filmin kalınlığı yaklaşık 150 nm olarak tahmin edilmiştir. Burada dikkat çekici tevdi TiO2 filmin düzlüğü olduğunu. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile daha fazla analiz yüzeyinin kök ortalama kare (rms) pürüz 0.2 nm (Şekil 2B) olduğunu ortaya koymuştur.
TiO2 yüzeyi OTS ile modifiye edilmiş ve daha sonra bir serum ihtiva eden büyüme ortamına temas ettiğinde serum albüminler OTS yüzeyi üzerine adsorbe etme ve daha sonra da protein adsorpsiyon ve hücre yapışmasını inhibe 18,20. Odaklı UV ışığı yüzeye ışınlanmış zaman Ardından, reaktif oksijen türleri (ROS) TiO2 üzerine OTS kendi kendine monte tek tabaka (SAM) ayrıştırmak ve SAM ve adsorbe a kaldırmak TiO2 yüzeyinde 21 de oluşturulurYüzeyden lbumins. Bu hidrofilik ve protein adsorpsiyonu permisif ışınlanmış bölgesini oluşturur. Albüminleri ile ROS doğrudan etkileşim aynı anda meydana olabilir, ama OTS SAM albümin ve TiO2 arabirim beri OTS ayrışma, ana reaksiyon olmalıdır. Mevcut protokolde, hücre dışı bir matris proteini Col-IV ışınlama sırasında ortam içinde ilave edilir ve Col-IV albüminler kaldırılır UV ışınlanmış bölgede bulundu (Şekil 3A), tercihen absorbe eder. Örneğin fibronektin gibi başka proteinler, bu yaklaşımın çok yönlülüğü belirten aynı protokolü (Şekil 3B) desenli olabilir.
UV ışınlama zamanında ortam içinde mevcut olan serum albüminler, aynı zamanda ışınlanmış bölgeden üzerine adsorbe, ancak sonuçlar miktarda sağlam OTS SAM o kadar yüksek olmadığını göstermektedir. Bunu doğrulamak için, BSA afinite fark incelenmiştirboya etiketli BSA floresan mikroskobu ile UV-ışınlanmış ve bozulmamış OTS SAM için. Bu deney için, odaklanmış UV ışığı serum ihtiva eden ortamda daldırılmış edilmemiştir OTS / TiO2 örnek ışınlandı ve sonra örnek etiketli fluorescein eden bir çözeltiye daldırıldı BSA. Şekil 3C, adsorpsiyon modelini gösterir BSA. UV ışınlanmış alanından daha sağlam OTS SAM bölgesinde Parlak floresan adsorbe BSA miktarı sağlam bölgede daha yüksek olduğunu gösterir. Tercihli adsorpsiyon mekanizması iki bölgede hidrofobisitesinin farkla anlaşılabilir. BSA adsorpsiyon miktarı hidrofobik yüzeyler 22 daha yüksek olduğu bilinen ve sağlam OTS SAM bölgesi UV ışınlanmış bölgeden 18 birden fazla hidrofobik olan bir.
Bu şekilde oluşturulan Col-IV model Hücre yapışması için bir yapı iskelesi olarak işlev görür. Şekil 4A, bir kültüre NGF farklılaşmış PC12 hücreleri göstermektedir n ex-situ 1 gün bölgeyi desenli. Daha sonra, UV ışığı mikrodesenlerle tarafına ışınlandı ve hücreler ek bir 5 gün süre ile kültürlenmiştir. Şekil 4B,-D gösterildiği gibi, hücreler daha fazla yüzey hücresi afinite başarılı bir hücre kültürü ortamında değiştirilmiş olduğunu gösteren, tadil edilmiş bölgeye göç.
Şekil TiO2 filmin 2. Karakterizasyonu. (A) numunesinin kesit SEM görüntüsü. TiO2 yüzeyinde (B) AFM görüntüsü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAD / 53045 / 53045fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
UV ışınlanmış bölge üzerine proteinlerin Şekil 3. Sitesi seçici adsorpsiyon (A). Flüoresanla etiketlenmiş kollajen (200 um sekizgen deseni) ve (B) rodamin etiketli fibronektin (100 um kare şablonu). Bu proteinlerin Tercihli adsorpsiyon protein adsorpsiyonu (C) blok albüminleri yokluğunda dayanmaktadır. (C) 'de dikkat ediniz, OTS SAM fluoresan etiketli BSA uygulanmasından önce, serum ihtiva eden ortam içinde daldırılmayan. Ölçek barlar, 100 mikron (A) ve 50 mikron (B, C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Ex-situ ve PC12 hücrelerinde in-situ desen. Bir ex-situ desenli bölgeye üzerine PC12 hücreleri (A) Yapışma. Noktalı sekizgen in-situ UV ışınlaması siteyi gösterir. (B - D) ışınlama 2 gün sonra (B), 3 gün (C) ve 5 gün boyunca (D) in-situ desenli bölgeye PC12 hücrelerinin göç. Ölçek çubuğu, 200 mikron. Yamamoto ve ark., 18 izni ile Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokolde, TiO2 filmi RF-manyetik alanda sıçratma tarafından kuruldu. Bize tekrarlanabilir bir alt-nm pürüzlülüğü ile fotokatalitik TiO2 filmi hazırlamak için izin verir çünkü biz birikimi bu yöntemi tercih. Püskürtülerek bırakma süreçleri malzeme bilim adamları ve mühendisleri elektronik tanıdık olmasına rağmen, biyologlar oldukça erişilebilir olmayabilir. Bu durumda, spin-kaplı TiO2 filmi alternatif bir seçenek 23 olacaktır. Bu yöntemde, bir çözücü içinde çözülmüş TiO2 nanopartiküller santrifüj kuvveti ile, bir alt-tabaka yüzeyi üzerinde yayılır. Gerekli özel ekipman püskürtme sisteminden çok daha uygun fiyatlı bir spin lak vardır. Biz kendimiz için bir spin-kaplı TiO2 nanopartikül filmi kullanmış ve film de benzer deneyler yürütmek için kullanılabileceğini doğruladı (veriler gösterilmemiştir). Spin-kaplı TiO2 filmin yüzey birkaç on bir etken sertliği ile nispeten kabanm s ve tekrarlanabilir özellikle birden fazla sıkma kaplamaları kalın filmler elde etmek için ihtiyaç duyulduğunda düzgün ceket substrat bazı pratik alır. Bununla birlikte, yöntem biyologlar için ilk aday olabilir.
Buraya kadar, desen sadece PC12 hücreleri, aynı zamanda, bir insan pankreas kanseri hücre çizgisi ASPC-1 ve embriyonik sıçan Hipokampuslardan 19 elde edilen birincil nöronlar bu yöntem kullanmışlardır. ASPC-1 hücrelerinin Adhesibility PC12 hücrelerinin ya da hippokampal nöronlar, ve iskele molekülleri, kolajen gibi, bunları desenleme gerekli değildi takviyesi çok daha güçlüdür. Henüz nedeniyle OTS SAM hatalarına muhtemelen zaman gözlenmiştir ışınlanmamış bölgeye hücrelerin spesifik olmayan yapışma not edin.
Onların adhesibility zayıf olduğundan desenleme birincil nöronlar çok daha zorlu idi. Aslında, mevcut sürecin kritik adımı doğru adsorpsiyon yatıyormoleküllerini iskele. Kollajen veya laminin basit bir takviye nöronlar değiştirilmiş bölgenin afinitesini geliştirmek için yeterli değildir. Hipokampal nöronlar geleneksel kültür kaplamak için lamel 24 yüzeyine pozitif yüklü peptit poli-lizin dayanır. Bu bağlamda, UV ışınlanmış alana poli-lizin indükleyici seçici bağlanma arzu edilmektedir, ancak aynı zamanda sağlam OTS SAM bölgeye poli-lisin adsorbe yana imkansızdı. Biz bu hiçbiri bir anti-kirlenme olan poli-lizin bulmak için, polietilen glikol-silan SAM ve perfluoro-silan SAM gibi diğer yüzey kaplamaları, denedik. Bu sorunu çözmek için, çok yakın bir çapraz bağlama molekülü UV radyasyona bölge 19 üzerine iskeleler moleküllerin aktif adsorpsiyonu uyarılması için kullanılabileceğini göstermiştir. Iskeleler moleküller ve konsantrasyonu optimizasyonu böyle bir seçimi, her bir deney için gerçekleştirilmelidir.
UV ışınlama dozukuvvetle Protein adsorpsiyonu miktarını etkilediği de optimize edilmelidir. Bizim durumumuzda, floresan yoğunluğu ölçümü 200 J cm -2 18 optimal bir UV dozu elde etmek için kullanılmıştır. Değeri, kalınlık ve TiO2 film kristalinite gibi deneysel parametrelere bağlı olarak değişebilmektedir.
Şimdiye kadar geliştirilmiş in situ yüzey modifikasyonu, çeşitli teknikler arasında, bu yöntemin önemli bir avantajı, bir yüzey işleme için özel moleküllerin organik sentezleri gerektirmez olmasıdır. Burada sunulan yöntem ticari olarak temin edilebilen polimerler, peptidler ve SAM öncüleri büyük kütüphanesinden hazırlanan organik film ile uyumlu, ilke olarak,. Aynı zamanda, burada gösterildiği gibi yüzey modifikasyon işlemi, bir cıva arklı bir lambayla donatılmış bir geniş alan floresan mikroskop gibi geleneksel laboratuar ekipmanı kullanılarak ifa edilebilir bir anlamda uygundur. KullanımıIşık kaynağı olarak bir UV lazeri, ~ 3 um kadar hücre içi çözünürlük elde edilebilir (veri gösterilmemiştir).
Geçerli yöntemin bazı sınırlamaları ROS, orta iskele molekülleri tamamlayan için gereken yüzey modifikasyonu geri döndürülemez ve nesil içerir. Burada tarif edilen işlem, yüzeyin permisif dönüşüm non-permisif uygulanabilir olmakla birlikte, dönüşüm tek yönlü ve geri alınamaz. Hücre afinite ters dönüşüm gerektiren deneyleri için, başka yöntemler de 15 dikkate alınması gerekir. Buna ek olarak, işlem, hücre kültür ortamına banyosu-uygulanacak kolajen gibi iskele molekülleri gerektirir. Önceden desenli hücreleri popülasyonu kaçınılmaz moleküllere maruz kalacağı için, bu sürecin bir uygulaması sınırlayabilir. UV ışınlanmış bölgede hidroksil radikalleri gibi ROS Photocatalyzed nesil, yakındaki hücreleri için toksik olabilir, ama en azından bu etki değildiBizim deneylerde gözlenen. Bu diğer uygulamalar için öne çıkmaktadır bile, bu sorunun büyüme ortamında oksijen temizleyiciler tamamlayan tarafından çözülmelidir. Molekülleri atma oksijen TiO2 ve yüzeyinde olmayan müsamahakâr moleküller arasında yer olmaz çünkü onlar desenlendirme işlemi kinetik etkilemeden aşırı ROS ortadan bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
