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Bioengineering

TiOを使用して水性環境中のタンパク質や細胞を光パターニング Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/53045
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 2,4, 2,5, 6
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 2CREST, Japan Science and Technology Agency, 3School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, 4Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 5Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, 6Faculty of Science and Engineering, Waseda University

Abstract

二酸化チタン（TiO 2）の表面に吸着した有機汚染物質は、紫外線（UV）光の下で光触媒により分解することができます。ここでは、局所的に、基板表面の細胞親和性を変化させるためにTiO 2の光触媒を採用した新たなプロトコルを記述します。この実験では、薄膜のTiO 2膜をスパッタコーティングしたカバーガラス上で、TiO 2の表面は、続いて、細胞接着を阻害オクタデシルトリクロロシラン（OTS）に由来するオルガノシラン単層で修飾しました。サンプルは、細胞培養培地中に浸漬し、UV光を八角形の領域に照射された焦点を合わせました。神経細胞株PC12細胞を試料上にプレーティングしたときに、細胞は、UV照射領域に接着しました。我々はさらに、細胞を基板上に成長している場合でも、この表面改質はまた、 例えば 、 その場で行うことができることを示しています。表面の適切な修飾は、細胞外マトリックスpを必要とUV照射時に培地中に存在することが、コラーゲンをrotein。ここに提示された技術は、潜在的に共培養システムを構築するか、任意の培養で細胞を操作するための複数の細胞型のパターン化に用いることができます。

Introduction

半導体リソグラフィプロセスおよびその誘導体- 、フォトリソグラフィ1,2、電子ビームリソグラフィ3-6、および7-10を印刷マイクロコンタクトとしては-今定義された位置と形状に生きた細胞を成長させるために、細胞生物学の確立ツールとなっています。パターニング方法は、非許容バックグラウンドでセル許容コーティングのミクロの島からなる、微細加工された基板の使用に依存しています。このような基板は、パターンセルをするためのテンプレートとして機能します。これらの技術は、私たちの細胞の本質的な特性を抽出すること、及び細胞ベースの薬物スクリーニング11のスループットを高めるために、単一および多細胞レベルでの細胞およびそれらの機能を設計するための新規な方法を提供しています。

テンプレートのパターン形状を、すなわち 、 その場で変更することができれば、細胞がS上で培養されながら、自由度のセルのパターニングでは大きく増加しますurface。これらは大気中または真空中でサンプルを処理するためのパターン形成のための従来の方法は、直接、ここでは適用できません。そのため、様々な新しい表面改質技術はちょうど少数を示すために、光反応性化合物12,13またはレーザーアブレーション5,14に、 例えば 、基になっている、提案されています。提案された方法はうまくチョイら 16と中西17によって、より最近になって。Robertusらによって 15を見直し、されています。

ここでは、この記事では、我々は、二酸化チタン上に有機分子の光触媒分解を利用していますin-situで表面修飾、（TiO 2の）表面18,19の新規のプロトコルを記述します。この方法では、TiO 2のフィルムは、ガラス基板と細胞膜の間に有機インターフェースに挿入され、有機膜が局部的に紫外線（UV）を照射することにより、その場で分解され関心領域（λ<388 nm）での光。新たなプロトコルは、細胞外マトリックスタンパク質および生細胞の両方の現場外のその場での微細パターンを作成するために使用できることを示します。 TiO 2は、細胞培養実験に導入することがフレンドリーになる特徴、そのうちの、生体適合性の化学的に安定し、光学的に透明です。このプロトコルは、細胞培養環境での細胞培養足場を修正するための材料科学ベースの代替手段を提供します。

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Protocol

TiO 2の調製は、ガラスカバースリップをコーティングを採用しました

  1. ナンバーダイヤモンドスクライバーを使用してカバースリップ。これは、各カバースリップを追跡するためだけでなく、サンプルの正しい側が上を向いていることを確実にするためだけではなく役立ちます。次にピラニア溶液にそれらを浸漬することにより、第一のddH 2 Oを実行して下に、カバーガラスを清掃し（H 2 SO 4：H 2 O 2 = 4：1）。 10分後、のddH 2 Oに、徹底的に8回をカバースリップをすすぎN 2気流下でカバーガラスを乾燥させます。
  2. 無線周波数（RF）スパッタリング装置にTiO 2のターゲットを設定します。ポリイミドテープを用いたスパッタリング装置の試料ホルダー上にカバーガラスを取り付けます。スパッタチャンバー内の試料ホルダーを配置します。圧力が2.0×10 -4 Paのに達するまで室を避難させます。
  3. チャンバー内にArガスを導入し、4.0トルの堆積圧力を設定します。シャッターが閉じ維持しながら、徐々に増加W. 70へのRF電力
  4. シャッターを開き、120〜150ナノメートル（ 図1：ステップA）の厚さのフィルムを得るために15分間スパッタ。膜の成長速度は、マシンごとに導出する必要があります。

セル・撥水膜との2表面コーティング

  1. プラズマ反応器のメーカーが提供する説明書に従って、O 2プラズマで試料を処理することにより、TiO 2の表面を親水化。私たちは、100 SCCMのO 2流量で200 Wで5分間サンプルを処理します。 ddH 2 Oにサンプルを浸し、表面が超親水であることを確認します。 N 2気流下で完全に表面を乾燥させます。
  2. 100ミリリットルのトルエンに39.6μlのOTSを追加することによって、1mMのオクタデシルトリクロロシラン（OTS）溶液を調製します。室温で1時間、溶液中の試料を浸し。 N 2 -filledグローブバッグ（：ステップB 図1）の内部では、この手順を行ってください。
  3. 物理吸着分子を除去するために、sonicat電子トルエン、アセトン、エタノール中のサンプル、及びその順序で各5分間、のためのddH 2 Oを。新鮮なのddH 2 O中でサンプルを4回すすぎ、N 2気流下で表面を乾燥。表面は100〜110°の接触角を有する疎水性でなければなりません。

3. 現場外表面パターニング

  1. 層流フードでの作業、表面にダイヤモンドスクライバーで数スクラッチマークを描きます。マークが処理された領域を追跡し、また焦点に顕微鏡をもたらすのに役立ちます。 5分間70％エタノール中にサンプルを浸漬することにより被覆されたOTSのTiO 2を殺菌します 。その後、滅菌のddH 2 Oで二回サンプルをすすぎ
  2. 35-mmディッシュ内のサンプルを置き、PC12成長培地2mlを追加し（ステップ4.2を参照）。 CO 2インキュベーター（37℃）で3時間以上インキュベートします。この手順は、血清アルブミンの表面上に吸収させることを意図しています。吸着アルブミンは他のproteのその後の吸着を阻害しますインと細胞（ 図1：ステップC）。
  3. 待っている間に、倒立蛍光顕微鏡を設定します。
    1. 、アークランプをオンにするUVフィルターキューブを挿入し、20X対物レンズを設定します。
    2. 光強度Iを測定する（W cm -2の）紫外線強度計を用いて、 および dの用量のために（秒）照射時間Tを算出する（Jセンチ-2）として：T = D / I。
      例えば、200 J cmの線量で照射すること-2 600ミリワットのcm -2での光源を用い、照射の333秒が必要です。
    3. ステージマイクロメータを使用して、 例えば 、照射される領域のサイズを設定するには、200ミクロンの視野絞りを閉じます。
  4. 3時間のインキュベーションの後、3.0 mgのmlの200μlの-1 IV型コラーゲン（;最終濃度は300μgmlの-1 COL-IV）を含む培地を補います。
  5. 顕微鏡ステージに35-mmディッシュを転送します。スクラッチメートルを探しますアークは、試料表面上に顕微鏡の焦点を合わせると、200 Jセンチ-2（ 図1：ステップD）の投与量でUV光を照射します。 UV照射の領域は、視野絞りの開度を調整することにより、または仲裁ジオメトリのメタルマスクを用いて視野絞りの交換のいずれかによって変更することができます。
  6. （COL-IVなし）新鮮な増殖培地で培地を交換し、バックインキュベーター内のサンプルを配置します。

4.細胞培養

  1. PC12細胞のルーチン培養物を、コラーゲンコートされたプラスチックディッシュ上で行われます。
    1. コートCOL-IVと60 mmの組織培養皿に、最初のddH 2 Oで表面を濡らし、すべてのddH 2 Oを吸引
    2. 元の溶液を希釈して300μgのmlの-1 COL-IVを準備するのddH 2 Oで（3ミリグラムml -1の）10倍
    3. 300μgのmlの200μlの-1 60-mmディッシュあたりCOL-IVを追加します。表面を介して広がるソリューションをしてみましょう。
    4. ドライトン彼は約1時間、層流フード内で皿。
    5. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）4mlで二回表面をすすぎます。すぐにコートディッシュを使用しない場合、のddH 2 Oの4ミリリットルで一回の皿をすすぎddH 2 Oを吸引した後、インキュベーターで料理を格納します。それが2週間以上保存され維持しないようにしてください。
  2. ダルベッコ改変イーグル培地（低グルコース）+ 10％ウシ胎児血清+ 5％ウマ血清+ 1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液：PC12細胞から成る増殖培地中で増殖させます。 CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートする（37℃、5％CO 2）、一日おきに培地の半分を交換します。継代細胞は、それらがコンフルエンスに到達する前に。
    1. 吸引は、増殖培地、及び追加の2 mlのPBS +（D-PBS +の10mg ml -1の牛血清アルブミン（BSA）+ 10mMのEDTA）を37℃に予熱。 37℃で5分間インキュベートします。静かに、すべてのCEを切り離すために料理をタップLLS。
    2. 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞を収集します。 37℃に予熱し、新鮮なD-PBS 3mlで料理を、洗浄します。
    3. 4分間150×gでチューブを遠心。
    4. 上清を吸引除去し、成長培地1mlを加えます。
    5. 1：3：ルーチン培養のため、細胞を1分割5。
  3. UV-修正OTS / TiO 2のサンプルの細胞をプレートに、細胞密度をカウントし、35-mmディッシュで3.0×10 5細胞 （ 図1：ステップE）を追加します。 1~2日間の加湿インキュベーター（37℃、5％CO 2）で皿をインキュベートします。両方のナイーブおよび神経成長因子（NGF）-differentiated PC12細胞は、パターニング実験に使用することができます。 NGF分化のために、7S-NGFの100 ngのmlの-1は数日間試料上に細胞をプレーティングする前に増殖培地に添加されます。 NGF分化は、PC12細胞の密着性を高めるように見える、特にその場でパターニング e。で、扱いやすくなりますxperiments。

5. その場表面パターニング

  1. 現場外改変された表面上での培養の1〜2日後、細胞を取り付け、紫外線照射された領域のみに成長していることを確認します。ステップ3.4で説明したように、顕微鏡を設定します。
  2. 成長培地を含む新しい35-mm組織培養皿にサンプルを転送し、100 ngのmlの-1 NGF（NGF分化細胞を用いた場合）、および100μgmlの-1 COL-IV。
  3. 顕微鏡ステージ上の皿を置きます。適切な位置を見つけ、200のJ cm -2の（ 図1：工程F、G）の線量のUV光を照射します。新しく作成された許容領域は、 図1のアスタリスクで示されます。ステップG.
  4. 30分以内に単一のサンプルの処理を完了してみてください。照射後、COL-IVなしにバック中にサンプルを転送します。
  5. Cuと料理を運ぶ時は十分に注意してくださいltured細胞や皿からサンプルを転送するには、パターン化された細胞の着脱防止するために皿に。

図1
全体的なプロセスの1模式図を図。詳細は本文を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Representative Results

図2Aは、スパッタ堆積のTiO 2膜の断面の走査型電子顕微鏡（SEM）像を示します。観察から、フィルムの厚さは150nm程度であると推定されました。ここで顕著な堆積のTiO 2膜の平坦性があります。原子間力顕微鏡（AFM）によるさらなる分析は、表面の二乗平均平方根（RMS）粗さは0.2nmで（ 図2B）であることが明らかになりました。

TiO 2の表面をOTSで変性し、次に血清含有成長培地に浸漬したとき、血清アルブミンは、OTS表面に吸着およびその後のタンパク質吸着および細胞接着を阻害する18,20。その後集束UV光を表面に照射されたときに、反応性酸素種（ROS）は、OTSの自己組織化単分子膜（SAM）を分解したTiO 2表面21にて生成されたTiO 2上とSAMを除去し、吸着されたA表面からlbumins。これは、親水性とタンパク質吸着の許容照射領域をレンダリングします。アルブミンとROSの直接の相互作用が同時に発生している可能性がありますが、OTS SAMがアルブミンとTiO 2をインターフェースしているのでOTSの分解は、主反応である必要があります。現在のプロトコルでは、細胞外マトリックスタンパク質COL-IVは、照射中に培地に補充され、COL-IVは、アルブミンが除去されるUV照射領域（ 図3A）に優先的に吸着します。例えば、フィブロネクチンのような他のタンパク質は、このアプローチの多用途性を示し、同じプロトコル（ 図3B）にパターニングすることができます。

また、UV照射時の培地中に存在する血清アルブミンもまた、照射領域に吸着する必要があり、その結果は量が無傷OTS SAM上と高くないことを示唆しています。このことを確認するために、我々は、BSAの親和性の違いを調べました紫外線照射し、そのままOTS SAMへの色素標識BSAの蛍光顕微鏡による。この実験では、UV光を血清含有培地中に浸漬されていないし、サンプルをフルオレセイン標識BSAの溶液中に浸漬したOTS / TiO 2の試料に照射された焦点を当てた。 図3Cは、吸着パターンを示しますBSA。紫外線照射された領域よりも、完全なOTS SAM地域の明るい蛍光は、吸着、BSAの量は、完全な地域の方が高いことを示しています。優先的な吸着機構は、二つの領域の疎水性の差によって理解することができます。 BSAの吸着量は、疎水性表面22に高いことが知られており、無傷のOTS SAM領域がUV照射領域18よりも疎水性です。

このようにして作成COL-IVのパターンは、細胞接着のための足場として機能する。 図4（a）は、上で培養し、NGF分化PC12細胞を示しています 1日のn個のエクスサイチュパターン領域。次に、UV光は、微細パターンの側面に照射し、細胞をさらに5日間培養しました。 図4B-Dに示されるように、細胞は、さらに、表面の細胞親和性は、正常細胞培養環境で変更されたことを示す、変更された領域に移動しました。

図2
図のTiO 2膜のキャラクタリゼーション2（A）サンプルの断面SEM像。 TiO 2の表面の（B）AFM像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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紫外線照射された領域へのタンパク質の図3.サイト選択吸着。（A）フルオレセイン標識したコラーゲン（200μmの八角形のパターン）と（B）ローダミン標識フィブロネクチン（100μm角のパターン）。これらのタンパク質の優先的な吸着は、タンパク質吸着（C）をブロックアルブミンの非存在に依存しています。 （C）に 、OTSのSAMは、従来のフルオレセイン標識BSAのアプリケーションに血清含有培地に浸漬されていなかったことに注意してください。スケールバーは100μm（A）と 50ミクロン（B、C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4. 現場外とPC12細胞のin-situでパターニング。 エクスサイチュパターン領域へのPC12細胞の（A）の接着。八角形の点線は、 その場で UV照射の部位を示します。 （B - D）照射後2日目（B）、3日（C）、および5日目（D）においてその場パターン領域へのPC12細胞の移動、。スケールバー、200μmです。山本らは、18の許可を得て変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

我々の現在のプロトコルでは、TiO 2の膜は、RFマグネトロンスパッタ法により形成しました。それは、私たちは再現性のサブnmの粗さと光触媒の TiO 2膜を作製することができますので、我々は、堆積のこの方法を好みます。スパッタ成膜プロセスは材料科学者や電子技術者によく知られているが、それは生物学者に非常にアクセスできないことがあります。その場合には、スピンコートされたTiO 2のフィルムは、代替選択肢23あろう。この方法では、溶媒に溶解させたTiO 2ナノ粒子は、遠心力によって基板表面上に広げられます。必要な特別装備は、スパッタリング装置よりもはるかに手頃な価格で、スピンコーター、です。私たち自身のためにスピンコーティングしたTiO 2ナノ粒子の膜を使用したフィルムはまた、同様の実験を行うために使用することができることを確認した（データは示さず）。スピンコートされたTiO 2膜の表面には、数十のrms粗さを有する比較的粗いですナノメートルの、そしてそれは、複数のスピンコーティングが厚い膜を得るために必要とされるときに再現特に基板均一にコーティングするためにいくつかの練習を取ります。それにもかかわらず、この方法は、生物学者のための第一候補であるかもしれません。

これまでのところ、我々は、パターンだけでなく、PC12細胞だけでなく、ヒト膵臓癌細胞株のAsPC-1および胚ラットの海馬19から得られた一次ニューロンにおいて、この方法を利用してきました。 AsPC-1細胞の密着力は、PC12細胞または海馬ニューロン、および足場分子、コラーゲンなど、それらをパターニングする際に必要とされなかったの補充のそれよりもはるかに強いです。我々はまだたぶんOTS SAMの欠陥が原因である、非照射領域への細胞の非特異的な接着が時折観察されたことに注意してください。

その粘着力が弱いため、パターニング一次ニューロンは、はるかに挑戦しました。実際には、現在のプロセスの重要なステップは、適切な吸着にあり足場分子の。コラーゲンやラミニンの簡単な補充は、ニューロンのための改質領域の親和性を増大させるには不十分でした。海馬ニューロンの従来の文化はコートにカバーガラス24の表面を正に荷電したペプチドポリリジンに依存しています。この文脈では、紫外線照射領域にポリリジンの誘導選択的結合が望まれるが、それだけでなく、完全なOTS SAM領域上のポリ - リジン吸着するので不可能でした。我々は、これらのどれもが、ポリ - リジンに防汚なかったことを見つけるために、ポリエチレングリコール - シランのSAMとパーフルオロシランのSAMなどの他の表面コーティングを、試してみました。この問題を解決するために、我々は非常に最近、架橋分子が、紫外線照射領域19の上に足場分子の活性な吸着を誘導するために使用できることを示しました。その濃度の足場分子と最適化のような選択は、各実験のために行われるべきです。

UV照射量それが強くタンパク質の吸着量に影響するためにも最適化する必要があります。我々の場合では、蛍光強度の測定は、200 Jの18 cm -2での最適なUV線量を得るために使用しました。値は、このような厚さ及びTiO 2膜の結晶性などの実験パラメータに依存して変化する可能性があります。

これまでに開発されたin-situでの表面改質の様々な技術の中で、本発明の方法の主な利点は、それが表面処理に特化した分子の有機合成を必要としないことです。ここに提示される方法は、原則として、商業的に入手可能なポリマー、ペプチド、お​​よびSAM前駆物質の膨大なライブラリーから調製された有機膜と互換性があります。ここに示されたように、それは、例えば、水銀アークランプを搭載した広視野蛍光顕微鏡のように、表面改質処理は、従来の実験装置を用いて行うことができるという点でも有利です。使い方光源としてUVレーザー、〜3ミクロンまでの細胞下解像度を達成することができる（データは示さず）。

現在の方法のいくつかの制限が表面改質、培地中に足場分子を補充する必要性、およびROSの生成の不可逆性があります。ここで説明する方法は、表面の許容変換非許容に適用可能であるが、変換は一方向であり、逆にすることができません。細胞親和性の逆変換を必要とする実験のために、他の方法15を考慮する必要があります 。加えて、我々の方法は、細胞培養培地に浴適用されるコラーゲンのような足場分子を必要とします。予めパターン化細胞の集団は、必然的に分子に曝されることになるので、これは、このプロセスのいくつかの適用を制限することができます。紫外線照射された領域で、ヒドロキシルラジカルなどのROSの光触媒生成は、近くの細胞に対して毒性であり得るが、少なくとも、この効果はありませんでした我々の実験で観察されました。これは、他の用途のために顕著になった場合でも、この問題は、増殖培地中に脱酸素剤を補充することによって解決されるべきです。酸素捕捉分子がその表面上のTiO 2及び非許容分子の間に位置されないので、それらは、パターニングプロセスの動力学に影響を与えることなく、過剰なROSを除去することが期待されます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslip Warner Instruments CS-15R15 15 mm diameter, #1.5 thickness
Diamond scriber Ogura Jewel Industry D-Point Pen
RF sputtering system ANELVA SPC350
TiO2 sputtering target Kojundo Chemical Lab Titanium (IV) oxide, target Purity, 99.9%
Plasma reactor Yamato PR301
n-octadecyltrichlorosilane (OTS) Aldrich 104817
Toluene Wako 204-01866
Tissue-culture dish (35 mm) Greiner 627160
Tissue-culture dish (60 mm) BD Falcon 353002
Type-IV collagen Nitta Gelatin Cellmatrix Type IV
D-PBS Gibco 14190-144
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco 11885-084
Fetal bovine serum Gibco 12483-020 Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use
Horse serum Gibco 26050-088 Pass through a 0.22 μm filter before use
Penicillin-streptomycin (100x) Nacalai tesque 26253-84
7S nerve growth factor (NGF) Alomone Labs N-130
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
EDTA Dojindo N001 Stock solution in 0.5 M
TiO2 nanoparticle Tayca TKD-701

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References

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生物工学、104号、セルパターニング、タンパク質パターニング、二酸化チタン、光触媒、自己組織化単分子膜、表面改質、PC12細胞
TiOを使用して水性環境中のタンパク質や細胞を光パターニング<sub&gt; 2</sub&gt;光触媒
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Yamamoto, H., Demura, T., Sekine,… More

Yamamoto, H., Demura, T., Sekine, K., Kono, S., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Tanii, T. Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis. J. Vis. Exp. (104), e53045, doi:10.3791/53045 (2015).

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