Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Photopatterning البروتينات والخلايا في وسط مائي البيئة عن طريق تيو Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/53045
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 3, 2,4, 2,5, 6
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 2CREST, Japan Science and Technology Agency, 3School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, 4Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 5Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, 6Faculty of Science and Engineering, Waseda University

Abstract

الملوثات العضوية كثف على السطح من ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) يمكن أن تتحلل عن طريق تحفيز ضوئي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور. نحن هنا وصف بروتوكول رواية توظيف تحفيز ضوئي تيو 2 لتغيير محليا تقارب خلية من سطح الركيزة. لهذه التجربة، وكان رقيق تيو 2 فيلم على ساترة الزجاج المطلي تفل، وتم تعديل سطح تيو 2 في وقت لاحق مع أحادي الطبقة organosilane المستمدة من octadecyltrichlorosilane (OTS)، الذي يمنع التصاق الخلية. تم مغمورة العينة في مستنبت الخلية، وركز تم المشع ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى منطقة مثمنة. عندما كانت مطلية على الخلايا PC12 خط الخلية العصبية على العينة، خلايا التقيد فقط على منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية. وتبين لنا أيضا أن هذا التعديل السطح ويمكن أيضا أن يؤديها في الموقع، أي حتى عندما الخلايا تنمو على الركيزة. التعديل المناسب للسطح المطلوب مصفوفة ص خارج الخليةrotein الكولاجين ليكون حاضرا في المتوسط ​​في وقت اشعة فوق البنفسجية. تقنية المعروضة هنا يمكن أن يحتمل استخدامها في الزخرفة أنواع خلايا متعددة لبناء أنظمة coculture أو التلاعب تعسفية الخلايا تحت الثقافة.

Introduction

عمليات أشباه الموصلات الطباعة الحجرية ومشتقاته - مثل 1،2 ضوئيه، شعاع الإلكترون الطباعة الحجرية 3-6، وmicrocontact طباعة 10/07 - أصبحت الآن أداة أنشئت في بيولوجيا الخلية في النمو الخلايا الحية في وضع تعريف والهندسة. يعتمد أسلوب الزخرفة على استخدام ركائز microfabricated، تتكون من جزيرة صغيرة من الخلايا طلاء متساهل في الخلفية غير متساهلة. تخدم هذه الركيزة كقالب لنمط الخلايا. وقد وفرت هذه التقنيات لنا طرق جديدة لهندسة الخلايا وظيفتها على مستوى أحادية ومتعددة الخلايا، لاستخراج الخصائص الجوهرية للخلايا، وزيادة الإنتاجية من خلية القاعدة المخدرات فحص 11.

ان درجة-الحرية في الزخرفة الخلية زيادة كبيرة إذا كان من الممكن تغيير هندسة نمط القالب في الموقع، أي في حين أن الخلايا يتم تربيتها على الصورةurface. الأساليب التقليدية لتشكيل نمط لا يمكن تطبيقها مباشرة هنا، لأنها معالجة العينات في الجو أو في فراغ. وقد اقترحت مختلف بالتالي تقنيات تعديل السطح الجديدة، والتي تقوم، على سبيل المثال، على مركبات photoreactive 12،13 أو ليزر الاجتثاث 5،14، على سبيل المثال لا الحصر. وقد تم استعراض الأساليب المقترحة لطيف من قبل روبرتوس وآخرون 15، ومؤخرا من قبل تشوي وآخرون. 16 وناكانيشي 17.

هنا في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول رواية في الموقع تعديل السطح، الذي يستفيد من التحلل بهوتوكاتاليتيك من الجزيئات العضوية على ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) سطح 18،19. في هذه الطريقة، يتم إدراج فيلم تيو 2 بين الركيزة الزجاج والفيلم العضوية التي واجهات الخلايا، وتتحلل الفيلم العضوية في الموقع عن طريق تشعيع محليا فوق البنفسجية (UV)ضوء على المنطقة ذات الاهتمام (λ <388 نانومتر). وتبين لنا أن البروتوكول الجديد يمكن أن تستخدم لخلق micropatterns من البروتينات المصفوفة خارج الخلية والخلايا الحية على حد سواء خارج الموقع والموقع. تيو 2 متوافق حيويا ومستقر كيميائيا، وشفافة بصريا، ملامح مما يجعلها صديقة ليعرض في تجارب لزراعة الخلايا. يوفر هذا البروتوكول بديل المواد على أساس علمي لتعديل السقالات خلية الثقافة في بيئة خلية الثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد تيو 2 المغلفة زجاج ساترة

  1. عدد لل coverslips باستخدام الناسخ الماس. هذا لا يساعد فقط على تتبع كل coverslips لكن أيضا لضمان أن الجانب الصحيح من العينة هو مواجهة. تنظيف لل coverslips، أولا تحت تشغيل ده 2 O، ثم عن طريق غمر لهم في حل سمكة البيرانا (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). بعد 10 دقيقة، شطف لل coverslips بدقة، 8 مرات في 2 O. ده تجفيف coverslips تحت N 2 التدفق.
  2. تعيين تيو 2 هدف في الترددات الراديوية (RF) النظام الاخرق. إرفاق لل coverslips على حامل عينة من المعدات الاخرق باستخدام الشريط بوليميد. وضع صاحب العينة في غرفة الاخرق. إخلاء الغرفة حتى يصل الضغط 2.0 × 10 -4 باسكال.
  3. إدخال الغاز عار في غرفة وضبط ضغط ترسب إلى 4.0 mTorr. مع الحفاظ على مصراع مغلقة، تزيد تدريجياقوة RF إلى 70 W.
  4. فتح مصراع وتفل لمدة 15 دقيقة للحصول على الفيلم مع سماكة من 120-150 نانومتر (الشكل 1: الخطوة A). معدل النمو في الفيلم يحتاج إلى أن تستمد لكل جهاز.

2. طلاء السطح مع الخلية طارد السينمائي

  1. Hydrophilize سطح تيو 2 عن طريق التعامل مع العينة مع O 2 البلازما، واتباع التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمفاعل البلازما. تعاملنا مع العينة لمدة 5 دقائق في 200 W مع O 2 تدفق 100 SCCM. تزج العينة في ده 2 O والتأكد من أن السطح فائقة المحبة للماء. يجف السطح تماما تحت N 2 التدفق.
  2. إعداد 1 ملم octadecyltrichlorosilane (OTS) حل عن طريق إضافة 39.6 OTS ميكرولتر إلى 100 مل التولوين. تزج العينة في حل لمدة 1 ساعة على RT. إجراء هذه الخطوة داخل N 2 كيس القفازات -تعبئة (الشكل 1: الخطوة B).
  3. لإزالة جزيئات physisorbed، sonicatالبريد العينة في التولوين، والأسيتون، والإيثانول، وده 2 O لمدة 5 دقائق لكل منهما، في هذا النظام. شطف العينة أربع مرات في ده الطازجة 2 O ويجف السطح تحت N 2 التدفق. يجب أن يكون السطح مسعور مع زاوية الاتصال من 100-110 درجة.

3. مثال الموضع الزخرفة السطحية

  1. العمل في الصفحي تدفق غطاء محرك السيارة، ووضع عدة علامات خدش مع الناسخ الماس على السطح. علامات تساعد في تتبع المناطق المجهزة وجلب المجاهر إلى التركيز أيضا. تعقيم تيو OTS المغلفة 2 عن طريق غمر العينة في الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق. ثم شطف العينة مرتين في تعقيم ده 2 O.
  2. ضع عينة في طبق 35 ملم، وإضافة 2 مل من النمو PC12 المتوسطة (انظر الخطوة 4.2). احتضان لأكثر من 3 ساعات في CO 2 حاضنة (37 ° C). ويهدف هذا الإجراء إلى السماح الالبيومينات المصل تمتص على السطح. الالبيومينات كثف تمنع امتصاص لاحقا المتواجد الآخرينخصوصيات والخلايا (الشكل 1: الخطوة C).
  3. في الوقت الذي تنتظر، وإعداد المجهر مضان مقلوب.
    1. تشغيل مصباح قوس، تضاف مكعبات فلتر الأشعة فوق البنفسجية، وتعيين عدسة موضوعية إلى 20X.
    2. قياس شدة الضوء I (W سم -2) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية متر الكثافة، وحساب الزمن t التشعيع (بالثواني) لجرعة من د (في J سم -2) على النحو التالي: ر = د / I.
      على سبيل المثال، لأشرق بجرعة 200 J سم -2 باستخدام مصدر ضوء 600 ميغاواط سم -2، مطلوب 333 ثانية من الإشعاع.
    3. استخدام ميكرومتر المرحلة وإغلاق الحجاب الحاجز المجال لضبط حجم المنطقة المراد المشع، على سبيل المثال، 200 ميكرون.
  4. بعد الحضانة 3 ساعات، تكملة المتوسطة مع 200 ميكرولتر من 3.0 ملغ مل -1 نوع-IV الكولاجين (كو-IV؛ النهائية تركيز 300 ميكروغرام مل -1).
  5. نقل 35 ملم طبق على المسرح المجهر. البحث الصفر متابوت، والتركيز المجهر على سطح العينة، وأشرق ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند تناول جرعة مقدارها 200 J سم -2 (الشكل 1: الخطوة D). مجال الأشعة فوق البنفسجية يمكن تغيير إما عن طريق ضبط افتتاح الحجاب الحاجز الميدان أو عن طريق استبدال الحجاب الحاجز الميدان مع قناع المعادن هندسة التحكيم.
  6. استبدال المتوسطة مع المتوسطة النمو الطازجة (بدون العقيد-IV)، ووضع العينة مرة أخرى في الحاضنة.

الثقافة 4. خلية

  1. يتم الثقافة الروتينية الخلايا PC12 خارجا على طبق من البلاستيك المغلفة الكولاجين.
    1. إلى معطف 60 ملم طبق الأنسجة الثقافة مع العقيد-IV، والرطب أولا السطح مع [ده 2 O ونضح كل ده 2 O.
    2. إعداد 300 ميكروغرام مل -1 العقيد-IV عن طريق تمييع الحل الأصلي (3 ملغ مل -1) 10X مع ده 2 O.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من 300 ميكروغرام مل -1 العقيد-IV في 60 ملم الطبق. اسمحوا الحل تنتشر عبر السطح.
    4. تي الجافانه طبق في غطاء تدفق الصفحي لحوالي 1 ساعة.
    5. شطف السطح مرتين مع 4 مل من الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(D-PBS). في حالة عدم استخدام طبق المغلفة على الفور، وشطف الطبق مرة واحدة مع 4 مل من ده 2 O. بعد الشفط ده 2 O، تخزين الطبق في الحاضنة. ليس محاولة للحفاظ على تخزينها لأكثر من أسبوعين.
  2. تزرع خلايا PC12 في وسط النمو الذي يتكون من: متوسطة (الجلوكوز منخفض) تعديل النسر Dulbecco لفي المصل + 1٪ حل البنسلين الستربتومايسين + 10٪ مصل بقري جنيني + حصان 5٪. احتضان الخلايا في CO 2 حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2)، واستبدال نصف المتوسط ​​كل يوم. خلايا مرور قبل أن تصل إلى نقطة التقاء.
    1. نضح في والمتوسطة النمو، وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني + (D-PBS + 10 ملغ مل -1 ألبومين المصل البقري (BSA) + 10 ملي EDTA) prewarmed إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 ° C. اضغط برفق الطبق لفصل كل مLLS.
    2. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. شطف الطبق مع 3 مل من جديد D-PBS، prewarmed إلى 37 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 150 × ز لمدة 4 دقائق.
    4. نضح طاف، وإضافة 1 مل من وسط النمو.
    5. للثقافة الروتينية، وتقسيم الخلايا 1: 3-1: 5.
  3. لوحة الخلايا على OTS / تيو 2 عينة المعدلة للأشعة فوق البنفسجية، عد كثافة الخلايا وإضافة 3.0 × 10 5 خلايا في طبق 35 ملم (الشكل 1: الخطوة E). احتضان الطبق في الحاضنة ترطيب (37 ° C، 5٪ CO 2) لمدة 1-2 أيام. كلا عامل نمو العصب السذاجة و(NGF) خلايا PC12 -differentiated يمكن أن تستخدم في التجارب الزخرفة. لNGF التمايز، يضاف 100 نانوغرام -1 مل من 7S-NGF إلى النمو المتوسط ​​عدة أيام قبل طلاء الخلايا على العينة. يبدو NGF-التمايز لزيادة adhesibility من الخلايا PC12 ويجعل التعامل أسهل، وخاصة في في الموقع الزخرفة هxperiments.

5. في الموضع الزخرفة السطحية

  1. بعد 1-2 أيام من الثقافة على سطح السابقين الموقع المعدلة، تأكد من أن الخلايا تنمو ويعلق فقط على منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية. إعداد المجهر، كما هو موضح في الخطوة 3.4.
  2. نقل العينة إلى الجديد 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة التي تحتوي على النمو المتوسطة، و 100 نانوغرام مل -1 NGF (في حالة استخدام الخلايا NGF متباينة)، و 100 ميكروغرام مل -1 العقيد-IV.
  3. وضع الطبق على المسرح المجهر. العثور على الموقف المناسب، وأشرق ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند تناول جرعة مقدارها 200 J سم -2 (الشكل 1: الخطوة F، G). يشار المنطقة المتساهلة التي أنشئت حديثا مع النجمة في الشكل 1: الخطوة G.
  4. في محاولة لاستكمال تجهيز عينة واحدة خلال 30 دقيقة. بعد التشعيع، ونقل العينة مرة أخرى إلى وسيط وبدون العقيد-IV.
  5. كن حذرا للغاية عند القيام الطبق مع مكعبخلايا ltured ونقل عينة من طبق إلى طبق لمنع فصل الخلايا منقوشة.

الشكل 1
الشكل 1. توضيح تخطيطي لعملية شاملة. انظر النص لمزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 2A يظهر مستعرضة المجهر الإلكتروني (SEM) صورة تيو 2 فيلم المودعة تفل. من الملاحظة، قدرت سماكة الفيلم أن ما يقرب من 150 نانومتر. ملحوظة هنا هو التسطيح للأودعت تيو 2 فيلم. كشف مزيد من التحليل بالقوة المجهر الذري (AFM) أن جذر متوسط ​​مربع (RMS) خشونة السطح كانت 0.2 نانومتر (الشكل 2B).

عندما يتم تعديل سطح تيو 2 مع OTS ثم مغمورة في وسط النمو المحتوية على مصل، الالبيومينات المصل كثف على سطح OTS وتمنع لاحقا امتصاص البروتين والخلايا الالتصاق 18،20. وفي وقت لاحق، عندما يشرق تركز الأشعة فوق البنفسجية على السطح، ويتم إنشاء أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) على سطح تيو 2 21، والتي تتحلل OTS الذاتي تجميعها أحادي الطبقة (SAM) على تيو 2 وإزالة SAM وكثف لlbumins من على سطح الأرض. هذا يجعل المنطقة المعرضة للإشعاع محبة للماء ومتساهلة لامتصاص البروتين. قد يكون التفاعل المباشر للROS مع الالبيومينات تحدث في وقت واحد، ولكن يجب أن يكون التحلل من OTS رد الفعل الرئيسي، منذ OTS SAM يتم التواصل الزلال وتيو 2. في البروتوكول الحالي، وتستكمل بروتين المصفوفة خارج الخلية العقيد-IV في المتوسط ​​خلال التشعيع، والعقيد-IV يكثف تفضيلي للمنطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية حيث تتم إزالة الالبيومينات (الشكل 3A). البروتينات الأخرى مثل فبرونيكتين يمكن منقوشة في نفس البروتوكول (الشكل 3B)، مما يدل على براعة هذا النهج.

الالبيومينات مصل، والتي هي أيضا موجودة في المتوسط ​​في وقت أشعة فوق البنفسجية، كما ينبغي أن كثف على المنطقة المعرضة للإشعاع، ولكن تشير النتائج أن كمية ليست عالية كما أن على حالها OTS SAM. لتأكيد هذا، ونحن التحقيق الفرق في تقارب من BSAإلى المشع للأشعة فوق البنفسجية وسليمة OTS SAM بواسطة المجهر مضان المسمى صبغ BSA. لهذه التجربة، والمشع تركز الأشعة فوق البنفسجية إلى OTS / تيو 2 عينة التي لم يتم منغمسين في المتوسط ​​المحتوية على مصل، وبعد ذلك تم مغمورة العينة في محلول fluorescein- المسمى BSA. ويبين الشكل 3C نمط امتصاص BSA. مضان أكثر إشراقا في المنطقة OTS SAM سليمة من منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية يشير إلى أن كمية كثف BSA أعلى في المنطقة على حالها. آلية امتصاص تفضيلية يمكن أن يكون مفهوما من قبل الفرق في للا مائية للمنطقتين. ومن المعروف أن كمية BSA الامتزاز أن يكون أعلى على أسطح مسعور 22، والمنطقة OTS SAM سليمة هو أكثر مسعور من منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية 18.

نمط من العقيد-IV بالتالي خلق بمثابة سقالة للالتصاق الخلية. الشكل 4A يظهر خلايا PC12 NGF متباينة في تربيتها على ن السابقين الموقع منقوشة المنطقة لمدة 1 يوم. بعد ذلك، تم المشع ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى جانب من micropattern، وكان المثقف الخلايا لمدة 5 أيام إضافية. كما هو مبين في الشكل 4B-D، خلايا هاجر أيضا على المنطقة تعديلها، مشيرا إلى أن تقارب خلية من سطح تم تعديل بنجاح في بيئة خلية الثقافة.

الرقم 2
الشكل 2. توصيف الفيلم تيو 2. (A) مقطعية SEM صورة من العينة. صورة (B) AFM من سطح تيو 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

OAD / 53045 / 53045fig3highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الشكل 3. الموقع انتقائية امتصاص البروتينات على منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية. (A) الكولاجين فلوريسئين المسمى (200 ميكرون نمط مثمن) و (B) المسمى رودامين فبرونيكتين (100 ميكرون نمط مربع). الامتزاز التفضيلية من هذه البروتينات يعتمد على غياب الالبيومينات التي تعمل على منع امتصاص البروتين (C). لاحظ أنه في (C)، لم مغمورة OTS SAM في المحتوية على مصل المتوسطة قبل تطبيق المسمى فلوريسئين BSA. أشرطة النطاق، 100 ميكرون (A) و 50 ميكرون (B، C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. السابقين الموقع والزخرفة في الموقع من خلايا PC12. (A) التصاق الخلايا PC12 على منطقة السابقين الموقع منقوشة. المثمن منقط يشير موقع في الموقع للاشعة فوق البنفسجية. (B - D) هجرة الخلايا PC12 إلى المنطقة منقوشة في الموقع، في 2 أيام (B)، 3 أيام (C)، و 5 أيام (D) بعد التشعيع. شريط النطاق، 200 ميكرون. تعديل بإذن من ياماموتو وآخرون. 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في البروتوكول الحالي لدينا، تشكلت تيو 2 فيلم RF-المغنطرون الاخرق. نحن نؤيد هذا الأسلوب من ترسب لأنه يسمح لنا لإعداد بتكاثر على بهوتوكاتاليتيك تيو 2 فيلم مع خشونة نانومتر الفرعي. على الرغم من أن عمليات ترسيب بالرش مألوفة للعلماء والمهندسين المواد الإلكترونية، قد لا تكون في متناول جدا لعلماء الأحياء. في هذه الحالة، فإن المغلفة تدور تيو 2 الفيلم سيكون خيار بديل 23. في هذه الطريقة، تيو 2 النانوية المذاب في مذيب وانتشرت على سطح الركيزة بواسطة قوة الطرد المركزي. المعدات الخاصة المطلوبة هي المغطي تدور، والتي هي في متناول الكثير من النظام الاخرق. وقد استخدمنا لأنفسنا تيو 2 فيلم جسيمات متناهية الصغر المغلفة تدور وأكدت أن الفيلم يمكن أن تستخدم أيضا لإجراء تجارب مماثلة (لا تظهر البيانات). سطح تيو 2 فيلم المغلفة تدور الخام نسبيا مع خشونة التربيعي للعدد عشرةالصورة من نانومتر، ويستغرق بعض الممارسات للمعطف موحد الركيزة بتكاثر خصوصا عندما تكون هناك حاجة متعددة الطلاء تدور للحصول على الافلام سميكة. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة قد يكون المرشح الأول لعلماء الأحياء.

حتى الآن، لقد استخدمت هذه الطريقة في الزخرفة ليس فقط الخلايا PC12 ولكن أيضا البنكرياس خط الخلايا السرطانية البشرية AsPC-1 والخلايا العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من الحصين الفئران الجنينية 19. Adhesibility من AsPC-1 الخلايا هي أقوى بكثير من الخلايا PC12 أو الخلايا العصبية قرن آمون، ومكملات من جزيئات السقالات، مثل الكولاجين، لم يكن مطلوبا في الزخرفة لهم. نحن حتى الآن نلاحظ أن التصاق غير محددة من الخلايا إلى منطقة غير المشععة لوحظ في بعض الأحيان، والتي ربما تكون بسبب عيوب في OTS SAM.

وكانت الخلايا العصبية الأولية الزخرفة أكثر تحديا منذ adhesibility بها ضعيفة. في الواقع، خطوة حاسمة في العملية الحالية تكمن في امتصاص السليمالسقالات الجزيئات. وكان من اضافة بسيطة من الكولاجين أو laminin كافية لزيادة تقارب من المنطقة المعدلة للالخلايا العصبية. الثقافة التقليدية من الخلايا العصبية قرن آمون تعتمد على شحنة موجبة الببتيد بولي يسين معطف سطح ساترة 24. في هذا السياق، هو المطلوب إحداث مرفق الانتقائي للبولي يسين إلى منطقة الأشعة فوق البنفسجية المشع، ولكن كان من المستحيل منذ بولي يسين كثف على المنطقة OTS SAM سليمة كذلك. حاولنا مواد الطلاء الأخرى، مثل البولي ايثيلين جلايكول سيلاني سام وperfluoro سيلاني صواريخ سام، لتجد أن أيا من هذه كانت المضادة للحشف بولي يسين. لحل هذه المشكلة، أظهرنا مؤخرا جدا أن جزيء عبر ربط يمكن أن تستخدم للحث على امتصاص نشطة من جزيئات السقالات على منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية 19. وينبغي أن يتم هذا الاختيار من جزيئات السقالات والأمثل للتركيز إلى خارج لكل تجربة.

جرعة الأشعة فوق البنفسجيةوينبغي أيضا أن يكون الأمثل لأنه يؤثر بشدة على كمية البروتين الامتزاز. في حالتنا، تم استخدام قياس كثافة مضان لاستخلاص جرعة الأشعة فوق البنفسجية المثلى من 200 J سم -2 18. ومن المرجح أن يختلف وفقا لمعايير التجريبية مثل سمك والتبلور من الفيلم تيو 2 القيمة.

ومن بين التقنيات المختلفة في الوضع الطبيعي التعديل سطح المتقدمة حتى الآن، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب التركيب العضوي لجزيئات متخصصة لتجهيز السطح. الطريقة المعروضة هنا هي، من حيث المبدأ، متوافقة مع أفلام العضوية المحضرة من مكتبة واسعة من البوليمرات المتاحة تجاريا، والببتيدات، والسلائف SAM. بل هو أيضا مواتية بمعنى أن عملية سطح التعديل يمكن القيام بها باستخدام معدات المختبرات التقليدية، مثل المجهر مضان واسعة المجال مجهزة مصباح قوس الزئبق، كما هو موضح هنا. باستخدامليزر الأشعة فوق البنفسجية كمصدر للضوء، لا يمكن أن يتحقق قرار التحت خلوية وصولا الى ~ 3 ميكرون (لا تظهر البيانات).

وتشمل بعض القيود المفروضة على الطريقة الحالية عدم التراجع عن تعديل السطح، والحاجة إلى المكمل جزيئات السقالات في المتوسط، وجيل من ROS. العملية الموضحة هنا هي التي تنطبق على غير متساهلة لتحويل متساهل من السطح، ولكن هذا التحول في اتجاه واحد ولا يمكن عكس. للتجارب التي تتطلب التحويل عكس تقارب الخلية، وأساليب أخرى 15 تحتاج إلى النظر فيها. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب عملية لدينا جزيئات السقالات مثل الكولاجين ليتم تطبيقها حمام إلى مستنبت الخلية. منذ السكان من الخلايا نقوش ما قبل حتما أن تتعرض لجزيئات، وهذا قد يحد من بعض التطبيقات لهذه العملية. الجيل Photocatalyzed من ROS، مثل جذور الهيدروكسيل، في منطقة المشع فوق البنفسجية قد تكون سامة للخلايا المجاورة، ولكن، على الأقل، كان هذا التأثير لالوحظ في تجاربنا. حتى لو كان هذا يصبح بارزا لتطبيقات أخرى، يجب أن تحل هذه المشكلة من خلال استكمال الزبالين الأوكسجين في النمو المتوسطة. منذ الأكسجين الكسح الجزيئات لن يكون موجودا بين تيو 2 والجزيئات غير متساهلة على سطحه، من المتوقع أن القضاء المفرط ROS دون التأثير على حركية عملية الزخرفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslip Warner Instruments CS-15R15 15 mm diameter, #1.5 thickness
Diamond scriber Ogura Jewel Industry D-Point Pen
RF sputtering system ANELVA SPC350
TiO2 sputtering target Kojundo Chemical Lab Titanium (IV) oxide, target Purity, 99.9%
Plasma reactor Yamato PR301
n-octadecyltrichlorosilane (OTS) Aldrich 104817
Toluene Wako 204-01866
Tissue-culture dish (35 mm) Greiner 627160
Tissue-culture dish (60 mm) BD Falcon 353002
Type-IV collagen Nitta Gelatin Cellmatrix Type IV
D-PBS Gibco 14190-144
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco 11885-084
Fetal bovine serum Gibco 12483-020 Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use
Horse serum Gibco 26050-088 Pass through a 0.22 μm filter before use
Penicillin-streptomycin (100x) Nacalai tesque 26253-84
7S nerve growth factor (NGF) Alomone Labs N-130
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
EDTA Dojindo N001 Stock solution in 0.5 M
TiO2 nanoparticle Tayca TKD-701

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
  2. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
  3. Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
  4. Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
  5. Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
  6. Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
  7. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
  8. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
  9. Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
  10. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
  11. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
  12. Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
  13. Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
  14. Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
  15. Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
  16. Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
  17. Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
  18. Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
  19. Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
  20. Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
  21. Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
  22. Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
  23. Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
  24. Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 104، الزخرفة الخليوي، البروتين الزخرفة، ثاني أكسيد التيتانيوم، تحفيز ضوئي، أحادي الطبقة الذاتي تجميعها، وتعديل سطح الخلايا PC12
Photopatterning البروتينات والخلايا في وسط مائي البيئة عن طريق تيو<sub&gt; 2</sub&gt; ضوئي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamamoto, H., Demura, T., Sekine,… More

Yamamoto, H., Demura, T., Sekine, K., Kono, S., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Tanii, T. Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis. J. Vis. Exp. (104), e53045, doi:10.3791/53045 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter